Board logo

标题: [讨论帖]再谈细胞培养基ph值的调节 [打印本页]

作者: 831226    时间: 2011-12-30 10:56     标题: [讨论帖]再谈细胞培养基ph值的调节

[讨论帖]再谈细胞培养基ph值的调节



看过群内很多关于培养基ph值的调节问题,有一个比较统一的说法是:
PH值的调整可以通过hepes液和NaHCO3来调整,不能用HCl。

那么,真的不能用HCl来调节吗?

我觉得是完全可以的,理由是:
我购买gibco公司的dmem-f12培养基的使用说明书明确的写到:use of 1N NaOH or 1N HCl is recommended.

D-MEM/F-12, Gibco, 12400-024说明书(我做了简单的翻译,仅供参考):

1)  measure out 5% less distilled water than desired total volume of medium, using a mixing container that is as close to the final volume as possible.

量出少于总量5%的蒸馏水
2)  add powered medium to 15 to 30℃ (room temperature) water with gentle stirring. (Do not heart water).
加入干粉培养基,轻轻搅拌(不能加热)
3)  rinse out inside of package to remove all traces of power.
冲洗包装袋 内壁
4)  add 1.2 g of NaHCO3 per liter of medium.
加入1.2g碳酸氢钠(每升)
5)  dilute to a desired volume with water. Stir until dissolved. (do not over-mix)
稀释至所需水量(轻轻搅拌,不要加过量了)
6)  adjust pH of medium to 0.2-0.3 below desired final working*:use of 1N NaOH or 1N HCl is recommended.(add slowly with stirring). After pH has been adjuster, keep container closed until medium is filtered.
调节ph值(比最后要求的ph低0.2-0.3,因为过滤以后会上升0.1-0.3*pH units will usually rise 0.1-0.3 upon filtration),用1N氢氧化钠或者1N盐酸调节,)调好后封装避免灰尘。
8)  sterilize immediately by membrane filtration. (positive pressure recommended).
立即用滤膜正压过滤
*pH units will usually rise 0.1-0.3 upon filtration

所以我觉得是可以的。

欢迎大家讨论,请给出操作的依据,谢谢!

附:

1N NaOH的配制方法(100ml)

4gNaOH溶于蒸馏水中,加水稀释至100ml

1N HCL的配制方法(100ml)

8.333ml浓盐酸,加水稀释至100ml

ps:NaOH要用烧杯称量,产热很厉害。要用容量瓶定容,容量瓶不能刷,不能烤干,得用无水乙醇润洗后挥发干燥,或者用吹风机冷风吹干。
(依据:化学课本和实验技术指导和化学老师)

作者: 831226    时间: 2011-12-30 10:56

----------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------
第一阶段总结,欢迎大家继续讨论


已有结论:目前用于培养基Ph值调节的主要有1N NaOH、1N HCl、NaHCO3和CO2,其中还有少部分战友在配培养基的时候加入了hepes,并且这些调节都是在培养基过滤之前调节的,

依然存在的问题:上述的调节方法都是在培养基过滤之前进行的,对于培养基过滤以后使用期间的ph调节很少有人讨论,只有111ading和唐朝风韵两位战友提到:配1N HCL灭菌后进行调整,但是这两位战友并没有讨论是如何灭菌1N HCL的,和灭菌后如何保存及保存时限。

下一步期待:期待大家讨论一下培养基过滤以后的ph调节所用的溶液的配制方法,除菌方法,除菌以后如何保存,保存条件,保存的期限。

比如:除菌方法的讨论,首先是否需要除菌,然后再谈怎样除菌。如果不需要除菌,为什么,比如有人说1N NaOH、1N HCl就不需要除菌,原因是强酸强碱里面细菌无法生长,但是也有人比如111ading战友说配1N HCL灭菌后进行调整,需要灭菌,那么到底需要不需要呢,请大家讨论?

再比如:ph调节液该如何保存,最多可以保存多少天,在什么条件下保存,是4度冰箱还是室温,请大家讨论?

作者: loli    时间: 2011-12-30 10:59


这个问题我是这么理解的:并没有说不能用HCL来调节PH值,其实只要了解了其中原理也就没那么困难了。
细胞生长需要一定的PH值来维持,我们一般用NaHCO3来调节,只所以用它,还是因为其的酸碱两性,可酸可碱,于是就用于调节PH值了。但是其也有缺点,即不稳定性,缓冲能力很差,有时候感觉效果真的很差,于是才引进了hepes液,其优点搜索即可。
现在来说HCL,将其配制成一定浓度的母液,是完全可以用来调节PH的,但是用此来调节你会发现,并不能一次调节,终身受益!需要反复的调节,这样一来,你原先的培养液可就不是真正原来意义上的培养液了,它有可能被这母液的HCL给稀释掉了,细胞状态自然就下滑了。
我的观点:NaHCO3是必须的,但是可以和HCL相互辅助,效果不错。至于hepes液,说真的,我们很少用到。

作者: 盼盼    时间: 2011-12-30 11:00


一般在放了一段时间后细胞培养基确实会变碱,我们实验室的一般是配1N HCL灭菌后进行调整,少量调整,细胞状态也挺好的,没用过NaHCO3。

作者: tianmei001    时间: 2011-12-30 11:09


不能用HCL调节的可能的情况是细胞外cl-浓度对其细胞的培养或具体的实验设计有影响.
一般是没有问题的.

作者: ladyhuahua    时间: 2011-12-30 11:09

我们实验室用的也是GIBCO的培养基粉末,是DMEM高糖,一般情况下,加入NaHCO3后,PH值会偏碱,所以基本上都是用1NHCL调节,每次每升培养基加入的量也基本是固定的,也没有特地的再将HCL灭菌,因为后面还有0.22微米滤膜灭菌,基本上会滤掉细菌等污染物。每次配的时候不能配很多,否则放置时间长了之后,会发现培养基变了颜色,呈碱性。保证大家会在一个月之内用完就没什么关系,现在这段时间之来,也没出什么问题。所以用HCL调节PH值是可以的。另外我们的配培养基所用水是新鲜的UP超纯水,其电阻率为18.2MΩ-cm。
作者: hyuu    时间: 2011-12-30 11:10


用hcl调节是可以,起码我们是这样使用的。但是这个调节只是暂时的,因为HCL没有多少缓冲能力。所以我觉得只能作为辅助使用。另外NaHCO3虽然有一定缓冲能力,但是其缓冲能力是有限的。相对来说HEPES在这个方面具有很大优势。只是因为HEPES的价格相对NaHCO3来说比较高,所以很多人不会使用他。

作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-30 11:11

反正我们是用HCl调的。
作者: hold住    时间: 2011-12-30 11:12


前天晚上配培养基,刚配出来的偏酸,我用1N的NaOH调,居然加了快4ml,才刚刚到7.0,惊讶中,不知道这样养出来的细胞什么样!等有了结果我再告诉大家!

作者: 二丫头466    时间: 2011-12-30 11:14

你想想你加进去那么多水,完了真正培养的时候还可能需要用酸来调节,那效果能好了么,一般的肿瘤细胞无所谓,遇到一些娇气一点的,有时候你都不知道问题在哪里
作者: 盼盼    时间: 2011-12-30 11:15

关于这个问题没那么复杂,少量加点没问题,至于溶液环境的影响跟碳酸氢钠的作用一致
作者: pengke1983    时间: 2011-12-30 11:15

DMEM里面本来就是哈有氯离子的 Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111 116.6 1.05045
Potassium Chloride (KCl) 75 311.8 4.157333
Sodium Chloride (NaCl) 58 6995.5 120.61207 (加盐酸制造的盐应该很少吧,我没有算过,1l培养基加2N盐酸180ul)

先调PH再定容吧。
细胞可耐受的渗透压应该是280-320吧 记不清楚了。

作者: moonlight45    时间: 2011-12-30 11:17

Hepes是维持培养液的酸碱平衡的,我培养液时一直都用HCL调PH。一般都是先调PH在定容》
作者: 831226    时间: 2011-12-30 11:17     标题: 回复 #9 hold住 的帖子

基本上加入碳酸氢钠之后,刚配出来的培养基都是偏碱的……你的怎么回事偏酸呢? 是什么培养液啊?1640? MEM?
作者: 831226    时间: 2011-12-30 11:19     标题: 回复 #13 moonlight45 的帖子

定容之后,那么PH 不就又改变了吗?
作者: moonlight45    时间: 2011-12-30 11:19

定容后的PH改变是可以忽略的。
作者: woshituzhu    时间: 2011-12-30 11:20     标题: 回复 #14 831226 的帖子

我们这里印象中dmem的培养基,无论高糖还是低糖,还是f12,配出来的都偏酸,以前是直接加NaOH片调的ph值,这次用的溶液NaOH调的。
可能和我们的双蒸水偏酸有关!
作者: 缘yuan    时间: 2011-12-30 11:21


我们是用HCl和NaHCO3进行调定pH的,可是培养基经常在4℃中就会偏碱,所以就使用HCl调,但基本上在第二天在使用时,培养基又回到昨天的颜色(偏碱)(使用pH计进行测定的)。所以很想知道哪种方法可以长期保证调定后的培养基pH基本不变。]

作者: 西子    时间: 2011-12-30 11:22


我们是用HCl和NaHCO3进行调定pH的,可是培养基经常在4℃中就会偏碱,所以就使用HCl调,但基本上在第二天在使用时,培养基又回到昨天的颜色(偏碱)(使用pH计进行测定的)。所以很想知道哪种方法可以长期保证调定后的培养基pH基本不变。

============================================================================================================

1.请问你们的HCL和NaHCO3是如何进行无菌处理的。谢谢
2.根据我看的资料,好像hepes的缓冲能力很强,但是没有见过配好后的培养基用hepes调ph值的。呵呵,我有很多的hepes,不知道如何使用,除了配培养基的时候用那么一点点,甚至现在培养基里已经添加有了hepes,真的不知道该如何充分利用hepes。


[ 本帖最后由 西子 于 2011-12-30 11:24 编辑 ]
作者: 西子    时间: 2011-12-30 11:24     标题: 回复 #16 moonlight45 的帖子

请问这样的说法有依据吗?谢谢
作者: duoduo    时间: 2011-12-30 11:26


我们实验室没人这么干,主要原因是我们实验任务繁多,培养基消耗速度快,所以PH改变的培养基较少,同时,我们培养基进行了50毫升的分装( 用于少量使用或消耗速度较慢的实验),还可以减少污染。对于楼主的问题,我个人觉得,不要使用HCl,因为不知道HCl对于细胞本身有无危害,其次引入cl-离子会不会产生其他问题等等

作者: 西子    时间: 2011-12-30 11:27

我们实验室没人这么干,主要原因是我们实验任务繁多,培养基消耗速度快,所以PH改变的培养基较少,同时,我们培养基进行了50毫升的分装( 用于少量使用或消耗速度较慢的实验),还可以减少污染。对于楼主的问题,我个人觉得,不要使用HCl,因为不知道HCl对于细胞本身有无危害,其次引入cl-离子会不会产生其他问题等等

==================================

我以前分装的是250ml,现在分装为100ml了
作者: BUK    时间: 2011-12-30 11:27

我们实验室也是使用100ML的瓶子分装的,也是为了避免污染。
怎样能保证培养液pH值啊,只要能保证一周基本不变就可以?
有没有培养肠上皮细胞的群友啊?

作者: sunnyB    时间: 2011-12-30 11:28

我的理解是:可以加。但是一定要控制量,不要加进去过多造成原来成分的稀释。我们做胚胎培养液时候是这样的。
作者: 西子    时间: 2011-12-30 11:28

记忆中以前看的帖子,用的最多的好像是NaHCO3调的,但是没有战友把NaHCO3得浓度和配方以及灭菌方式跟大家分享的。

作者: 小糖块    时间: 2011-12-30 14:11


我用的是二氧化碳调PH值

作者: ladyhuahua    时间: 2011-12-30 14:43


个人认为是可以用Hcl调pH的,不过调节后没有缓冲能力,如果放的时间长的话还是会变碱,并且加入的量不宜过多,以免引入的cl离子对细胞的影响。

作者: 笑弯了腰    时间: 2011-12-30 14:43


我们就是按照配方,用NaHCO3,整袋DMEM或1640,从来没用过盐酸,也基本不调PH值,滤器滤完PH值就是正常值。一般三个月内用完细胞没问题的。

作者: ha111    时间: 2011-12-30 14:44

我们实验室的经验:
干粉的培养基,按照包装袋上说明要加的NaHCO3的量,一般配好的是偏酸(因为使用的是优普的纯水机,过滤导致水偏酸),加入NaOH调整pH7.2~7.4,有时候是7.4~7.6。
过滤除菌,200ml分装储存,临用前加血清(加血清会使得培养基略微偏酸,pH约为7.4左右)。如果一个月内用完应该不会发生明显变碱的事情。

作者: TAT    时间: 2011-12-30 14:45


细胞培养基的pH调解中最好不要添加其它的物质,因为有可能会明显改变培养液的渗透压,特别是溶于强酸或强碱中的物质,以免影响培养基的缓冲能力。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ~320 mOsm/kg。一般要用碳酸氢钠调节pH值,NaHCO3 为另外添加,若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差,或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合,然后用CO2气体调整pH,而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH),因为氯离子对细胞生长可能有影响,且贮存时培养基的pH 易发生改变。加入NaHCO3 0.75g~1.00g调节PH值至7.0,定容1L,加入1g NaHCO3的培养基 pH约为7.0--7.2,此时就不需要再调节pH值了。

作者: 泡泡    时间: 2011-12-30 14:46

我配培养基时一般是按说明书要求加入碳酸氢钠后,将干粉溶于900毫升水中,然后分装、过滤,等使用时再加入血清和双抗并用少量盐酸调节Ph值,不知道这样有没有影响哎,不过我们一直都是这么干的。
作者: abc816    时间: 2011-12-30 14:47

我咨询过Hyclon公司,一般放时间长了的培养基会变碱,可以加HCL,但是HCL会影响细胞;另一个方法也是最简单的,就是把培养基的瓶盖旋松些放在培养箱里过会再拿出来就可以了。我试过一次,放了两个小时,颜色有点变浅。
咨询电话:010-80499033还有个免费的电话因为没有座机可用也没记住,可以向卖培养基的公司要他们的电话进行咨询

作者: 阿敏    时间: 2011-12-30 14:47


我们也是用HCL调的~~~~~~~~~~

作者: BOSS2011    时间: 2011-12-30 14:48

把培养基的瓶盖旋松些放在培养箱里过会再拿出来就可以了。我试过一次,放了两个小时,颜色有点变浅。

==========================

这种方法我经常用。没什么问题。
作者: lixi559    时间: 2011-12-30 14:49

以上许多贴子说可以加入HCI调节,但不能加入太多,请问标准是多少 ,1mLHCL/L培养基多吗?
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-30 14:51

hepes是一种缓冲酸,再加入NaHCO3之后,培养基的缓冲能力比较强,有利于细胞生长吧!我自己已用过HCL调节pH值,培养基缓冲能力比较差,但细胞生长得还行。
作者: hold住    时间: 2011-12-30 14:53     标题: 回复 #36 乌贼老弟 的帖子

我的DMEM/F12确实是含有hepes的。主要是不想自己加,想着人家加的要比自己加的好。呵呵
cuturl('http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Product-Technical-Resources/media_formulation.59.html')

COMPONENTS Molecular Weight Concentration (mg/L) mM
Amino Acids
Glycine 75 18.75 0.25
L-Alanine 89 4.45 0.05
L-Arginine hydrochloride 211 147.5 0.699
L-Asparagine-H2O 150 7.5 0.05
L-Aspartic acid 133 6.65 0.05
L-Cysteine hydrochloride-H2O 176 17.56 0.0998
L-Cystine 2HCl 313 31.29 0.1
L-Glutamic Acid 147 7.35 0.05
L-Glutamine 146 365 2.5
L-Histidine hydrochloride-H2O 210 31.48 0.15
L-Isoleucine 131 54.47 0.416
L-Leucine 131 59.05 0.451
L-Lysine hydrochloride 183 91.25 0.499
L-Methionine 149 17.24 0.116
L-Phenylalanine 165 35.48 0.215
L-Proline 115 17.25 0.15
L-Serine 105 26.25 0.25
L-Threonine 119 53.45 0.449
L-Tryptophan 204 9.02 0.0442
L-Tyrosine disodium salt dihydrate 261 55.79 0.214
L-Valine 117 52.85 0.452
作者: hold住    时间: 2011-12-30 14:54

Vitamins
Biotin 244 0.0035 0.0000143
Choline chloride 140 8.98 0.0641
D-Calcium pantothenate 477 2.24 0.0047
Folic Acid 441 2.65 0.00601
Niacinamide 122 2.02 0.0166
Pyridoxine hydrochloride 206 2.031 0.00986
Riboflavin 376 0.219 0.000582
Thiamine hydrochloride 337 2.17 0.00644
Vitamin B12 1355 0.68 0.000502
i-Inositol 180 12.6 0.07
Inorganic Salts
Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111 116.6 1.05
Cupric sulfate (CuSO4-5H2O) 250 0.0013 0.0000052
Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 404 0.05 0.000124
Ferric sulfate (FeSO4-7H2O) 278 0.417 0.0015
Magnesium Chloride (anhydrous) 95 28.64 0.301
Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 120 48.84 0.407
Potassium Chloride (KCl) 75 311.8 4.16
Sodium Chloride (NaCl) 58 6995.5 120.61
Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4) anhydrous 142 71.02 0.5
Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) 138 62.5 0.453
Zinc sulfate (ZnSO4-7H2O) 288 0.432 0.0015
Other Components
D-Glucose (Dextrose) 180 3151 17.51
HEPES 238 3574.5 15.02
Hypoxanthine Na 159 2.39 0.015
Linoleic Acid 280 0.042 0.00015
Lipoic Acid 206 0.105 0.00051
Phenol Red 376.4 8.1 0.0215
Putrescine 2HCl 161 0.081 0.000503
Sodium Pyruvate 55 ∞
Thymidine 242 0.365 0.00151

作者: yes4    时间: 2011-12-30 14:58

我们一直是用HcL调的呢,每次差不多配制1L的DMEM培养基,这时候的PH大约是8.0左右,水是五蒸水高压的,然后再用过滤好的HCL调一下,到7。4就可以了。再用0。22的膜过滤除菌就完毕了,放4度保存。1L基本半个月就可以用完了。细胞状态不受影响。
作者: baidukk    时间: 2011-12-30 14:59


如果是自己用粉剂培养基配置,按规程加入NaHCO3,建议:1、添加10-20mM HEPES(很好的pH稳定试剂);2、配制后启用的培养基要尽快用完,因为溶于培养液中的CO2很容易因取用培养基后储存瓶中的非液体空间变大而逾出,造成NaHCO3/H2CO3缓冲对失衡而使培养基变碱。

作者: ffooll    时间: 2011-12-30 14:59


我们的实验室用NaHCO3调,有一次科室里的一位同学加多了,培养液太碱,用HCl都调不好。所以每次都一点点地加,尽量混匀之后测PH值。

作者: dongdongqiang    时间: 2011-12-30 15:04


我们的实验室是用NaHCO3来调节pH值的,还没有用过1N盐酸来调节pH值。
等我们下次用1N盐酸来调节pH值,一什么结果的时候再告诉大家。

作者: loli    时间: 2011-12-30 15:05


反馈:昨天下午配制1000ml培养基,容量瓶配的,1N NaOH调ph值,因为刚开始偏酸ph=6.79,加NaOH 3.7ml以后,ph=7.11(ph值均为过滤前用ph计测量,过滤后没有再测)。

作者: 生物迷    时间: 2011-12-30 15:05


我们用的培养基粉末和楼主一样,但是怎么说明书是每升加2.438gNaHCO3呢?我们每次加完后都用偏碱,只能用HCL调节PH.

作者: loli    时间: 2011-12-30 15:10     标题: 回复 #44 生物迷 的帖子

你确定你的和我用的一样吗?我的是D-MEM/F-12, Gibco, 12400-024
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-30 15:14


用HCL调没有问题的,我也用HCL调,一半用浓盐酸,5L的培养基加几滴就可以,不会影响整个体积~~~然后0.22过滤除菌,分装保存4度,一半一个月左右颜色不会有太大的变化~~~

作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-30 15:15

有可能和不同实验室用的水不一样的原因
======================================================
你确定你的和我用的一样吗?我的是D-MEM/F-12, Gibco, 12400-024
作者: 911    时间: 2011-12-30 15:18


一般情况下,不调PH值也可以养细胞,特别是癌细胞,影响不大,我们实验室以前是调的,现在省事,不调了,也能养好

作者: bohe221    时间: 2011-12-30 15:19

一直都是用稀盐酸调的 为什么会有这个问题啊
作者: 西子    时间: 2011-12-30 15:24     标题: 回复 #49 bohe221 的帖子

请问是多大浓度的稀盐酸,是过滤之前用,还是过滤之后用!谢谢
作者: wu11998866    时间: 2011-12-30 15:25

我觉得是可以的,不过要先把HCL稀释成一个当量的浓度,然后滴入培养基调PH值,我自己试过,是可行的,而且我是用来培养神经元细胞,养活了。要不你尝试一下?
作者: wu11998866    时间: 2011-12-30 15:26

补充一下,用稀释后的HCL调了PH值后再过滤就可以了
作者: 西子    时间: 2011-12-30 15:27

已有结论:目前用于培养基Ph值调节的主要有1N NaOH、1N HCl、NaHCO3和CO2,其中还有少部分战友在配培养基的时候加入了hepes,并且这些调节都是在培养基过滤之前调节的,

依然存在的问题:上述的调节方法都是在培养基过滤之前进行的,对于培养基过滤以后使用期间的ph调节很少有人讨论,只有111ading和唐朝风韵两位战友提到:配1N HCL灭菌后进行调整,但是这两位战友并没有讨论是如何灭菌1N HCL的,和灭菌后如何保存及保存时限。

下一步期待:期待大家讨论一下培养基过滤以后的ph调节所用的溶液的配制方法,除菌方法,除菌以后如何保存,保存条件,保存的期限。

比如:除菌方法的讨论,首先是否需要除菌,然后再谈怎样除菌。如果不需要除菌,为什么,比如有人说1N NaOH、1N HCl就不需要除菌,原因是强酸强碱里面细菌无法生长,但是也有人比如111ading战友说配1N HCL灭菌后进行调整,需要灭菌,那么到底需要不需要呢,请大家讨论?

再比如:ph调节液该如何保存,最多可以保存多少天,在什么条件下保存,是4度冰箱还是室温,请大家讨论?

作者: qqq111    时间: 2011-12-30 15:28

我们配KNOCK OUT DMEM培养基也一直用盐酸+氢氧化钠调pH的,不过调之前加3.7g碳酸氢钠/L,按照说明书做的,一直以来细胞也很正常。我们的水是用hyclone的细胞培养级水,一般配完都偏碱,有时候我们为了省时间直接用浓盐酸调了,也还好,呵呵。
对了,想问各位群友一个问题,调好pH的培养基要过0.22微米的膜除菌,然后我们最后的完全培养基中需要加牛血清,是先把血清加进去再过滤,还是过滤完再加呢?还有个问题,如果加了血清再过滤,貌似非常难,有没有什么好的方法?

作者: 西子    时间: 2011-12-30 15:29     标题: 回复 #54 qqq111 的帖子

过滤后的培养基是无菌的;

血清是无菌的;

难道混合到一起就有菌了???!!!

所以,完全没有必要多此一举,费时费力不说,还容易出错,不过心理上好受一点。

此外,配好培养基以后的第一件事不是养细胞,而是检菌!!
作者: qqq111    时间: 2011-12-30 15:31     标题: 回复 #55 西子 的帖子

其实我们每次过滤完都会检菌的。至于加血清再过滤,不是我本人,只是看到实验室有人那样做,非常的吃力,才顺便在这里问一下的。
我们配好的培养基一般都分装保存于4度冰箱,限两周内用完,使用前先预热。
作者: 铜雀    时间: 2011-12-30 15:31

N NaOH的配制方法(500ml)

20gNaOH溶于蒸馏水中,加水稀释至500ml

1N HCL的配制方法(500ml)

41.6ml浓盐酸,加水稀释至500ml
分装后,室温保存。
一直用到完为止,也不知道能保存多长时间,
也没有注意能保存多久,反正是一直在用的 ,

作者: 西子    时间: 2011-12-30 15:33     标题: 回复 #57 铜雀 的帖子

请问是在培养基过滤之前用来调ph,还是培养基过滤之后用来调ph呢????
作者: zhezhe    时间: 2011-12-30 15:33


tutu19820419 说的很有道理,NaHCO3可以和CO2够成一个缓冲体系,这样对维持PH值可能会更好!

作者: 园丁##    时间: 2011-12-30 15:36


我想从以下几个方面回答这个问题:

1、配制培养基PH值有一个原则,就是宁愿酸不要碱。

2、我配制DMEM培养基是这样调PH值的

用900ml左右的去离子水溶解干粉DMEM培养基,

加入 3.7g NaHCO3 搅拌溶解一至两个小时

这时候的培养基溶液PH值大致在8.6左右

3、直接加入浓盐酸1ml左右,这时候的PH值大至在6.6-6.8左右

4、定容至1000ml

5、过滤培养基,这时候的PH质在7.2左右,正好

不知大家注意到没有,过滤培养基会使得其PH值上调,

因此我在配培养基的时候故意在过滤之前将培养基的PH值配的偏酸一点,这样过滤后的PH值就

正好是所需要的范围。

大家看我只用了NaHCO3,和HCL ,没有用到NaOH.

此方法比较简单,百试不爽,你也可以试试看

作者: 园丁##    时间: 2011-12-30 15:36

我从不在过滤后调PH值,请大家注意,虽然有很多方法在过滤后调PH值,但是我不建议采用

毕竟过滤后我的培养基就马上要分装的,保持的是无菌状态,一个过滤好的无菌状态的培养基

为什么还要被折腾来再去配PH值呢,所以原则上过滤后不应该去调PH值。一切都要在过滤前解

决。

作者: 园丁##    时间: 2011-12-30 15:37


补充一点,我的DMEM培养基是放在负20度保存的,效果不错,两个月内解冻没有问题,请问大

如过两个月还用不完1L培养基,那你的细胞怎么在养就不好说了,呵呵

作者: glass    时间: 2011-12-30 15:37


我们一直用5N的HCL450ul调PH值即可,也可用CO2来调,但必须的有经验,而且使用时很容易变碱,

作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-30 15:38

我们实验室的看法是:HCL肯定是不能高温灭菌,因为超过了HCL沸点后就会挥发,如果高温灭菌后,就成为水了。我们实验室一般为两种,做的稍微粗一点的就直接拿纯盐酸对灭菌水配,如果细致一点的可以配完用可回收的小滤器滤一下。一般最好保存在4度,可以稍微长一点,我们一般是配了几个人一起用,一两个月内没有问题。希望大家一起探讨。
作者: milkdog    时间: 2011-12-30 15:39

我的培养基配置后给细胞使用后,第二天就边黄了,我不知道1640里面有没有酚红指示剂
别人都不是用1640养的,都是用DMEM。他们的比我红很多
我调了PH值,7左右,但是依然第二天培养液就变黄了。
配方:1640:胎牛血清 9:1
外加三种因子和双抗:胰岛素,胰岛素样生长因子,表皮生长因子,还有青链霉素。
1640过滤后再加入三种因子和双抗。
配置完毕后红色就比较淡了。测PH值,在7附近,偏碱一点。
但是细胞培养时,换液,过夜后培养瓶中液体完全变黄,完全变黄。彻底的黄色,很多师兄师姐说太酸了,PH值没有调好,我就彻底晕菜了?
到底怎么搞啊,细胞倒是能活,我每天换液。

作者: 西子    时间: 2011-12-30 15:41     标题: 回复 #65 milkdog 的帖子

细胞的状态如何,只要状态好,就不用管它吧。
此外,培养基变黄,是否浑浊,如果浑浊,怀疑污染。如果不浑浊,则1细胞量的多少,量太大代谢多,肯定要变黄;2ph值的问题,偏酸了。
关于ph值,你配制以后测的值是用试纸测的,还是ph计啊,建议ph计。
还有一点经验:变黄,如果是触目惊心的黄,那么一般都浑浊了,就是污染了
good luck!多思考
作者: 铜雀    时间: 2011-12-30 15:41

1.请问你们的HCL和NaHCO3是如何进行无菌处理的。谢谢
2.根据我看的资料,好像hepes的缓冲能力很强,但是没有见过配好后的培养基用hepes调ph值的。呵呵,我有很多的hepes,不知道如何使用,除了配培养基的时候用那么一点点,甚至现在培养基里已经添加有了hepes,真的不知道该如何充分利用hepes。

==================================================================

灭菌我们直接高压,但盐酸浓度不能过高,会挥发。我们养的细胞是直接用HCl调pH的
作者: milkdog    时间: 2011-12-30 15:42     标题: 回复 #66 西子 的帖子

是触目惊心的黄,但是,镜下细胞活着,贴壁良好,生长良好,培养瓶对光,挺清亮,有师兄说支原体感染看不出,请教下,怎么解决。我没有PH计,只有试纸
作者: vvmmoy    时间: 2011-12-30 15:44


镜下也没发现什么别的生物,就是细胞,还有些死亡的上浮的,下面贴壁百分之70%要传代了。

作者: tangxin_80    时间: 2011-12-30 15:45


比如:除菌方法的讨论,首先是否需要除菌,然后再谈怎样除菌。如果不需要除菌,为什么,比如有人说1N NaOH、1N HCl就不需要除菌,原因是强酸强碱里面细菌无法生长

支持不用灭菌,要是这也得灭菌,那酒精是不是也需要灭一下菌啊,这玩意应该能杀菌的,不用灭吧。

作者: ha111    时间: 2011-12-30 15:47

我们实验室情况:
粉末配成1000毫升培养基,除袋上标明加3.7g Na2CO3(DMEM高糖粉末), 5% CO2 环境下对应Na2CO3 1.2~2g是比较好的缓冲环境,我们一般会加hepes浓度15~20mM,在外面操作较久培养基颜色不会那么快变碱
另外,配置过程中,加碳酸氢钠和hepes 后用NaOH调节至7.4左右后再定容,过滤后上升~0.2个pH,分装90ml/瓶,要用之前10ml血清又稍变酸,颜色看起来很不错。

作者: fsdd817    时间: 2011-12-30 15:48

一般情况下,不调PH值也可以养细胞,特别是癌细胞,影响不大,我们实验室以前是调的,现在省事,不调了,也能养好

==============================================================================================================

确实,我曾经用PH值8.0的RMPI 1640养过,确实长的没问题,但是后来我想,不调还是有问题的,因为没有人知道PH值的改变到底对细胞产生了什么样的影响,这些影响有会不会对你的后续实验产生影响,最终导致你的结果出现偏差,而这种偏差的结果可能无法再PH7.2的情况下得到重复验证,最终导致其他学者对你的结论提出质疑。
这点我们还真要想小 日 本 学习,该怎么样就怎么样,不能偷懒。
个人意见。

作者: fsdd817    时间: 2011-12-30 15:48

比如:除菌方法的讨论,首先是否需要除菌,然后再谈怎样除菌。如果不需要除菌,为什么,比如有人说1N NaOH、1N HCl就不需要除菌,原因是强酸强碱里面细菌无法生长

支持不用灭菌,要是这也得灭菌,那酒精是不是也需要灭一下菌啊,这玩意应该能杀菌的,不用灭吧。

===============================================================================================================

上次说的太武断了,后来想想,至少有一种大家熟知的细菌是可以在酸性条件下存活的,HP啊,当年提出的学者也受到了广泛的质疑,后来好像还得了诺贝尔,看见凡事没有绝对的。
作者: ladyhuahua    时间: 2011-12-30 15:49

我们实验室是用NaHCO3 来调的 用无菌过滤器过滤后分装 时间长了就知道100毫升培养基大概加多少NaHCO3 来调到理想的值了
作者: 四福晋    时间: 2011-12-30 15:49

问各位战友我买的1640培养液还用调PH值吗?谢谢!
作者: utt0989    时间: 2011-12-30 15:50


受益颇多,我这几天正为培养基pH值的问题发愁呢,我的培养基过滤了两次,pH值达到了8.0,后来用过滤后的HCL调节pH到7.5,我都不敢用这个培养基了,怕把细胞养死。我用的HCL用一次性滤器过滤的,但一个师姐说HCL是强酸,会不会把滤膜给破坏呢?我就更担心我配的培养基的情况了,所以现在也没敢用,想丢掉重新配。

作者: HP007    时间: 2011-12-30 15:52

1N HCL的配制方法(100ml)

8.333ml浓盐酸,加水稀释至100ml

===============================================================================================================

这个应该修正一下。浓盐酸也叫发烟盐酸,发烟是挥发后的液化现象。

如果先取浓盐酸,后加水,那么会有很强的发烟及呼吸道刺激性。

正常应该先准备好约80%体积的水,例如配制100ml溶液可以取80ml水,然后再取浓盐酸加入到水中。用枪加时枪头可以迅速插入液面下加,减少发烟和刺激性。

还有这段话:ps:NaOH要用烧杯称量,产热很厉害。要用容量瓶定容,
如果不是做分析滴定用,只是为了调节pH使用的话,没有必要用容量瓶定容。
NaOH称量少量的最好用称量纸,然后倒入到先加有水的烧杯中,快速搅拌。这么做的原因是防止烧杯干燥不够,如果烧杯底部不小心有少量水分的话,NaOH的溶解热能融化玻璃的。我曾经就把一个玻璃容器给溶了一个大坑。

这些可能常在实验室里干活的群友会认为是废话,谁不知道啊,呵呵。
不过我认为既然是个总结,还是严谨一些的好,可能有刚刚进实验室的群友不熟悉。

作者: 西子    时间: 2011-12-30 15:52

受益颇多,我这几天正为培养基pH值的问题发愁呢,我的培养基过滤了两次,pH值达到了8.0,后来用过滤后的HCL调节pH到7.5,我都不敢用这个培养基了,怕把细胞养死。我用的HCL用一次性滤器过滤的,但一个师姐说HCL是强酸,会不会把滤膜给破坏呢?我就更担心我配的培养基的情况了,所以现在也没敢用,想丢掉重新配。

================================================================

滤膜有很多种的,可以过滤不同的东西,比如盐酸。你看看滤膜的说明书就知道了。
作者: dongdongqiang    时间: 2011-12-30 15:54


我想请问一下如何配碳酸氢钠。实验室一个星期前用5.6g的碳酸氢钠配了100ml溶液,然使用针式滤膜过滤,过滤完后发现很多很小很小的小东西漂浮,请问一下是什么问题?





欢迎光临 分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/) Powered by Discuz! 5.5.0