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标题: [求助]谁能帮我看看这是不是肺泡II型上皮细胞 [打印本页]

作者: bamboo16 时间: 2011-12-29 16:19 标题: [求助]谁能帮我看看这是不是肺泡II型上皮细胞

[求助]谁能帮我看看这是不是肺泡II型上皮细胞

我刚开始养的大鼠肺泡II型上皮细胞，基本上是按照Dobbs的方法培养的。
这是培养60小时以后拍的照片，不知道是不是我要的细胞，觉得非常不像，希望有高人指点一下。
另外，除了红细胞较多，巨噬细胞更是遍地都是，不知各位有没有更好的除去巨噬细胞的方法呀？我觉得养这个细胞真是麻烦呀～
谢谢！

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作者: bamboo16 时间: 2011-12-29 16:20

再贴一张，感觉放大了就更不象了。

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作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:22

呵呵，不好说是不是，不过你可以用II型上皮细胞的鉴定鉴定方法鉴定一下阿，我也正在养，方法基本也是Dobbs的，不过还没有经过存化的步骤，所以杂细胞很多，上一批都被我弃掉了，而且没有留下照片，等我做下一批的时候，我们可以交流一下经验，呵呵。对了，请教您以下，你用了DNAse么，用和不用效果怎么样？这个用到这里我不明白到底起什么作用

作者: bamboo16 时间: 2011-12-29 16:23

我下次准备买BCIP/NBT染色试剂盒鉴定。
我一开始做就用了DNAse I，根据文献，采用消化液加这个是防止细胞聚集的，不过有没有效果我就不知道了，跟着做，呵呵~

作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:24

呵呵，我已经买了BCIP/NBT染色试剂盒不过一直没有用，因为一直没有专业人员告诉我这个试剂盒能否反复冻融，它是需要在－20度保存的，所以不敢轻易用，不过很快我就打算用了，如果反复冻融不行就要考虑分装了，你的DNAse I也是按照250ug/ml配置的么，我的试剂是15000u,有的说它换算后应该是10mg,这样的话，算来我每瓶试剂也就能做不几次，好贵阿。

作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:24

看文献说灌洗就可以很好的除去巨噬细胞，不过效果好像不是很好，唉，这个细胞真是很令人头痛阿，我配的试剂一，有很多沉淀，你的也有么？别着急，我们一起慢慢摸索，等过两天我的细胞出来，我把照片弄上来，咱俩对照一下吧

作者: bamboo16 时间: 2011-12-29 16:26

关于染液我问问别人，有答案了再告诉你。
我的DNAse I买的是粉，所以没有换算的问题。25MG大概170左右吧！
你是指溶液II有沉淀么？这个我和在这个版上认识的一个战友讨论过这个问题，解决方案是：先单独溶解CaSO4，然后再加入溶解了其他物质的溶液中即可。

作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:26

我看您在写的溶液配方怎么和我的不一样阿，我的溶液一和您的一样，不过溶液二是在溶液一的基础上加的cacl2和
Mgso4就可以了，而且这里面没有CaSO4，您告诉我的先溶解的应该是MgSO4吧。不过我的好像确实是溶液一有沉淀，而二没有。

作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:27

对了，还有一点就是这两种溶液因为有EGTA和Hepes缘故，我一直是过滤达到无菌的，是不是这两种溶液不可以高压消毒啊？

作者: bamboo16 时间: 2011-12-29 16:28

我的配方是参考的Dobbs的文献。溶液I没有一点沉淀，溶液II是多加这两个物质，Mg离子和SO4离子会形成MgSO4沉淀的呀，我是根据化学原理分析这种沉淀的可能性。所以我做了些改动和配置顺序变化，现在都没有沉淀。
我觉得这些都是缓冲溶液，一些小小的变动没有什么关系的，只要渗透压一样就可以了作用都是一样的。
我都是自己用0.22UM滤膜抽滤除菌的，不知道可不可以高压，不好意思。

作者: guagua 时间: 2011-12-29 16:28

参考一下：
肺泡Ⅱ型上皮细胞的割断面，其细胞质内有线粒体（M）、粗面内质网（RER）及板层体（LB）等细胞器。Mv为Ⅱ型细胞游离面之微绒毛，L为肺泡腔。

作者: hot_hot_hot 时间: 2011-12-29 16:28

我刚看到还有这么多的师兄师姐在做类似的实验。我在做类似的实验过程中发现了一个问题：就是细胞涂片加上BCIP/NBT染色时出现脱片，对照（PBS）没有脱片。不知道是什么原因？怎么解决？谢谢。
Dobbs全文好像我没搞到，谁能否给我发一份？anjh931@yahoo.com.cn，谢谢。
实验中加入DNA酶我发现很有必要的，主要作用有：
（1）减少细胞成团；
（2）可以用来粗略评估细胞消化的程度；、
对了，我还想问你们用的是什么消化酶？浓度是多少？时间以多少为合适？

作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:30 标题: 回复 #12 hot_hot_hot 的帖子

我是单用0.25％胰酶，时间20分钟，不过效果还不知道怎么样呢，也想请教一下anjh931,您的BCIP/NBT试剂盒是什么厂家的，工作液怎么配的？而且这个试剂盒说需要－20度保存，需要给分装么，还是只要用时溶开，用后冻上就可以了，请赐教。

作者: 缘yuan 时间: 2011-12-29 16:30

当然要分装~反复冻融会坏的

作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:30

可是我打回厂家，那里的人说应该可以，说只要不是酶类的就应该可以，这里的负20度保存是指长期保存，不过我听口气怀疑不是专业人士，所以不敢相信，像请教做过这个试剂盒的朋友，能帮个忙么。

作者: 缘yuan 时间: 2011-12-29 16:31

消化的方法和程序不同的文献不完全相同。主要的是消化酶的不同。当然有弹性蛋白酶、分散酶那是最好的了。如果你的老板－－建议用后两者。我在实验中0.25％和0.1％的胰酶（15-20min）我都试过，效果区别不是很大，由于目的细胞含量不多，加之没有鉴定的方法，也没有进行培养，不好评论。
对于这个实验，我有一下体会，或许对你有帮助。
（1）消化过程在倒置显微镜下观察下进行。
（2）消化时间不能太长和过于强烈，导致细胞活性下降。消化结束后去掉消化液，经FBS终止消化后，用摇床摇使目的细胞脱落下来。
（3）用胰酶浓度过大，炎性细胞的Fc受体损伤，不宜于用IgG包被的方法纯化。
（4）BCIP/NBT试剂盒（100×）我用的是中杉金桥的，按使用说明书操作，是否浓度过高是脱片的原因待排除。分装我考虑过，但量不多，不结冰，冰箱旁吸取，动作快一点，影响可能不会很大。我暂时没分装。师兄确认需要分装，不妨告诉我。谢谢
彼此交换一个经验，我们每个人都会有2个。

作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:32 标题: 回复 #16 缘yuan 的帖子

我看细胞培养书上确实说用胰酶不适合用抗体包被，不过我看中国的国家自然基金的文献上也同样用胰酶和抗体包被了，所以想试试，觉得包被简单点么，如果不行只能另用它法了或者改用弹性蛋白酶，这周由于要准备科里安排的报告，所以实验没有进行上，我一定不会吝啬经验的，只可惜现在还没有做过一次完整的，我决定等我把这个细胞养成，一定从头到尾给总结出来。

作者: guagua 时间: 2011-12-29 16:33

其实细胞脱片的原因应该是很容易向导的，不过都被我们忽略了：
AKP的活性需要碱性条件，BCIP/NBT试剂盒（100×）提供的BufferpH9.5
用多聚赖氨酸包被的环境是酸性。
能不掉片吗？
问题是用其他的什么方法包被玻片吗？

作者: bamboo16 时间: 2011-12-29 16:33

呵呵，我昨天做了鉴定。由于我们这里的显微镜是绿色光，所以不能把鉴定细胞照片拍下来，这是我染色前拍的，基本都是肺泡II型上皮细胞，但是不是非常纯，大家可以看看，对照一下。

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作者: bamboo16 时间: 2011-12-29 16:34

我也是在丁香网上得到了很多帮助，所以希望自己的一些东西可以帮助到大家。等我空下来一定告诉大家我自己的培养方案和体会。
再贴一张。

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作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:34

我一直很想看看养出来的是什么样子呢，自己养不出来干着急。

请教：用什么酶消化细胞，弹性蛋白酶还是胰酶？

作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:35

我今天做了一次，好像染完BCIP /NBT也都脱片了，反正基本上看不到细胞，郁闷，我打算明天把培养24小时的再鉴定一次。

作者: 兔唇 时间: 2011-12-29 16:36

不知道上面两位，做这个细胞做的怎样了？
我正开始做，我打算用胰酶消化。不晓得效果怎样

作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:36

我也是用胰酶，效果不是很好　，不过应该不完全是酶的问题。

作者: guagua 时间: 2011-12-29 16:37

我培养了2次，细胞还可以，但细胞的污染问题没有解决。
楼上的师兄师姐们谈谈你们的方法。谢谢。
to bamboo：能不能发点BICP/NBT鉴定后的图片？

作者: 小野花 时间: 2011-12-29 16:37

我的细胞倒是不污染，我有好几次想往上面传照片，可是总传不上去。而且最近要忙着找工作了，也有好一段时间没有做了　。

作者: guagua 时间: 2011-12-29 16:38

污染的问题已经基本解决，我现在的问题是如何寻求到一种高效、可重复性好的消化方法，以后还要用的。再一个原因，我感觉贴壁效果好像不是很好，我用的自己作的鼠尾胶原。

作者: guagua 时间: 2011-12-29 16:38

小野花：
最近你还在做类试的试验吗？
我用胰酶进行消化，消化效果总是不好，想还用分散酶或是弹性弹白酶，原装太贵，且时间太长，不知道在哪里能买到分装的？

作者: yysr238 时间: 2011-12-29 16:39

具体是不是type II细胞，我感觉必须用抗体染色-如sp-c抗体才能知道纯度是多少。

作者: guagua 时间: 2011-12-29 16:41

因试验需要，我们用胰酶灌注消化小鼠获取ATII细胞，但效果不是很好。用大鼠相对要好很多，主要原因是小鼠难于操作，灌注不充分，做过的师兄们能不能提些经验和小技巧？谢谢！

作者: 薄荷侠 时间: 2011-12-29 16:42

我也准备养这个细胞，不知每只大鼠能分离出多少细胞？

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