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标题: [求助]AnnexinV/PI双染检测凋亡细胞，结果“诡异” [打印本页]

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-16 11:34 标题: [求助]AnnexinV/PI双染检测凋亡细胞，结果“诡异”

[求助]AnnexinV/PI双染检测凋亡细胞，结果“诡异”

最近在做AnnexinV/PI双染检测凋亡细胞，用的是凯基生物的AnnexinV/PI试剂盒，细胞给药24小时后，有70%都变圆收缩，还有20-30%都漂了起来，但是用流式检测凋亡的结果却只有百分之几而已，请高手帮我解答下这是为什么啊？
PS:本人之前还做了hochest33342和DNA Ladder，结果都显示我的化合物是有促凋亡作用的。

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-16 11:34

这是我的流式图

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9953

作者: 分子式 时间: 2011-12-16 11:35

单从流式图来看，的确没有凋亡的细胞。
导致这种结果原因有很多，不知道楼主是哪一个原因造成的：
1、你的细胞没有凋亡，可以进一步用PI染色分析细胞周期的方法看看有没有明显的凋亡峰以进一步确定你的细胞是否发生凋亡。
2、你的试剂盒可能有问题，不知道有没有阳性对照，就是肯定发生凋亡的细胞用该试剂盒检测看看。
3、你的操作的问题，可以上传你的操作步骤让大家帮你分析是否可能存在问题。

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-16 11:35 标题: 回复 #3 分子式的帖子

1.我之前做了hochest33342荧光染色和DNA Ladder，结果都显示我的细胞是有凋亡的。而且细胞给药后有70%都变圆收缩，还有20-30%都漂了起来的哦！
2.没有用阳性对照哦，我下次找个阳性药测试的看一下哦
3.我的操作步骤是这样的：给药时间到了后，我是收集上清，再用胰酶-EDTA消化细胞（胰酶没有弃去，是直接加含FBS的培养基终止消化后吹打），两者的细胞加在一起离心1000rpm，5min，弃上清，再用PBS重悬洗两次，最后将细胞保存在1ml的PBS里面，拿去检测。（我从学校到送检的地方有两个小时，两个小时中细胞就保存在PBS里面，然后放在冰盒里，不知道这个时间的耽误有没有问题哦！等我送到检测的地方后细胞大部分都自然沉降在离心管底了。）

作者: 分子式 时间: 2011-12-16 11:36

两个小时的中间送检过程不会有影响。
从你的步骤中怎么没有最重要的标记抗体的过程？

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-16 11:36 标题: 回复 #5 分子式的帖子

我是将细胞收集后保存在PBS里，送到检测的地方再加染料检测哦！我做的是AnnexinV/PI双染检测凋亡细胞，买的试剂盒里面只有AnnexinV和PI两种染料，不需要标记抗体吧？

作者: 911 时间: 2011-12-16 11:36

是不是因为“胰酶-EDTA”的问题。AnnexinV结合PS时需要钙离子，而EDTA是钙离子螯合剂。

作者: mickeylin 时间: 2011-12-16 11:37

我感觉是细胞没有染上，你下次加大染色剂的浓度，另外缩短染色后到上机检测的时间试试。

作者: 黄花菜 时间: 2011-12-16 11:37

.我之前做了hochest33342荧光染色和DNA Ladder，结果都显示我的细胞是有凋亡的。而且细胞给药后有70%都变圆收缩，还有20-30%都漂了起来的哦！
2.没有用阳性对照哦，我下次找个阳性药测试的看一下哦
3.我的操作步骤是这样的：给药时间到了后，我是收集上清，再用胰酶-EDTA消化细胞（胰酶没有弃去，是直接加含FBS的培养基终止消化后吹打），两者的细胞加在一起离心1000rpm，5min，弃上清，再用PBS重悬洗两次，最后将细胞保存在1ml的PBS里面，拿去检测。（我从学校到送检的地方有两个小时，两个小时中细胞就保存在PBS里面，然后放在冰盒里，不知道这个时间的耽误有没有问题哦！等我送到检测的地方后细胞大部分都自然沉降在离心管底了。）

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用含有EDTA的胰酶消化细胞，很有可能会降低Annexin-FITC的阳性率。另外PBS的PH值你测过没有？最好在7.4左右。

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-16 11:38

我想问一下左上象限代表的是什么细胞？左下象限是正常细胞，右上是中晚期凋亡细胞，右下象限是早期凋亡细胞。那死亡细胞是不是在分析之前都去除了啊?急求，谢谢

图片附件: 66259937.jpg (2011-12-16 11:38, 23.24 KB) / 该附件被下载次数 6
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