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标题: [讨论帖]如何把细胞养的更漂亮 [打印本页]

作者: 铜雀 时间: 2012-1-4 14:26 标题: [讨论帖]如何把细胞养的更漂亮

[讨论帖]如何把细胞养的更漂亮（转载）

1.不同的细胞，喜欢的环境是不一样的。

这个不仅仅是说培养基的不同，还有就是细胞生长的空间密度问题。

有一些细胞是数量多一点比较好生长，生长状态也比较好。这种一般是属于生长速度慢的细胞。譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好，譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞，生长速度非常得快，贴壁速度很快，所以传代时就应该留很少量的细胞，这样细胞状态会比较好。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。

2.对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：

首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）

其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。

如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。这个是我师兄发明的，谢谢他了。这个方法真的很好用！

3.关于培养瓶内加入培养基的量的问题。

这个是要靠自己去摸索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些细胞反而是培养基少一点相反细胞形态会长得比较好。（可能也是竞争很大，有优胜劣汰吧。呵呵。）对于生长速度快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基细胞形态会更好。但是要注意换液掌握。

4.关于选择培养瓶的问题。

个人发现生长速度快的细胞在玻璃瓶内生长的状态会比一次性塑料瓶相对好一些。而对于同一种细胞，在其生长旺盛快速的时期在玻璃瓶内的生长状态也比塑料瓶内好。这可能是因为塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速度快的细胞在塑料瓶这种相对“更安逸”的环境里反而长得状态不如玻璃瓶好。

所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，塑料瓶比玻璃瓶会好，对于生长速度慢的细胞，玻璃瓶则会更好。同样，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候，塑料瓶会好一点，比如刚刚复苏的时候，或者原代培养的时候。而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。

呵呵，暂时有这么些经验总结，再想到的话会补充的。有不对的地方还请斧正啊。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-4 14:28

我总结出来最后试验的结果好坏和细胞状态关系非常大的。所以希望能够多多交流，真正养好细胞。

作者: tianmei001 时间: 2012-1-4 14:34

我来顶一下吧我也在养细胞遇到了很多问题
在努力的一个个解决
唉最怕就是找不到原因有时候细胞状态不好也不知道是哪里出错了真是让人头大呀

作者: 伊莎贝拉 时间: 2012-1-4 14:37

我养的是A549细胞，常常在传几代，就出现细胞颗粒感很强，时间一长就会在培养基中出现细胞少的颗粒，如果一消化就会出现大片死亡，常常养着养着就大部份细胞就老化，死亡了，请LZ及各位高手指点。

作者: whitesheep 时间: 2012-1-4 14:46

最近我养的细胞中也经常出现黒渣现象，可以试试楼主的“二传”法。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-4 14:47

你可以试一试，这个情况我们用过，传了一次后好很多了，但还是会有一点。你传几次，应该会不错的。记得要洗一下，用滴管吸走。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-4 14:54 标题: 回复 #4 伊莎贝拉的帖子

你好，我对你这个细胞不是很熟悉，需要你自己摸一下情况。细胞颗粒感很强是不是细胞充水的缘故？你的培养基的渗透压是不是过小了。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-4 14:54 标题: 回复 #5 whitesheep 的帖子

你可以试一试，这个情况我们用过，传了一次后好很多了，但还是会有一点。你传几次，应该会不错的。记得要洗一下，用滴管吸走。

作者: 伊莎贝拉 时间: 2012-1-4 14:55

培养基的渗透压过少，这个没想过，因为前面的师兄们都是这么养的，这个可能不是问题，这几天发现培养基中飘着密密的充满细少的颗粒，很多细胞轮廓都很不明显了。我想这是不是因为支原体或衣原体感染，长到一定程度，就裂解细胞，飘着的是裂解的细胞碎片。请分析指导。

作者: tieshazhang 时间: 2012-1-4 15:05

楼主，请教个问题。
我们养的是大鼠骨髓间充质干细胞，细胞传到三代之后，总共40多瓶，大概过了又有两三天，实验室用甲醛熏蒸了下，结果第二天发现细胞死了好多，大概20瓶死亡了，死亡的瓶子都有颗粒状的沉淀贴附在瓶底，但是轻轻摇动就会脱壁。我们以为是个别小瓶培养基污染，因为我们培养基是封装到小瓶的，我们怀疑是细菌污染了，专门分装出前面用过的小瓶培养基培养，24小时也没有细菌生长，也没见到真菌，现在就是不明原因。请楼主帮我们分析下，谢谢。而且发现之后我们就马上新配了培养基，把没有污染的全部都换液了，结果今天早上一看，又有8瓶变成那种“污染”的样子，现在不知道怎么办~

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:27 标题: 回复 #10 tieshazhang 的帖子

兄弟，不要着急，慢慢来分析找找原因！
虽然没有养过你的这个细胞，但是人觉得方法学上都大同小异吧。
第一，按你说的。传到三代之后到发现死亡中间间隔了有四天吧。这个时间对于大部分细胞都是不好的，是需要处理的。除非是在量特别少的情况下（即便这样，为了使细胞状态更好，也应该3天换液）。

第二，我不知道你们实验室为什么会用甲醛熏蒸？一般紫外灭菌完全可以了。虽然不一定就是因为甲醛熏蒸的原因导致细胞死亡，但是头一天熏蒸，第二天死亡，说没有关系的话这未免也太巧了点。甲醛的毒性众所周知，甲醛是有细胞毒作用的。甲醛对生物细胞蛋白质有破坏作用，是一种毒性很强的原生质物质。在一篇文献看到过：经甲醛染毒处理后 ,小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率逐渐升高 ,与对照组相比有极显著性意义。结论　甲醛可不同程度地影响小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核形成率 ,并呈良好的剂量 -效应关系。所以，感觉甲醛是凶手的可能性还好蛮大的。

第三，死亡的瓶子里有颗粒状的沉淀贴附在瓶底，但是轻轻摇动就会脱壁。这个不像是污染的迹象。以后再次遇到这个情况，不要着急把死亡的细胞就扔掉，等完好的细胞都处理好之后，处理这些细胞。可以按照我所说的二传的方法试几次。吹打之前着重要多洗两遍，建议用PBS或者无血清培养基洗。

第四，重新配的培养基，你就敢全部换液啊？还是应该用原培养基留几瓶，以防止污染。否则万一新培养基污染的话，就无可挽回了。（不过我还是能够救回来的，呵呵。）现在你应该把今天变成的这8瓶按照我说的方法试一下。你要确定新配的培养基是没有污染的，只要不是污染就好办。另外的几瓶，你暂时不要动它，3天后换液或者传代，按照我说的方法试一下。我估计你的细胞状态应该都比较老化一点了。刚开始可能没有把握好时间。干细胞在8代以内生长速度都是比较快的，贴壁速度也很快的。所以你着实还是需要再摸索一下最佳传代时间和频率的。

呵呵。祝你好运啊！不要慌！

作者: 831226 时间: 2012-1-5 14:28

所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，塑料瓶比玻璃瓶会好，对于生长速度慢的细胞，玻璃瓶则会更好。
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LZ，是生长快的用玻璃瓶好啊？玻璃瓶清洗要求比较繁琐，一般好养的置于塑料瓶中也不错，但是特殊要求的我们还想摸摸条件的。谢谢！

作者: hold住 时间: 2012-1-5 14:28

有养脐静脉内皮细胞的？请大家多交流下新的！我的细胞现在是颗粒很多，而且形态变得又瘦又长，还有很多触角，形态由铺路石变成了多边形，有时候看起来像神经元！请楼主及各位同仁提点宝贵意见！谢谢

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:31 标题: 回复 #12 831226 的帖子

我摸出来的条件是这样的。细胞长得很快的，在塑料瓶中贴壁更快。很容易就老化。所以需要你更加频繁地换液和传代的。
你需要在你的细胞上试一下就知道了。
玻璃瓶用过的必须泡酸再高压的。是麻烦点，但是很好用。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:32 标题: 回复 #13 hold住的帖子

你的细胞是从一开始就有这样的问题还是后来在你养的过程中逐渐出现的？

如果是一开始就有这个问题的话那就可能是细胞本身的原因了。如果是你养的过程中后来出现的那就是养的问题了。你可以按照我的方法试一下。在传达的时候，先在显微镜下找到铺路石状态的好细胞，只吹打该处，其余的不要，然后把吹下来的细胞传入新瓶，观察生长情况，这时你可以适时进行“二传”。呵呵。希望对你有帮助。

另，脐静脉内皮细胞属于成纤维细胞，本身就是呈短梭状或铺路石样镶嵌排列，细胞为扁平多角形。所以你的细胞形态并不是不符合。好事。加油！

作者: 小鱼鱼 时间: 2012-1-5 14:32

请问下楼主，你传代的时候。消化下来的细胞不离心吗？直接加入新的培养瓶吗？还有在“二传”的时候，当有部分细胞贴壁的时候倒掉培养液，那岂不是会损失很多暂时还未贴壁的细胞吗？

作者: 了了 时间: 2012-1-5 14:33

最近刚开始养细胞，来这里学习一下，今天看到我的细胞好像污染了，上涨图片，希望楼主指点一下，谢谢！图片是骨髓基质细胞，11月2日取得原代，4日首次全量换液，9日全量换液，这几次观察细胞长的都很好，今天换液时就出现了如图所示的情况，培养瓶背景有很多黑色的斑点，高配镜下观察到有些黑点似乎在运动，

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10140

作者: 了了 时间: 2012-1-5 14:34

补充一下，今天换液时，培养液还没有沉淀，准备再养两天看看，伤心...

图片附件: 40418331.snap.jpg (2012-1-5 14:34, 44.99 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10141

作者: eric930 时间: 2012-1-5 14:36

请问lz养过肾小球上皮细胞（足细胞）吗？养细胞用的Ｉ型胶原是起什么作用的？谢谢

作者: TNT 时间: 2012-1-5 14:37

我养的是293细胞，细胞代数不是很高，但是细胞的状态很不好，三四天都不怎么长，也不知道是什么原因，而且培养基里似乎漂了好多小的黑点点，请楼主指教！

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:39 标题: 回复 #16 小鱼鱼的帖子

呵呵，你的疑问很正确哈。
第一，我消化下来的细胞不离心，直接用新鲜的培养基吹打下来细胞悬液，加入到新的培养瓶中。
第二，“二传”就是为了要留下细胞生长状态最好的细胞，所以才要留贴壁早的，把还没有贴壁的细胞扔掉。这是为了筛选出年轻力壮的细胞。必须得扔掉一些不好的。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:40 标题: 回复 #17 了了的帖子

原代培养的话7-10天是要传代的。
有黑点有可能是污染，也可能不是。既然你的培养液没有浑浊，那应该就不是污染，污染的话培养液很快就会变浑浊的。
你现在应该把细胞传一代了。记得洗一洗细胞，如果细胞数量多的话可以考虑“二传”。我们上次也是这种情况，细胞上有不明黑色物体，最后就是用这个方法搞掉的。

附：黑色物可能是牛血清中的杂质，是你的牛血清质量不够好，要么是国产的，要么是澳大利亚或新西兰那边的吧？

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:41 标题: 回复 #19 eric930 的帖子

不好意思啊，你这个细胞还真是没有养过啊。
不过我们做其他细胞的时候有用到过，就是对于贴壁不牢，不容易贴壁的细胞，帮助他们贴壁的。你的应该也是？？呵呵。。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:42 标题: 回复 #20 TNT 的帖子

小陈小陈 wrote:
我养的是293细胞，细胞代数不是很高，但是细胞的状态很不好，三四天都不怎么长，也不知道是什么原因，而且培养基里似乎漂了好多小的黑点点，请楼主指教！

293细胞生长快，通常倍增时间不到一天。每3-4 天1：10至1：20稀释加入培养液，在5% CO2条件下培养。

293细胞贴壁是很疏松的，建议你只用培养基进行吹打（吹打不下来的话只用EDTA进行消化）。可不用胰蛋白酶过度消化。这样对细胞生长状态保持好。培养基更换每2-3天一次。

另外，293细胞在室温时不易贴壁的，37℃几日后才重新贴壁。所以控制好温度。

你的小黑点如果确定不是污染的话那就可能就是培养急用血清中自身带入的杂质了，这个很常见的，我们消除的办法就是“二传”。呵呵。你可以试一试的。但前提是你必须把细胞量
先养起来。便于筛选。

作者: milkdog 时间: 2012-1-5 14:44

学习了
最近复苏了株293细胞，传了3代，总是有颗粒。我已尝试换液时加冲洗一次，有效果。
准备按lz的方法试试。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:45 标题: 回复 #25 milkdog 的帖子

293细胞生长快，通常倍增时间不到一天。
293细胞贴壁是很疏松的，建议你只用培养基进行吹打（吹打不下来的话只用EDTA进行消化）。可不用胰蛋白酶过度消化。这样对细胞生长状态保持好。

作者: abc816 时间: 2012-1-5 14:45

不知楼主养过神经干细胞没，请谈谈经验，我养的神经细胞球，加了因子细胞反而长的要死不活的，显微镜下细胞球发黑不透亮，边缘细胞也是，不加因子的反而有长的还可以的。另外如果楼主养过DC细胞，也请谈谈经验。

作者: tangxin_80 时间: 2012-1-5 14:46

LZ 你好，我最近养的LLC细胞背景出现一些黑色的细胞碎片样的东西，使得资本也不是很清凉的感觉，看起来我觉得像是死掉的细胞碎裂的碎片，你们养细胞有出现过这种情况吗？准备用你的方法试试呵呵

作者: yychen 时间: 2012-1-5 14:46

培养的胎鼠海马神经元，培养三天后加阿糖胞苷，为啥胶质一点都不见少呢？

作者: wmp1234 时间: 2012-1-5 14:48

请问楼主，巨噬细胞不经过消化就可以直接吹打下来吗？很难吧！我养的是RAW264.7，在状态好的时候消化5-6min还不一定能消化下来，只是现在不知什么原因，消化1-2min状态就不好了。

作者: abc816 时间: 2012-1-5 14:48

可能有一个非常重要的原因大家忽略了，那就是我们用的培养基、血清、生长因子、培养器皿都是山寨货或者大大小小的代理商在储存运输过程中极不负责任，然后造成细胞的乱七八糟的状态。

我做10次干细胞培养，同样的试剂(也只是厂家名称一样，但颜色、质地、外形却不那么一样)步骤，在国内成功1次，在国外成功10次，因此除了高度怀疑这些代理商干了伤天害理的事我找不出其他理由！

我到是认为应该在丁香元成立一个代理商监督机构，只要大家拿出证据，就坚决曝光它，现在的情况是我们很弱势，浪费了钱都算了，关键是时间和精力耗不起！

而且这个监督机构或者子论坛的新闻和动态应该长期放置于首页，这才是大家最关注的，比某些晃眼占版面但毫无意义flash实用很多，这和论文打假不同，因为这直接和每个做科研的人的切身利益有关，一旦遇见山寨和低劣试剂，搭进去的就是时间，代价惨重，并且执行疑罪从有的严厉监督制度（丁香园如果不想或者无力监督，至少开辟一个板块当大家互通信息避免更多的同学上当受骗），比如某一批号某一牌子的试剂大家都感觉不正常，那就毫无疑问绝对不正常，难道还要去检测去鉴定？接着就曝光！NND国内有些代理商很无良，买一个10ug的生长因子，一样的ep管包装，在国外买的原装肉眼就真真切切的看见有很少的粉状物在里面，而国内买的代理商分装品，死活看不见里面有东西，电话打过去它还说是很微量的所以看不清楚——只问一句，一个看得见一个看不见，这难道不是质的区别？肯定有一家在明目张胆的造假！等我回去把那家代理找出来告诉大家，以免再上当。

作者: mickeylin 时间: 2012-1-5 14:49

请问各位大虾，本人最近在养panc-1胰腺癌细胞，一周前复苏的细胞，由于量较少，培养一周后才传代。用胰酶消化时细胞都是一大片一大片的的脱落，虽然吹打了四五十下，但传到新瓶后很多呈团块状，贴壁后感觉像是一个一个小的岛屿，而且很多圆球形细胞附在表面
想知道是消化有问题还是细胞株本来就有问题？不胜感激！

作者: pengke1983 时间: 2012-1-5 14:50

我养HepG2.2.15细胞（稳定分泌HBV的肝癌细胞），出现的情况和圣地亚哥的一样“这几天发现培养基中飘着密密的充满细小的颗粒，很多细胞轮廓都很不明显了。我想这是不是因为支原体或衣原体感染，长到一定程度，就裂解细胞，飘着的是裂解的细胞碎片。”，是衣原体污染的话怎么处理啊，过滤又没办法除去，可是我的细胞也是养了好长一段时间了啊，扔了不是很可惜。

图片附件: 39149743.snap.jpg (2012-1-5 14:50, 56.53 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10142

作者: tieshazhang 时间: 2012-1-5 14:50

请教楼主大哥个问题:我养的是新西兰大白兔骨髓间充质干细胞。从开始培养，原代到第二代都挺好，细胞形态也挺漂亮的。后来实验室有调整，养细胞的人比较多大家就把培养箱分开了，我传第三代后就放在就培养箱里了（坏过一次，刚修好）。第二天发现细胞贴壁的很少，大部分都还漂着，而且整个培养基变成粉红色，以前都是橙黄色。后来发现培养箱上显示的二氧化碳浓度在7.8左右一直跳，不稳定。检修人员检查过后说是风扇坏了，培养箱中二氧化碳不均匀，所以不稳定。我分析可能是二氧化碳分布不均导致培养基偏碱所致，所以我把所有的细胞全转到新的培养箱中，第二天发现培养基颜色虽然好些了，但飘起来的细胞更多了，贴壁的细胞也都开始变圆脱落，我随后赶紧换液，第三天依然飘起很多细胞，贴壁的所剩无几而且形态皱缩变圆，很郁闷，不知道该怎么办。请高手指点是什么原因，该怎么处理？

作者: 伊莎贝拉 时间: 2012-1-5 14:51

楼主，请教个问题。
我们养的是大鼠骨髓间充质干细胞，细胞传到三代之后，总共40多瓶，大概过了又有两三天，实验室用甲醛熏蒸了下，结果第二天发现细胞死了好多，大概20瓶死亡了，死亡的瓶子都有颗粒状的沉淀贴附在瓶底，但是轻轻摇动就会脱壁。我们以为是个别小瓶培养基污染，因为我们培养基是封装到小瓶的，我们怀疑是细菌污染了，专门分装出前面用过的小瓶培养基培养，24小时也没有细菌生长，也没见到真菌，现在就是不明原因。请楼主帮我们分析下，谢谢。而且发现之后我们就马上新配了培养基，把没有污染的全部都换液了，结果今天早上一看，又有8瓶变成那种“污染”的样子，现在不知道怎么办~

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培养基多加点胎牛血清，不知行不行

作者: 麦丽素1986 时间: 2012-1-5 14:52

在此问一下，有没有人养过PK15细胞呢？这个细胞很难消化，即使消化下来也不能吹打成单细胞悬液,都是成团块状，贴壁后，细胞之间有很多像是细胞碎片的东西，不知道如何处理，请高人指点一二！

作者: ffooll 时间: 2012-1-5 14:52

我养的是A549细胞，常常在传几代，就出现细胞颗粒感很强，时间一长就会在培养基中出现细胞少的颗粒，如果一消化就会出现大片死亡，常常养着养着就大部份细胞就老化，死亡了，请LZ及各位高手指点。

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我也养A549，最初是消化不完全,传代效果不好,后来用0.25% ph8.0的胰酶和0.1%的EDTA消化，效率很高，但是很多细胞过早离壁被倒掉了。
目前，我和你遇见的情况一样,上清很清亮,但是细胞像是溶解了,界限不清楚,细胞内有粗大的颗粒，像是老化溶解了，真愁人，生长的也慢了，培养基好几天颜色都不变。
听说A549喜欢偏酸的环境，养过的人建议把用过一段时间的DMEM用浓盐酸10-100ul调PH值,还没试验过。
你找到原因和我交流啊！！

作者: rxcc33 时间: 2012-1-5 14:53

我很奇怪楼主的观点。细胞的生长是需要一定的条件的，像你说的那样反复把细胞从培养箱里面拿出来不会影响细胞的生长吗？细胞刚达到最适合的生长环境，马上环境又变了，这样对细胞不会有影响吗？！

作者: toy 时间: 2012-1-5 14:53

我正在养人胚肺成纤维细胞MRC5，用的培养液是DMEM+10%进口胎牛血清。不知道是不是培养液的问题，还是操作问题，细胞长的特别慢，用的都是新的培养瓶。一周才能传一次代。看楼主有什么建议没？

作者: duoduo 时间: 2012-1-5 14:55

楼主二传的方法不错，但我想楼主忽略了至关重要的一点，细胞形态不好不会是无缘无故的，这样处理的同时还应该寻找原因，才能从根本上加以改善。
还有楼主前面回答问题说培养基没有浑浊应该就不是污染，这肯定是不对的，我想可能是你回答的时候疏忽了。不浑浊不一定没有污染，培养基没有变黄也不一定没有污染，只要细胞生长状态发生改变了，就不能排除污染的可能。

作者: dotaaa 时间: 2012-1-5 14:55

我养的是A549细胞，常常在传几代，就出现细胞颗粒感很强，时间一长就会在培养基中出现细胞少的颗粒，如果一消化就会出现大片死亡，常常养着养着就大部份细胞就老化，死亡了，请LZ及各位高手指点。

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我在养这个细胞，开始也出现颗粒感很强这个问题，后来发现是吹细胞速度过大。
解决办法：细胞扔掉挺可惜的，一般是贴壁后，摇晃培养基，吸走，换新的，类似楼主说的2传。
后面传细胞时，温柔一些就好了。不过A549老化的问题，我倒是很少遇到，我一般是隔天传细胞做实验，一般是半年复苏一次，除非遇到非正常情况，比如培养箱大规模污染，会重新复苏。

作者: guagua 时间: 2012-1-5 14:56

我养的是a7r5细胞，一传代就会有黑色颗粒出现，显得好像污染一样，但应该不是污染，换换夜就少一些，直到传代前都没事，可一传代就出现。不知道能不能用这个方法试下。以前传代别的细胞时没有这种情况出现。是不是我吹打得太用力太粗暴了？
请教下~谢谢！

作者: bamboo16 时间: 2012-1-5 14:56

我养的是正常大鼠肝细胞株BRL-3A，同学给我的，之前传了多少代就无从追溯。最近养老是出现细胞状态不好，比如我传代，0.25%的胰酶消化三分钟内可以消化下来，第二天全部贴壁，死细胞很少，而且长得很快，几乎两天就得传一次。之前老是有细胞拉丝、空泡、变薄等情况，但是也不影响生长，我怀疑是培养基的问题，换了别人的培养基，现在有空泡的细胞比较少，倒是细胞里面出现黑点点，镜下培养基是干净的，黑点点不在培养基里面的。肉眼培养基是橘红色的，也是澄清的。如果是污染应该不是这样吧。但是细胞里面那些黑色的点点到底是啥真希望能有张照片就好了。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:57

楼主二传的方法不错，但我想楼主忽略了至关重要的一点，细胞形态不好不会是无缘无故的，这样处理的同时还应该寻找原因，才能从根本上加以改善。
还有楼主前面回答问题说培养基没有浑浊应该就不是污染，这肯定是不对的，我想可能是你回答的时候疏忽了。不浑浊不一定没有污染，培养基没有变黄也不一定没有污染，只要细胞生长状态发生改变了，就不能排除污染的可能。

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呵呵，这位兄台说的在理。是我回答时的疏忽，措辞不当。
一般来说，污染的发生是很容易从外表象看出来的，培养基的颜色，通透度，折光度都会发生明显的改变，肉眼几乎可见污染物的存在，在显微镜下观察，能够明显看到污染物的存在。但是有一些污染，不常见的微生物污染吧可能有例外，可能会观察不到污染物，但是至少培养基的通透度和折光度一定会发生明显改变。

细胞生长状态的改变，有可能是污染，但是大多数情况下，只要没有明显的污染迹象，细胞生长状态的改变不会是污染引起的。细胞的生长状态时刻在发生变化，影响因素很多。而污染其实可能性最小的一种。并且，实际中，污染的发生情况很少见。我甚至好几次没有在洁净台中操作，只在实验室里，点了一酒精灯，照样没有污染。呵呵。操作其实很重要的额。呵呵。

多多交流呵呵。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:58

我养的是正常大鼠肝细胞株BRL-3A，同学给我的，之前传了多少代就无从追溯。最近养老是出现细胞状态不好，比如我传代，0.25%的胰酶消化三分钟内可以消化下来，第二天全部贴壁，死细胞很少，而且长得很快，几乎两天就得传一次。之前老是有细胞拉丝、空泡、变薄等情况，但是也不影响生长，我怀疑是培养基的问题，换了别人的培养基，现在有空泡的细胞比较少，倒是细胞里面出现黑点点，镜下培养基是干净的，黑点点不在培养基里面的。肉眼培养基是橘红色的，也是澄清的。如果是污染应该不是这样吧。但是细胞里面那些黑色的点点到底是啥真希望能有张照片就好了。

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你用的应该是四季青的牛血清吧？？？

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:58

我养的是a7r5细胞，一传代就会有黑色颗粒出现，显得好像污染一样，但应该不是污染，换换夜就少一些，直到传代前都没事，可一传代就出现。不知道能不能用这个方法试下。以前传代别的细胞时没有这种情况出现。是不是我吹打得太用力太粗暴了？
请教下~谢谢！

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先问一下，你用的是四季青的牛血清吧?或者是澳大利亚或者新西兰产的牛血清吧？

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:59

我很奇怪楼主的观点。细胞的生长是需要一定的条件的，像你说的那样反复把细胞从培养箱里面拿出来不会影响细胞的生长吗？细胞刚达到最适合的生长环境，马上环境又变了，这样对细胞不会有影响吗？！

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我说的是在细胞生长状态很不好的时候，有老化或者其他问题的时候，为了使细胞恢复到优秀的状态，只能择优而取那些年轻力壮，生长状态好的！并不是让你一直这样子！

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:59

请教楼主大哥个问题:我养的是新西兰大白兔骨髓间充质干细胞。从开始培养，原代到第二代都挺好，细胞形态也挺漂亮的。后来实验室有调整，养细胞的人比较多大家就把培养箱分开了，我传第三代后就放在就培养箱里了（坏过一次，刚修好）。第二天发现细胞贴壁的很少，大部分都还漂着，而且整个培养基变成粉红色，以前都是橙黄色。后来发现培养箱上显示的二氧化碳浓度在7.8左右一直跳，不稳定。检修人员检查过后说是风扇坏了，培养箱中二氧化碳不均匀，所以不稳定。我分析可能是二氧化碳分布不均导致培养基偏碱所致，所以我把所有的细胞全转到新的培养箱中，第二天发现培养基颜色虽然好些了，但飘起来的细胞更多了，贴壁的细胞也都开始变圆脱落，我随后赶紧换液，第三天依然飘起很多细胞，贴壁的所剩无几而且形态皱缩变圆，很郁闷，不知道该怎么办。请高手指点是什么原因，该怎么处理？

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我觉得还是PH的问题，刚开始细胞在最不容易生长的时候长的都很好，后来却不贴壁了。这就说明培养基和细胞都是没有问题的，问题出在中间的部分，也就是你说的CO2的浓度问题上。这直接导致了培养瓶内培养基的PH，影响到了细胞膜表面的正常分布，所以细胞贴壁情况改变，细胞悬浮皱缩，变圆是在自保的应激反应，以免死亡。

所以建议你重新确定培养箱的CO2浓度是否真的正常，另外重新配置培养基，把血清浓度提高到15%，PH值配低一点（少加一些碳酸氢钠）。

后续交流。。。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 14:59

请问各位大虾，本人最近在养panc-1胰腺癌细胞，一周前复苏的细胞，由于量较少，培养一周后才传代。用胰酶消化时细胞都是一大片一大片的的脱落，虽然吹打了四五十下，但传到新瓶后很多呈团块状，贴壁后感觉像是一个一个小的岛屿，而且很多圆球形细胞附在表面
想知道是消化有问题还是细胞株本来就有问题？不胜感激！

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建议你在新塑料瓶（大号）中培养细胞，消化的时候先用0.5ml胰酶润一下细胞生长的底部面，然后快速吸走，再加入胰酶进行消化，吹打的时候稍微加大力度。
一定要在塑料瓶中培养你这个细胞，可以避免细胞抱团的情况出现。
后续交流，祝你好运！

作者: zhezhe 时间: 2012-1-5 15:00

我做糖尿病肾小球脏层上皮细胞(足细胞)培养,要用高糖刺激,文献报道正常情况下是RPMI1640+5mMol/L葡萄糖，高糖培养时RPMI1640+３０mMol/L葡萄糖．但我看到１６４０说明书上的葡萄糖含量是２ｇ／Ｌ。折算成葡萄糖浓度是１１．１mMol/L．那我配培养液时该如何配制？谢谢！lz 有养足细胞的经验吗

作者: yychen 时间: 2012-1-5 15:01

我用的是同学给我的进口小牛血清+GIBCO培养液（公司配好的），细胞以前会拉丝啊，空泡啊，后来我完全用同学的培养基了，现在拉丝空泡很少见，就是细胞里面有颗粒。我自己总结原因：1，要么细胞老化了？但是同一批复苏的其他人养得好好的。2，污染了？我的PBS,滴管，枪头，瓶瓶罐罐定时高温消毒。或许是培养基污染，但是细胞长得飞快，两天就得传一次代，而且培养基干净的，高倍镜下都看不到脏东西。3，培养基出了问题，我之前用公司配好送来的培养基细胞会拉丝，空泡等营养不良的情况，用了同学的培养基后上面情况没有了，就是有颗粒，是不是好转的表现？

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:01 标题: 回复 #51 yychen 的帖子

有一些细胞本身就会分泌一些东西如颗粒状。我养脑内皮细胞的时候也是经常出现这个问题。我是用二传的方法慢慢把颗粒物去除的。

据说产自澳大利亚和新西兰的血清经常会有黑色或者透明颗粒状物质存在，我查过资料，有些说是一些蛋白的结晶，有些事杂质没有去除纯净。

不过，既然你的细胞开始出现好转，并且生长速度也这么快，你完全可以试一试二传的方法，看能不能去除颗粒物，如果重复几次之后还是很多或者根本没有减少，那就是细胞本身的分泌物了，可以不用管它吧。

祝你好运啊！

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:02

我做糖尿病肾小球脏层上皮细胞(足细胞)培养,要用高糖刺激,文献报道正常情况下是RPMI1640+5mMol/L葡萄糖，高糖培养时RPMI1640+３０mMol/L葡萄糖．但我看到１６４０说明书上的葡萄糖含量是２ｇ／Ｌ。折算成葡萄糖浓度是１１．１mMol/L．那我配培养液时该如何配制？谢谢！lz 有养足细胞的经验吗

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养过小鼠肾小球细膜细胞，没有养过你说的这种。呵呵。

高糖培养应该是指葡萄糖终浓度是30mMol/L吧。正常培养的葡萄糖浓度也不是固定的，不同的细胞和培养基都不同。

作者: flower-201 时间: 2012-1-5 15:03

培养基的渗透压过少，这个没想过，因为前面的师兄们都是这么养的，这个可能不是问题，这几天发现培养基中飘着密密的充满细少的颗粒，很多细胞轮廓都很不明显了。我想这是不是因为支原体或衣原体感染，长到一定程度，就裂解细胞，飘着的是裂解的细胞碎片。请分析指导。

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我不太清楚这位楼主养的是什么类型的细胞，在我们实验室，一般培养皿中出现大量细小颗粒状物质，而且细胞也都会慢慢死亡，这些我们一般定义为细菌污染，我们培养的都是杂交瘤和肿瘤细胞，不知是不是有共通性。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:04 标题: 回复 #54 flower-201 的帖子

出现大量细小颗粒状物质的时候，应该就是污染了。细菌污染一般能在镜下看到密密麻麻的。支原体或衣原体污染很多的时候镜下能见细沙状物质。这是共同的。

看你描述的情况就是污染了。很像是支原体污染。丢弃吧。

我说的是有时候细胞培养中会出现大的颗粒状物质，但是不是很多，对细胞生长状态影响也不大。这些会是血清的问题或者是细胞自身分泌的物质。可以采用二传去除。

祝你好运啦！

作者: 969 时间: 2012-1-5 15:05

请问楼主你那种“二传”的方法适用于刚复苏的细胞吗？

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:06

对于刚刚复苏的细胞，最好还是不要用，除非细胞真的是长的特别快，状态也很好。在你确定复苏的细胞活了之后，量多了之后，你再进行优选，二传是可以的。这比较保险。呵呵。加油啊！祝你好运！

作者: 兔唇 时间: 2012-1-5 15:07

培养基的渗透压过少，这个没想过，因为前面的师兄们都是这么养的，这个可能不是问题，这几天发现培养基中飘着密密的充满细少的颗粒，很多细胞轮廓都很不明显了。我想这是不是因为支原体或衣原体感染，长到一定程度，就裂解细胞，飘着的是裂解的细胞碎片。请分析指导。

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我养的原代牙髓细胞也出现这种细小的颗粒，主要附着在细胞上面,密密麻麻的，培养液里的倒是比较少，不知道上面东西，愁啊！

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-1-5 15:07

觉得你的方法来传代养好细胞挺不同的,我刚开始学养细胞,我也试试你的方法,我觉得应该能行,特别是贴壁牢的细胞用这个方法应该更能找出好的细胞吧.但是我听说细胞老化以后,贴壁反倒是会更牢,那这样的方法是不是就难处理了呀?

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:09 标题: 回复 #59 爱老虎游tt 的帖子

老化的细胞传代后贴壁用时较长。所以你还是可以帅选出比较好的细胞的。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:09

有养脐静脉内皮细胞的？请大家多交流下新的！我的细胞现在是颗粒很多，而且形态变得又瘦又长，还有很多触角，形态由铺路石变成了多边形，有时候看起来像神经元！请楼主及各位同仁提点宝贵意见！谢谢

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你这个不会是成纤维细胞了吧。

作者: 一叶 时间: 2012-1-5 15:10 标题: 回复 #62 铜雀的帖子

脐静脉内皮细胞本身就是成纤维细胞类型，他的细胞现在有铺路石状长成多边形，伸出伪足，也是成纤维细胞的一种生长状态，细胞有不同的生长状态和生长条件时，可能呈现出放射状、火焰状或者涡旋状。这都是正常的，当然这也说明，你的培养条件已经发生改变，所以，要更换新的培养基。当然，细胞过度变形，则是老化变异的表现。你要引起注意。

作者: wu11998866 时间: 2012-1-5 15:10

最近，我养的MCF-7乳腺癌细胞长的不是很好，而且感觉杂质特别多，请教一下，有什么好方法吗，让细胞生长更快一些。谢谢。

作者: HP007 时间: 2012-1-5 15:11

您好，版主
我养的细胞是兔子的骨髓间充质干细胞，但是一直不是很顺利，我现在用兔子抽骨髓，focoll离心，然后细胞原代培养，已经没有无菌操作的问题了，只是产过一次带之后，细胞数量一直增长的很慢，现在很着急，不知道版主能不能帮我找找原因？

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:12

您好，版主
我养的细胞是兔子的骨髓间充质干细胞，但是一直不是很顺利，我现在用兔子抽骨髓，focoll离心，然后细胞原代培养，已经没有无菌操作的问题了，只是产过一次带之后，细胞数量一直增长的很慢，现在很着急，不知道版主能不能帮我找找原因？

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对于你这个骨髓间质干细胞，我没有养过，做过其他的原代培养。
你为什么不加生长因子呢？你查资料确定这个细胞不需要加么？
另外原代培养刚开始就是这样的，细胞生长状态很慢，所以需要加生长因子刺激，另外血清浓度也要加至20%以上。然后就是需要耐心等待，最好不要频繁移动培养瓶看。。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:12

最近，我养的MCF-7乳腺癌细胞长的不是很好，而且感觉杂质特别多，请教一下，有什么好方法吗，让细胞生长更快一些。谢谢。

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杂质特别多，你具体指的是什么呢？
这个细胞在适宜的条件下的生长速度还是蛮快的，需要20%的FBS。

作者: 克隆鱼 时间: 2012-1-5 15:12

谢谢楼主
杂质就是在显微镜下看到培养基上漂浮一些东西，不知道是什么？我昨天刚配的培养基，以前用的是15%的FBS，再看看细胞长的怎么样吧。
十分感谢！

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:13 标题: 回复 #68 克隆鱼的帖子

你要确定杂质是培养基里本就有的还是在细胞产生的，如果是培养基的问题那就需要你另配了，如果是细胞的问题，你倒是可以试一试二传的方法了。这个可以帮你去掉那些杂质。。

作者: 泡泡 时间: 2012-1-5 15:14

楼主，你好！
前几天我刚开始养细胞，最开始是同学给我传了一瓶，养了两天，长得还好，然后传了两瓶。这两天那三瓶细胞都有不同程度的细胞碎裂样的细小裂片或斑点，但培养基还是清亮的，用PBS洗两三遍也洗不下去。
请楼主分析一下问题出在什么地方，该怎样解决。
多谢！

作者: ladyhuahua 时间: 2012-1-5 15:18

多谢楼主的经验！我想养HL-60细胞和DH-82还有L929细胞，不知道大家有没有养过的，能不能给点好经验，谢谢

作者: BOSS2011 时间: 2012-1-5 15:18

前来求助!
我养的MCF-7是从别的师兄那里拿过来的，用的培养基是DMEM+10%FBS，昨天给我的是一满瓶，所以我拿过来就传代了。一瓶传了三瓶，今天一看，有俩瓶里基本没有贴壁，全是悬浮的团状细胞，幸好还有一瓶里的贴的多一些。现在就只能巴望着那一瓶了。
我现在把我的传代步骤说一下，请大家帮我指证一下哪里做错了。谢谢了。
1，先用PBS洗，去除残余培养基，
2，加入1ml胰酶，是很小的玻璃瓶，1ml刚好够覆盖。我就没有再吸出胰酶。
3，首先镜下观察，约1min，见到极少数细胞隆起变圆，大部分没有变化。
4，放入37°培养箱，计时2min，拿出后见到大部分细胞变圆脱落。
5，加入新鲜培养基终止消化作用，将液体移至离心管
6，1500rpm离心5min，弃去上清。
7，重悬细胞，因为我要传三瓶，所以加了3试管培养基，约9ml吧，然后吹打20下。我老师说我这一步是有问题的，应该只加少量培养基，先把细胞吹匀成单个，再加入相应的培养基，分入瓶中。嗯，我觉得她说的很有道理。
但我听有个师姐说消化细胞时可以待细胞成圆形后，就把胰酶吸走，再加入相应的培养基进行吹打。这样就省去离心这一步，因为我们实验室细胞房的离心机是有点问题的，平时离心都会有很多细胞悬浮在中间，得加大转速，又高转速担心对细胞的伤害。所以我也试验了这种方法，是在我养的R2C上试用的。但是试用结果是我很难吹匀细胞成单个，后来去问师姐，她说要用移液枪吹，比用滴管吹的力气大。是这样么？这种消化方法是不是适用于所有的细胞？
各位大虾们，请指教一下~

作者: whitesheep 时间: 2012-1-5 15:19

各个实验室的条件不同，且个人习惯也不一样，我养的也是MCF-7每次我都是加入3ml胰酶(75cm
)培养瓶，等约2分钟就直接用胰酶吹打，我感觉那样效果很好。

作者: 蒲公英 时间: 2012-1-5 15:19

楼主你说污染的细胞你还是有拯救的办法的，具体是什么呢啊？能赐教么？

作者: moonlight45 时间: 2012-1-5 15:20

楼主说的主要是贴壁细胞的二传，那悬浮细胞有没有什么经验呢？悬浮细胞也会出现一些死细胞或者状态不好的细胞，我问过实验室的师兄师姐他们说可以试试梯度离心，具体怎么个做法啊？谢谢啦！

作者: skytree 时间: 2012-1-5 15:21

顶楼上，盼大家都来说说养悬浮细胞的经验吧。我养的急粒细胞系状态一直不好，细胞不亮，扁，折光性差，增值慢！该试的方法都试过了，郁闷。

作者: 气泡 时间: 2012-1-5 15:21

我最近也是养的A549细胞，传代几次后也出现黑渣现象，用培养基吹打洗几次再到镜下看就好很多，但是传代后又出现这种情况，师姐说是因为消化的时间太久了，我现在正试着消化时间短一些看看能不能把它养过来。

作者: baidukk 时间: 2012-1-5 15:22

总结的不错，有空了会试试的，我的内皮的形态也是不好，好多触角，我还以为就是这样呢？

作者: windy+++ 时间: 2012-1-5 15:23

我也在养MCF-7细胞，复苏的细胞里有小黑点可能是冻存时的血清有杂质，也有可能是细胞代谢产生的。我养的MCF-7细胞里周围也有小黑点不知道是不是传说中的黑胶虫，还是细胞本身产生的。细胞状态不太好，郁闷呐~还请多多指教~

作者: jujuba 时间: 2012-1-5 15:23

我也正要开始养BMSCs，而且是人的,据说很不好养，有没有养过人的这细胞的大虾，支点招，谢谢！

作者: sunnyB 时间: 2012-1-5 15:24

“llo6”的细胞一定是甲醛搞的，通风一段时间再做细胞吧！

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:24

我也在养MCF-7细胞，复苏的细胞里有小黑点可能是冻存时的血清有杂质，也有可能是细胞代谢产生的。我养的MCF-7细胞里周围也有小黑点不知道是不是传说中的黑胶虫，还是细胞本身产生的。细胞状态不太好，郁闷呐~还请多多指教~

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小黑点排除不是污染如黑胶虫的话就应该是血清中的杂质。
灭活的血清比较容易产生黑色小颗粒状物质，肉眼不见，镜下可见。
另外，细胞趋于死亡的时候也会产生这些黑色物质流出细胞外。你可以在传代或者换液的时候，用PBS或者培养基洗一下细胞。这样会好点！

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:25

LZ，你说的方法很值得学习，受教了！我现在遇到一个问题，上学期冻了一批MCF-7细胞，冻之前细胞状态很好，这学期重新复苏，但是复苏出来的细胞长得轮廓不是很清晰，而且也不是之前拿来的那样，细胞面上好像又一点点小黑点，不知道是不是细胞破碎，但是不可能是污染，因为培养液很清晰透亮，不知道问题出在哪了，希望指点下，谢谢！

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不好意思，很久没有来关注我的这个帖子了。呵呵。今天才看到你的问题。
你的这个问题，我现在也遇到了，年前的时候细胞好的不能再好了，过完年回来，细胞再复苏，一直不好。好几次都是这样。我自己也不明白到底问题在哪里。但是可喜的是，现在终于好了呵呵。

对于这个问题，我分析可能的原因：

1.冻存的时候细胞没有处理好！就是没有把细胞的最佳状态保存到冻存。这个冻存的时间还是很重要的。我就不祥述了。

2.复苏的时候，把血清的浓度提高到20%。复苏后，隔天观察，直到贴壁细胞比较多的时候再进行换液。如果相隔时间较长，中间你可以补充培养基进去。

3.不要高速离心，要1200以下。这样会好一点，如果细胞1200很少或者离不出来，可以提高到1500.不要超过5分钟。

呵呵，暂时想到这么多。祝你好运！

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:25

楼主你说污染的细胞你还是有拯救的办法的，具体是什么呢啊？能赐教么？

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对于贴壁生长的细胞的污染拯救方法：
用PBS洗2-3遍后，再加入足量PS洗2-3遍，然后加入培养液，再加入2ml的双抗。隔天重复。
在实在危机情况下可以拯救的回来。如果还有细胞那还是重新复苏的好。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:26

楼主说的主要是贴壁细胞的二传，那悬浮细胞有没有什么经验呢？悬浮细胞也会出现一些死细胞或者状态不好的细胞，我问过实验室的师兄师姐他们说可以试试梯度离心，具体怎么个做法啊？谢谢啦！

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悬浮细胞就只能梯度离心，就是以不同的离心速度对细胞悬液进行离心。一般从高到底。
因为死细胞和细胞碎片与活细胞比较而言，其比重小，沉降速率大。所以低速离心的时候，能够把活细胞离心出来而死细胞和细胞碎片留在细胞悬液中。经过几次的梯度离心，就可以筛选出大部分的活细胞。。。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:28

顶楼上，盼大家都来说说养悬浮细胞的经验吧。我养的急粒细胞系状态一直不好，细胞不亮，扁，折光性差，增值慢！该试的方法都试过了，郁闷。

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PH值你掌握好了么？急粒细胞系对PH值还是很敏感的。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:29

楼主，你好！
前几天我刚开始养细胞，最开始是同学给我传了一瓶，养了两天，长得还好，然后传了两瓶。这两天那三瓶细胞都有不同程度的细胞碎裂样的细小裂片或斑点，但培养基还是清亮的，用PBS洗两三遍也洗不下去。
请楼主分析一下问题出在什么地方，该怎样解决。
多谢！

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细胞碎片是最后可能的，有一些细胞死亡了。去除方法就是洗，再洗，轻轻吹打然后再洗。。。呵呵。

作者: bohe221 时间: 2012-1-5 15:30

我养的是A549细胞，常常在传几代，就出现细胞颗粒感很强，时间一长就会在培养基中出现细胞少的颗粒，如果一消化就会出现大片死亡，常常养着养着就大部份细胞就老化，死亡了，请LZ及各位高手指点。

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这个细胞我在养，它应该算是很皮实的细胞了。颗粒感很强应该就是在凋亡的过程中了，两天一换液或是三天，四天或是一周一传代。细胞密度不一太大。我手里的A549长的很快。用的是5%的血清。你再次传代时离心一下。弃去上清，以免影响其他的细胞，留下状态好的细胞用来传代试试。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:30 标题: 回复 #89 bohe221 的帖子

非常同意这位仁兄的建议。
A549是肺腺癌细胞株，生长速度比较快。正常培养是1640+10%新生牛血清即可。由于其生长速度快，所以必须要缩短传代时间。不能等到细胞长的很多的时候再去传代。必须要在60%-70%生长密度的时候就进行传代，这样子才会保证细胞的状态。
另外，这位兄弟说的离心也是一个不错的方法，可以筛选出比较好的细胞留种。我一般采取双传的办法：
首先不加胰酶，倒掉就培养基加入少量新培养基洗1-2遍，然后直接简单吹打一遍，把贴壁不牢固的细胞吹打下来传入新瓶，然后再洗一遍，加入胰酶消化传代。你可以比较这两批细胞哪个长的更好一些，就知道你的细胞喜欢什么样的方式了。对于A549一般是消化3-5分钟的比较好。要保证细胞被一个个消化开才好。

作者: tianmei001 时间: 2012-1-5 15:34

我在培养H460细胞的时候也遇到细胞传不了几代就开始形态改变的情况，细胞的活力也大不如从前，做了细胞的生长曲线图，并不是平常中的S型标准曲线，不知道为什么，而且计数时第二天的细胞数会比第一天铺板时减少，我想也许是因为细胞生长状态太差，所造成，不知道各位能帮我分析一下吗？应该怎么解决呢，谢谢

作者: yysr238 时间: 2012-1-5 15:34

有个问题请教下楼主~我养的是293T,想试下楼主的二传法，想问下预吹打之后不是要吸走吗？是转到新培养基中？这样的话吹打会不会较后面的不够充分？还有就是不用胰酶消化，仅靠吹打会不会对细胞造成伤害？谢谢楼主！

作者: 薄荷侠 时间: 2012-1-5 15:35

不同的培养基培养出的细胞形态是有区别的，只是不知道对其性能有什么影响。“二传”的做法我认为也不能适用于所有细胞，SP2/0就不喜欢被打扰。
我养的BHK也出现了传代后增值速度变慢甚至停滞的现象，黑点也不少，这倒是可以试试hjdd 的方法的。
另外我也认同不能突然地全部更换原材料，但有时候也是没办法

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:36

有个问题请教下楼主~我养的是293T,想试下楼主的二传法，想问下预吹打之后不是要吸走吗？是转到新培养基中？这样的话吹打会不会较后面的不够充分？还有就是不用胰酶消化，仅靠吹打会不会对细胞造成伤害？谢谢楼主！

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预吹打的可以扔掉的，这一步主要就是不想要贴壁不牢的衰细胞。所以进行预吹打。

不用胰酶消化，只是对于某一些贴壁比较不牢固的细胞。胰酶和吹打是都会对细胞产生伤害的，不过你控制的好的话，可以把这种伤害降到最低，不对细胞产生明显影响。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:36

不同的培养基培养出的细胞形态是有区别的，只是不知道对其性能有什么影响。“二传”的做法我认为也不能适用于所有细胞，SP2/0就不喜欢被打扰。
我养的BHK也出现了传代后增值速度变慢甚至停滞的现象，黑点也不少，这倒是可以试试hjdd 的方法的。
另外我也认同不能突然地全部更换原材料，但有时候也是没办法

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呵呵，你说的对，没有哪一种方法是适合所有的细胞的，我的“二传”法我开始就说了，并不一定适合你们的细胞，你们可以试一试，摸索出你们细胞自己喜欢的条件。呵呵。

作者: @STAR@ 时间: 2012-1-5 15:36

我的A2780耐药细胞养了快一周了，数量上没有什么起色，挺少的，这样子也没法传代呀，只能换换液，或者加胰酶吹散一些。怎么才能呢个养得好一些呢？求教~~

作者: 黄花菜 时间: 2012-1-5 15:37

学习了，我养的是角膜上皮细胞的，原代不传代，在3.5MM平皿中培养完直接提RNA。请教楼主细胞计数怎么计啊，我师姐叫我在显微镜下数，怎么可能数的过来啊。拜托指点下，万分感谢。

作者: utt0989 时间: 2012-1-5 15:38

仔细拜读了，很有收获哦
不知道是否适用于悬浮细胞？我养的是悬浮的，不知道悬浮细胞状态不好的时候用塑料培养瓶养是不是会好一些

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-1-5 15:38 标题: 回复 #98 utt0989 的帖子

你养的悬浮细胞是什么细胞，接种密度是多少？
状态不好的情况下可以考虑部分换液，增加新的细胞进行悬浮等等措施。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:39

有个问题请教下楼主~我养的是293T,想试下楼主的二传法，想问下预吹打之后不是要吸走吗？是转到新培养基中？这样的话吹打会不会较后面的不够充分？还有就是不用胰酶消化，仅靠吹打会不会对细胞造成伤害？谢谢楼主！

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预吹打一下，吸走扔掉，因为这些吹打下来的基本上都是不怎么好的一些细胞了。
不用胰酶，是针对某一些特殊的贴壁不牢固的细胞。大部分还是要用胰酶消化传代。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:40

仔细拜读了，很有收获哦
不知道是否适用于悬浮细胞？我养的是悬浮的，不知道悬浮细胞状态不好的时候用塑料培养瓶养是不是会好一些

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呵呵，悬浮细胞在塑料瓶或者玻璃瓶都一样，只是悬浮细胞非常重要的一点是细胞的生长密度问题。你可以将细胞的密度留大一点，细胞会比较容易生长，另外，换液的时候，换一部分的培养液。这样有利于细胞生长，这要求你计算血清的浓度，要保证里面的是10%，所以你配置的培养基要高一点，自己算吧。呵呵。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:41

学习了，我养的是角膜上皮细胞的，原代不传代，在3.5MM平皿中培养完直接提RNA。请教楼主细胞计数怎么计啊，我师姐叫我在显微镜下数，怎么可能数的过来啊。拜托指点下，万分感谢。

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那你只能同时多做一个副空，培养完提取RNA的时候这空消化下来，用细胞计数板计数。显微镜下数也是可以的，但是自觉太难，数不过来。一般可以划分区域。只数一部分。然后计算。貌似需要特殊工具的。。。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:41

我的A2780耐药细胞养了快一周了，数量上没有什么起色，挺少的，这样子也没法传代呀，只能换换液，或者加胰酶吹散一些。怎么才能呢个养得好一些呢？求教~~

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增加血清的浓度，最好是更换好一点的血清，500ml在2800以上的血清。很快就会长起来。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:41

血清是非常重要的！牢记这一点。做大实验，一定要用好血清。

作者: greenbee 时间: 2012-1-5 15:42

我在实验室主要养的是PC12和HepG2细胞，而且正要打算养脐静脉内皮细胞，但是现在细胞状态着实让人担忧，。每次传代之后总是有几瓶染菌了的（出现明显浑浊），其他的就总是有说不清道不明的黑点点也不知道是染菌了还是什么，培养基倒是很清澈。我是刚刚进到实验室的，遇到这样的事情感觉压力好大！

作者: 911 时间: 2012-1-5 15:42

我的pc12细胞复苏并养了4天了，数量上没有什么起色，挺少的，这样子也没法传代呀，只能换换液。可能是我的细胞密度低了些，可我就省这一瓶了，急啊。培养基用的和之前的是一样的，之前养的都还可以，长的挺快的，两天传一次。现在的不知道怎么了，，不知道怎么才能把它养得多一些呢？求教~~ 热心的楼主给点建议。。。。

作者: 911 时间: 2012-1-5 15:43

对了，楼主，我的培养基也有不少小黑点，我感觉应该是培养基不纯里面的杂质，培养基看上去还有透亮的，并且加入细胞之前，我还做了3天的污染实验，培养基一直都是好的，应该没问题的。但就是不知道这些小点点对细胞的生长有没有影响，之前养这个细胞的时候也是有这些小点点的，，我下午准备把培养基用进口的0.22微米的过滤器过滤下看看，并且稍微加大胎牛血清的浓度，我现在用的是5%的国产的。不知道还有还有什么好的方法，，，请楼主指点。。。
另外还有一个问题，麻烦楼主：
我昨天在做细胞之前本打算在37°预热下培养基，但是没有看指示，打开的时候是25°，等我再去看的时候温度已经到48°了，原来别人之前用的时候把它调到56°了，搞的我极其郁闷，我感觉48°的时间也是很短的，并且我的培养基是从4°拿出放进去的，，时间也没多久。。

我的意思是配我的培养基会不会在这个时间段血清灭活？是不是不能再使用了？？反正我是为了保险其间就没有用，又重新配的。

作者: yes4 时间: 2012-1-5 15:44

请问楼主养的是什么细胞？是成系的细胞系还是原代细胞，两者一样吗？

作者: nn255 时间: 2012-1-5 15:45

我之前养细胞的时候也出现了zyj818说的那种情况，我养的是小鼠肝癌细胞，复苏后第一代细胞长的很好，传代后细胞就变成zyj818说的那样的，开始以为是污染，就让同学帮着复苏了一瓶，但是她养的情况也是相同的，所用的血清是她自己的，同时她也在养细胞，她的细胞就没事！不知道楼主知道这是怎么有一回事么？

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:47 标题: 回复 #107 911 的帖子

1 血清使用之前是一定要灭活的。我不明白你说的到底是你的灭活了还是没有？实验之前，预热是可以的，但是不预热也没什么问题。放在室温下平衡，对细胞是没有什么影响的。

2 那个黑色点点的东西，你过滤一下看看，一般国内产的四季青的血清是有这些杂质的，国外牌子的比较低端的血清也是如此。所以还是建议用好的血清。另外，黑色小颗粒是其他的可能性也是有的。你先排除了杂质一说再探讨吧。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:47

我的pc12细胞复苏并养了4天了，数量上没有什么起色，挺少的，这样子也没法传代呀，只能换换液。可能是我的细胞密度低了些，可我就省这一瓶了，急啊。培养基用的和之前的是一样的，之前养的都还可以，长的挺快的，两天传一次。现在的不知道怎么了，，不知道怎么才能把它养得多一些呢？求教~~ 热心的楼主给点建议。。。。

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细胞复苏生长速度慢是很正常的现象，有一些细胞就是这样，复苏生长速度慢。另外也有可能是你冻存的时候就没有冻存好，细胞状态不好。
建议：1.换成好血清。2.把血清浓度提高到20%。3.不要着急传代，2-3天换一次液。控制好你换液的操作。不要太过激烈。

作者: 笑弯了腰 时间: 2012-1-5 15:48

我之前养细胞的时候也出现了楼上说的那种情况，我养的是小鼠肝癌细胞，复苏后第一代细胞长的很好，传代后细胞就变成zyj818说的那样的，开始以为是污染，就让同学帮着复苏了一瓶，但是她养的情况也是相同的，所用的血清是她自己的，同时她也在养细胞，她的细胞就没事！不知道楼主知道这是怎么有一回事么？

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是这样的，我养的小鼠肝癌细胞，复苏后第一代细胞长的很好，传代后细胞就出现了黑色的点状物体，可以在细胞周围活动，细胞状态也不好，变得瘪瘪的。怀疑可能是污染了，就扔了。然后让同学帮忙复苏了一瓶，培养基和血清都是用同学的，同时同学也在养其他的细胞。可是同学帮着复苏了以后，第一代也是长的很好，传代后，细胞又变得瘪瘪的，周围出现了黑色的点状物体。不知道是啥原因啊！要是说是培养基和血清的问题的话，同学的细胞长的很好啊！

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:48 标题: 回复 #112 笑弯了腰的帖子

细胞和细胞是不一样的，这一点你知道吧？所以说适合用的培养基和血清也是不一样的。不见得他的细胞用这个培养基和血清可以，而你的就也可以。这个你还是需要摸索一下的。适合你细胞的培养条件。
复苏是细胞很好，传一代就不好了。建议你注意一下你的传代方法！黑色的点状物体可能是细胞死亡的裂解的碎片和一些颗粒物。你传代的时候细胞死亡的比较多，你的传代方法有问题。或者是培养条件不好，细胞不能长期生存。

作者: 小野花 时间: 2012-1-5 15:49

关于楼主所说的细胞跟细胞不一样这是肯定的，我同学跟我养的细胞都是用DMEM来养的，而且第一代和第二代细胞用的东西是一样的。可能是细胞消化的问题吧，我再仔细的研究研究。

作者: hyuu 时间: 2012-1-5 15:49

郁闷，昨天培基拿去染色，看到了霉菌，有没有人知道如何处理呀？？？

作者: utt0989 时间: 2012-1-5 15:50

总结的不错。我养的是杂交瘤细胞，最后筛选出阳性单克隆放到24孔板扩大培养，细胞形态开始不好了，长的慢，显微镜下视野也不干净，细胞形态不圆润，反正就是不漂亮，也不知道什么原因。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:51

霉菌的话一般会成白色。漂浮的黑色的碎渣，应该就是细胞死亡裂解的碎片了。如果培养基是浑浊的话，你要考虑细菌污染了。

建议你重新复苏一株新的细胞吧。污染这样很难再救活了。如果有细胞的话你就复苏新的吧/复苏的时候把血清换成好一点的血清，浓度提高到20%。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:52 标题: 回复 #115 hyuu 的帖子

霉菌的话一般会成白色团状漂浮物，镜下能看到菌丝。。漂浮的黑色的碎渣，应该就是细胞死亡裂解的碎片了。如果培养基是浑浊的话，你要考虑细菌污染了。

检测到霉菌的话，挽救的方法是加入一些抗霉菌的药物，这个你可以向一些试剂公司购买，他们有专门的药物。但是还是建议你重新复苏一株新的细胞吧。污染这样即便救活了，细胞的状态也不行。。
如果有细胞的话你就复苏新的吧/复苏的时候把血清换成好一点的血清，浓度提高到20%。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:53 标题: 回复 #116 utt0989 的帖子

换到培养板里，很容易出现这个问题。因为培养环境改变太大。细胞分泌物以及代谢物等浓度过高，会对细胞产生影响的。换液勤一点会好一点。。呵呵。

作者: ha111 时间: 2012-1-5 15:54

都是自己的经验呢不错二传的那个方法倒是第一次听说，不过有时候细胞数量少就不太好整了

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:55

呵呵，是啊，数量少的时候还是不要二传，等长多一点的时候再二传吧。

作者: vvmmoy 时间: 2012-1-5 15:56

你好请教一下我养的SW620。应该是梭形但近期出现圆的多梭的少了请问是什么原因啊。呵呵麻烦了希望能详细点解释。万分感谢

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 15:57 标题: 回复 #122 vvmmoy 的帖子

按道理应该是贴壁不牢或者营养不足导致的细胞回缩。你可以尝试把细胞洗一洗，换液。

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-1-5 15:58

顶，好贴
我想知道，细胞最多能传多少代？我的细胞现在已经50几代了。不知道能不能用了！
共同努力！

作者: junjie05 时间: 2012-1-5 16:12

LZ，请教一下，我正在做大鼠的原代小胶质细胞的培养，用多聚赖氨酸包被一次性的塑料瓶，培养基是MEM+10%Hylcone灭活血清，里面加了双抗，MEM液体培养基我是在Hylcone公司购买的液体培养基，里面加了HEPES和NaOH,之后培养基的PH值在6.7-7之间，调节ph值的目的是因为我培养后7天都不要换液呢，可现在是细胞根本就培养不出来了，成片的细胞都死了，大家怀疑是因为染菌了，可培养基做无菌培养也没有问题啊，还有人建议我把PH值调到7以上，这样可以吗？
此外，最近我想培养N9细胞，请问您有养这方面细胞的经验吗？
急切盼望您的回复，谢谢！

作者: 社会主义好 时间: 2012-1-5 16:13

新手报道：我养的是骨肉瘤细胞株MG63，细胞生长很活跃，第一天接种几乎第二天就已经长满瓶底传代了，之后每隔一天就要传代一次了。但是由于复苏的是别人的细胞株，细胞状态不是很好，不够饱满，细胞内总是会有一些黑色的颗粒样物质，不够透亮的感觉。请问有什么好的方法可以改变这种情况？

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 16:14

顶，好贴
我想知道，细胞最多能传多少代？我的细胞现在已经50几代了。不知道能不能用了！
共同努力！

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这个细胞株的话应该是没有问题的。我的有些细胞甚至传到100多代。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 16:18

LZ，请教一下，我正在做大鼠的原代小胶质细胞的培养，用多聚赖氨酸包被一次性的塑料瓶，培养基是MEM+10%Hylcone灭活血清，里面加了双抗，MEM液体培养基我是在Hylcone公司购买的液体培养基，里面加了HEPES和NaOH,之后培养基的PH值在6.7-7之间，调节ph值的目的是因为我培养后7天都不要换液呢，可现在是细胞根本就培养不出来了，成片的细胞都死了，大家怀疑是因为染菌了，可培养基做无菌培养也没有问题啊，还有人建议我把PH值调到7以上，这样可以吗？
此外，最近我想培养N9细胞，请问您有养这方面细胞的经验吗？
急切盼望您的回复，谢谢！

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您做原代培养不用加生长因子么？

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 16:19

新手报道：我养的是骨肉瘤细胞株MG63，细胞生长很活跃，第一天接种几乎第二天就已经长满瓶底传代了，之后每隔一天就要传代一次了。但是由于复苏的是别人的细胞株，细胞状态不是很好，不够饱满，细胞内总是会有一些黑色的颗粒样物质，不够透亮的感觉。请问有什么好的方法可以改变这种情况？

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既然细胞很多。长得又快就可以二传啊。仔细看帖子。。。

作者: 黄花菜 时间: 2012-1-5 16:19

没看到文献上加生长因子啊，我做的是原代小胶质细胞的培养，好像原代神经元培养用加生长因子吧，困惑中，不知道问题出现在哪

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 16:20

LZ，请教一下，我正在做大鼠的原代小胶质细胞的培养，用多聚赖氨酸包被一次性的塑料瓶，培养基是MEM+10%Hylcone灭活血清，里面加了双抗，MEM液体培养基我是在Hylcone公司购买的液体培养基，里面加了HEPES和NaOH,之后培养基的PH值在6.7-7之间，调节ph值的目的是因为我培养后7天都不要换液呢，可现在是细胞根本就培养不出来了，成片的细胞都死了，大家怀疑是因为染菌了，可培养基做无菌培养也没有问题啊，还有人建议我把PH值调到7以上，这样可以吗？
此外，最近我想培养N9细胞，请问您有养这方面细胞的经验吗？
急切盼望您的回复，谢谢！

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仔细分析了一下，发现有些疑问：
1:你培养7天不换液，培养基的营养够么？一般3天，至多5天培养基就不行了，何况还是原代细胞。我的原代3天换液都还是用的20%血清，血清还是顶级的胎牛血清，4000RMB/500ml。

2：PH值的问题，你的PH值位于6.7到7之间，再培养7天，PH值估计就在4-5左右了。细胞应该会自杀了。我原代培养基PH都是调整在7-7.5左右的。还是3天换液。

我还是觉得你这个换液时间把细胞拖死了。。。

作者: yhz1973 时间: 2012-1-5 16:21

哦，我培养的这个原代小胶质细胞是一个韩国回来的博士教我的，她用这种培养方法都已经博士毕业了，呵呵，不过我和她用的培养基厂家不同，其余的都是大同小异，培养7天后，PH值在6左右啊，她说这种方法就是要求不换液的，呵呵，不过下次我也打算按照楼主的做法提高PH值，增加血清浓度，试试看

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 16:22 标题: 回复 #132 yhz1973 的帖子

我还是觉得你要查查文献，再咨询一些做过的，这个换液时间的问题我还是觉得需要调整。

作者: bongte 时间: 2012-1-5 16:23

我刚刚开始养血管平滑肌细胞不久，因为我们这边之前没人养过，所以很多时候我处于摸索和迷茫状态，虽然你不一样养过，还是希望你能给予帮助，先谢谢了！

我养的血管平滑肌细胞，有段时间细胞很难贴壁，种了96孔板差不多要三天才能贴壁长出形态来，后来试了一下用多聚亮氨酸铺板，贴壁时间缩短了，但是感觉效果还是不很理想。

我的大致步骤：

我原来在消化后加培养基离心后，再用PBS离心洗一遍的，但是后来听别的医院的师兄说他们不离心的，不知道是不是因为这个细胞经不起离心和吹打，因为我之前的时候吹打时间久点的话细胞贴壁和状态就会有点不一样的，所以我现在加胰酶消化后（消化到细胞质回缩即可），弃去胰酶，再用PBS洗一遍（我怕消化后的细胞贴壁不牢会被洗掉，所以只洗一遍），然后再加新鲜培养基吹打下细胞培养，我也有点担心胰酶残留，所以第二天一般会换个液，但是有一段时间，第二天细胞根本就没贴壁，没办法换液，而且不知道什么原因，我的细胞贴壁貌似不是很牢，种板后要是换液的话我感觉会有一些细胞被换掉的（镜下发现贴壁细胞比换液之前少了些），我试过半换液，貌似也不是很理想，所以要是种板的话我一般就不换液，等他贴壁后直接处理了。

奇怪的是这些细胞虽然贴壁久了点，但是一般3天还是可以贴壁的，并没有死的，之后长出来的细胞状态还是好的，跟前几代的长的并没有多大差异，一开始可能是因为我去血清的时间久了点（24h），但是后来我不去血清了的细胞还是这个样子的，不知道是什么原因，苦恼耶，呵呵！

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-1-5 16:24

看了楼主的文章真是受益匪浅。我有个问题请教：在提到的“二传”中，第一步消化结束后是不是用完全培养液终止消化，然后就直接放到培养箱中培养？用不用离心后用培养液重悬后再放到培养箱中，观察细胞贴壁时间？我在养N9小胶质细胞，但用LPS刺激一直检测不出NO的释放，有人说是我细胞生长速度慢，细胞状态不好，所以准备采用您所说的“二传”。

作者: 四福晋 时间: 2012-1-5 16:24

我养的是贴壁细胞，最近细胞总是成堆儿生长，分散度不好，堆儿中间的细胞明显铺展的不好，不知道怎么回事，真的希望得到指点。。。。非常感谢！

作者: 969 时间: 2012-1-5 16:24

的确是好文章，谢谢楼主了。我最近在养H460和A549，我是细胞新手，嘿嘿，发现A549长得很好，但是H460养了块一个月了，一直没有起色，细胞状态一直不好，总感觉里面有黑乎乎的东西，我也不知道怎么办才好，看了楼主的二传法，决定试试，楼主知道这是什么原因吗？望赐教，感激！

作者: misswu61 时间: 2012-1-5 16:25

我是从中国医学科学院肿瘤细胞库买的这个细胞，细胞来后海客隆胎牛血清15%，加1640培养，一次性培养瓶。细胞质和细胞外见很多黑色颗粒（打电话问说是这个细胞就是这个样子），但细胞长的很快（他们自己说是这个细胞长的慢），我用我自己的敏感株测了一下耐药性，耐药指数1.01，基本不耐药，又打电话过去问，说是要自己加顺铂加压再诱导下耐药性，按他们提供的方法我从0.5ug/ml到2.0ug/ml顺铂加压培养，细胞大片死亡，剩余的状态慢慢变差。（从低浓度到高浓度，我并不是一下子就加压的，低浓度的顺铂培养后，换无药的培养基，还是一样的结果）。我怀疑他们的细胞根本不耐药，打电话过去后，人家一口咬定，细胞没问题，耐药指数在6以上，而且态度非常恶劣，说是我自己的问题，只要细胞长的好，耐药不耐药不是他的问题，是我实验的问题，他没有义务帮我把实验做的完美，还说这个细胞不是我一个人从他们那买了，很多人买了都很好，我说能不能把这些人的电话给我，我自己打电话过去请教人家，他说不可能透露客户的资料，说是怕我打扰他们客户的正常工作！我想中国的科研氛围还没到这个地步吧？？丁香园不就是为了科研工作的交流而成立的吗？我说那就把如何加压的方法再详细说一次，人家竟然说我们的方法你用着不行再问干什么？自己查文献去，又不是一年级的小学生！！我彻底无语。。。今天态度极其恶劣，极其不负责任的是一位田姓的女老师，作为一名在线的学生，我深深感觉自己真不是这位田姓女老师的对手，她冷血的心肠，咄咄逼人的态度，让我在电话里张口结舌，无言以对，我不是无赖，不能不讲道理的在那和这位田姓女老师胡搅蛮缠！！今天一天气的吃不下饭。

有没有人从这家买过这个细胞啊？到底是我自己的问题还是他们细胞的问题啊？？

作者: ffooll 时间: 2012-1-5 16:26

我养的是A549细胞，常常在传几代，就出现细胞颗粒感很强，时间一长就会在培养基中出现细胞少的颗粒，如果一消化就会出现大片死亡，常常养着养着就大部份细胞就老化，死亡了，请LZ及各位高手指点。

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这位同学，请问你这个问题解决了吗？我的细胞也是这样的问题，细胞颗粒型强，现在长的很慢很慢。

作者: loli 时间: 2012-1-5 16:27

后面不知道到底用玻璃瓶好还是塑料瓶好，迷糊了。。。

作者: 吴才子 时间: 2012-1-5 16:28

楼主，请教一下。我养小鼠原代小胶质细胞，用的培基是DMEM+10%FBS+双抗（但血清没有灭活），原来养的很正常，后来突然有一天就不行了，细胞从第二天开始就会出现很多黑渣滓，贴壁，不易摇下来，还有很多漂的渣滓和细胞，而且细胞状态也是一天比一天差。但是培基是清澈的，也不像是污染。请教一下我该怎么办，好着急啊。

作者: fsdd817 时间: 2012-1-5 16:30

请教各位大虾一个问题：
小妹养的是食管癌Eca109细胞，传代时误用了无血清培养基，第二天看的时候很多细胞都漂起来了，之后赶快换了含10%FBS的培养基，但后来细胞状态就不好了，细胞间隙里有很多颗粒状的点点，换液的时候用PBS洗过，再次传代的时候离心过并且换了瓶子，都没有很好的效果，不知该怎么挽救呢？可不可以换用更高血清的培养基试一试？谢谢！！
附图：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10144

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 16:31

楼主，请教一下。我养小鼠原代小胶质细胞，用的培基是DMEM+10%FBS+双抗（但血清没有灭活），原来养的很正常，后来突然有一天就不行了，细胞从第二天开始就会出现很多黑渣滓，贴壁，不易摇下来，还有很多漂的渣滓和细胞，而且细胞状态也是一天比一天差。但是培基是清澈的，也不像是污染。请教一下我该怎么办，好着急啊。

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支原体污染。需要重新培养了。处理过后也比较麻烦，另外，所有培养区域必须进行彻底消毒了。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 16:32 标题: 回复 #142 fsdd817 的帖子

不要用高血清的培养基。正常血清浓度培养。
按照我的方法进行细胞的二传，筛选出好的细胞。传之前，PBS彻底清洗。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 16:34

看了楼主的文章真是受益匪浅。我有个问题请教：在提到的“二传”中，第一步消化结束后是不是用完全培养液终止消化，然后就直接放到培养箱中培养？用不用离心后用培养液重悬后再放到培养箱中，观察细胞贴壁时间？我在养N9小胶质细胞，但用LPS刺激一直检测不出NO的释放，有人说是我细胞生长速度慢，细胞状态不好，所以准备采用您所说的“二传”。

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如果细胞比较少，敏感，胰酶消化后，吸去胰酶，加完全培养液终止消化吹打培养。如果细胞比较皮实，可以离心后再重悬培养。

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 16:35

我最近养的也是A549，出现和你想同的状况，不知你的问题解决否，望赐教经验，谢谢了

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A549需要DMEM高糖+10%FBS。FBS尤其需要质量好的，特级的。这个细胞培养时，生长速度特别快，所以需要短时培养，2-3天就要消化传代，及时换液。

作者: rxcc33 时间: 2012-1-5 16:35

请问楼主哪里可以买到好点的程序降温盒啊？

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 16:36 标题: 回复 #147 rxcc33 的帖子

这个你找生物试剂公司之类的吧，应该都有，具体哪个牌子，我还是推荐德国的。你可以问一下，我一般都是自己控制温度降温的。不怎么用程序将温盒。

作者: lixi559 时间: 2012-1-5 16:37

楼主你好，请教你个问题：我在刚刚开始做兔子的主动脉内皮细胞的原代培养，但是对于选用什么消化液很困惑，多数是0.125%胰酶消化10min、0.1%胶原酶消化15-20min，我消化下来的细胞总是很少，而且贴壁的也少。我不知道和消化液有没有关系。希望你能指点一二。是不是消化液的问题。有没有这方面的经验可以传授一下，谢谢了。

作者: DNA 时间: 2012-1-5 16:38

请问楼主，养过THP1细胞吗？是悬浮细胞，总是养不好，一般传一两次后，出现许多细胞碎片，小颗粒物，细胞状态不好，不圆润。培养基血清应该都没有问题，都买的gibco的，不知道是什么原因啊？急求解答，感激不尽！！

作者: 铜雀 时间: 2012-1-5 16:39

楼主你好，请教你个问题：我在刚刚开始做兔子的主动脉内皮细胞的原代培养，但是对于选用什么消化液很困惑，多数是0.125%胰酶消化10min、0.1%胶原酶消化15-20min，我消化下来的细胞总是很少，而且贴壁的也少。我不知道和消化液有没有关系。希望你能指点一二。是不是消化液的问题。有没有这方面的经验可以传授一下，谢谢了。要是能有具体的实验方案更好了，我的邮箱：499725289@qq.com

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内皮细胞即使没有消化下来，进入培养之后，也会从血管段里面爬出来的。需要时间，我一般5天之内是不换液的。需要一段爬出来的时间。一般消化的过程并不是把内皮细胞直接消化下来的，当然有一部分。另外胶原酶的质量是个重要的问题。有提高到0.15的吧。

作者: TAT 时间: 2012-1-5 16:40

楼主您好！非常感谢您的经验分享。
我最近养U251细胞，发现总是有几瓶细胞里面会有一些杆状的悬浮物，在培养基里也有。不知道是不是支原体或是衣原体污染？？培养基一直是清亮的，好像细胞生长状态不影响。谢谢！

作者: flower-201 时间: 2012-1-5 16:40

我现在养的人食管癌Ec109细胞，用0.25%的胰酶+0.02%的EDTA消化后很难从瓶壁上吹下来，请师姐帮忙也不行，请问是不是细胞太老了？请问楼主还有别的什么原因吗？
另外请问有在天津的同仁养人食管癌Ec109细胞的吗？能否转赠，或者交换？哪家卖的好些？

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