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标题: [讨论帖]肝星状细胞原代培养方法及trouble-shooting [打印本页]

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:37 标题: [讨论帖]肝星状细胞原代培养方法及trouble-shooting

[讨论帖]肝星状细胞原代培养方法及trouble-shooting

由于近期收到一些群友们关于肝星状细胞的pm. 特发此贴, 便于大家讨论及学习. 谢谢

请参考下面2个帖子, 是去年开始学习肝星状细胞时发的帖子
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=12033417&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#12033417')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=12860230&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1286023')

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:38

过多的血细胞是不是影响HSC的提取啊？

答: 如果一开始灌流肝脏时灌流成功的话, 不会残留太多的血细胞(肝脏的颜色会变成乳白色). 而如果发现肝脏还是红色, 或者后面取完细胞后, 镜下发现有较多的血细胞, 是否可以理解为前面的灌流那一步操作不好? 而如果灌流做的不好(消化不完全)会直接影响HSCs的得率.

因此, 建议再好好设定好灌流的条件.

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:39

我们用PERCOLL提取的，效果很不好，没有清楚的分层，问下老师用过PERCOLL提过吗？要怎样处理好些呢

答: percoll我没有做过, 我說說optiprep的经验. 原理上离心分层是由于不同浓度的optiprep的密度不同, 而hsc又是最轻的细胞而会漂浮到上层. 分层不清很有可能是由于加上不同密度的离心液(比如,我就是加15%和11.5%的optiprep和GBSS)时, 由于速度过快引起了几个层之间的液体被混匀在一起.(我一般加3层液,会花上5分钟左右)

因此, 建议加不同密度的离心液时,一定要非常缓慢的加.

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:39

分离小鼠HSC细胞时，用的DNAse酶是哪个公司的，你说solution II里含20mg/l的DNAse,我上网查了一下，sigma公司的500ug 就要1890元，如果按您的浓度一只小鼠就要需要600ug的DNAse 了，所以能否跟您确认一下您的DNAse，

答: DNase加入的目的,在于清除在消化过程中被破坏的大量的肝细胞(hepatocyte)中被释放出来的genome. 因为genome带有粘性, 会把细胞们黏在一起,这样的话在过滤(100μm 左右的筛子)清除垃圾时, hsc也会被黏在一起而被阻挡, 这样会直接影响hsc的得率. 还有一点是各个公司的不同批号的DNase的作用力会不同, 具体使用量还得预实验中摸索.

因此, 建议通过几次预实验, 掌握好DNase的使用量.

作者: tieshazhang 时间: 2011-12-16 16:40

达人，请问您的灌注系统是如何构建的？直接用血管夹固定注射器针头,那恒流泵的管子又是如何与注射器连接的呢？多谢啦

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:40

您好

1. 我的灌注系统, 其实是我们组其他人用来心脏体外灌注用的泵. 只不过由于我仅仅是需要恒速灌流而已, 所以被我拿过来使用.

2. 注射针头的固定, 我也是一开始用血管夹的, 但是由来发现血管夹夹住后有缝隙, 灌流液会反向流出来. 因此后来我都是将门脉分离后, 用手术线直接结扎的

3. 管子是直接连到注射器, 由于大小尺寸不合适, 我是用封口膜将缝隙堵死了.

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:41

OPTIPREP配置有哪些需要注意的事项？

答: 需要注意的地方有几点
1. 尽量现配现用
2. 虽然我的配方是15%和11.5% 但是实际上我会下面的稍微重一下, 上面的稍微轻
一下, 这样对提高纯度有一些帮助 (或许是心理作用?)

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:42

分离过程中最关键的步骤是哪一步？.

答: 我倒觉得所有的步骤都是最关键的. 因为是一环一环影响着的.

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:42

如何避免污染?

答: 首先, 每个试剂该0.22过滤的过滤, 该高压的高压. 但是我的经验是在我的protocol当中, solution1不用可以灭菌, 常规配置就可以;而solutionII 是一定要0.22过滤的(因为含有glucose, 所以不能高压).

其他的就按照常规无菌操作即可.

作者: 气泡 时间: 2011-12-16 16:44

请教下
1.灌流的时候，是否结扎上腔静脉或者下腔静脉？
2.一只小鼠肝脏分离的细胞够吗？
3.最后一步吸取GBSS和11.5%OPTIPREP的中间层后，450G离心8MIN后，能否看到沉淀？
谢谢！！

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:44 标题: 回复 #10 气泡的帖子

1. 以前听过有人结扎. 但是我是门脉插入注射针后, 剪开腹部血管(腹主动脉那里剪一刀), 形成一个出口.

2. 够不够要看每个人的使用量. 我一般是2只一起取, 细胞在5*10^5 左右的数量.

3. 能看到一小撮白色的细胞沉淀. 但是不多.

作者: lixi559 时间: 2011-12-16 16:45

你好，请问在门脉插管时是用的注射针头还是塑料管子呢？用线固定吗？我用的是打吊针的针头可是感觉很容易刺破血管，不知怎样更好

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:46 标题: 回复 #12 lixi559 的帖子

您好

1. 门脉插管时是用的注射针头还是塑料管子.

这个只要您觉得哪个用起来顺, 就用哪个. 最终目的是把灌注液灌到肝脏里面. 只要能达到目的, 不要拘泥于方法. 我个人是喜欢用针头, 然后用线固定

2. 我用的是打吊针的针头可是感觉很容易刺破血管

同上一个问题一样, 如果您觉得针头老是移动容易刺破血管的话, 可以想办法固定住针头, 比如用止血钳一起夹住针头和下面的组织, 诱惑着用套管针.

作者: 小螺号 时间: 2011-12-16 16:46

楼主您好，我已从大鼠肝脏分离到一些原代星状细胞了，刚分离出来时细胞状态还好，但48h后细胞的状态变得较差，折光性下降，有的贴壁还不牢，很怕它们会逐渐死掉，我用的1640+20%FBS进行培养，种于24孔板上，24h后对半换过一次液，想请您帮忙分析下问题主要出在哪儿。另外您在分离培养的过程中通常多久换一次液，何时可以传代，不知原代星状细胞可否冻存，复苏后活力如何？谢谢啦

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:51

刚分离出来时细胞状态还好，但48h后细胞的状态变得较差，折光性下降，有的贴壁还不牢

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如果您能上传图片, 可能更加有帮助.
但是一般性的考虑的话, 如果您觉得细胞不够健康的话, 在整个提取细胞的过程中操作再轻柔一些.

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:53

我用的1640+20%FBS进行培养，种于24孔板上，24h后对半换过一次液，想请您帮忙分析下问题主要出在哪儿。另外您在分离培养的过程中通常多久换一次液，何时可以传代，

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我是用DMEM+10%FBS的条件. 换液是刚种植的24小时后换一次液,后面就是2天换一次(每48小时换一次). 传代就是您觉得铺满了(超过80%覆盖率)就可以.

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:53

不知原代星状细胞可否冻存，复苏后活力如何？谢谢啦

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关于冻存由于实验上不需要, 这个细胞我没有冻存过, 但是理论上没有问题.
复苏活力就看您的冻存技术掌握的如何了.

下面附上一张我的HSC的自发荧光图, 请参考
day2

图片附件: 82673274.jpg (2011-12-16 16:53, 24.86 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9958

作者: 小螺号 时间: 2011-12-16 16:54

谢谢楼主的指点了，图片很漂亮，我再努力的试试看吧。另外您的这张图片里HSC在分离出的第二天就伸展开了么？我分离的细胞第二天还是类似于圆形的呀，难道不是HSC？！（ps实验室的倒置显微镜不能激发荧光了，还有什么可行的方法能在分离后就先判别下么）

作者: 二丫头466 时间: 2011-12-16 16:55

楼主的照片很漂亮，最近也在分小鼠的HSC，用9%的nycodenz，有细胞层，但收集以后经常不贴壁，有贴壁的，形态也不好，总是圆圆的，铺展不开，真是急死了

作者: 969 时间: 2011-12-16 16:55

原代HSCs我冻存过，但复苏后的状态比未冻存前差多了，我也在为这事烦恼。每次分离的细胞又用不完，冻存后状态又不好········

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:57

离出的第二天就伸展开了么？我分离的细胞第二天还是类似于圆形的呀，难道不是HSC？！（ps实验室的倒置显微镜不能激发荧光了，还有什么可行的方法能在分离后就先判别下么）

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您好

如果想从形态判断的话. 肝细胞最好鉴别, 比其他细胞大很多(2-3倍) fibro和HSC长的差不多. 理论上只能通过desmin免疫染色或自发荧光去鉴别.(但是倒置镜下看多了, 也能鉴别出来的, 折光率不同, HSC由于富含脂滴所以更加凹凸不平以及包浆内有小颗粒)

HSC一般在24小时以内会贴壁. 所以第二天换液后就能看到细胞开始展开.

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 16:58

但收集以后经常不贴壁，有贴壁的，形态也不好，总是圆圆的，铺展不开，真是急死了

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您好

刚分离后试一试用trypan blue 看看细胞的viability. 如果死细胞多的话, 当然不会贴壁的

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 17:00

每次分离的细胞又用不完，冻存后状态又不好········

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您好

太羡慕您了. 我是每次为细胞不够而发愁.

作者: nn255 时间: 2011-12-16 17:00

不知楼主用的Optiprep是什么公司的？

作者: duoduo 时间: 2011-12-16 17:01

请问楼主用的DMEM是否含丙酮酸？
做药理实验用传代的HSC与原代的相比，差距大吗？

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-16 17:01

不知楼主用的Optiprep是什么公司的？

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OptiPrepTM（货号：1114542 ） Axis-shield（公司）奇康有代理，我自己用过，的确不错。

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-16 17:02

请问楼主用的DMEM是否含丙酮酸？
做药理实验用传代的HSC与原代的相比，差距大吗？

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原代星形细胞在培养5-7d后会早期活化，14d完全活化，后者与传代的星状细胞在细胞表型和形态上无明显差异

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-16 17:03

楼主的照片很漂亮，最近也在分小鼠的HSC，用9%的nycodenz，有细胞层，但收集以后经常不贴壁，有贴壁的，形态也不好，总是圆圆的，铺展不开，真是急死了

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说明细胞的活力不好，应该从提高细胞活力的细节着手，比如细胞离体后尽量缩短处理时间，一般两个小时可以完成。在离体后尽量保持4摄氏度的细胞环境。还有就是不要过度消化，链酶对星状细胞也有损伤。
分离的星状细胞3h即可良好贴壁，2d大部分细胞开始伸展，其实根据我的观察，如果你细胞活力好第24h细胞就会开始不规则。个人经验，仅供参考。

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-16 17:03

您好

如果想从形态判断的话. 肝细胞最好鉴别, 比其他细胞大很多(2-3倍) fibro和HSC长的差不多. 理论上只能通过desmin免疫染色或自发荧光去鉴别.(但是倒置镜下看多了, 也能鉴别出来的, 折光率不同, HSC由于富含脂滴所以更加凹凸不平以及包浆内有小颗粒)

HSC一般在24小时以内会贴壁. 所以第二天换液后就能看到细胞开始展开.

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补充几句，星状细胞的早期纯度鉴定只能通过自发荧光和油红o染色。细胞早期desim表达不强，甚至不表达，因此不是早期鉴定的指标。我最近正在做油红o爬片染色，有经验的可以交流一下。

作者: guagua 时间: 2011-12-16 17:07

针头可以磨平了再用
我觉得关键还是缩短操作时间

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 17:08

不知楼主用的Optiprep是什么公司的？

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我用的是sigma的

cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=Product%20No.%7CBRAND_KEY&N4=D1556%7CSIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC')

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 17:09

请问楼主用的DMEM是否含丙酮酸？
做药理实验用传代的HSC与原代的相比，差距大吗？

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这个差距指的是什么?

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 17:09

正常普通老鼠原代取的话,,大概7天以后都会完全活化的.我自己测过alpha-SMA的mRNA的表达, 7天和14天无明显区别.

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 17:09

补充几句，星状细胞的早期纯度鉴定只能通过自发荧光和油红o染色。细胞早期desim表达不强，甚至不表达，因此不是早期鉴定的指标。我最近正在做油红o爬片染色，有经验的可以交流一下。

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HSCs是desmin-positive的.
下面附上我自己做的desmin的免疫荧光图,仅供參考.

图片附件: 57914308.jpg (2011-12-16 17:09, 25.71 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9959

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 17:10

针头可以磨平了再用
我觉得关键还是缩短操作时间

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?

作者: caihong 时间: 2011-12-16 17:11

我来发1张星状细胞的Oil Red O染色图片，（DIC，40X） 24h的细胞爬片

图片附件: 84004934.jpg (2011-12-16 17:11, 5.47 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9960

作者: caihong 时间: 2011-12-16 17:13

想跟版主探讨几个问题。
1、是否有必要使用15%opti prep？我觉得理论上，只用11.5%opti prep 加GBSS就可以了。因为我们只收集11.5%opti prep 和GBSS之间的细胞富集区。楼主认为呢？
2、梯度离心时，使用50ml离心管和15ml离心管的问题。两个我都用过，都能看到明显细胞层，小管子相对较厚些。如果只拿细胞层，小管子看的更清楚，再考虑到管壁对细胞的吸附，是不是小管子得率上更有优势？
3、我每次把BGSS和11.5%opti prep 全都收集起来，而不是只收集两者之间的细胞层，这样做是不是会影响纯度？楼主是怎么操作的？
谢谢赐教！

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 17:13

想跟版主探讨几个问题。
1、是否有必要使用15%opti prep？我觉得理论上，只用11.5%opti prep 加GBSS就可以了。因为我们只收集11.5%opti prep 和GBSS之间的细胞富集区。楼主认为呢？
2、梯度离心时，使用50ml离心管和15ml离心管的问题。两个我都用过，都能看到明显细胞层，小管子相对较厚些。如果只拿细胞层，小管子看的更清楚，再考虑到管壁对细胞的吸附，是不是小管子得率上更有优势？
3、我每次把BGSS和11.5%opti prep 全都收集起来，而不是只收集两者之间的细胞层，这样做是不是会影响纯度？楼主是怎么操作的？
谢谢赐教！

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赐教不敢当, 一起学习吧

1. 如果仅仅是2层,11.5%和GBSS的话,将使很多细胞拥挤在下面11.5%那一层. 这样的弊端就是很有可能其他细胞也有可能漂上来. 如果是3层的话,等于有2次"把关"对于提高纯度有帮助.
2. 没有比较过,不清楚,但是这个地方应该影响不大的.
3. 11.5%那层有很多fibroblast和endothelial, kupffer等等其他细胞, 一不小心就会吸上来, 这样非常影响纯度的.

作者: 生物迷 时间: 2011-12-16 17:14

问4.OPTIPREP配置有哪些需要注意的事项？

答: 需要注意的地方有几点
1. 尽量现配现用
2. 虽然我的配方是15%和11.5% 但是实际上我会下面的稍微重一下, 上面的稍微轻
一下, 这样对提高纯度有一些帮助 (或许是心理作用?

)

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问题一：看过有些文献是用DMEM高糖培养液来稀释，很多文献都直接写配置成百分之多少的，没有提到稀释液，想问下楼主，你也是用这个稀释的吗
问题二：optiprep稀释后密度的计算，有没什么计算公式的

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 17:15 标题: 回复 #39 生物迷的帖子

上网下载一个optiprep的说明书，就什么都有了。

作者: 生物迷 时间: 2011-12-16 17:15

上网下载一个optiprep的说明书，就什么都有了。

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之前下过一下，不知道是下的不太对，还是自己看的不仔细。
我再找找，好好研究一下

作者: zhezhe 时间: 2011-12-16 17:16

我目前正在提原代肝星状细胞，细胞得率很少，纯度也不理想，我想问下各位，怎么样可以尽量提高它的产量，原代的肝星状细胞会不会养着就没掉了？它最多可以传多少代呢？30代可以吗？还有静止跟活化状态下的microRNA比较，这个结果做得出来吗？结果怎样？用optiprep梯度离心液和Nycodenz梯度离心液，到底哪一种效果比较好些？谢谢~~~

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-16 17:16

我目前正在提原代肝星状细胞，细胞得率很少，纯度也不理想，我想问下各位，怎么样可以尽量提高它的产量，原代的肝星状细胞会不会养着就没掉了？它最多可以传多少代呢？30代可以吗？还有静止跟活化状态下的microRNA比较，这个结果做得出来吗？结果怎样？用optiprep梯度离心液和Nycodenz梯度离心液，到底哪一种效果比较好些？谢谢~~~

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细胞得率是整个protocol和操作是否合理最重要. 当然, 操作员不一样, 同样的protocol的得率也不一样. 加油吧

一般HSCs传1代的多见. 如果想用完全活化的HSCs做实验的话, 比如养个5-7天,传一代, 12-14天做实验.

还有静止跟活化状态下的microRNA比较，这个结果做得出来吗？这个问题没看明白想问什么

用optiprep梯度离心液和Nycodenz梯度离心液，到底哪一种效果比较好些？两个都很好.

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