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标题: [求助]请高手鉴定破骨细胞 [打印本页]

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:18 标题: [求助]请高手鉴定破骨细胞

[求助]请高手鉴定破骨细胞

我最近做的破骨细胞照片
请高手鉴定
听说是多核的
我该用啥方法鉴定啊
多谢了

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作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:19

能看见是多核的吗？

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作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:19

破骨细胞的鉴定可以分多种：这个是我在一篇论文中找的，具体你可以找一下论文！
1.形态学观察　破骨细胞是一类多核、体积大的巨细胞，在相差倒置显微镜下观察容易识别。细胞直径达30～100μm，含几个至数十个核。培养2小时后胞浆伸展，形态清晰，呈油煎蛋形、长条形、漏斗形、不规则形等

2)TRAP染色反应　抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)为破骨细胞的特异性标志酶，应用偶氮偶联组化分析法酶活性部位显示红色反应。以萘酚二磷酸盐为底物，偶氮副品红为显色剂，TRAP在酒石酸钾钠存在条件下将萘酚AS-BI磷酸盐水解为萘酚AS-BI，与显色剂结合形成红色沉淀

3)TrATPase染色反应　抗酒石酸酸性三磷酸腺苷酶(TrATPase)与破骨细胞质子泵功能有关，是破骨细胞骨吸收微环境酸化，发挥骨吸收所必需的酶。应用镁激活铅染色法，以ATP二钠盐为底物，硫化铵为显色剂，形成PbS棕黑色颗粒阳性反应，分布在胞浆中

4)降钙素受体测定　破骨细胞及其前体含有丰富的降钙素受体，结合位点>106/细胞。降钙素受体只在定向破骨细胞前体及成熟破骨细胞中表达，因而是反映破骨细胞分化的特异性标志，并是与巨噬细胞多核体的鉴别指标。应用免疫细胞化学染色法，经ABC试剂反应和显色反应，呈橙黄色阳性反应，苏木精复染后核呈淡蓝色

5)骨片吸收陷窝观察　骨吸收陷窝形成是破骨细胞的特异性功能标志，应用薄牛骨片(10～50μm薄)培养破骨细胞，经3天培养，有活性的破骨细胞在骨片上形成明显的吸收陷窝，基底粗糙不平、边界清晰，呈圆形或不规则形

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:20

对了
以上照片都是400倍的

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作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:20

多谢斑竹关照

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作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:21

上面的是瑞氏染色的片子

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作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:21

贴壁后的照片

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作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:21

感觉瑞氏染色的效果不好
有会做的高手帮忙指教一下
多谢了

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作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:22

大家帮看看最上面的是刚从呱股骨和胫骨骨腔分离出来的细胞,血细胞比较多,后面几张是贴壁的,尤其是瑞氏染色的,能否看见多核状态?第一次做,实在迷茫,无从下手,请大家多多指点!感激不尽了!

作者: loli 时间: 2011-12-18 15:22

谈一下个人总结破骨细胞的内容，仅供楼主参考：

１　破骨细胞的发育来源
破骨细胞的发育来源较为明确，是造血干细胞分化为单核/巨噬细胞后在多种细胞因子（TNF-a、RANKL、RANK、OPG、M-CSF、PGE2等）的调控下分化为成熟的具有多个细胞核的巨细胞。

２　破骨细胞的鉴定
破骨细胞呈特异性的抗酒石酸的酸性磷酸酶染色阳性（TRAP+），F-actin染色阳性，表达降钙素受体、组蛋白酶K（cathepsin-k）、整合素αvβ3（integrinsαvβ3），内可以分解骨组织，体外培养可以在骨片、象牙或者人工骨组织培养板上可以形成吸收性陷窝。

３附上几篇关于破骨细胞鉴定的较为权威具体的文献

（１） Chambers, T. J. Regulation of the differentiation and function of osteoclasts. J. Pathol, 2000; 192: 4–13
（２） Boyle, W.J., Simonet, W.S. & Lacey, D.L. Osteoclast differentiation and activation. Nature, 2003; 423: 337–342
（３）Udagawa, N. Takahashi N, Akatsu T,et al. Origin of osteoclasts: mature monocytes and macrophages are capable of differentiating into osteoclasts under a suitable microenvironment prepared by bone marrow-derived stromal cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1990;87:7260–7264
（４） Lee SH, Rho J, Jeong D, et al. v-ATPase V0 subunit d2–deficient mice exhibit impaired osteoclast fusion and increased bone formation Nat Med. , 2006; 12:1403 - 1409
（５） Teitelbaum, S., L., and F. P. Ross. Genetic regulation of osteoclast developmentand function. Nat. Rev. Genet,2003;, 8: 638–649.
（６）Teitelbaum, S.L. Bone resorption by osteoclasts. Science,2000;289:1504–1508

４小鼠的破骨细胞TRAP+照片（×１００）

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作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:23

谢谢回复！我用400倍的染色后看细胞都没有你的大，是不是我分离的不对？
那经过造血干细胞分化为破骨细胞，需要培养多少天？需要加1.25-二羟基维生素D3吗？
我还想问问，依您的经验来看，我的是吗？

作者: loli 时间: 2011-12-18 15:23 标题: 回复 #11 fei1226com 的帖子

不知道你分离的是否是小鼠的破骨细胞，种属差异可能也是存在的。

个人诱导培养过破骨细胞，但是没有直接分离获得过破骨细胞，所以不敢妄下结论您获得的是否为破骨细胞。

具体的培养和鉴定方法在附上的文献内有详细的介绍。

好运！

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:24 标题: 回复 #12 loli 的帖子

谢谢你的回帖。我分离的是大鼠破骨细胞，大概有2-3月龄。其实应该用乳鼠的，但是我是新手，借着师哥分离心脏后的大鼠就继续做了，不知道这样差异会不会很大。具体文献也看过，国内外也没有破骨细胞的纯分离培养。只是在形态学方面想请教一下大家。

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:24

附上我的方法，请大家多多指点：
分离得到大鼠股骨，胫骨；刮净骨外膜及其他附着组织；于培养液中剪掉两端骨诟；用针头抽取培养液，然后冲洗骨腔；直至骨腔变白；将冲洗得到的悬液静置。吸取上层培养液于6孔培养板培养。24小时后吸取培养液以去除不贴壁悬浮细胞；更换培养液。3天后，吸取培养液80%继续培养。
2-3天时，细胞明显贴壁，且有长长的伪足出现。个别细胞还呈现空泡状，但在400倍倒置相差显微镜下看不到多核状。3天后，经瑞氏染色后，细胞多核状态不明显，上面有图。
我现在买不到薄牛骨片，无法进一步鉴定；各位大侠有相关经验，敬请赐教！

作者: loli 时间: 2011-12-18 15:25

"具体文献也看过，国内外也没有破骨细胞的纯分离培养。"

这方面的文献还是有的，包括中文的也有。

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:26

我还想问一下高手们，在冲洗骨髓腔的过程中，会不会有成纤维状的细胞？
如果培养基里面不加1，25-（OH）2维生素D3，破骨细胞是不是就分化的晚？如果染色主要见到的是单核，但有伪足的细胞，那是不是破骨细胞前体？敬请赐教

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:26

我感觉感觉骨髓腔内的应该不是成纤维细胞
造成其他原代贴壁细胞污染的主要应该是上皮细胞
再说骨腔内应该是没有啥成纤维组织的

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-18 15:27

前面3张好像焦距有问题......

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:28

附上最新破骨细胞多核形态瑞氏染色图片，请高手帮忙鉴定。

图片附件: 43526812.snap.jpg (2011-12-18 15:28, 43.39 KB) / 该附件被下载次数 2
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作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:28

关于TRAP染色鉴定，需要购买利副品红，AS-BI磷酸盐，请问哪里能购买到？普通试剂公司都没有这种药品。请大家帮忙！

作者: loli 时间: 2011-12-18 15:29 标题: 回复 #20 fei1226com 的帖子

SIGMA 有全套试剂盒卖，也可以分开买试剂盒内的单种试剂，全套试剂盒大约１４００元。

作者: sunnyB 时间: 2011-12-18 15:29

那个骨片实验应该是必须做的．否则没有说服力，那个东西肯定没卖的，我见过的都是自己制作的. 似乎要求做的非常薄.

作者: 831226 时间: 2011-12-18 15:29

不知道你用的是长骨分离的还是诱导法，从前几张来看好像是长骨分离法，但是后来你换液的时间，和培养液又是诱导法。请问你是用什么培养基？
我现在也是在分离破骨细胞，用的是机械长骨分离法，细胞出来了，但是我有时候我分辨不清有些是多核的破骨细胞，有些是多个单核细胞聚集在一块，可能是我的显微镜不太好吧。还有就是单核细胞比较多，正在想用什么办法过滤一下。你的第二张照片我也看到过，一堆单核细胞中，看到一个体积比较大的细胞，但是胞浆比较均匀，不像多核的样子，有谁能告诉这个是什么细胞？

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:30

我用的是长骨分离法，并没有经过诱导培养，培养基也只是DMEM培养基+ 双抗+15%小牛血清。单核细胞多的原因是，破骨细胞还没有完全分化，而且单核细胞也不会贴壁，一旦贴壁，伸出伪足才会显现破骨细胞特征。那个大的细胞我感觉不像是破骨细胞前体，具体什么我也不敢说。通常我经过3-6天培养后，进行染色，多核细胞显现比较明显。

作者: 831226 时间: 2011-12-18 15:30

这位群友，我对破骨细胞培养的方法理解和你有不同。长骨分离法取得的细胞就已经是成熟的破骨细胞了，从骨髓中取出的细胞悬液30分钟左右就需要换液一次，是那时候成熟的破骨细胞已经贴壁，通过差异贴壁的方法稍微纯化一下破骨细胞。这个时候如果不加入诱导因子，破骨细胞的前体细胞是不会向破骨细胞分化的。而且成熟的破骨细胞在体外的存活时间一般在3-6天。
其中理解可能有误，请指正。

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:31

谢谢指正！可是，我刚刚分离出来的细胞培养30分后没有破骨细胞的任何基本形态，而且染色后依然没有多核形态。而且我培养10天后仍然没有死亡。上面的染色图片就是我6-8天左右染色的结果。我是遵照一些博硕论文上面的方法操作的，基本上都没有用到维生素诱导。我想经过染色，看到的多核细胞（最后一张图片）应该就是破骨细胞。谢谢你提出的宝贵意见。期待与您继续探讨！

作者: toy 时间: 2011-12-18 15:32

应该不会是种属之间的差异，幼鼠的成熟的破骨细胞更加容易存活而已。我觉得机械分离法培养破骨细胞最重要的是提高成熟的破骨细胞的纯度，它不像诱导法那样可以得到大量的破骨细胞样细胞（osteoclast like cell)，有一篇文献的提高纯度的方法我觉得挺好的，正准备也用此法，你可以参考一下：“高纯度破骨细胞分离培养与功能表达”中国骨质疏松杂志　2001 年2 月第7 卷第1 期。你用此法试试呢？咱们交流交流。

作者: toy 时间: 2011-12-18 15:32

再请问这位群友，做骨吸收实验的时候，我想用象牙片，你知道怎么获得吗？谢谢。

作者: toy 时间: 2011-12-18 15:33

谢谢战友提供信息给我！我想用牛骨片，这东西没得买，只能自己做，要买新鲜的牛骨，-30度冻存后，用钢尺锯分割成200微米左右，然后用金刚砂石磨成10-50微米厚，冻存，使用前进行相应处理即可了。我觉得象牙骨片可能更不好买到吧，而且买到会新鲜吗？
我是学食品营养的，对破骨细胞要求可能没那么严格，只要有趋势就可以，我现在很想知道，我最后一张染色后图片，是否就是破骨细胞呢？请多多指教。

作者: bamboo16 时间: 2011-12-18 15:34

瑞氏染色我没有做过，不太了解。你的最后那张图片我觉得很像破骨细胞，多核，伪足都能看到。如果方便的话再做一下trap染色，骨吸收实验更好。

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:34

感谢群友指教！我昨天去书店看了一看，似乎书上写的方法中都会在培养基中加1，25-（OH）2D3诱导了，看样子我需要进一步改进了。还有，你能买得到萘酚AS-BI磷酸钠吗？还是直接使用的TRAP试剂盒呢？是不是医院都会有钢尺锯呢？

作者: bamboo16 时间: 2011-12-18 15:35

机械长骨分离法得到的成熟的破骨细胞是osteoclast,而通过各种生长因子直接或者间接得到巨噬细胞击落刺激因子或者rankle，从而诱导单核细胞融合形成的多核细胞称为osteoclalstlike cell,这两种细胞都可以对三种鉴定方法显示阳性结果。有师兄告诉我说osteoclastlike cell的某些蛋白质不表达，但是我没有看到相关文献，也没有特意去查找。不知大家对这个问题怎么看？
不好意思，我不知道萘酚AS-BI磷酸钠的用处，也没有购买了。trap染色我打算让别人做了，自己做一下骨吸收实验就好了，trap有专门的试剂盒，但是好像比较贵，可以自己配置，好像也不是特别复杂。
钢尺锯骨科应该有吧。

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:35

谢谢群友回复，我现在快被这个实验弄晕了，以前都没接触过，课题设计方面也有些困难。我还想检测m RANKL的表达呢，复杂吗？

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:35

是RANKL的mRNA表达，写错了。

作者: bamboo16 时间: 2011-12-18 15:36

不好意思，我对rankle了解不多，不能给你有益的建议。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:36

They are not typical osteoclasts.

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:37

真的吗？那是什么细胞呢？请您指点！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:37

我指的是你贴出来的图片．你的图片中的细胞是破骨细胞，但最好采用ＴＲＡＰ染色，颜色会非常漂亮．

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:38

感谢您的建议，我最近在购买AS-BI磷酸盐时遇到问题，买不到，可能要买试剂盒了，对了，您知道怎么卖吗？还有，我贴出来的图片是我早期作出来的破骨细胞，染色很不成功，但是确实是经过那样变成最后你看到的多核图片的。请继续指教！不胜感谢！我还有很多问题想问您！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:38

2007-01-10 21:54照的是两个大气泡, 2007-01-10 22:04和2007-01-10 22:07的大细胞不能肯定，2007-01-10 22:09和2007-01-10 22:17确实是破骨细胞，2007-01-10 22:11和2007-01-10 22:15看不清楚是什么细胞．建议采用自制ＴＲＡＰ染液染色，在一般光学显微镜下鉴定．如果有条件，可兼用ＤＡＰＩ对细胞核染色，用荧光显微镜检查．

如果从Sigma买试剂合，染出来的颜色就和东方朔（2007-01-11 17:12）贴上来的照片一样，极不好看．

另外，2007-01-16 16:48的照片染上色的细胞不一定是多核，但凭经验应该是破骨细胞．因为osteoclast precusors也表达mature osteoclast的一些specific markers, 比如TRAP.

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:39

那张片（最后一张）是已经养11天的了，我觉得应该不会是前体了吧，因为我染过3-5天的细胞，生长状况在倒置显微镜下观察和11天的形态基本相同，数量不多，但是染色效果就不出来1月16日那样。不知这么说有没有道理？我是学食品营养的，还请大俠多多指点。这是我第一个月首次作出来的细胞阿。

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:40

我想用自制的TRAP孵育液，可是买不到AS-BI磷酸盐。请指教

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:40

我还想问一下，我用的是1-2个月龄的WISTER大鼠，这样行不行？没经过诱导。附上我最后一次的染色图片。

图片附件: 46796089.snap.jpg (2011-12-18 15:40, 44.31 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10023

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:41

单核的破骨细胞都可以叫破骨细胞的前体细胞，而且前体细胞在体外培养时可以分裂，尤其是在有Ｍ－ＣＳＦ时．而且，在分裂以后的前体细胞还是前体细胞，在体外，没有sRANKL时，不会differentiation.

ＴＲＡＰ染色的原料从Sigma可以买到．

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:41

感谢指点！说说的我的个人想法，请指点。就图片分析来看，已经是多核细胞，应该就是分化后的破骨细胞，他的前体细胞，之所以称为前体，是因为他还不具备破骨细胞的特性，特征。而分化后，很少见具有前体细胞特征得细胞，那还可以说：在分化以后的前体细胞还是前体细胞吗？如果细胞不是多核的，那么看见图片的多核现象，又是为什么呢？
我是食品专业的，初次接触细胞方面，恳请多多指点！如果想法有偏差，也请及时帮忙纠正，谢谢了！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:41

Okey, here are the points: mature osteoclasts (OCs) are TRAP postive giant cells with multi-nucei. They share common origin with monocytes/macrophage lineage. In vivo, in bone microenvironment, or in vitro, under suitable conditions, OCs progenitors will be turned into osteoclasts. In the process of differentiation, people usually call monocleated TRAP positive cells as pre-osteoclasts, or osteoclasts precursors.

Hope this would be some help.

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:42

谢谢指点。可是按照英文所述，那么如何区别破骨前体细胞和破骨细胞呢？活性相同，都是多核的。我看过一篇Science Direct文献，上面说破骨细胞前体是单核的，只有和一些因子，诸如RANKL. 1,25-(OH)2D3等结合是才会分化为多核细胞。真有些搞不清楚了。
我想请问大俠，如果我想做MTT，那么用胰蛋白酶能消化下来吗？要不要细胞刮刀？浓度多少？多长时间？
细胞培养6-8天时，是破骨细胞呢？还是前体？
谢谢大俠一直帮助！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:42

In the first place, I would like to clarify that all the points I listed at 2007-02-06 13:15 are my opinions. Of course, some of fresh cells you isolated are mature osteoclasts, however, there must be many cells which are at pre-osteoclasts (mononuclear cells) stage, although they are TRAP positive too.

In the second place, from my point of view, you can employ both methods to isolate cells from the bones. But, if you isolate cells by using trypsin, the cells may need longer time to recovery.

In conclusion, the cells you harvested will not be pure mature osteoclasts.

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:43

那么如果获得的成熟破骨细胞不纯的话，对下一步试验，诸如MTT，骨片吸收，以及进一步检测RANKL的mRNA会不会影响呢？
我看到文献说，破骨细胞的寿命在10天左右，可是我的细胞能够存活15天左右，可能大概就是你所说的原因。那么如果我想做进一步的实验，我该培养多少天时采用呢？
还有请您指点有关MTT试验，用胰蛋白酶能消化下来吗？要不要细胞刮刀？浓度多少？多长时间？
感谢指点!期待您的回帖！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:43

To anwser your questions:

(1) I do not think RANKL mRNA is expressed in osteoclasts. Please double check. To my knowledge, RANKL is expressed in osteoblasts, activated T-cells and activated synovial fibroblasts. Osteoclasts only express RANK.

(2) I do not know how to anwer other of your questions because I do not know the aims of your study. But, you could use the cells once they attached.

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:44

谢谢！您说的（1）我有些不同的理解，RANK是破骨细胞的配基，当破骨细胞繁殖时，通过外界物质刺激，特异性的表达RANKL,而成骨细胞中的特异性表达因子是OPG，当OPG表达过多时，会对体系内破骨细胞的RANKL产生拮抗，从而抑制破骨细胞生长。
我对以上的理解来源于：
《Osteopontin as a positive regulator in the osteoclastogenesis of arthritis》
文献太大，没法给您传上去，方便的话可以给您发到邮箱里。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:44

首先，破骨细胞是终端细胞，根本不能分裂，就是你说的繁殖．请仔细订正．（前体例外）．

其次，破骨细胞不表达RANKL, 只表达RANK, 请再次订正．

最后，一种细胞会分泌许多细胞因子的，分泌osteoprotegerin (OPG)的osteoblasts也同理．（是之成也萧何败也萧何也）

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:45

As i mentioned above, osteoclasts are terminal cells which never proliferate, (except their precursors).

And, there is none RANKL expressed on osteoclasts, except its receptor, RANK.

Osteoblasts not only express RANKL, but also osteoprotegerin (OPG).

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:45

This is the abstract of that paper (I have the full text of this paper too):
"We examined the role of osteopontin (OPN) in the osteoclastogenesis of arthritis using collagen-induced arthritis (CIA). Cells
from arthritic joints of wild-type (OPN +/+) mice spontaneously developed bone-resorbing osteoclast-like cells (OCLs). The cultured
cells showed an enhanced expression of receptor activator of nuclear factor jB ligand (RANKL) and a decreased expression of
osteoprotegerin (OPG). The addition of OPG reduced the number of OCLs, indicating that the osteoclastogenesis depends on the
RANK/RANKL/OPG system. The cells also produced OPN abundantly and anti-OPN neutralizing antibodies suppressed the
development of OCLs. Moreover, the addition of OPN increased the expression of RANKL and augmented differentiation of OCLs
from OPN-deficient (OPN )/)) cells. OPN, like the combination of 1a,25-dihydroxyvitamin D3 and dexamethasone, also enhanced
the RANKL expression and decreased OPG expression in a stromal cell line, ST2. These results suggest that OPN acts as a positive
regulator in the osteoclastogenesis of arthritis through the RANK/RANKL/OPG system.
2004 Elsevier Inc. All rights reserved."

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:46

如果你详细看看上边摘要，就知道在这句话中：＂The cultured
cells showed an enhanced expression of receptor activator of nuclear factor jB ligand (RANKL) and a decreased expression of
osteoprotegerin (OPG).＂，"the cultured cells" 没有说是破骨细胞．

如果你再去读该文章的813页，你就彻底明白了：OPN enhances the RANKL expression and suppresses the OPG expression on stromal cells:
Because the harvested cells from joints were a heterogeneous
mixture of cells derived from multiple sources,
such as stromal cells, osteoclast precursors, and lymphocytes,
etc., there are limitations in evaluating mRNA
expression. To clarify the effect of OPN on the expression
of RANKL and OPG, we used a murine stromal
cell line, ST2. As positive control, we used 1,25(OH)2D3
and Dex, which are well-known agents that induce
stromal cells to express RANKL and reduce their expression
of OPG [3,4,8,12,19]. While the combination of.....

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 15:46

看样子，我还需要进一步研读一下文章，感谢您提出的建议。
我还想请问有关MTT试验，用胰蛋白酶能将贴壁的破骨细胞消化下来吗？浓度多少？多长时间？要不要细胞刮刀？

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 15:47

这里有人用 raw cell + rankl + M-csf 诱导法 make 破骨细胞么？
你们的两个细胞因子的浓度如何？
要几天才能长出来？

再问氧过破骨细胞的前辈们，最后的破骨细胞的比率有多大？那些破骨细胞大多是几个核的？？
万分感谢！！！！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:47 标题: 回复 #58 ladyhuahua 的帖子

RAW264.7 cells were first used by Hsu et al to generate osteoclasts in vitro (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3540–3545, March 1999), and this method is widly used. By using this approach, I myself can produce osteoclasts with more than a hundred nuclei. I remind of you that, do not like primary cells, you do not need to use M-CSF in this model. sRANKL alone is enough.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 15:47

前辈，
真的难以想象还能形成多于100核的 osteoclast. 那么你开始时候的细胞密度是多少的时候加的cytokine? 1*10^6/well?
再次感谢

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 15:48

不好意思再问一句
几天能形成osteoclast阿？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:49 标题: 回复 #61 ladyhuahua 的帖子

2-10 million cells/60-mm petri-dish. 60-200 ng/ml sRANKL.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:50 标题: 回复 #61 ladyhuahua 的帖子

Osteoclasts appeared from day 3 on.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 15:50

前辈
再问个关于TRAP Assay的问题
我用的是 sigma的kit. 最后一步要用hematoxylin
复染色。我感觉好像效果反而不好，不知道你认为如何？
好像hematoxylin会将细胞浆染成粉色，所以TRAP反而不清晰

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 15:50

前辈
你用60-mm petri-dish.的阿，那么每次要用很多RANKL的阿，这个好贵啊。
你每一个well里面有多少ml呢？
谢谢

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:51 标题: 回复 #65 ladyhuahua 的帖子

The purpose of countstain the cells with Hematoxylin is to see nuclei. Nuclei are blue labelled by Hematoxylin, not the color what you mentioned. Your are right, countstaining is not necessary for there is no problem to see nuclei without this step.

What is the cat# of Sigma kit you are using? I used to use 386/7-A but I do not like it.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:51 标题: 回复 #65 ladyhuahua 的帖子

I made sRANKL by myself so does not matter how big the cell culture vehicle used. However,if you purchase RANKL you should use 8-well chambered slides, of course depends on what is the purpose of your experiments. For instance, if you want to extract RNA from the cells, you have to use dishes otherwise you would not have enough products. If you want to see osteoclasteogenesis, I think either 8-well chambered slides or 48-well plate will do.

For 60-mm Petri-dishes, 4 ml medium/dish.

I know commercial RANKL is very expensive, around 180USD/10ug.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:52

The purpose of countstain the cells with Hematoxylin is to see nuclei. Nuclei are blue labelled by Hematoxylin, not the color what you mentioned. You are right, countstaining is not necessary.

What is the cat# of Sigma kit you are using? I used to use 386/7-A but I do not like it.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 15:52

前辈
如果不用hematoxylin复染的话，是不是就是在37度孵育1个小时后将溶液倒出，在空气中干燥后显微镜下观察？
我现在想不起来cat No.了，得去实验室查一下

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 15:53

前辈
你真的好厉害自己做sRANKL, 你是自己PCR 然后E.Coli表达纯化么？
我试验目的是see osteoclasteogenesis，所以我现在在用12 well plate, each well 1.5 ml, 但是也保不准以后要提取RNA, 昂贵的RANKL的确是个问题。

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 15:53

前辈
再问一个问题
在每一个well里面，好像如果培养液越少，也就是每一个well里面培养液高度越小，细胞反而长得更快。所以在设计每个well的液面高度时候又没有什么讲究呢，还是每一种细胞都不一样？我想，可能是液面越低，越容易氧气渗透。
非常感谢

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:54 标题: 回复 #69 ladyhuahua 的帖子

10-15 min maximum will do, at 37oC. But not Sigma kit. Sigma kit is an hour.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:54 标题: 回复 #70 ladyhuahua 的帖子

Yes i do.~~~~~~~~~~·

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 15:55 标题: 回复 #71 ladyhuahua 的帖子

(1) when you plate RAW264.7 cells, you add sRANKL. (same time).
(2) cells will stop to proliferate when sRANKL is added, so your problem is not a problem.
(3) the reason you have this problem (cells still dividing when RANKL added) is: your raw264.7 cells are too old (i mean the generation).

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 15:55

前辈
还有个问题，如果每个well, 2-10*10^6 cell, 那就差不多每天都要换培养液了，RANKL的消耗很大啊

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 15:55

前辈
非常感谢阿，bow~~~
cell still dividing when RANKL add,除了the cell generation is too old(我用的是15代,应该多少代之前比较好呢？) 是否还有因为我加了M-CSF? 这个cytokine可以让osteoclast precursor分裂。

谢谢！！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:25 标题: 回复 #75 ladyhuahua 的帖子

2-10 million cells per 60-mm Petri-dish. If you use small wells in a plate, certainly cell number has to be reduced.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:25 标题: 回复 #76 ladyhuahua 的帖子

There is no any difference with/without M-CSF, but M-CSF is not necessary.

Passage <20 should be ok for osteoclasteogenesis.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:25

前辈
我的sigma的TRAP assay kit的 catalog No. 387A-1kT.
孵育一个小时以后，再复染。而且他还要做一个没有tartrate 的对照，不知道是不是也用不着。
如果不想复染，是不是就是避光孵育1个小时以后，自来水冲洗，空气风干就可以显微镜下观察了呢？

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:26

前辈
你是说generation>20就最好不要用了么？
rawcell 长得太快了。
谢谢！！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:27 标题: 回复 #79 ladyhuahua 的帖子

I do not like that kit for cells labelled as brown but not dark red (more pretty).

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:27

前辈
你是说generation>20就最好不要用了么？
rawcell 长得太快了。
谢谢！！

=======================

freeze some younger cells.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:28

前辈
你是说 TRAP+ 不会显示深红而是棕色？

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:28 标题: 回复 #83 园丁## 的帖子

another way around.

作者: fsdd817 时间: 2011-12-18 16:29

可是去哪里找到钢锯和磨石呢？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:30 标题: 回复 #85 fsdd817 的帖子

you can not use 钢锯和磨石 at all. I will tell you the brand of the instrument later.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:30

盼望中。。。

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Diamond band saw (Well™, model 3241); and different grade of sandpapers.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:31

前辈
你一般培养osteoclast多少天呢，如果第三天开始形成的话？
谢谢！！

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:32

好像如果培养太久了，细胞就会大片的脱落。
是不是一直等到培养液变黄才换呢？（同时也换cytokine）
谢谢！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:35 标题: 回复 #88 ladyhuahua 的帖子

一般情况下，４－６天形成的成熟破骨细胞就可以用来做实验．当然，要看你的实验目的，如果你要研究细胞的早期分化，刺激一两天甚至１０几分钟几个小时就够了．

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:36 标题: 回复 #89 ladyhuahua 的帖子

细胞大片脱落证明RANKL抑制了细胞的分裂，是正常的．但换培养液（含RANKL）的时间一般是隔一天一次，不是等到培养液变黄才换，那样就太迟了，RAW细胞本身性命都不保了，还如何分化呢？

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:36

谢谢前辈
那么如何防止细胞的大片脱落呢？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:37 标题: 回复 #92 ladyhuahua 的帖子

脱落是正常现象，证明你的ＲＡＮＫＬ有作用．

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:37

前辈
我上次养osteoclast，细胞的大片脱落是发生在9天后，所以我想尽量缩短在9天以内完成osteoclast的培养。

上次在100ng/ml RANKL 16ng/mlMCSF 条件下是有好多多核细胞但是>3的不多.

作者: jujuba 时间: 2011-12-18 16:38

Diamond band saw (Well™, model 3241); and different grade of sandpapers.

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请问是哪家公司的产品，能够告诉一下他们的联系方式吗？谢谢您了。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:38

请问是哪家公司的产品，能够告诉一下他们的联系方式吗？谢谢您了。

======

Well™~~~~~~~~~~~~·

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:39

前辈
我上次养osteoclast，细胞的大片脱落是发生在9天后，所以我想尽量缩短在9天以内完成osteoclast的培养。

上次在100ng/ml RANKL 16ng/mlMCSF 条件下是有好多多核细胞但是>3的不多.

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if cells partially dying from D2, it is a good phenomenon (RANKL effectively). your cells dying of overgrew (D9), no good.

check either your cells or the qulity of your RANKL. (I guess something wrong in your cells)

作者: jujuba 时间: 2011-12-18 16:39

Well™

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您知道是哪家公司代理吗？联系方式方便提供吗？谢谢。

作者: jujuba 时间: 2011-12-18 16:40

您知道是哪家公司代理吗？联系方式方便提供吗？谢谢。

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I wish i know but i do not.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:40

这次我用12well plate, 10^6cell/well, from D2,0.5ml培养液的那个well,有好多细胞dying, 我不知道还要不要继续这个well.

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if cells partially dying from D2, it is a good phenomenon (RANKL effectively). your cells dying of overgrew (D9), no good.

check either your cells or the qulity of your RANKL. (I guess something wrong in your cells)

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:41

但是 0.75ml 的well, 细胞数一样，RANKL量一样，就没有问题，不知道怎么回事

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:41

但是 0.75ml 的well, 细胞数一样，RANKL量一样，就没有问题，不知道怎么回事

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你指的0.75ml 的well（的plate）是多少well的，是和什么plate(or chambered slides)相比的？你说没有问题，可能是误判．不知道你发现没有，RAW264.7细胞本身（不加ＲＡＮＫＬ）就有一些多核细胞，你说加RANKL最多只能诱导出３个核的破骨细胞，显然不是成功的．

对不起，我提了许多意见，但愿对你有所帮助．

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:42

plate是 12well plate, 我就是在这个plate里面，同时做了control (treat nothing),都是10^6cell/well, 但是分成0.75ml 0.5ml 两个情况，对于每个情况分别treated with 100ng/150ng/ml, 但是三天后都没有明显的fusion. 并且在0.5ml的well里面分别有一个加了cytokine的和没有加 cytokine的well里面大量细胞在第二天死掉。

还有我用的是humanRANKL, is that ok? I saw some paper they use hRANKL.

非常感谢前辈，对我很有帮助！！！
BOW~~~~~

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:42 标题: 回复 #103 ladyhuahua 的帖子

too many cells/well but medium (nutrition) was not enough.

I guess human's works on mouse cells too.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:43

那我现在换成12 well plate, 10^5cell/well, 您看怎么样？
100ng or 150ng/ml RANKL

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:43

那我现在换成12 well plate, 10^5cell/well, 您看怎么样？
100ng or 150ng/ml RANKL

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We have used cells from different sources as osteoclast precursors.

When we used RAW cells, we never count the number of cells. of course you can count. this is the tricky: cells should initially cover the bottom of the well, let's say, 80-90% confluent, does not matter what kind of plate used.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:44

前辈
你是说不管放入多少细胞，都会是80-90%附着在盘底么？不太明白confluent在这里的意思。谢谢！！！

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:44

前辈
你说12 well plate ,in each well, how many volum is the better?

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:45

前辈
你是说不管放入多少细胞，都会是80-90%附着在盘底么？不太明白confluent在这里的意思。谢谢！！！

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细胞数目太多不好（太多培养液会变黄），太少也不好（太少细胞之间没有接触，因为ＲＡＷ细胞缺乏移动性）。你把细胞植入well后，静置片刻（５－１０分钟），然后在倒置显微镜下看看，细胞和细胞之间有一两个细胞的距离，就是80-90%附着在盘底，这样的细胞量正好。

记住你植入了多少细胞悬液，算算其中有多少细胞。下次就知道要放多少细胞了。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:45

前辈
你说12 well plate ,in each well, how many volum is the better?

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能加多少加多少，越多越好。只要实验组和对照组一样，就可以了。但为了节省你的RANKL, 就要酌情了。另外不能太满，碰到盖子就不好了。(2/3 of the well is the best).

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:45

现在老板让我鉴定osteoclast的特征性，让我检测rank的表达，所以我现在不知道培养多少细胞才够harvest cell, 能够做western blot ?
你知道哪里的rank抗体比较好么？
谢谢！！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:46 标题: 回复 #111 ladyhuahua 的帖子

rank怎么可以作为osteoclast的标记呢? 它在单核细胞中也表达的.

如果要做rank的Western blot, 用R&D的streptavidin-anti mRANK为好.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:46

这里的单核细胞是指 osteoclast precursor么？

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:47

那么多少细胞量才够作一次western blot的呢？

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:47

前辈， osteoclast 的 phenotype是什么呢

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:48

这里的单核细胞是指 osteoclast precursor么？

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monocytes/macrophages, like RAW264.7 cell line. Or primary monocytes/macrophages from animals. Yes, they are osteoclast precursor cells.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:48

那么多少细胞量才够作一次western blot的呢？

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20 ug protein/SDS-gel loading well.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:49

前辈， osteoclast 的 phenotype是什么呢

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many, but not rank. please read literatures.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:49

I did trap assay for several times, but I could not get the similar result as the pictures posted here. I use the kit bought from Sigma. After the stain, the background is always too strong, too colorful. It likes this, I do not whether the red grains in the cells are the TRAP+ sign.

图片附件: 40325993.snap.jpg (2011-12-18 16:49, 47.25 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10024

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:50

go on....
thank you if any of you can give your opinion

图片附件: 68805870.snap.jpg (2011-12-18 16:50, 43.23 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10025

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:50

go on....

图片附件: 55132809.snap.jpg (2011-12-18 16:50, 43.21 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10026

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:51

go on

图片附件: 50131196.snap.jpg (2011-12-18 16:51, 41.44 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10027

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:52

Personally, I do not think any of the cells you posted here are osteoclasts (or
osteoclast-like-cells). Some are multinucleated cells but they are macrophage
polykaryons.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:52

but the treated cell form much more mutinuclear cells than the control.
so is this kit should show so strong background?

do you mean the osteoclast should show the whole cell is red?

thank you so much

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 16:53

我最近分离的破骨细胞，用1，25D3诱导了，发现的确破骨细胞数目增多了，但是不知道为什么，就是没有上学期未经诱导培养的好。请指教！
还有昨天做了trap染色，孵育一个小时后，染色液出现了沉淀，用pbs洗后仍然效果不好，可能是杂质太多，看不清楚，看不到细胞核，而且细胞是黄色的，不是红色的，为什么呢？

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:53

请问楼上的，你做的trap染色，背景是像我这个颜色这么重么（照片就在上面）有蓝色有红色?
是不是trap+ 结果应该是整个细胞都是红色呢? 还是说有红色的颗粒

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:54

I will show you how the cells look like, with/without TRAP staining.

A paper written by me was submitted to a high score journal last month, hopefully it
will be accepted soon.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:54

thank you so much!!!

i think it will be published!!! waiting for your good news!

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 16:56

我做的很不好，第一次做，不是试剂盒，使自己配的，好像过滤不好，看到的都是染液的沉淀，但是能看到细胞被染成黄色或是橘色，看不到细胞核。
但是根据文献上说的应该是红色的，而且细胞核应该是酒红色的。
有什么好的经验，交流交流吧！
大家多多赐教

作者: 中国特色 时间: 2011-12-18 16:57

你的求助都已经发到我的帖子里了强啊如果没猜错teng110cn 是TG吧？我是ZHB

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 16:57

我做的很不好，第一次做，不是试剂盒，使自己配的，好像过滤不好，看到的都是染液的沉淀，但是能看到细胞被染成黄色或是橘色，看不到细胞核。
但是根据文献上说的应该是红色的，而且细胞核应该是酒红色的。
有什么好的经验，交流交流吧！
大家多多赐教

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It is not a bad idea to use self-prepared solution for TRAP staining.

Nuclei always negatively stained (no color), as you know TRAP is a cell membrane
protein (enzyme). Cells elsewhere should be deep red labeled.

Of course nuclei can be counter-stained with hematoxylin et al. after TRAP staining.

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 16:58

谢谢指点。
我需要在染色过程中注意什么呢？为什么我染色的细胞是黄色或橘色呢？

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 16:59

当我在不作最后一步counter stain时，和xiaohui一样：染色的细胞是黄色或橘色。
前辈你说：Nuclei always negatively stained (no color), as you know TRAP is a cell membrane
protein (enzyme). Cells elsewhere should be deep red labeled.
为什么是 cells elsewhere 是红色呢？难道不是有trap的地方是红色的么？也就是在细胞的轮廓上出现红色。
谢谢指教

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:01 标题: 回复 #133 ladyhuahua 的帖子

what i was trying to say is that cells are deep-red labeled except nuclei.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:01

前辈
请问你用的media是怎样的呢？我用的是10%FBS, 不知道是不是FBS 太多了，所以RAWcell长的太快了。

如果真的是细胞有问题的话，可能会是什么问题呢？

万分感谢

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:02

还有像fei1226com那样染色的细胞是黄色或橘色, 是不是就说明即使有multinucleated cell 也是macrophage?
谢谢！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:03 标题: 回复 #136 ladyhuahua 的帖子

All right, to be honest, cells from you are pre-osteoclasts, they are on the way of
differentiation process, but stopped at a certain stage for some reason (RANKL/Overgrow/aged/...). I am saying this is because that
your cells were TRAP labeled (although not as pretty as they should be), but not big enough.

I am using Gibco's FBS, 10% in DMEM plus antibiotics. But other midum should work.

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 17:04

请问counter-stained with hematoxylin et al. after TRAP staining.这是什么意思呢？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:04 标题: 回复 #138 fei1226com 的帖子

Hematoxylin labeles nuclei of any type of cells (not osteoclast-specific), to see how many nuclei a cell has. Personally I do use it when I (TRAP) label bone sections, but have never used it for in vitro generated osteoclasts/osteoclast-like-cells, because you can see neclei cleanly without H staining.

I read your previous posters. It seems that your multinucleated cells (fresh isolated/cultured for <10 days) were osteoclasts. Because when I did bone section (TRAP) staining, I can find only osteoclasts with multinuclei.

Your problem is TRAP staining, the color is not as good as it should be. H staining probabily not needed as well for newly isolated cells.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:05

前辈
如果不counter stain的话，整个细胞都是黄色或者是橙色很难看到细胞核阿
请问在你的情况下，在counter stain之前背景是什么颜色的呢？
谢谢

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:05 标题: 回复 #140 ladyhuahua 的帖子

deep-red. (nuclei no color).

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:06

哇深红色简直不敢相信
哪天我才能得到这样的结果啊
盼望早日看到你的样片
谢谢

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 17:06

前辈
你是说在TRAP染色后用苏木精复染吗？
luckaan你是怎么做的呢？
我都快急死了，请赐教！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:07 标题: 回复 #142 ladyhuahua 的帖子

I will post my pictures as soon as my paper is accepted.

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 17:08

前辈
你是说在TRAP染色后用苏木精复染吗？
你是怎么做的呢？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:09 标题: 回复 #145 fei1226com 的帖子

See my poster of 2007-05-04 22:37's.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:09

我都试过，如果不用苏木经复染，整个细胞都是黄色
如果复染之后色彩就变得很鲜艳，我曾贴过一些照片你可以看看

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前辈
你是说在TRAP染色后用苏木精复染吗？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:10

我都试过，如果不用苏木经复染，整个细胞都是黄色
如果复染之后色彩就变得很鲜艳，我曾贴过一些照片你可以看看

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Beware of Hematoxylin, which is not osteoclast specific. For instance, if you have a fluorescent microscope, instead of Hematoxylin, DAPI (or other fluorescent dyes) could be used for counter-staining.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:11

i know that, but without hematoxylin, all are yellow
i could not identify anything, even the boundary of cells.
so i think hematoxylin is necessary.

===========================================

Beware of Hematoxylin, which is not osteoclast specific.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:11

我不知道染色哪里有错误, 得到的照片看上去颜色都太重了
即便有TRAP+的颜色，在这种情况下也看不出来啦？？！！
请指教！
谢谢！

图片附件: 42884347.snap.jpg (2011-12-18 17:11, 37.49 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10028

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:11

再一张：

图片附件: 86575780.snap.jpg (2011-12-18 17:11, 66.29 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10029

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:12

再来一张

图片附件: 52753471.snap.jpg (2011-12-18 17:12, 49.12 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10030

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:12

最后一张：

图片附件: 96695642.snap.jpg (2011-12-18 17:12, 45.46 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10031

作者: toy 时间: 2011-12-18 17:13

颜色太重的问题真的不知道怎么解决

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-18 17:14

谢谢指点！但是我现在染色出来的效果不是红色的，那样是不是就不能直观而有说服力的说明我的细胞就是破骨细胞了？
你的细胞是诱导法吗？一次用了多少只老鼠阿？
另外，我想问问，破骨细胞可以做MTT吗？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:14

颜色太重的问题真的不知道怎么解决

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You have two problems:
(1) Your RAW264.7 cells are too old. Because the cells should be round shaped, even upon RANKL stimulation.

I do not see any (mature) osteoclasts on your photos.

(2) TRAP staining. RAW264.7 should be TRAP stained (deep-red) on second day of RANKL stimulation. I think your cells were TRAP stained, (although the color was not perect), it means cells were in the earlier stage of OC differentiation.

You could try to lable original (no RANKL addition) RAW264.7 cells by same method, if they are negatively stained, means your TRAP staining method is some kind of OK. (enen not idealy).

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:15

谢谢指点！但是我现在染色出来的效果不是红色的，那样是不是就不能直观而有说服力的说明我的细胞就是破骨细胞了？
你的细胞是诱导法吗？一次用了多少只老鼠阿？
另外，我想问问，破骨细胞可以做MTT吗？

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FYI (for your information): click "引用" if you want to discuss with anyone.

Luckann is using RAW264.7 cells, which is a murine monocyte/macrophage cell line.

For primary bone marrow culture, 1 million total bone marrow cells/well in 8-well chambered slide should do.

Sigma kit always lable OC as yellow, which I do not like.

作者: caihong 时间: 2011-12-18 17:15

前辈，你说Your RAW264.7 cells are too old.是说这批细胞诱导了太久才trap stain还是说这些细胞在seeding的时候就已经太老了呢？
谢谢！

作者: caihong 时间: 2011-12-18 17:16

这个是我control的照片，养了8天没有加任何细胞因子：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10032

作者: caihong 时间: 2011-12-18 17:16

control:

图片附件: 72425302.jpg (2011-12-18 17:16, 81.12 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10033

作者: caihong 时间: 2011-12-18 17:17

control

图片附件: 97917722.snap.jpg (2011-12-18 17:17, 53.22 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10034

作者: caihong 时间: 2011-12-18 17:17

control

图片附件: 93421383.snap.jpg (2011-12-18 17:17, 56.94 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10035

作者: caihong 时间: 2011-12-18 17:18

control:

图片附件: 76041203.jpg (2011-12-18 17:18, 74.03 KB) / 该附件被下载次数 130
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10036

作者: caihong 时间: 2011-12-18 17:18

这些control的照片看上去和treated cell没有什么区别，真郁闷

作者: 黄花菜 时间: 2011-12-18 17:19

建议看上海放射医学研究所，王洪复教授《骨细胞图谱〉

作者: caihong 时间: 2011-12-18 17:19

现在手头没有怎么办呢~~~~~~~~~~~~~

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:20

这些都是control的照片，请前辈指教了！！
谢谢
bow~~~

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So you have two problems as I indicated at 2007-05-08 23:06.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:20

I have never read that book, but am able to generate osteoclasts from bone marrow cells, splenocytes, peritoneal macrophages, and RAW264.7 cells, by using our sRANKL and Sigma M-CSF.

OCs we generated are TRAP and cathepsin K (IHC staining) positive, with actin-ring around ruffered-border. They are able to resorb bone.

We have also done histology of bone sections. OCs can be seen very clearly in vivo.

More exciting data are coming soon.

作者: 泡泡 时间: 2011-12-18 17:21

前辈
那么比较control (培养8天什么都没加) 来看，treated cell还是不是 trap stain呢？

前辈，你说Your RAW264.7 cells are too old.是说这批细胞诱导了太久才trap stain还是说这些细胞在seeding的时候就已经太老了呢？
谢谢！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:21 标题: 回复 #169 泡泡的帖子

No.

在seeding的时候就已经太老了/or RANKL did not work.

I am reading a book "Bone Resorption" edited by Felix Bronner, Mary C. Farach-Carson and Janet Rubin in 2005, which is really good. I recommend you to read it.

作者: 阿敏 时间: 2011-12-18 17:22

我又从R&D 购买了一些rmRANKL，不知道功效可靠不可靠？

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 17:23

太宝贵了！
但是我所用的是原代诱导培养，没有试过用购买的细胞系诱导。如果用购买的细胞系是不是效果要更好呢？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:23 标题: 回复 #172 fei1226com 的帖子

Depend on your objectives. I could produce osteoclasts from both primary cells and cell lines, with more than 150 nuclei/OC.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:23

i am a bit sad today because my paper submitted to BLOOD was rejected.

作者: 小螺号 时间: 2011-12-18 17:24 标题: 回复 #174 园丁## 的帖子

前辈
不要气馁阿，可能是口味不合编辑，也许你投比blood更好的杂志反倒被接受了呢！！
前辈加油！

作者: 小螺号 时间: 2011-12-18 17:26

从paper上看有的人也用sigma的TRAP kit,但是固定要30分钟，但是说明书上写的是30秒。不知道到底是多长时间？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:26 标题: 回复 #176 小螺号的帖子

4% Paraformaldehyde 15-30 min; Fixation solution as showing in sigma kit, 30 sec.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:27

前辈
我有个问题关于trap assay
是不是在酒石酸盐存在条件下，其他也能使染料变成红色的酶就失活了。只有trap才显色?
谢谢！！

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:28

前辈
我现在把rankl , raw cell都换了。不过也很紧张如果再不成我真得不知道该怎么办了。。。
我打算用48 well plate, 1ml/well, 10^5cell/ well, 100ng/ml rankl, 50ng/ml M-CSF.
您看怎么样？
万分感谢！！！bow~~~

也祝福前辈一切顺利！！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:28

前辈
我有个问题关于trap assay
是不是在存在条件下，其他也能使染料变成红色的酶就失活了。只有trap才显色?
谢谢！！

====================

TRAP能抗酒石酸盐的抑制。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:29

前辈
我现在把rankl , raw cell都换了。不过也很紧张如果再不成我真得不知道该怎么办了。。。
我打算用48 well plate, 1ml/well, 10^5cell/ well, 100ng/ml rankl, 50ng/ml M-CSF.
您看怎么样？
万分感谢！！！bow~~~

也祝福前辈一切顺利！！

===============================================================================================================

换rankl和raw cell是好主意。用48－well plate也可以，但10^5cell/ well太多了，因为raw cell长得很快。你试验用２.5x10^4-5x10^4cell/well比较合适。RANKL用６0-200ng/ml没有问题，Ｍ－ＣＳＦ没有必要用。

谢谢祝福。同样祝福你。

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 17:29

前辈，我想问您，破骨细胞能消化下来吗？
培养用液M199和α-MEM那个更好点呢？
我现在做的很不好，初次做细胞遇到好多棘手问题望您多多指教！

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:30

前辈，我想问您，破骨细胞能消化下来吗？
培养用液M199和α-MEM那个更好点呢？
我现在做的很不好，初次做细胞遇到好多棘手问题望您多多指教！

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小鼠的骨髓单核细胞培养，一般用RPMI 1640 containing 10% newborn calf serum (NCS), 1× antibiotics and 50 mM β-mercaptoethanol)。如果没有RPMI 1640，α-MEM也可以，没有关系。而且β-mercaptoethanol也不是必要的。我两种培养液都试过，没有区别。（重要的是M-CSF添加，如果不加，单核细胞培养超不过一个月）。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:30

Osteoclasts derived from RAW264.7 cells. (Herman6292003, 2005, unpublished data).

作者: hold住 时间: 2011-12-18 17:31

前辈：
现在trap assay 真得快要把我搞糊涂了。我今天又作了一次，counter stain以后，整个细胞都好像是蓝色的了。胞浆肯定是染蓝了。而且颜色好重呀。
你做trap assay ，conter stain 以后就只是核是蓝色的么？
谢谢！！！
再次祝福前辈一切顺利！！！

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 17:31

前辈，谢谢您！
您说的M-CSF是诱导剂吗？我现在用的是罗钙全软胶囊诱导的。
那破骨细胞能否消化下来进行流式细胞仪检测呢？请您指点

作者: mickeylin 时间: 2011-12-18 17:32

前辈
那么每一个well里面放多少ml 的培养液呢？

==============================================================================================================

换rankl和raw cell是好主意。用48－well plate也可以，但10^5cell/ well太多了，因为raw cell长得很快。你试验用２.5x10^4-5x10x10^4cell/well比较合适。RANKL用６0-200ng/ml没有问题，Ｍ－ＣＳＦ没有必要用。

谢谢祝福。同样祝福你。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:34

前辈：
现在trap assay 真得快要把我搞糊涂了。我今天又作了一次，counter stain以后，整个细胞都好像是蓝色的了。胞浆肯定是染蓝了。而且颜色好重呀。
你做trap assay ，conter stain 以后就只是核是蓝色的么？
谢谢！！！
再次祝福前辈一切顺利！！！

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Yes, because H is a nuclus specific dye.

Do not work too hard on weekends.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:34

前辈，谢谢您！
您说的M-CSF是诱导剂吗？我现在用的是罗钙全软胶囊诱导的。
那破骨细胞能否消化下来进行流式细胞仪检测呢？请您指点

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In cell co-culture system (stromal cells/osteoblasts + monocytes), M-CSF is not necessary.
Otherwise (isolated primary monocytes alone), M-CSF/or M-CSF conditional medium (from L929 cell cuture) is mandatory.

OCs are very fragile, detachment is not recommended.

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:35

前辈
那么每一个well里面放多少ml 的培养液呢？

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1 ml/well for 48-well plate, change with fresh 0.9 ml medium (with RANKL) every other day.

作者: yes4 时间: 2011-12-18 17:35

感谢前辈，您这里说的每隔一天换0.9，而不是1ml 是不是有什么trick在这里？

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-18 17:36

关于TRAP染色鉴定，需要购买利副品红，AS-BI磷酸盐，请问哪里能购买到？普通试剂公司都没有这种药品。请大家帮忙！

SIGMA 有全套试剂盒卖，也可以分开买试剂盒内的单种试剂，全套试剂盒大约１４００元。

国产的也有试剂盒,价格150元左右.
另:牛骨片应该没有卖的,可以取牛骨用硬组织切片机自己切片,冷冻保存就可以了

祝你顺利

作者: fei1226com 时间: 2011-12-18 17:37

我想请问前辈
做破骨细胞凋亡实验,除了丫啶橙染色还可以用什么方法? 能做琼脂糖凝胶电泳吗?

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:38

关于TRAP染色鉴定，需要购买利副品红，AS-BI磷酸盐，请问哪里能购买到？普通试剂公司都没有这种药品。请大家帮忙！

SIGMA 有全套试剂盒卖，也可以分开买试剂盒内的单种试剂，全套试剂盒大约１４００元。

国产的也有试剂盒,价格150元左右.
另:牛骨片应该没有卖的,可以取牛骨用硬组织切片机自己切片,冷冻保存就可以了

祝你顺利

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Comments:

1) I do not have any experience of domestic kit, however, Sigma one is definitely not recommended;

2) Bovine bones are not the only source of bone sections, whale tusks work well in my lab;

3) There is no sense to keep bone sections refridged. Instead, they could be kept in 70% ethanol.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:38

前辈
我有个问题关于保存RANKL的。我原来是配0.1ug/ml, 每10ul一管保存的。但是每次用时吸取的量太少，所以我现在配制了一些media含200ng/ml RANKL.用的时候直接加。保存在4度冰箱。不知道哪个好？
谢谢前辈

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:38

前辈
我想到一个问题 rawcell很容易变成巨噬细胞。那怎么防止这个发生呢
我传代的方法是用机械法将细胞刮下来。不知道好不好？
谢谢

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:40

前辈
我有个问题关于保存RANKL的。我原来是配0.1ug/ml, 每10ul一管保存的。但是每次用时吸取的量太少，所以我现在配制了一些media含200ng/ml RANKL.用的时候直接加。保存在4度冰箱。不知道哪个好？
谢谢前辈

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Generally, after reconstitution, protein can be stored at 2-8oC for a maximum of one month. (Your case II).

For extended storage, freeze in working aliquotes at -70oC (or -20oC) for a maximum of one year. (Could be longer). Repeated freezing and thawing is not recommended. (Your case I).

Usually I dilute my proteins with 0.2 um-filtered solution of PBS containing 0.015% BSA (as carrier protein) into reasonable concentration, aliquote, and keep them in -80oC. The RANKL I purified 3 years ago still works well now.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:41

bow to Herman6292003~~~~

作者: 园丁## 时间: 2011-12-18 17:42

bow to Herman6292003~~~~

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what is bow? interesting.

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:42

前辈
我这次用新的raw cell 结果好多了。7天后trap assay产生了好多的OC. 在counter stain之前就用肉眼可以看出明显的颜色差异了， treated cell是深红色的， control是黄色的。所以就没有复染。
形成的OC特别大所以只能用4x的看。有的OC内部有絮状的东西。不知道是否正常，希望前辈赐教，谢谢
在有絮状物的地方标注了圆圈。

图片附件: 88000588.snap.jpg (2011-12-18 17:42, 62.52 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10037

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:43

前辈
我看一篇文献里说，诱导的OC细胞核经常分散在细胞的周边，从动物骨分离的成熟OC细胞核经常聚集在细胞中间，不知道是不是这样的？
谢谢

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-18 17:44

还有疑问: 许多文献上都说数OC的个数，要么是number/cm2, 要么就是number/well ...
不知道他们是怎么数的？尤其是number/well，显微镜下移动视野怎么保证能没有重复计数呢？

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-18 17:46

请问各位有在培养破骨细胞中用到1，25（OH）2维生素D3的吗？如果有，那浓度是多大呢？
另外那骨片怎样可以得到呢？有人说自己制备，那不是还得具备钢尺锯和金刚砂吗？
拜托个位高手帮帮忙啊！！

作者: 笑弯了腰 时间: 2011-12-18 17:46

to luckann：
I am working on the induction of OCs from monocytes recently, but my results after TRAP is sort of strange. Your picture posted on 5-24 is so beautiful! When will I get data like that!
Would you mind if I ask you several questions?
For example: what is the concentration of RANKL you used in your experiment?

Thanks a lot!

作者: dragonkilly 时间: 2011-12-18 17:46

大家好,新手,刚看到这个帖子,想请教一下,怎么获得大量的破骨细胞呢,我做的是直接分离,5日龄的SD鼠,每次是4只,但是细胞量一直是个问题,想请教一下,指点指点,万分感谢了

作者: vvmmoy 时间: 2011-12-18 17:48 标题: [分享帖]细胞培养技术

[分享帖]细胞培养技术

一、细胞培养基本概念
　　细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
　　在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。
二、细胞培养的环境
　　细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
　　1、无污染环境
　　培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
　　2、恒定的温度
　　维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。
　　3、气体环境
　　气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。
　　细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。
　　4、细胞培养基
　　培养是既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。
　　（1）合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。
　　（2）天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合志培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。常见使用最为5-20%。

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