标题: [讨论帖]实验室成败经验 [打印本页]

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作者: 阿敏    时间: 2012-1-14 17:31     标题: [讨论帖]实验室成败经验



（转载）
谈谈你在做与细胞相关实验中的体会和收获，或喜或悲，一路从实验中走来，我们一定都感触颇多，细心观察和思考一下，做实验以来，你是否犯了很多的小错误，是否经历了一些实验的失败？是否又摸索了很多成功的经验，那么你是如何调整和思考的呢？这些体会有很多都不是能从书本上得到的，为什么不让大家一起来分享呢？每一个细节，每一份体会，都可能会给别人带来更多的便利，同时，你也一定会从别人的经验中收获许多。

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作者: 阿敏    时间: 2012-1-14 17:36


呵呵，我先抛砖引玉吧，其实实验中感触也是很多的。
记得刚养心肌细胞时候，开始时候很顺利，但有一次突然细胞就不怎么贴壁了，换液时候一吹打，就发现有许多细胞脱落。我检查了培养箱，可是别人的细胞都长的很好啊，培养基的问题？我仔细观察了一下，培养基粉红透亮，绝对不会污染，血清也没有问题啊，大家都是公用的血清，当时我很迷惑，后来我象老师如实反映问题，他听完我的叙述后想了想，让我把培养基拿给他看，然后告诉我，你的培养基颜色太深了，肯定偏碱，细胞在偏碱的情况下培养，耐受能力会逐渐下降，可能是产生脱壁现象的原因，后来我重新测了一下培养基，为7.5左右，我用灭菌的HCL调了一下，培养基颜色变成淡红透亮，再次培养，发现细胞贴壁比较好了，搏动效果也不错，因此，我以后每次培养前都要重新调好PH值，我觉得很多因素是能影响PH值的，这也算是实验的一点收获吧，呵呵，当然还有别的体会，以后慢慢说吧。
我也就养过几种常见的细胞，群里有很多养细胞的高手，我需要好好请教学习呢，希望都能给大家在这里留下一些宝贵的经验，从小的来说，是热情的帮助别人，从大方向来说，也给中国的科研出一份力，展现自己存在的价值

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作者: 盼盼    时间: 2012-1-14 17:37

我也来一个，刚开始养MOLT－4细胞的时候，细胞状态一直没有传说中好（前辈），常常发现胞内有很多颗粒，亮度也不够，但是增殖却挺旺盛。还以为这大概就是正常的，冻存了几管，结果复苏后状态更差，很郁闷。后来请教一高手，怀疑是营养不够，就换用20％的小牛血清培养（之前用的10％），状态果然转好，成团细胞增多，一团团象葡萄一样，看了就高兴！再后来，又换用新买的一批血清，20％时长的更好，调到10％也长得不错。估计以前是因为那批血清质量不好，影响了细胞生长。所以，我认为以后养细胞，用的血清浓度最好是每批次血清都摸一下，不一定要以参考文献为准，毕竟国产的血清质量差异比较大啊。

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作者: yes4    时间: 2012-1-14 17:38

我的实验感受：在做实验时经常会有一些低级错误的发生，例如，我在做细胞免疫组化时就发生了这样的一个错误：我的细胞是养在24孔板里的，细胞固定时我就直接加入了丙酮固定，结果扳子里面一片白白的，这时才赶紧询问他人，方知塑料制品会被丙酮所溶，真是好笨啊，另有一次，我 做 细胞爬片 时，因为觉得盖玻片不好处理，就自做主张地用了载波片（那可是我 自己花钱去做的 小波片呀），结果是虽然细胞长在了上面，但是用荧光显微镜观察细胞染色情况时却怎么也看不清楚（以后换用了盖波片就好了），被实验室主任训了一顿：谁让你自做主张换波片的？唉，不仅花了钱，浪费了 时间，白费了心血，才得出这样的结论。望xdjm做实验时一定要多咨询多请教噢。因为我所犯的 错误既往都有发生过。

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作者: tieshazhang    时间: 2012-1-14 17:38


我觉得养细胞无菌操作是关键，对于配制培养液时，有些人为了让培养粉充分溶解，搅拌4小时或更长时间。其实这完全没有必要，一般培养基的固体组分还是易溶于水的，搅拌的时间长了会增加污染机会，虽然后来滤过除菌了，但细菌的代谢产物比如脂多糖谁能够把它滤掉？细菌的代谢是很快的，甚至在常温下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的经验就是搅拌30min-60min就把它过滤。
另外关于培养基的pH问题，一般按照说明书操作，加入所说的NaHCO3量，与预计的pH不会有什么距离，也就是说基本上不用调pH，如果相差大，要考虑三蒸水的质量是否有所下降，当然这时调pH也是不得已而为之。我配培养基时基本上不调pH，只是用试纸检测一下pH，观察一下培养基的颜色。

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作者: hyuu    时间: 2012-1-14 17:38

刚开始做彗星实验的时候，按照实验步骤一步一步的做，电泳完发现胶全脱了！哭啊！怎么想也觉得没做错啊，问了一个师兄，方才知道，载波片要先泡酸，洗净后再泡乙醇，用前再拿出来。试了试果然不错！高兴极了，拿着染好的片子去看，发现背景so红，简直什么也看不清，又郁闷了！于是又东找西找，在园子里发现，有人染好后，将染液冲掉的，又试了试，果然！其实做实验的时候，有很多细节没写在实验方法上，还是要先请教一下做过的人，仔细看一下有关的文献之类，才不会多走许多弯路啊！

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作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-14 17:39

鄙人也算养了快一年的昆虫细胞了，而且最近又在做昆虫血液的原代培养，积累了点点经验（也许在高手看来根本算不了经验，贻笑大方啦），说出来大家共勉：首先，要广泛阅读细胞培养方面的专业书籍，打造自己扎实的专业基础，为以后的操作作准备，这方面的书有很多，《体外培养的原理与技术》，薛庆善主编，科学出版社；《细胞实验指南》，D.L.斯佩克特，etc著，黄培堂等译；《细胞培养》，司徒镇强，等等……其次，每种细胞的培养条件都不相同，别人的经验和书本上的protocl都只能作为参考，真正重要的是自己培养过程中的不断摸索，这就需要对自己培养过程中细胞出现的状况作详细记录，随时总结。再次，培养者极大的耐心，而过程中的影响因素又很多，这又需要培养者必须综合细胞培养是“细活”，其过程需要考虑各种影响因素，当出现问题时一一加以排除，找到最佳解决方案。我在这里没有讨论细胞培养的细节问题，因为那样的话是说不完的（也许有朋友会认为我在泛泛而谈，呵呵），暂且说到这，我去处理细胞了，以后再说……

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作者: BUK    时间: 2012-1-14 17:39

说起细胞培养，要说的确实很多。我就怎样防止污染说说我的体会。每个人都担心细胞被污染，每个人都碰到自己的细胞被污染。起初我学习细胞培养的时候，都是向师哥，师姐学习。基本上就是依葫芦画瓢。随着时间的推移，自己也就觉得有些步骤可以省略，有些就要注意。我个人认为比较重要的几点如下：（1）东西一定要用自己的。既不要借别人的，也不要借给别人。可能大家觉得比较自私。实际上还是很有好处的。并不是每个人的操作都规范，因此相互之间串着用，很容易造成交叉污染。（2）我习惯口对口倒液体，在倒前倒后都要在酒精灯上过一下。自己认为比起用吸管吸更能很好的防止污染。步骤越简单，越能防止污染。而且还能节省很多吸管。（3）一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要做到半路，又出工作间拿东西，这样增加了污染的机会。（4）整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。比如手机响了，最好不要接。我一般操作的时候将手机关了，手机声音响起，好烦躁。（5）我一般开紫外线照射台的时候，就将培养基、酶、DHANKS液那到室外让它自然升温。这样40分钟后，温度也升上来了。有很多人将他放到37度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里面很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水域锅那出后，最好找个毛巾插干上面的水。（6）操作前要洗手，用75%酒精搽手。（7）用完操作台，要打扫卫生。（8）细胞要经常冻存，我一般只要细胞状态好就将细胞冻存起来。细胞状态差了，扔掉，重新复苏。这是一个必须养成的习惯。毕竟很多情况下，细胞并不是因为污染了，才让你感到头痛。这样你不会担心没有种子了。（9）我一般是不加双抗的，只要注意，不会污染。

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作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-14 17:40

怎么说呢？细胞培养的过程－－痛并快乐着！
老师告诉我细胞培养与我的课题密切相关，我能不听吗？不能！
懵懵懂懂 地开始了学习，准备，预试验，实验。。。
当经历了失败，挫折，懊恼，郁闷；
硬着头皮询问，查阅，反思，尝试；
逐渐开始了解，见效，成功，喜悦，
这时，老师告诉我暂时放放！！
？？我不知道说什么好，还能说什么！
这是我的痛！
但在细胞培养中还是有所收获，实验中我知道日常生活所谓的“清洁”与实验要求的“无菌”相去甚远！有好几次，实验中情急都不由的想去吹吹！哈哈，还好，戴着口罩！其次，发现细胞培养真是个淘冶情操的活动，无论你性子多急，脾气多燥，不想事倍功半的话，最好老老实实，小心翼翼，按部就班地操作！半点马虎不得！最后，谈点实验心得，开始时总是刻意摩仿，简单操作，什么都不求甚解，结果是不断遇到问题，不断向别人请教，而别人只能提供通用的解决办法，对自己的问题没有什么帮助，最后还是要自己摸索才能解决！费时费力费工！慢慢发现细胞培养很重要的是，自己只要了解试剂中每种成分的作用，实验中每一步的意图，遇到的问题就会迎刃而解！其实是就没什么问题了！◎
这是我的快乐！

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作者: pengke1983    时间: 2012-1-14 17:40

开始养细胞的时候，实验室里只有一个师兄是养过的，很多东西不懂，刚开始师兄只肯让我洗管子，在旁边看；后来自己一步步学起来，看了很多资料，自己买耗材，去上海细胞库买细胞，配培养基、消化、冻存、复苏。刚开始犯了很多错误，消化的时候严格按照参考书上写的来，结果5分钟后细胞全死了；冻存的时候在-20度放置时间过久，结果复苏的时候一管细胞活下来的就十七八个，把含细胞冻存液的培养基吸走加入新鲜培养基的时候观察培养瓶，发现培养瓶简直比我洗的还要干净；后来知道光看参考书是没有用的，相同的细胞在不同的条件下实验条件也不同，需要自己摸索，参考书只能参考，不能照搬，现在差不多一个人同时养5个细胞没问题。还有我比较勤快，细胞室大部分时间都是我打扫消毒的，虽然累点，但是细胞不污染，比什么都强。

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作者: lixi559    时间: 2012-1-14 17:41

说起来养细胞也有几年了,但总是有一种避而远之的想法,一想起天天刷瓶子,泡酸,高压灭菌,过滤......这些琐碎的事情太多,真是不想做啊
培养的细胞不算少,怎么弄怎么死不了,但是后来该养293了,细胞却如此脆弱,在拯救它的日子里,一天看3遍,随时准备换液,随时提心掉胆,真是觉得好累啊!

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作者: duoduo    时间: 2012-1-14 17:41


马上要毕业了，回想起来最初做实验养细胞，犯了一个低级的错误，让我郁闷了两周，是这样的：
我们科里本来养细胞的不多，那些东西都要自己准备，配试剂、配培养基、分装小牛血清，甚至包括烧三蒸水，这些东西准备了一个星期，从别的同学那里拿了一瓶细胞就开始养了，发生了一件非常奇怪的事，细胞没有污染，但是消化一次细胞就少了一部分，贴壁困难，过了好几天又消化，细胞就更少了，百思不得其解，偶然的一个机会才发现配PBS时将氯化钠拿错了，结果用氟化钠配的，所以细胞越来越少，从中得到一个教训，有时候自己犯了错误不是很容易发现。

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作者: duoduo    时间: 2012-1-14 17:41

接着上面的话说：有一点我要提请所有养细胞的战友们注意的是，从做原代细胞培养的一开始，就必须有一个理念，那就是想着我的建系（株）会成功（这也是师兄师姐们毕业前传授的“秘笈”），其意思不是说成天想着我所建的系以后如何如何有价值（As we known，并不是每一种新建的细胞系都有很大的价值，当然这个可能还是有的），实际上是说你在从一开始做实验的时候就要想到以后建系成功后的后续实验，包括细胞系的分子标记鉴定，病毒敏感性试验，建系后的细胞与原来来源组织的差异，etc.所以说要详细记录原来取材时的材料种类，生长状况等，以便以后的实验有一个相同的标准，否则就是实验设计欠缺合理性了（严重啊，老板会骂的！）。另外，整个培养过程中要详细、客观的记录细胞的变化情况（包括文字和照片），对自己和下一届同学都是非常重要的第一手资料！一家之言，高手多多指教！

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作者: glass    时间: 2012-1-14 17:42


本人原是学医学的，跳槽出来进入一家生物制品研究所从事细胞培养工作，而去一做就是八年。这期间的酸甜苦辣只有自己清楚，首先是没有人教怎么进行培养，很多都是自己看书或经过大量的试验研究来获得的知识。没有学会时时常被教授骂，学会以后教授就每天都乐呵呵。哎........烦啊。现在虽然不是什么培养细胞绝顶高手，但多年来几十种细胞株在手中还没有死亡或变异过（不是吹牛啊，呵呵.........）。目前已经改行做药品研发了，但多年积累的经验希望和大家共同探讨。

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作者: 阿敏    时间: 2012-1-14 17:42


很感谢大家能在这里畅所欲言，但可能是我在置顶贴中没有说明白，希望这个贴子不仅仅是给大家抒发实验感想的地方，而是通过实验中所犯的一些错误和解决方法，来给其他群友们一些有宜的提示和参考，使他们能有一些捷径来快速掌握实验技能。所以，我在这里诚恳的希望后面跟贴的群友们，多谈谈实验中的技巧和注意问题，而不是自己的不断感慨，谢谢支持！

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作者: misswu61    时间: 2012-1-14 17:43

我养的是脂肪细胞,我要说的是前几次细胞过滤后总是有很多不明杂质,一些小的亮点.而且细胞数量特别少.不爱贴壁!!郁闷了好几天!!后来,我一个师兄,他说,过滤时不要用枪吹细胞!! 如果用力吹,筛网就像刀片一样,把你的细胞全部切碎!! 恍然大悟!
从中得到一个教训,做实验不要着急,要慢慢来,做仔细了,只要实验不出错,那么你就是在节省时间呢!!!

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作者: 小鱼鱼    时间: 2012-1-14 17:43

我曾经在自己制作的无细胞真皮上养过成纤维细胞，无细胞真皮是按照文献的方法制作的，把成纤维细胞接种到无细胞真皮上的方法也是按书和文献中的方法，可是很奇怪，成纤维细胞怎么都不长，我重复了好多次，结果都是失败，后来又做了对照，同样的条件，一个平皿中直接接种成纤维细胞，另一个平皿中放入无细胞真皮，再接种成纤维细胞，结果，没有无细胞真皮的平皿中细胞长得很好，这样说明不是细胞和平皿的问题，那么问题在哪里呢？我苦思了很久，觉得是不是无细胞真皮在处理的过程中用到了一些化学药品，对细胞的生长有害，可是在接种细胞以前我已经按文献上的方法将无细胞真皮用DMEM培养液浸泡了48小时呀，在后来的实验中我就将浸泡的时间延长，并在中间每天换浸泡液一次，经过5天的浸泡以后，成纤维细胞的接种最终成功了。这份迟到的成功提醒我，对于书和文献上的东西，不能不信，也不能全信，很多东西还得靠自己在实验中摸索。

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作者: vvmmoy    时间: 2012-1-14 17:43


现在在做双染(annexin-v/pi)和PI染色,由于所里没有FACS,做好后还要打的40min去检测,而且是按照老板在德国时用的方法和用量,结果好象还不是很好,还得自己摸浓度,做一次要老早起来,怕时间赶不上.总之感觉每做一次就要累掉一层皮,如果结果好那就什么都值得,如果不好,这一层皮就白掉了,所以感觉以前一个老师说的那句话"实验通常都是99%的失败和1%的成功",我们要得就是那1%,就足够了.别人看到的也就是我们发出来的那1%的结果.可那99恐怕只有我们自己知道了

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作者: 911    时间: 2012-1-14 17:44


我也要講講我第一次做實驗的經驗.....
我記得第一次[ 離骨髓的時候.原本的步驟都寫好了(參考文獻上的方法)..
結果當天要真正做實驗的時候才發現.原來文獻上根本有很多都沒寫....
不然就是寫的很簡單.例如文獻在寫分離骨髓的時候可以離心管上看到一層薄薄的細胞層(有站友說0.1mm)好薄的一層阿.實際上根本就看不出來.然後當天就用針筒抽取文獻在所說的約略位子.然後進行培養.結果過了三天.用顯微鏡尋找我要的細胞.看了好久竟然找不到.心中實在是非常的難過.就把分離的FLASK丟了.後來經過了幾次實驗才知道原來幹細胞的數目是相當少的.所以最少要個十天八天後才看的到.第一次真的印像很深刻.所以建議分離骨髓幹細胞.不要當天或前幾天就開始找.可以多養個幾天看到的細胞數目會比較多....

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作者: 大尾巴    时间: 2012-1-14 17:44

我从事细胞培养还不到一年，但已经从中体现了压力和乐趣

（1）做事要认真，严格要求自己。不能因为偷懒或报有侥幸心理而不守规则。
eg.刷玻璃器皿的过程：初洗、泡酸（一天）、自来水冲洗（10遍）、纯化水冲洗（3遍）、注射用水冲洗（3遍）。感觉过于苛刻，自来水只冲洗3遍。被老师发现后，一阵痛批，才知道这是极其关键的一步，残留的酸可能会抑制细胞生长，甚至导致细胞死亡，痛失辛苦得来的细胞，心血付之东流。无知不能无畏，一定不能大意。
（2）找一个良好的老师。在专家的指导下可以事半功倍，很快的掌握操作技巧、发现不易觉察的问题、形成严谨的态风格、获得为将来技术水平的提高奠定基础的扎实的理论知识。找几本相关的书看一看。
（3）有一颗平常心。细胞培养不是算1+1=2那样简单，微小的操作差异或试剂批次间的差异会导致细胞状态和目的蛋白表达量的明显差别，不符合预期目标。不喜不悲，尽力而为之。

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作者: 大尾巴    时间: 2012-1-14 17:44


1.做好准备工作。不要急于投身到细胞培养中去，要先设定计划：步骤，工具，试剂。特别是将细胞用于大规模生产时，尤其如此。eg.经过干热灭菌的容器一般认为可以在一周内保持无菌状态，如果准备多了，用不完的就得重新灭菌，耗费能源、占用灭菌空间，不值得；干热灭菌需要一天的时间，当器皿准备不足时，只能干着急，错过了最佳操作时间，也许得很久才能将细胞状态再调整好。
2.养成良好的操作习惯。
（1）物品准备充分，摆方整齐，有目的。在无菌操作过程中不要将物品拿进拿出，会增大染菌可能；无菌空间相对狭小，无目的的摆放将增加物品移动次数，取一个物品时跨过另一个的可能增加，增大染菌机会（一般的风是从上向下吹的）
（2）操作幅度尽量小，移动速度适中，快则容易产生气流，慢泽延误时间，增加了暴露时间。不要对着操作区讲话或咳嗽
（3）尽力独立完成，包括准备工具，配制试剂，除菌等过程，并不是不信任别人，只是需对自己更负责。
（4）试剂单独使用。细胞较珍贵，胰酶、血清等试剂较昂贵，一旦污染只能弃去，损失很大，交叉使用危险较大。尤其初学者，只需分装出适量用于练习即可。
3.保持良好的环境。操作空间只是室内空间的一小部分，要保证经常打扫，经常灭菌。唇亡齿寒，在恶劣的大环境中，即使在百级洁净环境下也不保险，染菌迟早会发生的。

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作者: 黄花菜    时间: 2012-1-14 17:45

我是个养细胞的菜鸟，才开始一个月左右，做的是海马神经元的原代培养，由于本单位实验室条件较简陋，能请教的高手不多，先前都是靠看书上的方法。做好准备后开始实验，头一会取材先把大鼠泡在酒精中消毒，顺便就可以把它淹死了，然后再取脑，分海马。结果做了两次都只养出一堆碎片（痛苦）！后来请来高手指点，人家第一下就指出：“你怎么一下就把老鼠弄死啦，那会影响细胞活力的！”
后面又发现我用的胰酶（0.125％消化十五分钟）可能不对，但是又不能鉴别到底是消化过度引起细胞死亡还是消化不够，细胞没有从组织块中分离出来。重复了三次实验以后，终于下定决心买了原配好的胰酶（0.25％），再将消化时间缩短到十分钟，终于做出了像样的细胞（这其实只是前天的事情）。现在细胞长势还不错，但愿它们能好好顶下去到我做完TUNEL，千万不要污染啊！

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作者: 缘yuan    时间: 2012-1-14 17:45

分享一个彗星的经验：裂解液的PH很容易变化，每次使用时一定要新调节，否则，没有彗星细胞，原因斗不知在哪里找。

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作者: hot_hot_hot    时间: 2012-1-14 17:45

我一直在养悬浮细胞，也积累了一些经验和教训。和大家分享一下：
1 无菌操作是一切技术的基础，切记此条。这方面大家说的很多，我就不重复了；
2 在细胞状态好时，乘胜追击，准备好一切所需要的细胞原料。例如：实验同时需要采用FCM检测药物干预后细胞周期的改变，需要做IHC，Werstern Blot，RT－PCR等时，可以现将细胞处理好后，根据不同的实验步骤，保存细胞标本，然后各个击破，这样可以减少实验时间。如要收集不同浓度点和时间点的标本，细胞处理后，部分用来做流式测周期（固定那步可以放置-20度数日，待标本收集全后一起检测）；部分用来细胞涂片（固定后，可以放-20度数月，本人曾放置3月没影响）；部分用来做Werstern Blot（将细胞离心呈粉末状置-80度保存，或者提取蛋白变性后保存，粉末保存时间可达2月）；部分用于提取RNA时，可现加上Trizol混匀后，置-80度保存。原料准备好后，在根据自己的时间进行合理安排，多出时间查阅文献；
3 在进行每个实验时，一定要找到该实验的详细的Protocal，一步一步踏踏实实的完成，一般都会得到比较理想的结果。
祝各位好运！

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作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-14 17:46


上面大家都说了很多。但是，我想说的是尽信书不如无书！当时刚养细胞时查阅了大量文献一直以为可以马上成功了，可是养起来才知道，在绝大多数情况下光根据文献或书上说的是无法成功的！文献和书上说的有一定的道理，但是自己还得多想 多根据一些基本的原理来思考，根据自己的条件来改进试验设计，每个实验室的条件是不一样的有时可能是不同的仪器做出的结果也不太一样（我觉得最明显的就是离心机，所以每次离心的速度都要自己摸），而且有的文献关键的地方本来就是错的可能少加或多加点东西或浓度差点，请大家注意啊！可以多看几个相同的文献对比一下，最好找些权威的杂志，再自己思考。我就是因为一直相信文献上说的浪费了大量的时间和金钱，后来明白了算买个教训。

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作者: utt0989    时间: 2012-1-14 17:46


第一次养小鼠的3T3细胞，把师兄仅有的一管冻存细胞拿来复苏，因为是仅有的种子细胞，特别怕污染，所以在操作上特别小心。第一天镜下看，细胞形态良好，培养基很清亮，看到有一些圆圆的折光体漂在培养基中，以为是未贴壁的细胞，没有理会。第二天培养基变浑，细胞形态极差，细胞数量也没有增加，悬浮的折光体数量增加，确定是污染了。因为是仅有的一瓶，舍不得扔掉，决定死马当活马医，用抗生素处理一下。上次在培养基中加入过量的抗生素后导致细胞瓶内长出真菌，这次严格按比例配置。先用加了抗生素的D-Hank's清洗两次，再加上加了抗生素的培养基，继续培养。第二天观察仍无起色，细胞状态不好，第三天以后，细胞状态开始逐渐转好。这是一点经验，仅作参考，还是尽量注意不要污染为好。

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作者: guagua    时间: 2012-1-14 17:46


我培养cho细胞的感受：
两个月前我选取了cho细胞作为我实验对象，于是在朋友那里求得细胞株，兴奋的拿回来，准备大干一场，没有想到的是，细胞却越张越不象话，开始有很多细胞悬浮，又有很多的残渣，颗粒，细胞形态也千变万化，真的如万花筒一般，可怜我实验就老是拖着，实在无奈啊！这时候，我就象抓狂一样，每天唠叨着我的细胞，天天想着该用什么办法使其恢复，开始的时候，我换了培养基，DMEM和F12一比一配比，加sigma非必须氨基酸，和丙酮酸钠，开始效果也很不哦理想，不过随着时间的推移，忽然有一天细胞居然奇迹般的变的光滑，颗粒明显减少，形态均一，透亮，贴壁良好，而且生长速度变快，幸福坏了！
我的感受是，你要象对待你女朋友一样对待你的细胞，你就会得到非常好的收获！

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作者: rxcc33    时间: 2012-1-14 17:47


养细胞实在可以说是爱恨交加，喜忧参半。。。
手头要是一两种细胞，那还好办，怎么也忙的来，要是同时整个6－7种的，真是搞死人，开始忙的焦头烂额的，因为中间要穿插做其他实验（不能仅考养这个毕业啊)，怎么感觉上午忙完了一阵，好容易从无菌室出来，下午又进去了，等放心的出来的时候，怎么感觉一下午又差不多完了，
开始总是没有头绪，后来把所有的细胞还有特性一一总结，每次处理时间记录，这样，大概那个要早出来，那个可以到什么密度多养会啦，就比较明了了，感觉也轻松多了。
消化处理的时候，因为同时要处理很多，就把比较“骄气的”要注意不要消化过头，着重把握，这样就比较省时省功。

对于骄气的细胞，我一般都是第一天处理完后，加少量培基（够盖住瓶底部），第二天换液，以免死细胞和碎片对活的产生不良影响。

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作者: 中国特色    时间: 2012-1-14 17:47

我做的是肿瘤细胞的原代培养,感触最深的是培养瓶的选择,刚培养时用的是玻璃培养瓶,传代时发现细胞贴壁不好,将培养瓶用2%白明胶铺壁后细胞贴壁生长很好,但用0.25%的胰酶消化时效果又不明显,现改用塑料培养瓶上面的缺点都克服了,希望大家作原代培养时可以试一下.

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作者: 911    时间: 2012-1-14 17:47


我做的是昆虫细胞的培养，昆虫细胞和哺乳动物细胞最大的区别就是昆虫细胞是不需要消化的，直接用弯头滴管把细胞从壁上吹下来，但是吹的力量和次数是很有讲究的，我最开始的时候总是怕细胞吹不下来，所以吹得力气比较大，最后就发现很多细胞都被我吹破了，慢慢熟悉了之后，发现吹的时候还是不要用太大的力气，怕细胞吹不开的话，可以在悬液再吹几次，或者吹之前把瓶子在操作台上磕几下，这样就比较好吹了。

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作者: whitesheep    时间: 2012-1-14 17:48


我的一个教训:
刚开始养细胞时，从别人那里要来了细胞，一种是野生型，一种是别的实验室 作的转染的过表达某种蛋白（我要研究的）的细胞株，拿来以后野生型长得挺好，转染的据提供者介绍，最好用G418再筛选一下，于是按他说的浓度用G418筛选，第一天死了好多，我还认为：真是有必要筛选，可是时间一天天过去，细胞一点长进都没有，一直维持原状，再过几天，全死了。哭啊！要知道好不容易才从别人那要来，后来别人指点，第二次要来以后，我再也不敢筛了，我先扩大培养转了好多，也冻了好多，有了足够的种子后，我才放心的筛，即使死了，也还有种子，不用再想别人要了。
虽然是低级错误，但新手犯的大多就是低级错误啊，写出来供来者借鉴。
第二次向别人要，受够了白眼 ，说尽了好话........窘迫呀！

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作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-14 17:48


我也来分享一下我的教训吧：
1。 我有一个试验需要把细胞点在载玻片上，吹干，观察。我为了干得快一些，就把载玻片放在HOOD的层流口上。结果被管理员批评，原因是这样会干扰层流，影响无菌状态。
2。有一段时间我的培养液的PH上升得很快，配好不久后就需要调整。后来我发现是由于我加热培养液的时间太长（1小时或者更多）。后来加热30分钟，用完就放回冰箱，培养液的PH就比较稳定了。
3。个人认为只要严格注意操作时消毒，定期清洁培养箱，染菌的几率并不大。
4。只要你把细胞当成你的宠物，记住它是有生命的，多花时间和心思在它身上，它一定会给你回报的。

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作者: BOSS2011    时间: 2012-1-14 17:49


刚入实验室的时候，跟着我的师兄做MTT法筛药。
1、MTT的96孔板结果参差不齐，要多难看有多难看。
当时怀疑细胞状态不好，怀疑季节问题，怀疑温度不好，重新复苏多次，请中科院的人来指导，总之，偶尔也能够出来一次好的结果，但是重复性太差了，无法提供一个稳定的、令人信服的结果。后来从肿瘤研究所来了一个高人，她看了我们养的细胞，在培养基的上方飘着许多酵母！虽然培养基颜色很好，细胞也能够长，但是仔细看，酵母还在动！！所以MTT能够有好的结果吗？
2、细胞成团特别严重（老板刚从国外带回来的时候是没有成团的！），无法得到单细胞悬液！
我和师兄几乎能想到的办法都用了，接近崩溃！后来高手用了一个5ML的注射器，接上针头，对着刚消化下来的细胞来回抽吸了几下，结果得到单细胞悬液了，好计数了，细胞状态也没有受到什么影响。后来经过几次这样的方法，后来再也不用抽吸，细胞消化下来就基本是单细胞悬液了。
3、老板是个追求完美的人，对于96孔板中任何一个稍微有点偏移的数据都不放过，要求我们继续搞一搞。
MTT要成功，要让孔间差异减少，从单细胞悬液的制备、接种一定药保证每个孔的细胞数要相同；加药干预、换液时，枪尖尽量不要接触底下的细胞层。其实仔细想想，认真一点，不要图省事，会很完美的。
就说这么多了，欢迎讨论。

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作者: 分子式    时间: 2012-1-14 17:49

我也来凑个热闹，就说说自己经历的一些细胞污染的过程吧！
最开始养细胞时都是师姐带着做实验，一步一步非常严格，之后因为实验需要就先做分子生物学，而后者对无菌操作要求并不非常严格，因此无菌意识慢慢就淡化了，后来又重新进入细胞实验，所需的细胞还是找别人送的，也算十分珍贵，但是一开始不知为何总是不贴壁，第一天传代之后，第2天一看培养液呈紫红色，PH值谝碱，高倍镜下发现一些小点，觉得是污染，但是培养液很清亮，就到园子里找了很多关于黑胶虫的帖子学习，为了解决这个问题被迫放弃五一休假，天天去实验室。先是认为污染，找别人送了另外一种细胞，结果养得很好。后来怀疑是培养箱的CO2的问题，就把细胞防到别人的培养箱里，结果也长得很好。于是就请厂家来修理了一次，再后来就能成功培养细胞了，期间我还发现新配的培养基直接用很清亮，但是在－20度保存一段时间后再溶解就要出现很多杂质，用37度水孵育没有效果，握在手里不停摇动非常有效。其实对于操作熟练的人来说，污染并不是我们想像那样容易出现，园子里很多人都问否污问题，而培养基的PH值往往被忽略，而且大多数人都习惯于一次配制1升培养基，分装成10X100ml，用1瓶，另外9瓶放在－20度保存，很容易出现结晶，镜下看就是一些杆状的物资，有时候晃动培养基，肉眼就可以看到很多沉淀，这就需要我们在用之前好好摇匀了。

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作者: 西子    时间: 2012-1-17 10:22


不知其他实验室的同仁们是怎么处理6孔板，24孔板及96孔板，反正我们实验室是要一些就去买，不过我发现这些重复利用效果也不错，经过泡酸后在操作台上先开紫外灯照两小时，然后再开风机再照2小时，可以省些钱呢。呵呵，是不是班门弄斧啦？

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作者: yes4    时间: 2012-1-17 10:24

从开始接触细胞培养到现在已经有大半年了，实验却没太大进展，去年从我一开始着手养细胞，奇了怪了，细胞就没养活过，老师也很急，让我找原因，可是我什么原因也找不到，由于细胞培养的环节太多，老师便一个步骤一个步骤帮我找原因，先是不加盖波片（怀疑我没处理好盖波片），然后让科里养过细胞的老师帮我刷瓶子，然后让那位老师操作取原代，然后是培养基、血清，把血清的含量提高后，细胞的状态明显好了，这才认为是原先的血清不好了。细胞培养真是个考验人的耐心和毅力的活，原以为实验只是体力劳动，现在才发现，什么事情都得动脑筋，细胞养的不好，真的要好好动脑筋，从各个环节着手找原因。

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作者: 小鱼鱼    时间: 2012-1-17 10:26

我是最近才近实验室,刚进实验室时心里很不是滋味,什么都不会,自己是老板的开门弟子,上面没有师兄带,老板现在在国外,根本不可能亲手指导,没有办法,只能靠自己了,硬着头皮.从配培养基开始,在丁香园上找找相关资料,一步一步来,终于可以把细胞放到培养箱里去了,结果后两天去看,全部污染了,可怜
无助!呜呼

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作者: tieshazhang    时间: 2012-1-17 10:26


说起培养细胞，想起一句歌词，“为你欢喜为你忧”，进入细胞室快两个月，可谓经历磨砺，养细胞实在是一件苦其心志的事情，前一天还为细胞生长良好而高兴，转过一天又见细胞污染而沮丧。下面是个人的一些小体会：
1.如果你是细胞培养的初学者，一定先找一株实验室内便宜好养的细胞练手，从培养，换液，传代，冻存，复苏，有一定把握以后在买来你实验需要的珍贵的细胞株来培养，不然付出的代价实在昂贵。
2.不耻下问。不懂得地方一定多问，多看书，多学习。
3.要善于总结动脑筋。目前两次复苏细胞总是不活，很可能是因为自己当初冻存细胞时细胞状态不是最好却急于保存种子，结果白忙一场。

最后祝所有的同道们实验成功。

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作者: skytree    时间: 2012-1-17 10:28

涉及到养细胞的话题就应该是几多欢喜几多愁，不过大部分时间是愁，是忧，只有在有结果的那一刻才会有一点的欢愉，甚至可以消除所有的不快。
起初在师兄的帮助下养的是原代细胞，养过细胞的大概就会知道，原代很烦人，取材时小心翼翼，可干扰细胞长得飞快，换液后镜下一看，满视野的干扰细胞，当时的心情就是想把培养瓶扔了，还要扔的远远的！！后来手法好点了，镜下需要的细胞也渐渐多了，在干扰细胞中看到自己想要的细胞，心情就是很好，之后再采用其他办法，高兴的看到自己的细胞越来越多，真的是开心至极啊！！
最郁闷的事就是污染，尤其是怀疑别人不小心给污染了，感觉真的就像自己的孩子受到不公正待遇，恨不得立刻查出谁干的，找他好好理论一番！！
就是这样了，养细胞的人们应该理解。不过后来还养了非原代，感觉爽多了，呵呵，原代细胞，唉！！

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作者: zhezhe    时间: 2012-1-17 10:28


我是做胚胎干细胞建系的，刚开始从囊胚培养时费了很多周折，那时因为对这种细胞特性不了解，所以实验遇到了很大的阻力，现总结如下：1.胰酶浓度不要太高，0.05%/0.04%胰酶-EDTA；当然也可以用蛋白酶E。2.胰酶消化囊胚的透明带时，不要时间太长，得到裸胚后用加完全培养液洗涤2次即可。3.ICM种植到饲养层后，一定要有耐心，ICM增殖比较慢，开始几天不要总是看，抓住时机传代。4.ICM不明显的囊胚建系成功率较低，注意选择良好囊胚建系。5.用丝裂霉素C处理成纤维细胞制备饲养层时，一定要冲洗干净。6.在ICM传代时务必注意不要消化为单细胞，单细胞很难扩增，小细胞团才好增殖。7.有的试剂在一定阶段该撤掉时就一定撤掉，一面造成不必要的浪费，例如人的ES细胞在早期用LIF，中晚期就不需要；而鼠的ES细胞却需要LIF维持未分化状态。8.做实验的同时注意国内外动态，以免白浪费时间。

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作者: 一叶    时间: 2012-1-17 10:30

一点经验教训：（我的教训不是细胞培养，而是一些固有的思维模式）
新实验室装修，实验仪器要搬家，安装仪器的时候，连接恒温培养箱上的电子继电器，上面有三个接线柱，而只有两条导线，不知道怎么接。实验室一位曾经用过此培养箱的教授帮忙连接的，他说，就是这么接，肯定没问题！我的固有思维告诉我，他是前辈，很有经验，一定没错！然后就满怀信心地培养我的淋巴细胞，结果.............，第二天，刚到实验室，发现培养箱的温度达到了80多度！！！，我的细胞也已经“发高烧”死了，失败！干脆，自己动手，丰衣足食。按照排列组合，两个线头，三个接线柱，共有6种接法，排除上面的错误接法，还有5种，首先把原来的高温降下来，然后逐个按每种接法尝试，接上后至少等2个小时观察温箱内是否恒温，最后，用 了一天的时间，总算把它接好了！（不要说我笨，接线柱上根本没有文字提示怎么接，曾经请教了电工，也不会接，说明书也没有了）
教训：凡事要多个心眼儿，不要想当然，要学会怀疑，我当时就是认为他是很有经验的教授，想当然地以为他接的肯定没错，根本没有去怀疑，结果造成了实验的失败。我觉得有时候思维定势在实验过程中会成为绊脚石，比自己资格老、经验多的老师的实验设计不一定很合理，我们要大胆地提出疑问，提出自己的想法，年轻的思维往往出现闪光的火花哦！

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作者: 园丁##    时间: 2012-1-17 10:31

哈哈，我也说一个我碰到的问题。
刚开始养细胞的时候，用的都是研究室其他老师配好的试剂，也没有认真去ATCC看一下自己养的细胞的照片，我开始养的细胞研究室其他老师告诉我是HT-29，但我看以往的记录写的是CCL-229，开始也没有在意，后来偶然的看了ATCC上HT-29的照片，与自己养的梭形的细胞形态差异非常明显，当时就吓慌了，半年多的实验都白作了。不过当时仍然没有死心，于是又查了一下看看有没有CCL229这种细胞，嘿！真不错，原来它的俗名叫LOVO，同HT-29细胞一样，也是结肠癌细胞，这下实验还有的补救。
等到后来弄到了真正的HT-29细胞，开始消化的时候又出现了问题，总是消化不好，要消化很长很长的时间，于是开始逐个原因的排查，最大的怀疑对象落在了消化液的身上，不过这些消化液都是研究室其他老师用了好多年的配方，是用蒸馏水加的胰酶，有经验的战友一定看出来了，不应该用蒸馏水。不过当时我根本没有经验，以为胰酶当中已经添加了缓冲液的成分，为此还与别人好一番讨论，最后将正确的做法提出来还是需要很大的勇气的，当自己用PBS配的EDTA-胰酶混合消化液在消化细胞时真的有效时，当时激动坏了，因为我改正了“权威”（研究室的老实验员）的错误。
所以奉劝各位新手，在养细胞时一定要先到ATCC的网站上先去看看自己细胞的推荐培养条件，另外千万不要迷信权威，一定要自己多看资料，勤快点，千万不能怕麻烦，光听别人的三言两语就决定自己的下一步实验，事必躬亲是会获得回报的。

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作者: 831226    时间: 2012-1-17 10:31

最近养细胞的一点教训:
我养的是一种肺癌高转移细胞,复苏后第一天长势喜人,24小时了,该换液了,用吸管把培养液吸出,又加入了等量的新培养液,结果,第二天观察,液面上漂着很多细胞团,第三天,全阵亡了.
总结原因: 因为是肺癌高转移细胞,其特点是贴壁不牢,换液时我是直接把新培养液加到培养瓶中有细胞的一面的,结果把细胞冲了下来,连成片,最终不能贴壁,导致死亡了.
改进方法:因为贴壁不牢,换液时先把培养瓶倒转过来,把培养液加到没有细胞的一面,再轻轻倒转过来,避免把细胞冲下来.
结果: 目前细胞生长良好.

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作者: sunnyB    时间: 2012-1-17 10:33


我是做上皮细胞原代培养的,说来惭愧啊,养了快一年了才养出来.我觉得细胞培养关键是细节.我做上皮细胞原代培养时,失败了很多次,关键是细胞不贴壁,想了很多办法,包括使用对细胞损伤很小的accutase酶,使用乳兔,消化分离后可看到较多的单细胞悬液,但细胞就是不贴壁,预铺胶原也试过.有幸在丁香园里找到了几位培养上皮的高手,经指点原来是我使用accutase酶分离消化后就直接采用无血清培养基重悬了,没有用血清中和,损伤了细胞.其实我做平滑肌细胞原代培养时也没中和,但养出来了.但上皮细胞就是不行,犯了经验主义的错误.因此,做细胞培养时应该严格要求自己,不要偷懒,洗瓶子就是很好的例子,如果你洗的不干净,最终是细胞长不好,做无用功啊!另外我觉得丁香园确实是个很好的地方,在这里大家相互学习,相互帮助,让人受益非浅啊!

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作者: hold住    时间: 2012-1-17 10:35

我曾经培养过的细胞有几种是肿瘤细胞、COS-7细胞、一种p53基因敲除的细胞。我们实验室细胞培养用液的配制、细胞的冻存和复苏都由管细胞房的那个老师负责，细胞培养的用具是雇人洗的。

最初学养细胞的时候养了两种肿瘤细胞，细胞形态看上去都还不错，只是不明白为什么瓶壁上老有一些小小的黑点，问那老师，得到的回答是：“支原体，细胞养了一段时间都会有的，没关系，只要多留点细胞让细胞的数量压过它就行了。”当时以为她到底是专业人士经验丰富，恍然大悟似地哦了一声然后高高兴兴做别的事去了。

那个学期这些细胞似乎也很照顾我这新手，长得挺快。后来一个学期，我的操作已经熟练了，可那个学期养的三种细胞却轮番死光光，而且总是在我急用的时候。那老师把问题归结到洗用具的刚换成了个新手、那个学期刚学养细胞的人多且好几个都习惯不好之类的问题上面。最终发现原来是她配的溶液有问题，别人去反映新配的溶液是污染的，她说“肯定是你用的时候给污染的”，正好当时我的培基用完了新领一瓶，还没开过，没放冰箱第二天就浑了，告诉她了，她没说什么，然后重新过滤了培基，说要新买一个小些、好用些的滤器才不容易污染。后来也还出现过几次培基或消化液污染的情况，后来在我急用细胞的阶段，凡是新领了D-Hanks、消化液我都会取一些和培基在干净Ep管里混合、另取一个Ep管装少量培基，一起放在培养箱里一晚上，没变浑才敢用。

再后来的一个学期，要用的几种细胞中有的过了两个星期也长不起来，长起来的细胞周围也有很多沙子样的小黑点，全实验室所有养了细胞的都说自己的细胞长得差，那位老师很不在乎地说实验室所有的细胞都有支原体污染，她以前所在的那个单位都是用BM清除的——很贵，接着就只是一次又一次地复苏细胞，也没人去想更多的办法。我急了，查了不少支原体方面的文献和帖子，终于帮自己也帮别的同学解决了这个问题。

关于检验支原体污染，有PCR法、培养法、DNA荧光染色法。我选择的是DNA荧光染色法，将冰醋酸和甲醇按1:3混合，固定细胞两次，每次10分钟，然后用1μg/ml的Hoechst33258染色20分钟，紫外激发，细胞之间的蓝色丝网表明有严重的支原体污染。

关于清除支原体污染，有些文章比较麻烦，要注射到小鼠体内来杀灭支原体，至少这在我们实验室是不可能使用的方法；有些文章是联合使用两种抗生素来清除支原体，简单方便，用的抗生素也很便宜，我就试了这种。花1.5元买了环丙沙星（ciprofloxacin）药片，稀释成50μg/ml，离心去除淀粉之类的不溶性辅料，加入培基中，稀释成10μg/ml，跟正常培基一样用法，处理两个星期后再用Hoechst33258染色验证，对于污染严重的再用1μg/ml四环素处理。效果很不错。

我向同学推荐了这个方法，有人说自己的培基前段时间已经加了青霉素应该也能奏效，但却没有一点效果。关于这个问题的解释是：青霉素的抗菌机理在于干扰细菌细胞壁的合成，而支原体没有细胞壁，这类干扰细胞壁合成的抗生素当然对其没有效果。

别人的意见和看法有时是正确的，有时是不正确的，要做好什么事还是需要自己多查多想。

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作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-17 10:35

进入实验已经快到一年了，回首这一年时间里，细胞培养这项技术从最初的陌生可畏到现在熟练掌握确实是经历一段刻骨铭心的过程，现按照版主的要求结合自己的失败与成功经验，共同与细胞版广大战友分享与交流：

1，首先最主要的是一定要养成良好的无菌观念。我想这点是大家最初接触细胞培养时听到的最多的一句话，而且也是最受益的一句话。所以我最初开始培养细胞的时候，头脑中时刻注意这点。可能本人是学临床出身，经历过严格的外科手术无菌操作训练，所以把这种训练用在细胞培养上是游刃有余。进入无菌间一定要穿好无菌衣，换好鞋，带好口罩帽子，手要用酒精消毒。实验用具应该事先用紫外消毒半小时，所用的玻璃仪器（如试管，瓶口）用前都要用酒精灯消毒几次。总之，只要你真正做到无菌要求，那么我想细胞污染的可能性会降为最低。当然除了一些客观无法意料到因素在外。

2，其次培养细胞一定要勤快，不能有懒惰的思想。由于细胞也是一种很娇嫩的东东，所以你应该像对待孩子一样地对待它。要每天都定时到细胞间观察细胞的形态、细胞生长状态以及培养基颜色如何，真正做到心中有数。该换液的时候一定要及时换液，不要贪懒。记得去年有一次自己因为贪图轻松，没有及时给细胞换液，结果再次观察细胞的时候发现整个培养瓶里的细胞全都漂浮起来，已经都over了，害得我重新复苏了一管。打那以后，我对细胞再也不敢马虎大意了，因为我知道，一次不小心都会给自己造成很大麻烦。

希望这些经验能够给战友们一些帮助

最后祝愿大家实验顺利

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作者: pengke1983    时间: 2012-1-17 10:36

在贴壁细胞的培养中，对于细胞消化程度的把握是很重要的。不同的细胞株贴壁能力不同。即使相同的细胞株生长状态良好时和不佳时贴壁程度也是不同的。所以不要呆板的按固定的时间进行消化。
消化不足时，即使细胞能脱壁，细胞间连接物质仍未被完全去除，依然相互连接，无法在培养液均匀分散开，形成细胞团，最终影响下一代细胞的质量；消化过度时，细胞可以完全被消化下来，但细胞仍会凝结成团，不利于分散，且细胞会受到损伤。
在加入胰酶后，要将培养瓶放在显微镜下随时进行观察。当细胞间出现间隙时，将胰酶倒掉，以防止大量酶造成消化过度，残余酶液即可使细胞消化完全。当瓶壁细胞开始呈流沙状下滑时，迅速加入含血清的培养基来终止胰酶的作用。消化即顺利完成

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作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-17 10:36


我在刚开始养细胞时,犯的低级错误，但我们实验室刚建,我的师兄都不养细胞,可能是这东西不好伺候吧,我是我们实验室养细胞的祖师爷了,呵呵.
我从上海拿回来一瓶我需要的贴壁细胞,找老板要的.高高兴兴的拿回来后,立即打开紫外灯消毒操净台,用我精心配制的培养液,而且还用PBS洗了3遍,加入我配制好的新鲜的培养液2毫升,严格遵守无菌操作,看的比我生命还重要,因为我毕业就靠他,小心翼翼的放到CO2培养箱中,过夜,第二天早上来看发现很多细胞漂浮起来,觉得不对劲,当时心如刀绞,不是男人的坚强,就落泪.最终这些细胞没逃过厄运.
现在得出的教训:细胞在外地拿回来后,不要急于给他换液,继续培养12小时,先把原培养液倒出来一部分留着,严格无菌操作,逐渐换成自己的培养液,尽量不要一时间改变细胞培养环境太大,望对细胞培养的新手们有一点启示.

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作者: 气泡    时间: 2012-1-17 10:37


细胞培养是个精细的活，过程中也有许多感受，没有太多时间整理，暂时想到几条写几条：
1。无菌操作：
重要性不言自明。但是我从进细胞间操作的第一天就没有穿 无菌衣（就是普通的白大衣），没有带过口罩和手套（当然有几次处理特别重要的细胞以及在超净台外面行无菌操作时带了），因为我的师兄师姐都没有带，而且基本上很少见到污染，我现在也是这么做的。所以我觉得常规紫外照台子，酒精擦手，操作过程中只要注意，达到无菌并不是很难的事，不一定象书上写的那么正式。
2。培养液：一定要用自己的，用之前一定要摇晃并仔细观察有无污染迹象。我有一次帮别人传细胞，做完之后收拾台子拿PBS的时候发现有白色浑浊，当时脑袋都大了，以为肯定是污染（后来证实虚惊一场，可能浑浊是盐结晶），此后度过了忐忑的24小时。
3。过火：有的时候看有些人过火时间很长，胶塞都烧出味来了，其实没有必要。还有管子烧太狠应该多凉一会，我曾经用手摸过过完火的管子尖，很烫的，太热有时候也容易烫死细胞。

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作者: 气泡    时间: 2012-1-17 10:39

4。配液： 以前配液及分大量的液体都是10ml那么一管一管的移，费时费力，最近发现还是直接倒好，瓶口烧好的话不会污染，快而且容易保持培养基的PH值。
5。试管和培养瓶： 试管和培养瓶并不都是好的，有几次我把细胞打到试管和培养瓶了，过了一会一看，里面空空的，原来都漏掉了，因此我现在拿试管都习惯性的用小指头勾一下管底，有破的一下子就感觉到。另外管口也要注意，有裂缝的千万不能用。还有一次00塞不合适离心的时候陷到管子里怎么也那不出来，后来把细胞仍了。
6。操作中的安全 ：a。我犯的一个巨经典的错误至今难忘，刚做时酒精擦手，擦镊子，湿淋淋的就拿镊子过火，结果。。。。火顺着镊子着到手上，虽然不怎么热，可是我手上的汗毛啊，555，都被烧了。这个错误以后再也没犯。b。过完火的试管口一定不能摸，时刻记着只拿试管的下1/2。c。给酒精灯加酒精永远记住不要拿酒精灯口那个灯心管，否则终身难忘。d。当酒精灯出现什么意外时一定要镇静，先让他着一会可能没事，不要慌乱中打坏别的东东。e。离心机尤其高转速时，配平当然要牢记，可是一定要检查一下离心机里还有没有其他东东（有一次我离东西，着急，放进去刚离一会我就觉得声音不对，打开一看里面竟然有一根别人没有拿出来的小管子）。还有一次配完平就打开离心机盖准备离心，结果吓个半死，原来别人正在离心，幸好管子没飞出来

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作者: 气泡    时间: 2012-1-17 10:39

7。关于污染： 污染是细胞培养过程中最不愿意看到的，原则上细胞一旦污染应立刻扔掉，但是作为新手，对待污染的判别一定要慎重。我刚做EPC时，细胞需要贴壁四天才半量换液。但是当时总沉不住气，两天就去看了一下，结果里面密密麻麻都是悬浮的大个圆形的东东（实际上是血细胞），我一看，这不是细菌吧，赶快翻司徒先生的细胞培养一书，上面说还会有浑浊，我到细胞间一晃皿，可不是么，是有烟雾一样的东东（实际是悬浮细胞太多），当时痛心棘手，觉得肯定是自己操作不合格，书上说得马上仍啊，周围恰好没有可以请教的人，一狠心，给仍了，后来发现别人养的也是那样，才知道不是污染。还有就是上面讲的PBS,其他人都说肯定污染，PBS都那样了，肯定不能要了，但我当时没扔（主要还是不舍的），结果第二天没事。所以，大家发现了污染，不一定是，要多问问别人，细胞也不急于马上仍，对于不太明显的可以再观察，对于理论上肯定要污染的心里还可存意思侥幸。总之，污染了不可系，没污染确被仍了的才可惜。

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作者: 气泡    时间: 2012-1-17 10:41

8。细胞冻存： 当细胞状态好，或者代数比较早，一定要大量冻存，不要吝惜暂时的大批使用血清，当细胞状态不好，长不起来的时候，马上取出来复苏，省时省力，不要去尝试努力恢复状态不好的细胞，费时间也费血清，会令你痛苦不堪。另外冻存的细胞不要放到一个地方，－80度，液氮（甚至不同的液氮罐）都放一点，谁也不敢保证不出意外，冰箱也可能有化的时候（我们－20度冰箱就化过），都放在一块容易全军覆没。
今天就写道这儿吧，想起来再来。

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作者: BUK    时间: 2012-1-17 10:41

前面的群友已经总结得很好了！我就说说自己刚开始实验时的情况吧！
我养的是大鼠骨髓间充质干细胞！
1、配液：我配的是L－DMEM培养基；我当时忘记加碳酸氢钠和Hepes，所以过滤前的时候调好PH值7.2，用了不久培养基颜色就变深了。分析原因：缺少了酸碱缓冲体系，培养基容易在空气中容易变碱！另外，过滤后的培养基PH值会升高，比原来越高0.1－0.2。而且，血清也偏酸，所以自己要心中有数。记住，细胞耐酸不耐碱。
2、这个错误相信大家觉得很好笑，我每次用培养基时，都是从4度冰箱拿出来后直接用于细胞培养，结果每次都是培养基没有污染，但细胞总是没能存活。
3、污染；当你发现细胞污染时，首先要冷静，如果你的细胞有冻存或者比较容易获得，那么可以查明原因后扔弃细胞；但是，如果你养的细胞比较珍贵，或者你还想继续养的话，我有个办法：用10倍的抗生素冲洗细胞，洗两次后用2倍抗生素培养细胞。（如果是悬浮细胞的话则离心冲洗）。这方法是师兄教我的，相当有效。
剩下的都让其他群友说了，等我想起什么再来！

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作者: lixi559    时间: 2012-1-17 10:42

呵呵

失败——太多次了，养过很多次小鼠的间充质干，失败过很多，恩，有一次，很认真，很仔细的做每一个步骤，结果，去悬浮后，只留下很多碎片，郁闷啊。想了很久，实在找不出原因，恩，很有可能是老鼠的问题。

看见一个战友写到安全问题了，突然想起我的那只火手……唉，一只沾满酒精的小手，一不小心变成了火手，谁说不疼的，幸亏烧掉的只是毛，不是皮

总之，我的座右铭是，对待细胞要像对待孩子一样。它们是那么的娇小，柔弱，它们需要我们的精心呵护

加油啊！

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作者: BOSS2011    时间: 2012-1-17 10:42


我上学的时候创造了一次染菌19瓶（细胞sp20）的记录，回想起来，当时的操作真是烂，工作后在做细胞培养和蛋白纯化，一直心理有个结，经过同事们的帮助和自己的努力终于有进步了。
对于细胞培养也有自己的心得：
1、不要心存侥幸，严格按照操作要求做，记住不规范的操作可能不染菌，但早晚会染菌的
2、准备工作做好，计算好物品，有条件应该准备备用的物品，不要到时候出现东西不够用的问题
3、清洁灭菌工作十分关键，一定要保证容器具的无菌。我们有一次培养细胞发现染菌，培养基，培养瓶，移液管等等，忙了好几天才发现是真空湿热灭菌箱有问题，造成整个实验中断。
4、按照试剂的保存标准保存，象血清、胰酶等没开封的-20℃，开封后-4℃保存一般不超过7天（用完它吧，不然浪费了）
5、一定要弄清楚每个组分的作用，特点，比如NaHCO3容易分解，因此培养基在过滤除菌时pH会上升，一般是0.1-0.3，所以在过滤之前，要把培养基的pH调低0.1-0.3。如果你不了解NaHCO3容易分解的特点，就不会做相应的处理，那么培养基不符和要求，细胞就长不好
6、还有做实验中间经历过的问题越多，提高就越大，你会从中学到事故处理方法，以及实验设计的注意事项等，因此，把握每次出问题的机会去学习（当然，不是故意出问题），多思考分析，查资料，问专家，几年下来，你会发现自己也是专家了。

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作者: 中国特色    时间: 2012-1-17 10:43


前面的群友写得很好。我是一个新手，才培养了一个多月。当然也犯过错误，同时也收获了不少。
写得肤浅了大家不要笑哦！
1.第一次让我自己操作的时候，当时我也跟了2周了，基本的操作自己也能够详细的在脑海里过一遍，可当时换液的时候就是有些手忙脚乱的，培养瓶、移液管、盒子等要用拿的时候就是感觉别扭，结果第二天去看培养液就有点点浑浊，后天倒置显微镜下就很明显的云雾状阴影了。所以在超净工作台里操作的时候，工具的摆放要合理、顺手。
2.其实自己很早就想做细胞培养了，苦于没有实验室，更没有人能带我！但是虚心的向在做的老师请教，并不时的去做做清洁、修修电脑的，后来老师就同意带我了，而且还从基本的开始教我，顺便还可以磨磨性子，挺好了。攻关也很重要哦！
3.细胞复苏的时候，以前都是先离心，然后去上清的，后来看书上说可以直接十倍稀释培养液，减少dmso的毒性，而且加培养液的时候要缓慢的加入，以减少渗透压的急剧变化造成细胞的死亡。所以细胞的培养是一个不断的学习改进的过程，有时操作不规范仍然可以将就，还没发现自己的失误。
4.思考也很重要。记得无菌观念的养成就得不停的思考，这样会不会污染，操作也得如此，每一步都得准备好。
现在做体外实验才觉得自己像在做实验！

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作者: duoduo    时间: 2012-1-17 10:44

我没有想到自己会养细胞
养了一个月了还没有端倪
心里确实很痛苦。
问了丁香园问老师
问了师姐问师兄。
养了一遍又一遍。
第一次是因为不明白大鼠脑微血管内皮细胞并不是要求新生鼠而把刚刚生得9只小老鼠全都处理掉了。可惜的是把不该丢的丢了。离心后把沉淀丢了。把上清夜培养了几天，细胞很少。也不是。
经过取经。
第二次我知道了步骤。但是留在筛网上的东西太多。离心后足有2ml的沉淀。分两个培养瓶培养，结果杂质太多。但是我是根据老师的指教做的。不明白为什么？就是分离不出来。
又一个人建议我买内皮细胞分离液。现在已经定了。还没有来。
我的母老鼠因为难产死了。没有原料怎么做呀。
买老鼠是辛苦的，养老鼠也不是那么简单。
洗瓶子可能是最恼火的了。泡酸，烤干。配液。过滤。
每一步都那么繁琐。
但是，里面也有快乐。
比如各位师姐师妹师兄师弟在一起抢抢烤箱。铮铮3蒸水。打扫卫生。
推水。
高压消毒。
相互讽刺一下细胞。
总之，痛苦中有快乐。快乐中也不乏痛苦。
我希望自己的细胞这次能长出来。给她照张相。
人生的每一种经历都是一种风景。
不要错过风景中的美丽
不要错过风景中的快乐
我希望在我毕业的时候能够理直气壮的对师弟师妹们说：
我养过细胞了！

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作者: 了了    时间: 2012-1-17 10:44

MCF-7细胞株，一个月前，我很兴奋地开始和它打交道！
在看过很多关于MCF－7的文献后，我本以为不难的，但是这种感觉是错误的！理论毕竟只是理论！
首先就是细胞株的购买问题！这是书上没有的，只能在网上找到联系商！
买来以后，面临着很多细节问题！例如，无菌操作问题，记得有一次，我用了一个不规范动作，害怕自己污染了培养液，于是想扔掉，但是又觉得可惜，幸亏师兄很肯定的告诉我没事的，因为他以前也这样过，不影响培养的。
现在进入诱导分化的过程了，数量上我有把握达到需求，但是培养液过多，怎样挑选优质细胞注射裸鼠呢？
总之，每一不都不是 书上说的那样简单。我的实验正在进行中，也期待以后得到高手的指教！

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作者: 911    时间: 2012-1-17 10:45


我做过磁株分选干细胞,需要一定数量的单个核细胞,最初在洗涤细胞时总是见到很多絮状物(多是血小板和细胞聚集在一起).于是采用800-1000r/m,10m是速度低了在去掉上清时易丢失细胞,高了去血小板效果不好.感觉1000r/m,0m,好,去上清时余留200-400ul洗涤液.
用淋巴分离液分离血液,收集白膜层后,尽量让吸取的percoll稀释(一般五倍体积),转速应至少1500r/m,10m上,足使细胞沉淀.

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作者: loli    时间: 2012-1-17 10:45

不知各位在细胞培养中，用培养板时，在换液过程中是否遇到过这样的问题，细胞出现成片死亡的现象，刚开始时，是因为在给干预时出现的上述的现象，所以还以为是药物作用的结果，但因所有的浓度的出现了同样的问题，那真叫郁闷，原来是在换液的时候把超净工作台的风开着没有关，被风给吹干了而引起的细胞死亡。因此，在对培养板的培养物进行换液时，应注意：1.可以把超净台的风关掉；2.吸掉原培养液后立即加入新鲜培养，动作要迅速。

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作者: 969    时间: 2012-1-17 10:46

我也刚开始养细胞不长时间，养的是MDCK，就是犬肾细胞，这种细胞挺师兄说挺好养的，于是就没怎么放在心上，以为随便养就是了，谁想一开始就遇到了一些问题，首先是消化的问题，怎么也消化不好，实验室以前有一个配方，但是有些数据莫名其妙，就问师兄，师兄也记不住了。知道自己摸索，有时候就延长消化的时间，细胞倒是消化的差不多了，但是发现活性很差，非常郁闷，到后来从青岛打听到了一个配方，试了一下，的确不一样，消化的时间不长，但是消化的效果很好，成片的都变成圆形了，加上培养基，不大用怎么吹打，大部分就下来了，爽的很。由于消化的时间短了，细胞收到的刺激就小，活性也就相应的提高了。因此想告诉大家，当一种配方不好用时，可以试试其他的。

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作者: caihong    时间: 2012-1-17 10:46


养细胞快半年了，也谈谈我的经验吧！
有一次，我的细胞有十几瓶在消化传代后被污染了，整个培养基都成洗肉水样，在显微镜下一看全是杆状的细菌，好家伙！还在作迅速地移动呢！由于污染的数量太多，我就心恢意冷，把它们全不要了。同时，我们实验室的另一个师姐的细胞也有两瓶被污染了。
于是开始找原因：因为我们的细胞都是消化传代后发生污染了，所以可能是胰酶污染（我们的胰酶是我配制的，我们共用胰酶），于是我俩花了2天的时间重新配制了胰酶。过了几天我的另外一批细胞有被污染了，这次我的细胞没有用胰酶消化，而我的培养基单独培养后没有污染，看来可能是器械污染引起的，那段时间我们实验室的高压锅的安全阀坏了，每次压力可能不够。最后，实验室重新买了个新的压力锅，我的细胞再也没有发生过污染。
现在回想起来，1）我当时没有及时冻存细胞，以致于重新开始培养细胞，非常浪费时间，今后一定要及时冻存细胞，以防万一。2）污染的原因很多，很复杂，但要慢慢找，不要轻易下结论，要多分析原因。免得像我上次一样，把胰酶重新配制一遍，挺累人的。3）发生污染后，如果是贵重的细胞株，要想办法拯救，不要随便丢掉，我有个同学的细胞污染了，但经过补救后没事了，我都很后悔轻率上次把细胞丢弃了，至少也可以尝试一下能不能拯救细胞。

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作者: 四福晋    时间: 2012-1-17 10:46

我养过滋养层细胞和蜕膜细胞，养这两种细胞的人可谓是比较少见，所以没有公司可以买到现成的细胞株，只有自己和实验室的师兄师姐摸索着做。首先去BD附属医院妇产科那里取人家刚做完人流的蜕膜和胎盘组织，回来后赶紧从组织上取细胞，哪部分使我们要的细胞哪？这下发愁了，赶紧到楼下请专家(做过这方面的博士后)，指导我们做实验，用胰酶消化后用1640培养基+10%胎牛血清试培养，后来发现这些细胞传代很慢，而且传的代数很有限，后来有换了培养基Ham F10培养基，效果就好一点了，这轮下来就稍有些经验了，原来F10培养基是试管婴儿实验室常用的培养基，所以我想我们培养罕见细胞时先看看相关的或类似的细胞是如何培养的，免得走不必要的弯路。

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作者: DNA    时间: 2012-1-17 10:47

要说我做实验的辛酸经历还得从半年前讲起，半年前老板给我指定了一个课题，是有关树突状细胞介导抗肿瘤方面的，当时一听就觉得心虚得要命，主要是自己搞临床工作多年，基础方面的知识已经忘记得差不多了，实验是从来没碰过，一起上学的同学曾经给我说过细胞培养是最吃力不讨好的实验，我委婉地向老板说了我的态度，但老板不由我辩解，要求我必须在8个月内把实验搞完，没办法我咬咬牙，只好硬着头皮上了！

才进实验室的时候，可以说什么都不懂，好在我的特点就是勤快、脸皮较厚，帮实验员做事，不懂就问，一段时间后，我就和实验员及博士姐姐、哥哥们处的很融洽了，他们手把手地教我洗瓶、消毒、配液、消化、传代、冻存细胞等等，后来他们还告述我养细胞一定要多上丁香园细胞版块去看看，还要看司徒的《细胞培养》、《细胞实验指南》等等，渐渐的我似乎也开窍了，操作也就越来越麻利了。

起初为了使实验成功，我把从文献上摘录下来的实验步骤抄在一张纸上，实验前两天总是不停地模拟操练几次，实验时还要把纸贴在操作台旁，尽管如此还是在培养树突状细胞开始的时候，头三次实验都惨痛地失败了。第一次失败原因归咎于我在离心前加全血于离心管的时候，血液加得太快，以至于离心后白膜层不明显，培养了几天，6孔板上只见到可怜的一些血小板和细胞碎片。。。第二次，由于周末细胞室的CO2气体没有了，我的DC就这样窒息身亡。。。第三次，培养基污染了，6孔板内只能见到混浊的培养基和我伤心的眼睛。。。一个月下来，DC没养成，2支价值1500多元的细胞因子也耗费一空。痛定思痛，冷静下来，认真地总结了教训，还经常上细胞板树突状细胞小组上看看战友们发的一些帖子，在其中汲取了战友们不少的经验和教训，一段时间后，我得DC终于培养出来了！！而且一次比一次好，形态特征很典型，我的课题实验也逐步进入了正轨。。。

如今，我的实验也进入了尾声，回归我的经历，让我深深地体会到“只有经历了才会有体会，只有体会了才会有感悟，才能有所收获！”这句话的内涵，这段经历将是我人生中的一段美好的回忆

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作者: guagua    时间: 2012-1-17 10:48

共养过三种细胞：Hep-2,CNE,hMSCs.
第一次养细胞时，看到细胞茁壮成长，十分惬意。得意劲还没完问题就接连出现，先是Hep－2细胞出现问题，形态变差，出现很多空泡，增殖变慢，最后干脆罢工了事。结果，受到老板的严厉批评。痛定思痛，原来是PH值太偏酸影响了细胞的生长。
后来，我的MSCs细胞在一次传代时，胰酶刚加进去，马上在镜下观察就只见到了细胞碎片，让我心痛不已。到现在我还没弄懂原因，因为那次的胰酶是我师弟刚配好的，以后，我自己用的东西全都自己准备
还有一次，我的MSCs细胞转染后，高高兴兴的去做共聚焦显微镜检测转染效率，可镜下一看，只有零星的几个细胞有荧光，共聚焦显微镜的老师说，培养板在运输时应避光保存，只好又做了一次
在养细胞的过程中，有失败，有成功；有痛苦，有欢乐。关键是失败了要总结经验，吸取教训，才能提高。另外，做事要全身心投入。

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作者: wu11998866    时间: 2012-1-17 10:48

我是最近才开始零星的养了一段时间的细胞，感觉比养动物麻烦多了，心肌细胞太娇嫩了，好比我的儿子一样，呵呵我个人认为作实验之前一定要弄清实验原理，消化细胞的时候胰酶的浓度不能太高了而且一定要新鲜配制，双抗不一定需要加的，暂时说这麽多了下次再写我的心得。

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作者: bohe221    时间: 2012-1-17 10:49

最近总是见到有人说自己的细胞污染了，怎么办
我就结合自己的经验和资料上查到的总结一下，希望对培养细胞的新手有帮助

一、  染对培养细胞的影响及污染的检测
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复、但是当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分类象减少，细胞变得粗糙，轮廓增强细胞浆出现颗粒、污染较严重，细胞增值停止，分裂象消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆、脱壁。
（一）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测
常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒置显微镜观察不易判断。怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养。
如果培养无真的细菌污染，24小时内可以获得阳性结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时，大约每20分钟一代，会使培养系统中很快产生大量细菌，后者不仅可以消耗培养系统中的养分，还能释放大量代谢产物。几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。细菌污染大多数可以改变培养液pH，使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。
（二）真菌污染对细胞的影响及污染物的检测
微生物污染中以真菌最多，真菌种类繁多，形态各异，但是污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。
（三）支原体污染对细胞影响及污染物的检测
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题,是细胞培养最常见的、干扰试验结果的一种污染。但由于不易被察觉，有些污染的细胞仍在被应用。研究表明，95％以上是以下四种：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii），为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。据查，目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%的细胞受到支原体污染。
污染来源包括工作环境污染、操作者本身污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。
细胞培养中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：
控制环境污染；
严格实验操作；
细胞培养基和器材要保证无菌；
在细胞培养基中加入适量的抗生素。
支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。
（四）细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测
细胞培养中，细胞间交叉污染并不罕见，多是由于在培养中操作时各种细胞同时进行，混杂使用器皿和液体所致，这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化，有些变化较轻、不易察觉，有些可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制，最终死亡。常用观察细胞形态学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞。

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作者: bohe221    时间: 2012-1-17 10:49

二、污染的预防
防止污染，预防是关键，预防措施应该贯穿整个细胞培养的始终。
1器皿准备中的预防：用于细胞培养的器皿应该严格消毒，做到真正洁净；应该无菌的物品，要做到消毒严格、真正无菌；器皿的运输、贮存过程中，要严格操作，谨防污染。
2开始操作前的预防：应当按厂家规定，定期清洗或更换超净台的空气滤网，请专职人员定期检查超净台的空气净化标准；检查培养皿是否有消毒标志，有条件得实验室可以使用一次性用品；检查新配置的培养液，确认无菌方可使用；操作前提前半小时启动超净台的紫外灯消毒；操作应戴口罩，消毒双手。
3 操作过程中的预防；主要包括：超净台内放置的所有培养瓶瓶口不能与风向相逆，不允许用手触及器皿的无菌部分，如瓶口和瓶塞内侧；在安装吸管冒、开启或封闭瓶口操作时要经过酒精灯烧灼，并在火焰附件工作；吸取培养液、细胞悬液等液体时，应专管专用，防止污染扩大或造成培养物的交叉污染；使用培养液前，不易较早开启瓶口；开瓶后的培养瓶应保持斜位，避免直立；不再使用的培养液应立即封口；培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中；操作时不要交谈、咳嗽，以防唾沫和呼出气流引发污染；操作完毕后应将工作台面整理好，并消毒擦拭工作面，关闭超净台。
4 其他预防：及早冻存培养物；重要的细胞株传代工作应有两个人独立进行；购入的未灭活血清应采取56度水浴灭活30分钟使血清的补体和支原体灭活；为了避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统的抗生素，或尽可能不用抗生素；对新购入的细胞株应加强观察，防止外来的污染源；定期消毒培养箱。

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作者: bohe221    时间: 2012-1-17 10:49

三、污染的排除
培养的细胞一旦污染应及时处理，防止污染其他细胞。通常选高压灭菌被污染的细胞，然后弃掉。如果有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常。常用的排除微生物污染的方法有以下几种：
1 抗生素排除法：抗生素是细胞培养中杀灭细菌的主要手段。各种抗生素性质不同，对微生物作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后应用好；如果发生微生物污染后再使用抗生素，常难以根除。有的抗生素对细菌仅有抑制作用，无杀灭效应。反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性，而且对细胞本身也有一定影响，因此有人主张尽量不用抗生素处理，当然，一些有价值的细胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在这种情况下，可采用5－10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24－48小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效。
2 加温除菌：根据支原体耐热性能差的特点。有人将受支原体污染的细胞置于41度中作用5－10小时（最长可以达18小时）杀灭支原体。但是41度对细胞本身应有较大影响，故在处理前，应先进行预试验，确定最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。
3 动物体内接种：受微生物污染的肿瘤细胞可以接种到同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭掉微生物，肿瘤细胞却能在体内生长，待一定时间，从体内取出再进行培养繁殖。
4 与巨噬细胞共培养：在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活7－10天，并可以分泌一些细胞因子支持其他细胞的科隆生长。与体内情况相似，巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。利用96孔板将极少培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度地同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染地效能。本方法与抗生素联合应用效果更佳。

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作者: 月牙牙    时间: 2012-1-17 10:50

我养的是骨髓间充质干细胞（MSCs），简单讲几个我感受教深的体会：
1.细胞的贴壁生长对培养基PH的要求：这个问题前面的战友已经提到过了，我这里再强调一下，因为我对这一点深有体会。记得我当时养MSCs时，我实验室里还没有人养过这种细胞，但那时实验室里有其他人在养血管平滑肌细胞。刚开始，我直接拿他们的培养基来配，但细胞老是不长，一个个贴在瓶壁，小小的。我连续接种了几次细胞，养了一个多月，细胞仍是不长。我当时非常纳闷，为什么他们的平滑肌细胞贴壁生长得好好的，我的MSCs却长不好？我先后换了几种血清，效果仍然不佳。后来实验室的技师提议我把培养基配酸性一点，他说培养基偏酸细胞更容易贴壁。于是我新配了培养基，将ph调到7.0左右，哈哈，细胞就此成功养出！所以说，不同的贴壁生长的细胞，其对培养基PH的要求还是不一样的。
2.配好的培养基装在血清瓶，放在冰箱里，日子久了会变碱，这从培养基的颜色就可以明显看出来。战友们要注意到这个问题，储放时瓶盖得尽量旋禁。
3.细胞消化传代后，最后在消化后的第二天即换液，已去除残余的胰酶。虽然理论上说胰酶在加入血清之后即失去活性，但我养细胞的实际经验表明，消化后第二天即换液，传代的细胞长得要比第3、4天才换液的细胞好很多。

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作者: 麦丽素1986    时间: 2012-1-17 10:51

刚养细胞1个月
一个月前在我师姐带习下，养了293细胞，学了不少细胞培养的技术（非常感谢我师姐）
经验不多
谈点教训吧
细胞消化：开始时养293细胞，师姐教我直接吸管轻吹细胞分瓶，效果还不错，很容易就吹下来了，省去酶消化步骤，省掉一步污染的环节
当我养MDCK时，就想直接吹就好了，^_^吹了半天，吹不动，MDCK贴得可真牢！只好向师兄要了点0.125％胰酶，开始消化（当中不时拿到显微镜下观察），
大约过了2分钟，发现细胞逐渐变圆，细胞间隙增大，我担心消化过度，马上加培养基中止消化，并用吸管吹！
无奈的是我用吸管吹了半天，死活还是吹不下来，太郁闷了
只好吸走培养基，重新加胰酶消化，大约再消化了1.5分钟（这回置于37度培养箱中）,并镜下观察，细胞间隙这回更明显了，细胞也很亮，加培养基中止消化，并用吸管轻吹，细胞这回终于很容易吹了下来

过了几天，又该分瓶了，有了上次教训，这回我直接就用0.125％胰酶（自己配的）37度消化3分钟（期间未观察），加培养基中止消化，这回吸管一吹，不得了，一吹就整片掉下来，很明显消化过度！
接着我就不断吹培养基希望将细胞吹开，一吹不得了，起了好多泡泡（后来看书知道这种吹法对细胞损伤很大），分瓶后培养观察有很多细胞碎片

总结教训：细胞消化跟多因素有关，如细胞状态、培养瓶、胰酶活性等有关，如胰酶时间久了活力下降，细胞代数增加、细胞密度都影响贴附强度
消化时一定要不时观察（或许有经验的高手们不需要），这样才能得到比较好的效果

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作者: TNT    时间: 2012-1-17 10:52

看了这么多兄弟姐妹的经验之谈，真长了不少见识．

在这里我也谈一个小事故吧，以供参考．

刚进细胞室的时候有些小的规则不知道，在收拾做实验用的东西后，我发现无菌操作台的玻璃有些脏，于是就自作主张用７５％的酒精去擦，结果傻眼了，那一点点花变成了一大片．操作台整个不能用了，因为几乎看不到里面了，只能换玻璃了．

后来师兄想了一个好方法，用牙膏擦拭，效果非常好，如果有哪位新手也遇到这个问题不妨一试．

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作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-17 10:53

前两天看到有人换无血清培养基的细胞出了很多问题，谈谈操作方法和注意事项，希望能帮助他们找到实验中的不足，尽快完成好实验．
有两种方法使细胞适应无血清培养基（SFM）:
1. 直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。
一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该:2.5×105~3.5×105细胞/ml。当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×106~4×106细胞/ml时，细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天，当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
2. 连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。
　　以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25％SFM 混合培养基中，传代培养。
　　当细胞密度>5×105细胞/ml时，以2×105到3×105细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
　　以2×106到3×106细胞/ml细胞密度，25％有血清培养基和75% SFM中传代培养。
　　当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml（接种后4到6天），在100％SFM培养基中传代培养。
　　每隔3到5天，当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。
细胞培养适应替代血清：许多细胞利用连续适应方法能很好的适应，用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1（v∶v）的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培养基。每次适应改变血清比例时，传代细胞2到3次。
培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。
特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。

　　另外，需要注意的是血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。
为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：
　　处于对数生长中期
　　大于90% 活细胞率
　　适应时以较高的起始细胞接种

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作者: rxcc33    时间: 2012-1-17 10:53

呵呵，我先抛砖引玉吧，其实实验中感触也是很多的。
记得刚养心肌细胞时候，开始时候很顺利，但有一次突然细胞就不怎么贴壁了，换液时候一吹打，就发现有许多细胞脱落。我检查了培养箱，可是别人的细胞都长的很好啊，培养基的问题？我仔细观察了一下，培养基粉红透亮，绝对不会污染，血清也没有问题啊，大家都是公用的血清，当时我很迷惑，后来我象老师如实反映问题，他听完我的叙述后想了想，让我把培养基拿给他看，然后告诉我，你的培养基颜色太深了，肯定偏碱，细胞在偏碱的情况下培养，耐受能力会逐渐下降，可能是产生脱壁现象的原因，后来我重新测了一下培养基，为7.5左右，我用灭菌的HCL调了一下，
～～～～这个可以灭菌？？？，就算是过滤除菌也是很困难（危险）的事情吧？

培养基颜色变成淡红透亮，再次培养，发现细胞贴壁比较好了，搏动效果也不错，因此，我以后每次培养前都要重新调好PH值，我觉得很多因素是能影响PH值的，这也算是实验的一点收获吧，呵呵，当然还有别的体会，以后慢慢说吧。

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作者: one    时间: 2012-1-17 10:54


HCL当然能灭菌了，用胶塞封口，然后在用注射器插在上面，保持内部压力能部分释放，上面传下来的方法，也不知道是否有更好的方法，反正我们是这么做的，难道你培养时候酸和碱不灭菌么？那如何应用呢？如何调节PH值啊？谢谢讨论，呵呵

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作者: 穿越时空    时间: 2012-1-17 10:55

养了近一年的细胞，说不上有什么经验，谈一点我的体会吧。一开始接触细胞培养的时候很多人都会非常小心，一般很少污染，各种动作都小心翼翼，深怕污染了细胞，如果样的细胞少还好一点，如果养的细胞多，我养了3种，时间长了就会觉得很麻烦，尤其那些长得比较快的细胞3天传一次代，周末节假日还要看看，后来有一段时间老是污染，分析原因排除培养的因素，因该是实验操作失误引起的，所以说，越是熟练越不应该大意。
有些细胞消化后成一团一团的，我做的NIH3T3细胞就是这样，有时生长也不好，后来和有经验的老师、同学以及园中的战友交流，在0.25%.胰酶的基础 上加了0.01%的EDTA,果然好消化。对于生长不是很好的细胞可以多加点血清，再不行加点谷氨酰胺。
在做血管内皮细胞的原代培养，已开始也没有指导，更没有什么经验，丛书上找来protocol，从医院要来脐带，等到第二天再做，养了好久也没有养活，后来通过向别人请教，才知道拿到脐带后又马上就接着做，而且对于培养基要求很高，经过发反复复的失败和摸索，终于养活了几次。
细胞培养这么久以来，最大的感受就是养细胞一定要有耐心，不怕麻烦，我们实验室学生实验的瓶子都是自己刷，细胞配用用具很多都需要泡酸，如果没有一定的耐心，恐怕很难进行下去。尤其是长时间的培养细胞。
另外失败的时候，不要马上就重做，更应该好好分析失败的原因，从中学到知识。不清楚的地方要及时向别人请教，学习别人好的经验和方法。

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作者: vvmmoy    时间: 2012-1-17 10:55

我以前是做临床的,做实验从来没有接触过,养细胞时,别人说你是做外科的,无菌操作很熟,养细胞应该没问题,自己也这么想.结果第一次养细胞第二天细胞全部污染了,非常苦恼,自己千小心万小心,怎么还污染?后来发现因为实验操作时步骤一般较多,光凭脑子记不行.有时稍一分心就会在一些小的细节上出错,从而导致前功尽弃.以后,干脆把步骤写下来规范化,到哪一步该加什么就加什么,再没出过错!

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作者: tangxin_80    时间: 2012-1-17 10:56

到实验室已经三个月了，培养新生鼠心肌细胞，经历艰辛，有欢乐有。。。希望与大家一起分享
　　　1，取心脏：起初取心脏的听说可以“剪开胸骨，就可以挤出来”但是找不到合适的剪开点。后来解剖开后才想起来，本科时候解剖老师说新生儿脏器位置偏低，，，，后来就在大约第5－6肋骨处插入剪刀尖，横向剪开胸骨，大概开口8ｍｍ就可以挤出心脏了。每取一个心脏大约1ｍｉｎ。
　　　２，培养基的使用，虽然大多数人用的是DMEM高糖培养基，可是又有人用的是1640，同样也有效果（心肌细胞波动良好），同时实验室里也有师兄正使用1640，我就偷懒，就用1640，可是细胞就是不搏动，后来查了资料才知道，1640的钙离子浓度太低，而DMEM钙离子浓度1.8×1000（－3）。这是比较适合的浓度。后来我就自己买了DMEM培养基就可以了，细胞博动的很好看。
　　　３，消化心肌组织是出现絮状物质，没有办法去除，吸出已经消化的细胞时由于絮状物质的干扰不能吸出。我试着加大离心速率，期待能去除，可是2000rpm*10min离心后，居然它还是悬浮着。那次消化心肌非常失败，后来有一次在医院食堂吃饭，同桌的一位脑外博士，提到他消化脑组织，消化过渡的时候也会出现，这样的现象，后来经人指点说的细胞破了，DNA出来了。哦，我才恍然大悟，原来如此。以前一味得追求心肌细胞消化的彻底，就把心肌组织剪成肉沫状，……。以后消化的时候就是不能太小了。
　　　４，在园子里提到两种消化方法，一种是用恒温振荡器，一种用磁棒搅拌，原来以为胰酶的合适温度是37度，我用前者，可是消化结果，细胞数量很少，经过8次每次消化8分钟后，剩余的组织块还是很大。没有办法了，用后者，在室温20度的情况下消化结果好多了。
　　　５，当我把组织都消化了，什么都没有剩余了，我就把那些液体去离心1000rpm*10min（园子里一般推荐用的），可是我发觉：离心下来的细胞非常少，冥思苦想。后来有人提示说，离心标准单位是用g，大约是350g，我就按半径换算了，结果发现350ｇ应该是1500ｒｐｍ。于是下一次消化时改用了1500ｒｐｍ，细胞就多了。不死心，把上清去除继续4000ｒｐｍ离心，发觉还是有细胞剩余，不过这些细胞台盼蓝染色存活率比较低约40％
　　　以上这些与大家共同讨论，谢谢。我也是个新手，希望大家能互相帮助。。。。。。。加油

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作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-17 10:57

首先谈谈细胞培养中的一些小体会，希望对他人能有所帮助。
⑴理解每一个步骤的作用、目的，也就自然会明白该如何去做，不要照葫芦画瓢的做，初学者切记！问前辈问题之前自己一定要先想一想，采纳建议前也要先想想对不对，靠别人有时不如靠自己。
⑵细胞室要经常开紫外灯消毒，注意选择好消毒时间，很多人习惯开一晚上灯，第二天一早关灯，这样不好，臭氧味一时散不去，对进屋做实验的同志健康损害极大！所以开紫外灯之前最好和使用细胞室的所有人都商量一下，找个没人做实验的空当消毒，大家一定要互相关心爱护！
⑶有些细胞可以只用EDTA消化，比用胰酶经济，且配制步骤简单；消化程度至细胞之间分离，然后用吸管轻轻吹打，避免过力。一次消化的细胞瓶数不要过多，因为倒掉EDTA后细胞会逐渐再次贴壁，后吹打的瓶就不容易吹下来了；如果出现这种情况，再次加入EDTA消化而不要用力吹打。
⑷即使所用培养基品种一样，养不同的细胞也要使用不同瓶的培养液，我以前没有在意这一点，后来总是觉得个别细胞长的像另外一种细胞，扔了可惜，留着嘀咕，实在烦恼。
⑸细胞瓶数多起来以后仍旧要像稀有时一样的照料它们，马虎不得。一分耕耘一分收获，时时刻刻都要细心。
此外，还想和大家探讨一些“新奇”的东西
我进细胞室是从来不穿白服的。我们的新细胞室也没有递物窗，也没横拉的门，每次实验时用塑料小筐把需要用的培养液等物品直接带进去。这些做法和书本上写的传统的细胞室设置布局要求完全相悖吧？可是我们很少污染，仅有的几次污染据分析也和以上无关，而是由个人实验操作或者马虎大意造成的。关于白服，如果穿细胞室专用的那种后面开口的太不合身太肥大了，尤其是袖子，肥，在超净台里移来动去带动的气流大，一不小心还有可能碰到瓶口，后来就干脆不穿了，进细胞室只是把平时穿的白服脱了，自己的衣服肥瘦合适很方便，不会带起大气流，夏天更好了是半袖的。并且，夏天里如果再套件大白服也太热了，再戴上帽子口罩就更不人性化了！（口罩我也是不戴的，不说话就行了，非出声不可时也不能对着工作台喊。戴的口罩薄了松了没有作用，厚了紧了大脑乏氧，不是么？）
我说的可能会引起一些同志的不屑，不过这些都是事实，并且都是经过实践检验了的，希望能引起大家的一点点注意和思考。对于我来说，至少我明白了，被大多数人认同的、被大多数人每天使用的方法并不一定是唯一的最适合的方法！
罗嗦了很多：）最后还是用我开始时的那句话结尾吧，理解每一个步骤的作用、目的，也就自然会明白该如何去做，不要照葫芦画瓢的做。我想这并不仅仅适用于细胞培养。

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作者: 831226    时间: 2012-1-17 10:58

我是做流式分选后再处理细胞，看周期和凋亡的。
一次分选完后，将细胞集中起来，打匀后加入另外一种细胞，4，8，12，16小时收获。熬了一晚上，终于将所有时间点的细胞都收集好了，然后做流式，分析周期和凋亡。可是，一上机，发现细胞数不对，而且都是凋亡细胞。这是怎么回事？我出了一头的汗。将细胞在镜下观察，发现都是分选出的凋亡细胞。另外一种细胞没有出现！！！
消失了？？？不可能。于是，我又将另外那种细胞拿出来看看，里面的细胞一切正常。说明我没有将它取出来，但是我的确吸了3ml呀！！
再一分析，由于我处理分选后的细胞时间较长，因此，在去另外一种细胞的时候，细胞沉淀到下层去了，结果我取细胞的时候，是取的上层液体，因此最后上机的时候只有分选的细胞而没有另外的一种细胞。
花了一晚上时间，还不算前期进一周的准备时间，都付诸东流了！后悔之余，一位师兄安慰我说，实验出问题是较常见的。重要的是以后每一步都要有检查的步骤，这样才能让实验循实验计划进行下去。要反思！！
从那以后，每次实验，我都思考很多，将有可能犯错误的地方标出来，并尽可能的找可以检查实验是否正常的点，以保证实验的顺利进行！终于，我的实验前期结果如愿获得。以后还要继续做，但我对实验的结果充满信心。

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作者: +小生怕怕+    时间: 2012-1-17 10:58

我的7年细胞培养经历
算起来从第一次养细胞,到现在已经有7年的时间了.最初选课题的时候我就铁了心要做细胞培养,而不是微生物,因为喜欢这个技术,觉得干净,技术含量也更高,呵呵,那时候还上大四......
刚刚进实验室的时候，什么都不懂，好在我的特点就是细心，勤学好问,从洗瓶开始做，那时候觉得做实验有一半时间在准备,由于我们实验室细胞培养历史悠久,老师经验丰富也耐心,所以进步很快,大约1个月就入门了,3个多月完成毕业论文,CHO细胞的驯化,得了很高的分数.
研究生课题我选的是造血干/祖细胞体外培养,觉得比较前沿...后来发现,每次做实验都要去产房取血,早晨预约好就去医院了,然后和家属一起等在产房门口,宝宝一出生,护士就将取的脐血当着很多人交给我,看着家属奇怪的眼神,想想真是有趣..当然,每次我是祝愿宝宝健康的.但是分血是需要时间而且很辛苦,经常实验做到很晚...最初实验没有进展,烦躁时真想砸东西,但是咬咬牙挺过来了,论文答辩都总算顺利...
毕业后也养过很多细胞,还使用生物反应器大规模培养.其实细胞养好了是非常结识的,搅拌通气都活得都很好...
回想起来,养细胞就如照顾小孩子,要用心的...其实养活细胞不难,养好就不容易了.细胞中原代细胞最不容易养好,细心就好.....
除了经验以外,对于细胞的特性,代谢,培养基成分都需要相当的理论基础和水平,如果仅仅只是动手养细胞，那么只是在操作的层面上，其实养细胞只是一种手段而不是全部，所谓学无止境吧...
现在由于工作关系已经不做细胞培养,但是我得细胞培养经历总是让我十分的怀念...有经历自然有收获...有时间仍然到细胞版来看看，能够有不少收获。
希望各位仍然做细胞的朋友喜欢自己的细胞,喜欢自己的工作...

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作者: 缘yuan    时间: 2012-1-17 10:58


我才开始养3周细胞，而且没有师兄／姐的指导，完全是自己看书／查网上资料，但通过已经考验，从没污染过，细胞状态从不好变好，而且已经同时养3种了，其中2种是我们实验室没养过的，冻存／复苏都很成功。我想，只要认真，养细胞真的没那么难。

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作者: fsdd817    时间: 2012-1-17 10:59


在做单细胞凝胶电泳的时候，玻片清洗的时候一般都是先泡酸在冲洗，不能用洗衣粉清洗，因为洗衣粉里面会有荧光干扰，影响试验结果。泡酸后很难保证玻片上的酸完全清洗干净，残留的酸会影响试验，后来我们试验的时候在配琼脂糖时加入少量酸碱指示剂，这样玻片上残留有酸的时候琼脂糖一加上去就会变色，很容易判断出玻片是否清洗干净了。

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作者: 伊莎贝拉    时间: 2012-1-17 10:59

我养原代大鼠成骨细胞，也谈谈自己的感受：
老实说一开始我是比较顺利的，因为我们实验室曾经有师姐养过，整整摸索了一年，留下不少经验。我是按她留下的实验记录采用两步消化法，结果第一次就养活了，导师表扬了我，让我沾沾自喜。没想到很快我就碰到了难题，在做细胞鉴定（alp钙钴法染色）时，着色细胞很少。我以为是试剂出了问题，于是重新配，结果还是一样；我又把一些老试剂换成新的，结果还是出不来，几次下来让我很沮丧。这时候我才意识到养细胞不是那么容易。通过查阅相关文献，咨询做相同细胞的研究生，帮我分析可能是细胞纯度不够，需要进一步纯化。于是我用反复贴壁法，酶消化法，去除大量成纤维细胞，再次鉴定，结果如我所想，大片细胞深染。
通过这件事让我颇有感触，得出经验：光靠前人的经验不够，做实验要自己钻研！

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作者: baidukk    时间: 2012-1-17 11:00

我养了半年多细胞了，CHO。
养细胞必须有耐心，必须细心呵护。
养了好多天，忽然状态不好了，或者是一起全死了，那种感觉太郁闷了。
细心一点。举个例子，有一次冻存细胞。准备了半天，冻存液都是现配的，高压都准备了好几次，总之那时刚开始接触细胞，麻烦的很了。我养的是两种细胞，一种转染了，一种没转染。最后发现了个致命问题，离心前忘了标号了。那个感觉啊，想哭又哭不出来。白忙活了一个晚上。亏了师兄安慰我，算交学费了。
再就是，那次细胞状态最好的时候懒，好多东西也都没准备好，没涂片做组化。等到都准备好了，细胞状态又不是很好了。还是郁闷。
所以，时常告戒自己，耐心点，细心点，勤奋点。

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作者: junjie05    时间: 2012-1-17 11:00

偶也谈谈自己的一点体会：（偶养的肾小管上皮细胞）

其一：我认为尽信书不如无书，书上所写不可全信，因为每个实验室条件 都不同，而且细胞类型不同，所采用的方法和诀窍也不同，有些书都是为写书而写书，就象目前的医学论文，你照着别人的剂量和方法，几乎没几篇可以重复，所以不可照搬书本
其二：细胞株一定要好，我们开始用的细胞株不行，老死，后来换了北京的细胞株，就很顺手了
其三：要自己摸索，不要人云亦云，例如我师姐说消化时间不要过久，约一分钟，但我的胰酶和细胞不同却要2分钟；还有一个著名的回国教授指导我们说，不要吹打，否则细胞会吹死，因为他在国外从不吹。我发现不吹根本不散，所以我坚持吹
呵呵，现在我的细胞疯长，不过可是艰苦摸了两个月哦

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作者: woshituzhu    时间: 2012-1-17 11:01

我养骨髓间充质干细胞的体会:
我养的细胞是贴壁细胞，在不断的摸索中我总结出以下几点：１.培养瓶泡酸必须彻底，冲洗时，流水冲洗要多于２０遍（我一般冲洗２５遍）蒸馏水冲洗２遍，三蒸水冲洗２遍，避免因冲洗不彻底而造成细胞的死亡。２.培养基发现有浑浊一定要用针头滤器再抽滤一下，然后再加入胎牛血清。３.血清最好１０ｍｌ分装到小瓶中，每次用时溶解一小瓶，这样可以避免培养基污染后再抽滤造成营养流失。４.最初开始培养细胞时，有一次发现细胞中出现一些空泡，但细胞的状态很好，问别的老师，他们也没见过。于是就当细胞营养不良，每天换液，过了三天这种现象就消失了，后来翻阅了资料才发现是细胞自然向脂肪细胞分化了。换液调整为两天换一次（以前三天换液一次），以后再也没出现过这种现象。

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作者: 兔唇    时间: 2012-1-17 11:02

不知道是不是因为天气越来越热了，细胞变的越来越娇了．好不容易这才顺顺利利的长了起来．正好也借这个机会做个小总结吧，希望能提起大家的注意．

１．培养液一次最好不要配太多，以一升为宜．用完再配．这样可以保证培养液是新鲜的，不会出现这样那样的问题．

　我以前是一次配很多，３至４升，结果一下子用不了，都堆在冰箱占地方不说，而且到了用的时候出现了各种问题，pH值也变了，双抗也感觉不强了，还得加这些来平衡，无形中增加了染菌的机会．

２．最好什么都用自己的，这可能是老生长谈了，有时候总觉得用不多就借一下别人的，但我也相信很多人吃过这种便利的亏吧．所以就是再小用量的试剂也要自己过滤一小瓶，用着放心．

３．如果是过滤前调的ＰＨ值，最好过滤后再测一下，我近两次发现1640培养液在过滤前后ＰＨ值差别很大，升高了将近０．５个值．如果有这种情况发生，可以用无菌ＨＥＰＥＳ缓冲一下，５００ＭＬ加１ＭＬ即可，再用精密试纸测一下．

４．培养瓶的灭菌方式：干热和温热分别宜合不同种类的细胞，提前查清楚能事半公倍．如果多次复苏不能活，请考虑一下是不是灭菌的方式不对头．如果是高温干热灭菌的话最好是包两层牛皮纸，而不要用玻璃纸，因为高温容易把玻璃纸烧碎，用时容易掉入培养瓶．

　　以前跟着师兄师姐做，养他们分出来的细胞总觉得很简单，到了自己做的时候才发现原来细胞培养是这么一件细心的事，稍不小心细菌就会入侵你的细胞．呵呵，可能这也是大家都经历过的吧．

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作者: bongte    时间: 2012-1-17 11:02


前一段时间我们养的A549一直状态很不好，细胞中又很多黑色颗粒，细胞有点肿胀。后来发现是因为用DMEM高糖+10％血清培养液并不适合A549的生长。我们换成了1640+10％血清，A549的状态非常好。协和细胞库的老师说A549在F12中生长也没问题。看来培养液还要真对细胞的种类进行选择，对细胞的生长影响很大呢！

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作者: 吴才子    时间: 2012-1-17 11:03

我的实验终于告一段落了，回想起一年的实验历程，怎一个难字了得！除了开始做实验时，细胞长得比较好之外，这一年中我始终在和我亲爱的细胞作斗争！曾经有一个月我养的原代细胞都不贴壁，在找遍了各种原因之后，我已经彻底绝望了，就在这时我的细胞有莫名的贴壁了，到现在我也不知道是什麽原因，好像是细胞在考验我的耐心。把我的经验告诉大家，希望大家可以少走点弯路：
1，养细胞是个细致活，事无巨细最好亲自动手，任何一个环节都马虎不得，急不得烦不得，细胞也是有感情的，你对它好，它才会好好长哟
2，无菌观念非常重要，尤其是养原代细胞，污染是一个大难关，随时都要有无菌观念，当然这一点是要慢慢培养的。
3，传代时如何使细胞种的均匀，这是很多新手容易碰到的问题，除了要吹打均匀之外，建议最好把用培养基吹打好的细胞从培养瓶中转到一青霉素小瓶中，用枪种到培养瓶中，这样就可避免分布不均的问题。

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作者: 彼岸花opp    时间: 2012-1-17 11:03


我养了四个月的鼻咽癌细胞和喉癌细胞,经验不多教训不少.跟大家尤其是将养细胞的新手分享一下:
1 有备无患 新手养细胞出错是难免的,所以得先准备好退路.首先细胞旺盛的时候一定要记得冻存,最好一种细胞冻三四管,复速细胞成活率可能没书上说的那么高.其次是要跟其他养同种细胞的搞好关系,危急时候互相支援一下吃吨饭强过被老板批再花大几百去买
2 不教条主义 初养细胞配液调PH值很麻烦,一般的试纸很不精确,号称精密试纸的作用也有限.我的经验是先参考说明书,按推荐剂量加.其次是观察颜色,多配几次对颜色有个印象,虽不是非常精确有大的出入还是能发现的.最后是观察培养液变黄时间,这是最重要的,我的经验是调整到两天变黄,这样工作量不是太大,营养也足够.换液时正好传代(我的细胞生长好时两天一代.强调一点注意双蒸水的PH值可能偏低,我们用的水只有6,最初没发现害人不浅
3 警惕污染 细胞出现污染情况要提高警惕但不要慌张.细菌污染比较好处理,少量的用大量PBS冲洗三次加入抗生素一般可以解决.大量的就只好弃取以免养虎为患,真菌污染非常麻烦但污染较轻及时加入抗真菌药还可以挽救一些
就说这些祝各位好运!

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作者: dotaaa    时间: 2012-1-17 11:04


我也刚开始养细胞,失败的经验比较多,希望大家不要重捣我的复辙.
我培养的是晶状体上皮细胞
刚开始,我的细胞总是不长,有时候一个月才长一点点,在丁香园查看文章才知道是衣原体感染了,以后严格无菌操作细胞很快就长出来了!
后来养了几批细胞,有一批污染了没有注意,加培养液 的时侯一块加,结果所有的都污染了,真事欲哭无泪阿!我的经验是应该多养几批,分开操作可以防止一块污染.

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作者: windy+++    时间: 2012-1-17 11:04


养细胞快有三年了，刚开始养的是大鼠心肌细胞，我记得最多的时候一周两次，每次20-30只左右，从开始准备洗瓶子，消毒，培养，到换液，处理等，要一周时间。其中经历了细胞状态不好，污染，不搏动还有血清质量不好等很多问题。所以我觉得在养细胞前，一定要检查好培养液有无问题，如PH值，有无污染，还有血清一定要质量好的尤其是对于原代的细胞，这样有住于细胞的贴壁。胰酶我是先配成母液用前用PBS稀释，这样可以把胰酶冻在-20度冰箱里。做原代时一定按顺序放好各个物品，以防污染。
在培养293细胞时，细胞状态很不好，我用了20％血清，两天换一次液，状态逐渐好转。
后来做过人脐带的平滑肌细胞，我觉得最重要的是动脉的外膜一定要剥离干净，组织块剪的尽量小些，分布均匀一些，使组织快周围和培养瓶贴紧密，这样才有利于细胞爬出来。

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作者: 盼盼    时间: 2012-1-17 11:05

已经差不多养了三个月细胞了，也算小小的积累了一些经验，呵呵．
养的是hacat细胞，算是生命力比较顽强的，不容易死．
刚开始养细胞的时候，很小心，怕污染，所以细胞也一直没出什么差错，蓬勃生长．但随着时间过去，问题就越来越多了，最郁闷的一次是，养着的两瓶细胞竟然同时污染，而且污染的是不同的细菌，一瓶培养液浑浊的一塌，一瓶里面可以看看很多杆状的歪歪扭扭的细菌．很无奈，全扔了，然后复苏，结果这个细胞复苏效果特别不好（也许我冻存也没弄好），一般只有１／１０不到的细胞会活，整整长了一星期才旺盛起来．．．．

现在细胞状态又不太好了，能看到很多透明的小颗粒，不知道是什么东西，而且常常有培养瓶出现周围细胞长的很快很满，中间以及靠近瓶口处细胞很稀疏：（郁闷中．．．．）

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作者: loli    时间: 2012-1-17 11:05

有些超净台的前的所谓“玻璃”用的是有机玻璃材料，不是真正的玻璃，如果有机玻璃，用75％酒精擦拭，就会造成表面模糊的情况，如果是真正的玻璃，则不会发生这种情况。
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看了这么多兄弟姐妹的经验之谈，真长了不少见识．

在这里我也谈一个小事故吧，以供参考．

刚进细胞室的时候有些小的规则不知道，在收拾做实验用的东西后，我发现无菌操作台的玻璃有些脏，于是就自作主张用７５％的酒精去擦，结果傻眼了，那一点点花变成了一大片．操作台整个不能用了，因为几乎看不到里面了，只能换玻璃了．

后来师兄想了一个好方法，用牙膏擦拭，效果非常好，如果有哪位新手也遇到这个问题不妨一试．

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作者: utt0989    时间: 2012-1-17 11:06

去年九月开始进实验室，目标是制备单抗，养的是杂交瘤细胞，即为小鼠脾细胞与NS-1的融合细胞，是贴壁细胞，不需要消化，传代时只要轻轻吹打就可以。

首先，要调整好心态，培养细胞就如同养个小baby（前面个个人大比喻各有不同，呵呵），不可以掉以轻心，亦不可以不放在心上，很多时候心情是随着细胞的好坏变化的，这样其实很容易影响试验，只有调整好心态，以平和的态度对待，遇到问题就努力去解决，科学嘛，就是不断的出现问题解决问题，这样坚持到最后，一定可以有满意的结果。

其次，事先对你的细胞有了大致了解，在培养实战中还要不断总结，摸清你的细胞的习性，就可以轻车熟路了。 如同我在拿到产抗体的细胞株后开始扩大培养，但是发现细胞已经变得有点脆弱，经不起吹打了，一吹就不再贴壁，但是换了另一个瓶子就又可以贴，所以经过摸索，我就把可以传代的细胞稍用力摇晃几下把贴的不紧的细胞摇下来，然后倒到另一个瓶子中，长势很好；或者吹了以后，转移到另外两个瓶中，丢弃以前的那个瓶子，长势也不错。呵呵，如果你也碰到这同样的情况不放试试看哦。

还有，无菌操作，培养基等前面战友已经说了很多，我也受益匪浅就不班门弄斧了， . 培养基使用前要平衡一下，室温20分钟以上或者37度10分钟以上，也不要太久，如果温度太低对细胞的刺激会很大。

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作者: wmp1234    时间: 2012-1-17 11:06

一个教训 大家共享
在扩大细胞的初期，我觉得细胞状态很好，就非常放心的从10％换为5％新生牛血清浓度的培养基，因为没有高糖，我想地糖应该没有问题。结果，第二天看，还没有什么变化，到了第三天，细胞就不是那么圆，那么漂亮了，我认为是营养不够了就给它换液了，再一天一看，我的妈妈呀，几乎没有活着的了。 不知是什么原因，后来在与老师汇报时，忐忑不安的把过程说了一遍，结果挨了一顿训，但是知道了是因为细胞的环境改变的太快太大，导致细胞不适应了。 后来啊再也不敢突然改变细胞生长环境了，要变也是一点一点慢慢的改变，呵呵－－，大家借鉴！

愿 我们的 试验都可以顺利进展！

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作者: 社会主义好    时间: 2012-1-17 11:07

我是从去年开始学习养细胞的，刚开始约有一个月的时间只是看着别人做，自己不动手，当时觉得真是太难了，好多细节都要小心，偏偏自己又是一个粗心大意的人，鼓足勇气后终于养了第一种细胞ψA，幸运的是没有污染，于是美滋滋的在镜下观察自己的细胞时骄傲的情绪上来了：养细胞挺简单的！在这种骄傲情绪的支配下，我的厄运开始了。
先是细胞状态不好，和别人的同种细胞相比，我的ψA就像林妹妹，瘦小还多颗粒，郁闷了几天后经高人指点才知道我领的血清是国产的，而我们实验室的ψA是喝进口血清长大的，我突然连招呼都不打，就给人家降低营养标准当然不行了，所以我得出的教训一：血清要换的话，要一点点地换，不要突然就换。
细胞状态好了，但却经常污染，我更郁闷，天天小心翼翼的操作还是不行，终于有一天我发现了自己的错误根源，得出了教训二：培养瓶的瓶颈处千万不能留有液体，所以操作时要小心，另外将培养瓶放到培养箱时要动作轻柔且不要倾斜。
经过了很多失败后，我终于也成为一个偶尔可以指导别人的成手了，但即使这样还会犯错误，比如紧张过度喷的酒精过多导致细胞死亡；冻存时忘记写标签；液体更换不及时；胰酶消化过度等等，诸如此类我得出的教训三：你想要细胞出什莫样的结果，取决于你如何对待它。
总之细胞的种类很多，要区别对待，这就要求我们在准备养一种细胞之前，应详细了解它的日常饮食、喜好及脾气，要像对待小孩子一样去照顾它，要经常看看它，了解它有什莫需要，当然最重要的一点是：及时把它所繁育的孩子放到液氮中保护起来。

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作者: yhz1973    时间: 2012-1-17 11:07


养细胞难，养原代细胞更难。刚开始做实验时，只是跟在师姐后面看看，传传递递东西。后来自己做，第一次居然养的很好，可能时看多了，步骤都烂熟于心了，当时那个兴奋阿。可是到消化细胞二次接种时，问题来了。做了几次细胞都不贴壁，基本上都漂了。问师姐，我俩的胰酶用量和消化时间都差不多。于是，干脆让师姐帮我消化一次。我看了一眼终止消化前的细胞状态，才恍然大悟：原来师姐在细胞变圆及有部分开始漂时终止消化，而我终止消化时候细胞基本全漂了。操作时间上差的很少，但就是这细微的时间差，细胞可以发生很大改变，细胞的活力受到了影响。后来，我消化细胞时不再看时间，只要镜下改变有了就终止消化，这样接种的细胞在1小时左右就贴的很好了。看来做实验不能按部就班，要从实际出发阿。

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作者: hyuu    时间: 2012-1-17 11:08

最近又是一个失误， ,心痛了好几天啊！

虽说原因不在自己的操作，但是想起来仍是惭愧啊！

我有两株细胞，打算等到状态长得好，数量也足够的时候，冻上以留种，这样心里就会有多多安慰了，有了保证不用担心丢失了。。
在各种冻存的条件都有的那一天，我很不舒服，浑身没有力气，什么也不想做。一方面，害怕自己万一晕晕糊糊的操作失误或者其他原因导致不可挽回的错误；另一方面，自己确实那天犯懒了。。
于是呢，就决定把它们传一下。
结果，第二天一看，几乎全部死光光。呜呜－－ 哭都来不及了

没有办法只好面对现实，好好保护剩下的几瓶很少的细胞，等待它再次长起来。

寻找原因啊，我可以确定操作没有失误，用的也都是高压后的东西，污染应该不会。再看细胞，那天上午所有处理的细胞无一例外的变得黯淡无光，难道是培养液的问题？ 不可能啊，同样的培养液，额下午用来处理的细胞就安然无恙啊。 再想，－－－，操净台！ 对就是它了。
我们实验室有两个操净台，它的紫外的开关有点不正常，有时会有你关了它却仍是开的状态，就算用前你确保它是关闭的，它也会在你用的过程中自动开启,(我已经被照过两次了，好在时间不是很久，胳膊灴了几天才好，现在，每次都把手套与隔离衣紧密连接好才进去）。 而那天一定是我不知道的情况下紫外已经打开，保护好了自己，却伤害了可爱的细胞，......
后来一经交流，才知道，我不是第一个碰到这种情况的人。 好在都还有幸存者（那天没有处理的  ），终于今天就可以冻了 。欣慰啊！！

总结一下就是：1.只要你是培养细胞，就不要偷懒，哪天该做怎样的处理了，一定要坚持处理，不然，出现的意外，都是始料不及的。
2.一定注意不要让紫外与你的细胞亲密接触

呵呵，不知朋友们，有没有碰到过，最好没有，希望以后也不会， 这是不是也算是，有时细胞无故状态不好，或者无故身亡的 一个可能原因呢？

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作者: 小螺号    时间: 2012-1-17 11:08

看到这么多细胞培养的前辈们的经验，受益匪浅。
本人学细胞培养至今整三个月，培养过三种购买回来的细胞株EC,SMC,SAOS-2,以及从原代培养的HUVEC和rat BMC。谈点自己的感受吧：
1、找个高手指点会事半功倍，还要不懂就问，初学者没什么禁忌，不懂很正常的，我是跟着老外学的，刚开始学想问都没法顺利表达那才叫痛苦呢。
2、实验器皿，除了移液管和烧杯，其它全为一次性的，虽然花多一点钱，但是培养效果很好，省心省力。还有，我们洗移液管和烧杯，都是4遍自来水冲洗，3遍双蒸水润洗即可。
3、灭菌一定要用灭菌指示胶带，不贵，一卷60元正常使用可以用半年，可以区分是否灭菌，方便安全。还有胶带上一定写明日期和姓名，两星期没用应该重新灭菌。
4、不管是传代还是原代培养，细胞状态好的时候一定要冻存，这样以后做实验也不会心理没底了。我们的冻存步骤是：加冻存保护液，异丙醇做冻存温度缓冲液，首先置与-70度冰箱两天（最多不能超过一星期），接着转移至液氮冻存，效果良好。
5、常用的试剂可以配成高浓度，便于保存。比如trypsin-EDTA，配成10倍浓度后用冻存小瓶分装，每次消化取出一瓶即可。
6、如果发现细胞死亡，而未观察到染菌现象，细胞应该继续培养一两天观察。我就有这样的经历，有一次培养的细胞一下子都没了，只有悬浮的一些细胞，以为细胞全死了，但还是换了培养基，结果第二天，换成蓝色滤光片后，惊奇地发现可爱的细胞还好好活着呢，呵呵，幸亏没丢掉。
7、每周一三换液，周五传代。传代的时候PBS和trypsin都要先用0.2um的滤膜过滤（不管以前有没有过滤或灭菌，这一步都必须的），如用25cm2的培养瓶，则先用5mlPBS洗两次，用trypsin洗一次后，再加trypsin进行真正的消化，之后加至少与trypsin等量的培养基稀释后离心，1000rpm，5min就行。
8、如果能够配一台吸液的设备，如医用的吸痰器＋细颈的滴管，这样在弃去培养瓶或培养板的液体时，效率会极大提高。

感想挺多，暂写这些，大家指正。本人在成都，欢迎PM。

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作者: mickeylin    时间: 2012-1-17 11:09

我在杭州一小公司,在租的一个老实验室养细胞,条件极其艰苦.一个几十年前的二氧化碳培养箱还是通过控制气体流速调二氧化碳浓度,一个老空调噪音很大,杭州夏天温度极高.在天气好时细胞在我尽心呵护下还长的健康,到夏天来了,我发现细胞一天比一天差,心里打鼓了.没有污染,我仔细看过,培养液也没变,其他操作如常.实在不甘心细胞就这样死光,想到这实验室里人都热得受不了,细胞是不是被热坏了?于是过一会去看一次培养箱温度,果然发现有段时间温度太高,都38度了.我打开空调,几天后,细胞好了,小点不多了.以后我不光只看培养箱温度等参数,还要关注天气预报,免得又热坏了我的细胞.
有谁在这么艰苦条件下养过细胞?

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作者: nn255    时间: 2012-1-17 11:09

本人正在做单克隆抗体的扩大培养，收集上清。有一点心得想要与大家分享。

得到单抗的三轮克隆的细胞株后，得到抗体的方法一般有两种，一种就是打小鼠收集腹水然后纯化，另一种是扩大培养细胞收集上清然后纯化。我现在用的是后一种。
在扩大培养的时候，尤其是同时扩大好几株的时候，细胞很多又不能立起瓶子来长，很容易感觉很乱很杂，不知从那一株哪一瓶开始处理好，而且速度很慢，没有条理。刚开始的时候我也有这种感觉，不过现在感觉就不是这样的了。   。
首先，把不同株的细胞放在不同的地方（比如不同的培养箱，又比如同一培养箱的不同层）；
其次，处理的时候，一株一株的处理，处理好的细胞放在靠一层的一侧，界限在哪儿自己要清楚才好，这样就不容易弄乱了；
最后，每处理一瓶（或一孔），用记号笔在瓶上写明作了何种处理（如换液、传代），写明处理的日期，如果用的液体不同还可以写上用的培养液，以及其他需要注明的内容。 eg:05.8.5 传 10％NCS （各位战友应该可以看明白，呵呵 “05.8.5用10％NCS 传代”，当然只要自己明白什么意思就好了）

OK了，到你下次再处理的时候，按照上面所说的一株一株处理，已处理的与未处理的分放两侧，且每处理一瓶细胞前先看一下之前做的何种处理然后镜下一看，下一步该如何就心中有数了！ 现在就不会再感觉杂乱无章了，而且效率和质量也有了大大提高。当然，心情也会随之明朗起来的

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作者: @STAR@    时间: 2012-1-17 11:11

正在做细胞的流式分选及分选后细胞培养，有几点经验与大家分享：
1 用于分选的细胞一定要保持最佳状态，否则禁不起折腾。
2 分选的前一天，要考虑好实验步骤，准备好所用物品，严格无菌操作。
3 制备分选细胞液体时，建议用双倍抗生素且含1％FBS的PBS，有利防止污染，保持细胞活性。
4 接分选后细胞所用的流式管里要加200－300微升的血清。
5 培养分选后细胞所用的培养基也要加双倍的抗生素，因为分选的过程并不是严格无菌的。

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作者: yes4    时间: 2012-1-17 11:12

在做彗星实验中，DMSO和Triton-100都是临用前才加入裂解液中的，而且不能指望用搅拌将其混匀，那样只会越来越浑浊而且会有结晶析出，在配制好裂解液后用固体NaOH调节好其PH后，4度预温用前加入DMSO和Triton-100，加入后会发现稍有乳白色浑浊，这时千万不要用磁力搅拌器去搅拌，放入37度水浴中一会就会澄清不少，偶第一次用磁力搅拌器搅拌了快3个小时结果裂解液彻底报废，汗一个！！

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作者: greenbee    时间: 2012-1-17 11:14


关于细胞污染方面的教训：
有一次整个培养箱的细胞全都细菌污染了。回想严格无菌操作，培养箱也没有污染。最有可能导致这大规模污染的原因可能就在培养基出问题了。然后取点培养基在培养箱培养观察，结果真的发现有细菌生长。但是培养基是瓶装进口的，不会出问题的。血清就成为重点可疑对照。但是血清分装时也是无菌操作的，不过还是拿了一条化开观察。结果发现那离心管竟然是漏的。天啊！
经过这次教训，我决定1.用进口的离心管分装血清 2.液体冻结后体积膨胀，分装时不能装太满 3.冻血清时要保持管身直立 4.化血清前观察管壁外有没有血清溢出

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作者: 泡泡    时间: 2012-1-17 11:14


我做的细胞应该算比较易于培养的成纤维细胞。但在实验中还是碰到很多问题。比如：原代细胞数量不满意；污染的问题；传代后细胞活性减低，贴壁率下降或出现死亡的现象。
在我的实验中，我用以下方法处理这些问题，收到较好的效果。供大家参考。
1.原代细胞数量少：最初实验虽说都有细胞，不是颗粒无收，但总是数量较少。采取的策略是：a.选择权威而相对简易的方法，方法越复杂，步骤多，细胞易于丢失，而且为污染埋下隐患；b.组织剪碎要彻底，这样消化效率会大大提高；c.消化时间要充分，这就得自己摸。消化时不要放在孵育箱，孵育箱内偏酸性，会减低胰酶活性。
2.污染的问题：a.“欲善其事，先利其器”。工作台、器械的消毒至关重要，尤其自己消毒时。b.少说为佳。做实验室不要聊天。c.培养瓶不宜火焰消毒，建议用酒精棉球擦拭。d.忍痛割爱。不仅要善于鉴别污染细胞，而且不要存侥幸心理。以免"一粒老鼠***，坏了一锅粥"。
3.传代过程中细胞丢失：传代的细胞活力往往比原代差，所以消化时间要短一些；其次，吹打不要太用力。本人感觉，对细胞而言物理损伤不亚于化学损伤。

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作者: 阿敏    时间: 2012-1-17 11:14

我要培养的是动脉的成纤维细胞，最开始的时候是用兔的动脉做试验，用消化的方法，细胞长的很好，也长的很快；我就觉得细胞培养不是问题。所以也没记录，现在想起来都后悔！
可是后来又培养鼠动脉，用消化的方法，可它死活不长啦，感觉都消化不下来细胞；也调整了酶的浓度，消化时间，最终还是没长！又改用贴壁的方法，组织也贴上去啦，也没污染，可就是没细胞爬出来！现在已快一个月啦，一点起色都没有，又找不到原因，急死我啦！

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作者: 二丫头466    时间: 2012-1-17 11:15


不知大家有没有过这样的经历：一株细胞，养的好好的，一天就不明原因的状态不佳，然后就开始补救工作，换液，更甚之，换更高浓度血清的培养液，但是看起来还是没有起色。

几天前，我遇到这种情况，（后来知道原因是因为细胞被紫外照了），也进行了补救工作，换了两次液后，瓶内只见死细胞残骸增加，却几乎见不到一个活细胞的影子。本想扔了，以后再重新复苏，转念一想，就这么一个小瓶子，放在培养箱里也不占什么地方，于是就往一个旮旯里一放，抱着一丝希望它能有几个活得长起来。结果，几天后看了一下，真的有几个小团的细胞，每一团大概有四五个细胞，好高兴啊 ，不用再复苏了，接着放回去，再几天看，细胞明显增多了。

呵呵，柳暗花明又一村的感觉。战友们如果也有这种情况，尤其是珍贵的细胞株，或者没有后备冻存的细胞，出现了类似情况时，不要轻易的扔掉，反正是对它失去信心了，就把它放在培养箱一角，没准几天后它会给你惊喜呢，呵呵。

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作者: pengke1983    时间: 2012-1-17 11:16

我想谈一下关于超净台安全使用的问题：我们实验室的超净台的紫外灯偶尔会自动打开。如果操作时不注意观察，不但那一刹那敞开的细胞被照上，影响细胞生长，裸露的皮肤也会被照射，如果没戴手套就更伤了。虽然紫外的杀伤能力不是很强，偶尔一两次不会有问题，但是如果长期不注意可能会引起蜕皮甚至更严重的后果。不知道大家有没有同样的经历？

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作者: 蒲公英    时间: 2012-1-17 11:17

我作晶状体上皮细胞的培养,先在还没有做完,有很多失败的经验,希望大家不要重蹈我的覆辙.
刚开始的时侯.细胞一直没有生长不知道是什么原因,查阅文献资料了解到很可能是支原体感染了.支原体是在显微镜下是无法观察到的,而且无法滤过清除掉,细胞感染支原体以后,会生长缓慢,甚至停止生长.所以一定要过好无菌操作这一关.
还有一次培养瓶取出来的时侯发现瓶内长满成片黑色的非细胞样物质.在倒置显微镜下观察,晶状体上皮细胞已经观察不到,观察到的是和细胞一样大小的成毛刺状的团状物.连接成片.覆盖整个瓶底.可能是真菌感染了.细胞全部舍弃.考虑到可能是培养箱的问题,实验决定对培养箱进行消毒:用无水酒精擦试培养箱内壁,包括间隔版,全部用酒精擦试3遍,晾干后再用紫外线照射一小时.培养液重新滤过.消灭可能的污染源.
夏天的时侯细胞更容易污染.操作不过关,在天气不热的时侯,细菌不容易生长,所以没有造成污染,进入夏天后,各种细菌繁殖增加,污染的机会也增加了.所以关键是要做到严格的无菌操作,这样无论在什么情况下都不会污染.而且应该同时培养多批细胞,这样可以节省时间,即使一批死掉还有预留的几批.

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作者: 黄花菜    时间: 2012-1-17 11:17

呵呵!看大家说的热闹我也来说说我的经历!那是郁闷的三个月,我养PC12,开学来就开始复苏细胞,师兄和老板一共冻了17-20支,细胞解冻离心后,我按照平时传代种板离心一样吹打了又吹打,把细胞悬液倒入培养瓶,第二天一看,只有极少数的贴壁!大部分葡萄样聚集漂浮着,就这样把师兄冻的细胞over了!慌了,赶紧查书看资料,这才知道吹打一定要轻柔!可这只是噩梦的开始!又开始复苏老板冻的细胞,什么都注意了.甚至台盼蓝染色检查细胞活性,细胞活性>50%用最小的培养瓶就底面积25CM2的那种培养,仍然只有几个贴壁细胞,就这样冻存的细胞终于全都完了!只有那几个细胞仍在培养箱中挣扎,一个月过去了他们终于长起一点,培养基黄了,我忐忑的换了液,可第二天一看那几个仅有的细胞不见了!欲哭无泪!就这样三个月过去了!细胞却没有了.直到那一天师姐发现CO2罐用了那么久还很重,才发现孵箱根本就没有CO2!真是惨痛的经验,什么都怀疑了却漏掉了孵箱!而且7721在没有CO2的孵箱还长的很好,真是误导啊!

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作者: TAT    时间: 2012-1-17 11:17

我讲一下我养MCF-7的失败教训
MCF-7是我养的第一种细胞，当时很紧张但细胞长得竟极好，在一传二的情况下，两天就传一代，培养液都快供不上用了，于是很得意就把师姐曾说的要及时冻存抛到了脑后。结果就在细胞数已够马上要开始实验时一夜之间细胞几乎全部浮起，抢救无效。后来请教细胞所的老师才知道MCF-7培养时一定要加胰岛素否则养到一定时间就不能顺利吸收养份而集体饿死。但我之前查的资料中并未提及这一点，而且很多文章中培养液的成分中都无胰岛素。所以在养一种细胞时一定要尽量找到曾养过的实验员询问注意事项，很多时候经验比书本更重要，同时一定要注意冻存，最好是新细胞第一次传代时就冻起1/2到1/3，第二次传代时再冻起1/3，这样既能保种又能保证细胞活性。
此外，一些书上曾提到浮起的细胞可以离心收集后加入培养液抢救，但我的经验是这种细胞并无抢救价值。我试过很多次，这种细胞的存活率几乎为零，就算中间夹有少量有活性的细胞，在大量细胞死亡崩解释放出毒素的环境中也难以幸免。所以，我的建议是彻底清除浮起的细胞，将残存的贴壁细胞换瓶换液并合并以保证细胞密度，而后减少换液以减少对细胞的损伤。

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作者: nn255    时间: 2012-1-17 11:18

我觉得养细胞无菌操作是关键，对于配制培养液时，有些人为了让培养粉充分溶解，搅拌4小时或更长时间。其实这完全没有必要，一般培养基的固体组分还是易溶于水的，搅拌的时间长了会增加污染机会，虽然后来滤过除菌了，但细菌的代谢产物比如脂多糖谁能够把它滤掉？细菌的代谢是很快的，甚至在常温下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的经验就是搅拌30min-60min就把它过滤。
另外关于培养基的pH问题，一般按照说明书操作，加入所说的NaHCO3量，与预计的pH不会有什么距离，也就是说基本上不用调pH，如果相差大，要考虑三蒸水的质量是否有所下降，当然这时调pH也是不得已而为之。我配培养基时基本上不调pH，只是用试纸检测一下pH，观察一下培养基的颜色。

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不知道你配过1640没?它里面有些蛋白质组分就很难溶.就是搅拌四小时以上都不一定能溶.那怎么办?还是30分钟就过滤吗?不溶要紧吗?如果有其他高手知道,也希望不吝赐教!

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作者: misswu61    时间: 2012-1-17 11:18


我们常配1640，一般是搅拌一小时再加NaHCO3,然后在搅拌一小时，很好溶啊，你用的是Gibco的干粉吗？好象我们实验室有用Hyclone的就难溶些。

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作者: tianmei001    时间: 2012-1-17 11:19


我做MTT的失败教训
我搜集了群里关于MTT的好多帖子，其中有个帖子认为加MTT之前要吸弃96孔板内培养液，加MTT为培养液量的十分之一（一般20ul），但有的帖子认为直接加MTT,我在实验时采用了前者的方法，即吸弃上清，再加MTT,4小时后吸弃各孔内液体，加MTT不见任何颜色反应，晕！实验结果自然没有意义：各孔OD值都很低。我想显然是否加MTT之前吸弃96孔板内培养液导致实验失败，于是重新实验，直接加MTT,果然后来加DMSO有颜色反应了!结果成功！以后实验一定要采用标准的实验步骤，不可以轻信有争议的帖子！

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作者: nn255    时间: 2012-1-17 11:19

我们常配1640，一般是搅拌一小时再加NaHCO3,然后在搅拌一小时，很好溶啊，你用的是Gibco的干粉吗？好象我们实验室有用Hyclone的就难溶些。

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是啊，我用的就是Hyclone的，因为实验室其它人大多用他们的干粉，口碑还不错，有的说不溶也不要紧，我总觉得可能还是不太好。你们用的Gibco的干粉感觉怎样？好用吗？

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作者: nn255    时间: 2012-1-17 11:20

我是做朗格汉斯细胞（LC）的培养，先要把表皮细胞弄出来，还要求数量比较大！做了快三个月了，连表皮细胞都还没解决。感觉在取材的问题走了很多弯路：我取过成年小鼠皮肤全层，根本分离不开表真皮，看文献上说把表皮从真皮层上撕去，就自以为是的用镊子在那个皮上靠里面一面刮啊刮的，留下又白又韧的那层以为那就是表皮，拿着它消化，就消化下来一些纤维样的物质，没有细胞。急得我回去查书，后来才发现我留下的那些应该是真皮的胶原层。又换动物，这次是直接取豚鼠的表皮，细胞是有了，但是豚鼠体积那么大，不好做到无菌，而且细胞不纯，什么细胞都有。现在借鉴了园子里一些做表皮细胞的高手的经验，换做新生鼠，感觉完全不一样，新生鼠和成年鼠的皮肤差别很大，消化后，表真皮很好分离，现在实验才算小有起色。希望写出来给以后准备做表皮细胞的同学一点启示，不要再走我这样的弯路！

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作者: zhezhe    时间: 2012-1-17 11:21


一提起实验，真是觉得没有一个词语能把它讲述出来，形容出来的。一年来一直作细胞方面的实验，从细胞增值、细胞周期、细胞凋亡到细胞分裂，涉及外周血细胞的分离、细胞培养和细胞因子的刺激。但是给我的感觉细胞状态和纯度是最最重要的，不管你后续工作是什么，如果这一步你作不好，那么以后就是冒险赌注。简单的一个细胞增值实验的3H掺入，就做了3个月，不是作不出来，而是结果不稳定，而且大家的结果均不太稳定，标准差太大，有时真是焦头烂额了，从整个实验的各个角度，各个关键步骤都进行了摸索，还是不太理想，有时真想放弃，但作为一个科研工作者，既然入门就要做好，还好现在大有改善，不管是实验的设计，还是细胞的处理，药物的稀释等，这些直接影响了我的结果。
细胞因子稀释时一定切记保存一定体积的高浓度的储存液，防止活性降低。
细胞因子的添加一定要尽量大一点体积，避免非常微笑的体积进行剃度实验。
细胞处理时间尽量短，动作轻柔，你好好对它，它就给你惊喜的结果。

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作者: zhezhe    时间: 2012-1-17 11:23

各位群友的经历可谓是各有不同，真是长见识了，谈一下个人浅见，望各位不吝赐教
我做肿瘤细胞药物干预试验，细胞培养条件成熟，药物干预后需要做流式检测细胞调亡情况，预实验时参考园子战友的资料，即：收取细胞时控制消化时间，不宜过长，吹打不宜过度，以减少人为损伤。可是结果出来了，损伤细胞还是占相当比例，影响结果，很是头疼。后来经过咨询实验室老师，查询相关资料自己摸索了一点经验
收取细胞前备好冰盒，用新配制胰酶（新配胰酶效果较好）消化控制在2分钟以内（考虑不同细胞贴壁情况不同，在培养传代时观察消化情况，以便控制消化时间),中止消化后，吹打用力适度，尽量避免气泡形成，因气泡表面张力对细胞有损伤作用，尽量吹打成单细胞悬液以免影响结果，然后4度离心10分钟，弃上清，将细胞悬于4度的pbs，置冰上备用。
还有就是培养细胞时，计数培养瓶或皿细胞数目，这样收取细胞就不必再花费时间计数，可以节约时间，做流式细胞数目不应低于100 0000。
结果还是比较满意，现在基本上能把人为损伤控制在文献范围内，甚至更低。
个人经验希望能有所帮助。也希望各位站友多交流。共同促进。这也正是我们园子的目的：
ONE FOR ALL ,ALL FOR ONE.

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作者: moonlight45    时间: 2012-1-17 11:23

我做过乳大鼠原代成骨细胞的培养，其中酸甜苦辣非言语尽述之。然而，为了对做同种细胞的战友能提供一点帮助，我还是想说说其中的一些粗浅的所谓的经验：
1）关于准备工作，楼上的已经讲得很清楚了，我只强调一点，就是泡过强洗洗液的器材一定要用自来水冲洗15遍，才可放心进行下一道工序。
2）MEM培养基和血清最好用国外的，我用的是hyclone的，国产的血清在没有养成功前和试用后最好不要使用。
3）消化液最好用进口的0.25%胰蛋白酶，一定不要加EDTA，因为加入后后者对细胞的损伤较大（既使用量减半，消化能力还是太强），影响进一步的实验。
4）胶原酶最好现配现用，否则其活力易减低，不光会浪费实验经费，还会延误实验时间。
5）最好用8-12只状态较好的新生24小时内的乳大鼠，以自已饲养的最为划算，还能保质保量。
6）传代时，消化时间不要太长，跟据自已在显微镜下观察的消化情况确定标准的消化的时间。
7）传代或接板准备测指标时，以血球计数器上测得的细胞数目作稀释后为标准的接板或传代的细胞密度。一般接板时：细胞密度为1.5*10E4 cell/mL，或3*10E3 cell/well(孔)；接瓶时，细胞密度为5*10E4 cell/mL（2mL/50mL瓶）。
8）传至2-3代后，如细胞状态好，可设法多冻存一些细胞，复苏后可以传代，传代后长起来就可以筛选药物了。当然，为了让细胞生长快一些，状态好一些，一定要使血清浓度处于10-15%之间，不要担心浪费，在这方面，时间的价值是大于金钱的。
其它的操作与一般的细胞培养没有太大的差别，这是我大半年的多次失败和多次的摸索中总结出来的！

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作者: 中国特色    时间: 2012-1-17 11:25


我现在才开始养细胞，也有一点心得体会，和各位战友分享。
1. 养细胞无菌操作我认为是最重要的，也是养好细胞的前提，包括洗瓶子，配液，超净工作台的清洁，细胞培养室的清扫等等都是很重要的。
2. 培养基的制备，一定要调节好PH值，太偏酸或偏碱都是很不利于细胞生长的，可以看培养液的颜色，颜色太深那就偏碱，适当提高培养箱的CO2的浓度。如果颜色太红，那就在适当加如一些NaHCO3，来调节PH值。
小弟目前就只有这些体会，继续学习中！

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作者: 白白的    时间: 2012-1-17 11:27

我再说说我的一次失败的经历和教训：
在我开始做原代成骨细胞时，养失败了几次，后来，在做好准备工作并花费了20天左右时间，我养的一只母老鼠生了12只乳鼠。我特别高兴，心想：这下乳鼠特别多，有活干了！做好了一切准备工作，终于消化得到了足够的细胞，我开始小心细致地看护我心爱的细胞了。
然而，我高兴得太早了。
我准备好次日传代，于是我开始换液，换好液后，在我打开培养箱后，拧松瓶盖。此时，意外发生了。瓶子碎了。。。我只好忍痛扔掉这瓶细胞了。一切得重新开始，因为我还没有冻存到细胞做种子呢！
教训不少：
1）在开始养细胞时，一定要小心拿培养瓶，我就犯了这样一个致命的错误。建议新手在使用时，左手拿瓶，拇指和食指捏住培养瓶的侧面，千万不要把拇指压在细胞贴壁瓶底和瓶顶，以防压拧瓶盖时压破培养瓶。
2）一旦培养成功细胞后，千万记住一定要先冻存几瓶状态较好的细胞，最好是2-5代的细胞。
3）一定要避免一些我犯的这样的低级错误！
这类低级错误还有：开培养箱时未将手消毒；培养瓶放入培养箱时一定要拧松瓶盖；冻存时忘记编号记录存放位置；注射式滤器灭菌完后在高压锅内放冷却的时间太长，超过了20分钟；使用注射式滤器未准备一次性进口滤器；在刚开始做原代培养时没有用空白的不含有细胞的培养基，染菌后不知是培养基污染还是操作过程中染菌。
诸如此类的错误太多了。

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作者: whitesheep    时间: 2012-1-17 11:28


我也来说两句吧，进实验室已经半年了，开始一直很迷茫不知道养细胞为何物，现在研二了，也开始着急了，觉得准备工作很烦琐，我们实验室条件也很差，想烧点三蒸水结果电炉全坏了，手也被烫了，连电子天平也没有，称试剂要等晚上别的实验室主任不在了再找同学带去称，而且实验室的同学们没有互助精神，感觉真的很辛苦，还好有丁香园，没事时常来逛逛，学习，虽然现在还没养出细胞，但我不会放弃，继续努力，感谢丁香园给我的支持和帮助！

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作者: junhun    时间: 2012-1-17 11:29

我是细胞培养的新手啊　！不过上手还比较快（师兄说的）！经过三次失败和三次总结，现在总算比较成功了．下面说说自己的感受．我做的是心肌细胞培养．一开始听人说心肌细胞特难培养，因为都是用原代，而且要做到细胞同步化搏动需要的条件很严格．不仅仅是无菌操作等一般原则问题，还要自己摸索各个环节的最佳方法．事实证明我在后来的过程中都遇到了．第一次污染是操作问题，做完第二天我发现培养瓶里有好多大肠杆菌．肆无忌惮的吞噬着我的细胞！那个心叫做痛啊．看来还是要严格注意无菌原则！再来！我把培养室和培养箱用甲醛加高锰酸钾熏了一晚上．第二次做完后当时细胞形态很好，等它贴壁吧．当时我就开始想象明天看到大片心肌细胞搏动的壮观景象了，还特地借了数码相机准备照相．谁知道第二天发现培养基里有一些小黑点，我纳闷啊？培养基颜色很正常！细胞形态也还好！不象污染啊？？？我在园子里看了那些典型的污染也不象啊？最后问有经验的师兄，他说可能是小牛血清的问题．虽然抽过滤，但是质量有问题．哦，那就不是我的原因咯．沮丧！换！第三次我吸取了前两次的教训．还查只了一些资料，前面操作做的还不错，但是在离心时离心速度没控制好，一般是５００～１５００转／分　我用６００转／分　（因为太大我怕影响心肌细胞活性）谁知后来得到的细胞好少，我用的速度太小，丢失了好多细胞！！可惜啊！看来实验环境也要自己慢慢摸索！（后来我发现用１０００转／分最好．）不过不同的离心机有不同的最佳，要自己摸索总结最好！在后来几次中我不断总结经验，现在细胞生长欣欣向荣哦！！！！看来细胞培养也需要永不放弃的耐心和不断的从失败中总结经验的细心才能一步步前进啊　！！生活何尝不是如此呢？

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作者: ha111    时间: 2012-1-17 11:29

这个活动搞得真好，可以让许多新手学到经验，少走弯路。就先说说我养细胞的事吧，有些地方和主任的情况有异曲同工之处。
偶是广东的，一般都做鼻咽癌，养的是低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞。师兄走之前，我没法下手做。走的时候手把手教了我养细胞，开始之后，先练练手，细胞长得很好，我暗自窃喜，心想：养细胞很容易嘛。大概过了一个月，开始做试验，我收集固定了十几瓶细胞去广州做电镜，让同学照看三四天，大概第三天的时候，同学短信告诉我细胞液很混浊，可能有污染。因为有一瓶细胞种类很希缺，我第二天就返回了。近十瓶细胞全部培养基变浑浊，描述一下，其他战友可以借鉴，就象米汤一样。而且蔓延速度很快。找来我们的老主任看了看，说可能是酵母菌污染。
当时就想，怎么会污染呢？同学告诉我，我走的第二天，他帮我看看了一下，那时就有一瓶长得很满、但状态不好的细胞培养液变浑了，所以应该不是他操作的问题。我恍然大悟，想起那瓶细胞养了很久，开始量少，长得不好，后来长满了，状态也不好，就一直没传代，想来应该是老化的太厉害了，抵抗不住少量细菌的污染。舍不得那一瓶细胞，却给我的全部细胞带来了灭顶之灾！
没办法只好忍痛全扔了，用甲醛加高锰酸钾把培养室和培养箱熏蒸一下，过了几天，重新开始养。嗨，却出现了意想不到的问题，细胞怎么也长不好，变形，不亮，就是折光度很差。因为要做RT-PCR，状态不好直接影响抽提RNA,整整三个礼拜，搞得我焦头烂额。开始怀疑是瓶子没洗干净，或者是还是有少量细菌，彻底清查之后，仍然不行。当时是百思不得其解啊！郁闷的要命!
总算我还有点悟性，我发现培养液的颜色好像比以前有点淡，开始怀疑培养液的PH值的问题，马上测量一下，竟是6.7，狂晕！太低了！于是将培养液加碳酸氢钠，调到7.2左右，过了大概三四天，细胞就渐渐复原了。
先说这么多，希望群友们能吸取我的教训。

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作者: abc816    时间: 2012-1-17 11:30


开始养HL-60细胞，细胞不是很干净，细胞状态不好，说是传代要上面的细胞，我就把培养瓶反过来，倒入新瓶子，仅为这样好操作一些，不容易洒，结果细胞越养越差。后来又向别人咨询，才知道应该瓶子轻轻拿出，把上面的培养液倒入新培养瓶中，这样才能细胞越养越好，结果实践证明果然如此，所以养细胞，细节很重要啊！

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作者: 大尾巴    时间: 2012-1-17 11:30

一开始我养贴壁细胞消化不下来，很郁闷！ 请教了师姐，她说：1)用1-2 mlD-Hanks洗一下细胞，将培养液洗干净，因为残留的小牛血清灭活胰酶2)消化期间，将细胞放于37度孵箱，可加快消化。一试，果然很灵！

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作者: woshituzhu    时间: 2012-1-17 11:31

我做药物干预试验，观察药物作用0，8，24，48小时后细胞凋亡情况。第一次作发现0小时的凋亡比8小时的还多，原来细胞是头一天接种到6-well plate，第二天开始加药。加药组都把培养液除去，PBS洗一遍，然后加入含有药物的培养液，时间到了以后把所有的培养液和细胞全部收获到一起做FACS。但是，对于0小时的对照组，却要把培养液全部清除后，仅仅收获细胞才对，因为经过一夜的培养，已经有了不少的死细胞，必须把这一部分非药物原因死亡的细胞清楚后才是真正的对照。
试验不顺利，不要急于重做，先找原因，查查资料，和别人聊一聊，到园子里转一转。一味重复，劳而无功，对信心是很大的打击。
细胞培养是个耐力活，碰到困难很正常，一定要坚持！

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作者: 爱老虎游tt    时间: 2012-1-17 11:31

我的一点交流
我还是个新手，从器皿的洗涤、消毒、配液,等等，一点点小心翼翼，直到我亲自养PC12 细胞，一种肿瘤细胞系，看着自己的细胞长得好好的，心里不知多么高兴，回想这一阶段的学习历程，总结一下：
1） 理论指导实践，做一件事前，一定要从思想上武装自己，所以好好阅读细胞培养的书籍，注意细节要摘录。加强记忆。
2）有条件要观模别人的操作过程，做到感性认识。并从别人那儿学习经验，接受教训。
3）实验前要从脑海中预演一遍试验过程，做到有准备。
困难时时出现，但信心不要降低！

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作者: 小野花    时间: 2012-1-17 11:38

作为刚刚进入细胞研究领域的新手,出现错误,无论级别高低，真的是不可避免的!!!斑竹能够建立如此好的板块,我双手赞成!不管成败，前车之鉴阿,作为后来者的确是一分书本上看不到的宝贵财富阿！！看到战友们的心得体会，我受益匪浅阿！先把自己的失败心得与大家共享，共勉之！
1.前日，转染细胞，分六孔板板时，细胞悬液和培养液加入六孔板后，未及时混匀，造成了六孔板中的细胞分布不均，局部细胞密度或高或低！望有做此试验者，切记：细胞悬液和培养液加入六孔板后，及时振荡混匀。
2.今日，细胞转染后，进行细胞换液，因为我的细胞在六孔板内贴壁不牢，但是我没有注意，所以加入新鲜的培养液体时，没有轻轻的沿孔壁加入，造成了细胞脱壁，细胞丢失严重阿！惨痛的教训阿！还得从头做起.....

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作者: 小野花    时间: 2012-1-17 11:41

做实验是件辛苦是，实验设计必须考虑周全，细到每个环节。
我想说的正式实验室时应把握“宁多，勿少“原则。比如这次实验室你毕业答辩、或联合攻关重要的实验，做实验时，支架与细胞符合，细胞接种量，支架材料的量都要比额定量有一点余富，这保管你实验顺利完成。如你需要额定细胞悬液5ml，你最好准备5.5ml或多出‘每次接种量二至三份，因为加细胞量时你正好，到后来细胞悬液的量要不够。支架需要10个，你准备11个，实验中即使有一块掉到工作台上，你还是能顺利完成实验。

我说的“宁多，勿少“原则，是针对复杂、操作过程多的实验，不要实验时为省经费，做出的实验不理想。

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作者: yychen    时间: 2012-1-17 11:51

从开始做实验以来遭遇到了种种挫折，其中的酸甜苦辣直到现在仍难以释怀，虽然到现在为止还在失败的阴影中挣扎，也已经没有了发言的勇气，但是我还是希望把我分析到的失败原因提出来，算是大家的“前车之鉴”吧！同时以此激励自己，从头再来!
我养的是鼠胚神经干细胞和大鼠嗅鞘细胞，细胞接种之前，台盼蓝染色达到30-40％，呵呵，不理想，放入培养瓶（grenier培养瓶）中观察细胞状态还可以，到第二天就观察到细胞透亮度欠佳，细胞轮廓不够饱满，台盼蓝染色居然发现全部都是蓝的。以下是我的分析过程（按实验步骤），请各位高手指教！
可能失败的原因及其分析：
1.孕鼠在酒精中浸泡时间过长（超过7-8分钟），但接种前台盼蓝染色率可以排除此原因。
2.在孕鼠消毒过程中可能将安尔碘带入培养液，影响细胞生长。但取原代时我通常更换器械。
3.玻璃器械泡酸后流水冲洗2遍，去离子水冲洗2遍。
4.取材的金属器械用新洁尔灭浸泡后流水冲洗2遍，去离子水冲洗2遍。
5.细胞分离过程中始终用冰冷的D-hanks冲洗，细胞不能耐受。
6.至于培养用液和培养瓶，因为同实验室也有人在用，所以不大可能。
我个人倾向3、4和5三种原因。一点体会：说起来不好意思，也是自己太懒的缘故！实验无小事呀！小小的疏忽都可能为自己的细胞带来灭顶之灾！

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作者: 四福晋    时间: 2012-1-17 11:53

我是从最热的七月中旬开始养细胞的，一路自己摸索，很感谢这里的群友，我也谈谈自己的一点心得：我养的THP-1细胞是从协和细胞中心购得，RMB636元，悬浮生长的。我用1640培养基，10％FBS，不加双抗，最好4－5天换一次液，3－4周传一代。和其它细胞不一样，千万不要换液过勤，越折腾越少，它在偏酸的条件下生长状态还好些。

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作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-17 11:54

我是学微生物的，刚开始养细胞没多久，也有个小教训。
好不容易向别科的师姐要了一瓶细胞，非常珍惜。到了传代的时候，有点紧张，害怕操作有误把细胞污染了，所以很认真的消毒，配液，然后开始按书上的步骤一步步进行：吸除培养瓶旧的培养液，加胰蛋白酶消化，倒置显微镜下观察后终止消化，吸除后加Hanks液轻柔冲洗，洗后吹打细胞，计数后分装培养。第二天早晨来到科室，去看时心里真的一凉啊，全是碎片。没办法，只得再跑一趟，又要了一瓶，回去后又看看书，注意了几个问题（传代时机。消化的时间和消化液的浓度）。又到了传代，心想原来是没注意这些问题，这次都注意了肯定没事了。睡觉一夜，清晨大摇大摆到培养箱，拿出细胞，看了一下，不会看错了把，换个地方看看，全一样，个别细胞幸免。很无奈，很郁闷，但有些不服气，再跑一趟。这次留了个心眼，我仔细问了那位师姐的步骤，又看了她的笔记，才恍然大捂！
大家如果谁养了这种细胞——HEK 293，要记得这种细胞是不用消化的，这种细胞贴壁并不牢，用手拍打几下瓶壁，就可以在显微镜下看到多数细胞已脱落，然后传代就很容易了。回去做了一边，果然细胞生长良好。
其实更大的教训是我们新手一定要多学多问，看着很简单的问题并不一定好解决，只有这样才能有长足的进步！

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作者: 薄荷侠    时间: 2012-1-17 11:55


最近四个月一直在培养经过脂质体转染后稳定生长的细胞，总的体会：好艰辛！
1 细胞坏死的碎片极难与细胞污染鉴别，很多次都失望以为是污染，但事实上是细胞碎片。此时的细胞已经存活15天以上，丢之可惜！心痛！
2 挑选稳定的细胞克隆挺难，再次培养时容易污染。细胞克隆容易粘在一起生长，需要用胰酶消化来分散，但胰酶消化的时间难以控制，每个细胞株都不一样。

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作者: toy    时间: 2012-1-17 11:56

我也是初养细胞者，在这里我就自己不多的实践经验发表一点看法，希望对大家有所启示。首先，我认为在养细胞之前先要搞懂无菌这个概念，不要只从形式上学别人的手法和步骤，要弄明白每一个动作为什么这样做。只有理解了每一个动作的动机你才会理解真谛然后切实养好你的细胞。再就是不要形而上学书上要求怎么做就要怎么做，做事情的宗旨是只要把事情做好。我比较推崇多借鉴周围人的经验教训，殊途同归，看书也好，借鉴周围人也好，目的只有一个：养好细胞。学会变通是很重要的。好了，初进实验室经验不多以后有经验一定拿出来与大家分享，希望大家也是，愿我们互相借鉴解开彼此恍然之惑，更加顺利的做完试验。

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作者: zhezhe    时间: 2012-1-17 11:57

养细胞真是一件让人头疼的事！
我们宿舍基本上每个人都养过，而且个个愁眉苦脸。
刚开始养细胞的时候，是做的原代培养，鼠血管平滑肌细胞，每次还要自己杀大鼠，取材，养上细胞，污染。无数次后，终于培养也没有在变混浊，我那个高兴啊。可是细胞就是不从组织块长出来，不能形成单层细胞，结果还是没用。再做！于是我就四处打听，求助。原来这种细胞长的慢，不能像其他细胞一样经常换液，只要不污染，放着不用管，半个月以上才能长出来。我得出结论，原来我太勤，给他换液太频繁，他的生长环境总改变，他也长不好。慢慢的，我的细胞养的比较像样了。
再后来就养肿瘤细胞了，嘿，他们长的可真快！而且有了以前的经验，现在他们的长势喜人，谁的细胞不行了都想我要，还说我养细胞有经验。我在心里说，我以前睡不着的时候谁知道？
哈哈。养细胞有苦有乐，让我们共同体验吧!

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作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-17 11:58

有空大家交流一下，
我也养过CHO，用的是武大细胞中心的细胞株，方法也参照他们的，用的培养基就是F12，没有用DMEM和F12的混合，武大的方法真的很管用，他们的1升（1L）F12里加了一点碳酸氢钠（印象中是1点几克，当时做实验做的太长太郁闷了，一手的资料损失了一些，估计师姐那里还有原始的配方），
养起来很顺手，
细胞活力高，
传代可以不参照书上的，按照你培养瓶的大小，结合倒置显微镜观察，一般隔两天就贴壁长满了，
我们传了近十代（一个月左右），实验都完成了，细胞生长都还很旺盛。
如果大家有养CHO的建议到武大购买细胞株，一定要记得向他们要培养基的配方哦！（如果这次放假回家能找出原始的配方清单，我再公布给大家）
现在我在浙大医学院进修，也要做细胞培养了，希望在这里能得到大家的帮助，

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作者: HP007    时间: 2012-1-17 11:58

我刚刚开始养cne-2细胞，也总结了一点失败的教训供大家指正。
细胞是买来的，邮寄的培养瓶刚来时，第一次处理细胞太紧张了，忙中出错，培养瓶里的培养液留多了，平放时培养液接触了瓶口导致细胞污染了。
以后就紧紧牢记，培养液铺满瓶底就可以了。
听人家说这个细胞比较难消化，于是就自作主张，用0.5％的胰酶37摄氏度消化了5分钟，结果细胞全都飘起来了。看来理论只有经过实践检验才有客观性、普遍性，现在用新鲜的0.25％的胰酶37摄氏度消化3分钟效果就很好了。
又一次，细胞全部污染了，原因找来找去，结果是血清出了问题。现在的做法是：任何加到培养瓶里面的东东（血清、培养液、胰酶、平衡液等），都要在37摄氏度放置2天，确定没有问题后才能使用。
养细胞是一项系统工程，要处理好每一个细节啊。
新手刚刚起步，希望得到大家的提携，谢谢。

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作者: 克隆鱼    时间: 2012-1-17 12:00


我也谈谈养细胞的一些体会．养细胞最重要的是避免污染！
１．培养基的无菌检测：每次配完后，待用前２－３天，加上谷胺酰胺等半衰期较短的营养物质，每一瓶取出少量放到３７度温箱中检测．
２.每次取用移液管要用酒精灯烤一烤，较放心．
３.每次无菌操作带一次性手套，用酒精消毒对手有刺激，可改用５％的新洁尔灭．
先说这么多吧，有个问题要请教各位大侠：我最近用生物反应器（satorious的）养，有一种黑色的＂黑胶虫＂，不知如何消灭？！

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作者: flower-201    时间: 2012-1-17 12:00

我做的是胸腺上皮细胞原代培养,也谈谈经验吧
1.无菌观念
我现在做细胞几乎从不污染,不是吹的哦.我的体会是,除了各方面消毒除菌到位外,操作过程的无菌观念要很强,比如,我从不认为超净台里的空气是绝对干净的,因此所有的瓶皿开口朝天暴露的机会要尽量减少;再者,手虽然酒精擦过,也决不能保证无菌,因为毛孔里的细菌难保证会消灭,分泌物还会逐渐把脏东西带出来,所以一定避免你的脏手在瓶口和盖子上空挥来挥去,我觉得细菌很少能拐着弯挤进你的瓶子,而多数是直接掉进去的.所以摆放东西除了要顺手,少大距离挪动外,象瓶盖最好放在酒精灯后面,手和其它东西少有机会经过,只要你树立了这种观念,很多细节就会注意到了.
2.消化法原代培养
一开始我按文献上说的用胰酶消化半小时然后吹打过筛离心,结果没有几个活细胞,很沮丧.后来改用一型胶原酶,效果很好,吹打后几乎都散开了,而且没有粘忽忽的团块---细胞损伤很少,长得不错. 定下神后又尝试用胰酶,因为便宜啊,这次我用了分批收集法,加少量胰酶边消化边轻轻吹打,待液体浑浊后就马上收集悬液放入准备好的含血清培养液中终止消化,而组织块则再加新的消化液消化,如此反复几次,把大部分的细胞消化下来,这次效果也不错哦.胰酶破坏力强,分批收集细胞可以避免先消化下来的细胞受损伤.同样方法也适用于传代时贴壁太牢,不易消化的细胞. 有一个细节要注意,就是吹打的时候一定要看清吸管的头是否完好,最好是光滑圆润(新吸管口在火上烧红就圆了),减少细胞损伤,有一次我快结束时才发现吸管头是破的,后来那次的细胞就是很糟糕.
3.细胞传代
呵呵,一开始也犯了很愚蠢的错误,按书上说消化3-10分钟或镜下看细胞变圆再终止,结果都死光光.我现在的做法是先用EDTA荡洗一遍,驱除二价离子,或者PBS洗两三遍,再加入胰酶摇晃,肉眼可以看到瓶底片状白膜逐渐脱落,继续消化到白膜变成雾状即可终止,或者在镜下看到细胞开始收缩,少量变圆浮起就可以终止了,一般不超过一两分钟,如果有部分难消化,前面说过可以分两三次进行.如果胰酶加入后荡一荡再吸掉大部分,仅剩下少量消化,还可以不要离心哦.

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作者: yychen    时间: 2012-1-17 12:01

如果第二天你发现你的所有细胞在一夜间全部污染了，那么甭问肯定是你昨天换液的那瓶培养基前几天已经污染了。所以才会加到哪，哪污染。扔了它吧。

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作者: dragonkilly    时间: 2012-1-17 12:01


好久不来细胞培养专栏学习了，今天看了各位得帖子，学到了很多东西，先表示一下感谢。我养细胞也有两年了，感觉养细胞是个细致活，需要耐心。关于细胞培养得方法，前面好多战友及以前得好多帖子里边说了很多，不赘说了，只是提醒新手一定要注意及时冻存，有了革命得火种，怎么做试验都不怕了。我有过血的教训，我刚开始养细胞的时候，是养师兄转染好的细胞，不用自己转染，省事，激动的很，光注意无菌操作，然后急着做WB鉴定，就没有注意冻存几支备用，常在江边走，难免失足，不幸细胞污染了，由于没有冻存，导致自己还得重新构建质粒转染，浪费了近两个月的时间，现在回想起来还很痛，如果可以重来，我一定冻存好几支。
现在养细胞比较熟练了（有点自夸），自己有时就想，我们大多都是围着细胞转，细胞长满了，就要消化传代，细胞长得不行了，就得等；细胞最终是为我们服务的，什么时候我能够控制细胞，我需要做的时候，它能够疯狂生长，不需要的时候能够速度慢一点，也许大家觉得只要把细胞密度控制好了就行，我看光细胞密度远远不够，还需要细胞状态，等因素综合考虑，也许也就是传说中的高手境界，努力朝这个方向吧，但一定记住不能为养细胞而养细胞，一定要让细胞成为我们的一种工具，很好的为我们服务。

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作者: 生物迷    时间: 2012-1-17 12:02

我也想来发表一下我的感慨.养细胞曾养过一年多,其中的酸甜至今还揪心.
我主要谈以下两点:
1.最初的细胞状态一定要好！我养的是MGC803细胞,最先是从师姐处拿来的细胞形态较难看.缺乏立体感,胞质及培养基中都有很多的颗粒,问师姐是否是细胞状态不好,回答"它是这样的,因为它是来源于腺细胞,有分泌功能".我一想,也对,MGC803细胞是来源于胃黏液腺癌细胞.于是我就开始利用它做实验——进行细胞稳定转染前G418筛选浓度的确定。之前我看过文献，G418的筛选浓度一般在400μg/ml左右，可我的从200降到100，不行，再从100降到50，还不行，再从50降到20，还不行，期间重复过不止多少次，也从师姐买细胞处买过多次的细胞，也哭过多少次，可就是浓度定不下来，以致于后面的实验也无法进行。哭啊！郁闷啊！后无意中听我们研究所原来的一位师姐现在中山医肿瘤所，她那可能有这种细胞。于是打听后索要了一瓶细胞。天哪，不比不知道，这细胞多漂亮，干净、无任何颗粒，立体感强、轮廓分明，异形性非常明显！G418的筛选浓度经3次重复实验均为400μg/ml。笑啊！开心啊！
2.无菌观念一定要强！记得做转染时，每次转染前细胞状态很好，可一加完质粒后第二天就发现细胞污染了，仔细回想，我的操作是严格按文献等操作的，似乎没什么纰漏，原因何在？后来跟导师交流，导师一句话解决所有问题：提的质粒被污染了！尽管按照说明书及文献操作抽提质粒，可质粒还是会有污染的可能性，尤其是以我们实验室的条件，因此抽提完的质粒应用75%的酒精固定24小时左右进行灭菌！后来按导师的意见后果然转染细胞不在出现污染现象。导师就是导师，导师就是伟大！

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作者: milkdog    时间: 2012-1-17 12:02

我才养细胞(K562)三个多月,回想起来作为新手的我犯过两次错误,希望后来开始养细胞的战友可以借鉴一下 :
1,不舍得过多的细胞丢掉,我从实验室老师处接了细胞之后,第一次换液,一看多漂亮的细胞啊.个个都是我的宝贝啊,不舍得丢,结果留的太多,结果第二天全长满了.细胞状态特不好.
2,有阶段细胞状态突然变的不好了,遍找原因,可能是人多烤箱少,我的培养瓶,吸管什么的就放在外面,时间久了,可能已经失效,重新消毒之后再换了新瓶子,细胞状态果然就慢慢调过来了

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作者: yhz1973    时间: 2012-1-17 12:04


我来说说我养细胞的一点体会:
我们实验室是统一滤培养基,国庆节前我们滤了一批5×的MEM,为了能够长期保存,我们象以往保存1×的一样,就放到-20℃冻存了.结果等到用的时候拿出来融了之后,瓶底一层絮状沉淀,营养成分都析出了,再用三蒸水稀释成1×的也无济于事,这批培养基就这么浪费了.在此,把这个经验教训讲出来,与大家分享,希望能给大家以借鉴,以后不要犯类似的错误.

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作者: eric930    时间: 2012-1-17 12:04

我才开始养细胞不久。一开始养Hela细胞，而实验室的师兄师姐们大多都养CNE-2Z。跟在他们后面看传代的时候，认真地记住每一个步骤，发现他们消化的时间都是6-7分钟，师姐还告诉我当消化好了之后，在吹打前会看到一层膜从瓶壁上脱落。于是我就按他们所说所做的开始了我的Hela传代。当我过了7分钟将细胞从培养箱里面拿出来的时候，在显微镜下面一看，天哪，细胞都浮了起来，手忙脚乱之际，把消化液倒掉，然后加入培养液再吹打，吹打完之后发现没几个细胞剩下了！赶紧请教师兄。他说，每种细胞所需的消化时间是不同的，Hela所需的就比CNE-2Z短，可以在显微镜下看着它消化而不用放进箱里面；当细胞浮起来的时候，可以不把胰酶倒掉而直接加入培养液即可。后来按师兄说的做了，果真如此！看来每种细胞的脾气都不一样，真要好好摸索才行

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作者: 园丁##    时间: 2012-1-17 12:05

前天复苏的HELA细胞，今天早上传代，用的胰酶是四个月前配的，一直放在冰箱保存，用前放在水浴箱加热。
加入胰酶消化2分钟后，在倒置镜头显微镜下观察发现细胞未离壁，开始以为是细胞状态好，拍打几下后又消化两分钟，还未离壁，怀疑胰酶失活，用力拍打并补加胰酶，还未脱壁。
心疼我的细胞啊，昨天复苏就折腾了好一会儿，再消化一会不知还能不能活了，立刻找来新的胰酶，水浴加热，将原加的胰酶吸出放在离心管中暂存，加入新的胰酶，消化1分钟，细胞基本都下来了，顿时心情放松多了，继续完成传代。
经过这次经验，发现胰酶放置太长时间可能就不能用了。我的胰酶是6月份配的，10月份就不能用了，希望各位群友注意！

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作者: ffooll    时间: 2012-1-17 12:05

我做过胶质瘤C6细胞的培养，C6细胞是一种相对好养的细胞，但是第一次做的时候还是很有感触。
第一、无菌原则。无论什么时候，这一点都要加倍小心，不能掉以轻心。一次性使用的东西千万不要舍不得。
第二、自己的实验务必事必躬亲。不要随意把自己哪怕最简单的工作轻易托付给别人。这样往往是实验失败的潜在风险。
第三、培养基、小牛血清等最好用同一个公司同一批号的产品。这样比较稳定。
第四、无论做的多么熟悉的实验，在做之前都要准备一个详尽的protocal。开始进行实验之前一一检查所有物品是否备好。
第五、我们把胰酶用青霉素瓶分装，每次用几瓶取几瓶。是减少污染机会的好方法。

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作者: qqq111    时间: 2012-1-17 12:06

我们刚刚解决的一个培养基的问题：
我们这里原来细胞培养一片空白，细胞、配制好的培养基、胰酶等都是师兄从清华带过来的，也是他手把手的教我们怎样培养细胞的，后来师兄走了，我们按照他的方法继续培养，细胞长的很好。他带来的培养基首先用完了，我们按照说明书上的要求配制培养基每升加碳酸氢钠3.7克，结果培养基加进去隔半天去看就变黄了，搞的我们那几天是一天换两次液，好辛苦！细胞的长势一天不如一天，我们的实验记录本上一片凄惨景象。
我们知道是培养基的问题，但不知道问题出在那里，第一次配制的培养基很快用完了，第二次的还是按照上次的用量配制，怀着侥幸心理希望细胞能有起色，但是失望了。
为了培养基的问题我上群里来寻求帮助，发现这里有很多帖子是关于碳酸氢钠用量的问题，原来是培养箱中二氧化碳浓度不同对应的培养基中加入的碳酸氢钠的用量不同。我们用的二氧化碳浓度是5％ 的，对应的碳酸氢钠应该是2g/L。我们按照这个用量重新配制了培养基，加到培养瓶中第二天看还是红的。我们可怜的细胞也逐渐缓过来了，现在长的很好，我们已经用它开始做实验了。

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作者: 二丫头466    时间: 2012-1-17 12:07


我做的是昆虫细胞培养。刚做的时候是用的gibicol的胎血清，长的很不错！可能很多人做实验都是这样，如果做顺了就觉得这个好像没什么难度，就开始放松警惕了。后来实验室说用国产的血清看能不能代替，毕竟gibcol的太贵了。我看细胞那么好，心想都是胎血清，应该没问题吧，在没保种的情况下全换成国产血清培养。那真是“血”的教训啊！辛辛苦苦养的几十瓶细胞都要死不活的，耽误了实验进程不说，又得找别人实验室要。
后来没换试剂的时候，不管细胞也好，植物的悬浮系什么的也好，我都要保留一些原来的试剂做的，万一出现意外，还可以弥补。
不是不支持国货，现在有些试剂国内还是做的不错的，但一定要先试好再用。讲民族感情也不能忽略品质^_^ 记得以前买了一个国内公司（名字就不说了，反正我再也不订那家的试剂）的尿素做PAGE胶，怎么都溶不了。还被老板骂了一顿，说那么好溶的东西都溶不了，不知道你怎么在做实验。冤啊
不知道里面装的是什么，是不是石英砂来的，哈哈

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作者: 盼盼    时间: 2012-1-17 12:07

我养细胞的经历让我时时想起就心痛。
在我开始查资料确定试验方案时，大家对ECV304细胞株还是认可的，认为ECV304就是一个内皮来源的细胞株，但是当我经过了重重的困难将一外源性基因导入这一细胞株，准备进行下一步实验时，有关ECV304的各种争论铺天盖地而来，我已有的部分结果写成的文章也遭到编辑部审稿老师的责问。我常想自己在实验设计之初如果全面查阅文献，发现ECV304的争论的苗头，我决不会采用它，而把自己置于如此的境地。
所以各位战友，对自己的课题所涉及到的细胞一定要有全面地了解，即使在你之前有多位师兄、师姐靠它毕业也要全面查阅最新资料。

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作者: 了了    时间: 2012-1-17 12:08

聊一下作细胞实验的体会，因为最近一直在做脑内皮原代细胞培养，其中也遇到过很多问题，我觉得保持无菌操作台的清洁是很重要的，再就是器具消毒灭菌也要严格控制，实验前，把实验所需要的器具服装都要紫外照射，实验后要及时清理操作台，75％的酒精擦拭操作台，然后紫外照射半小时，同时让操作台处于密闭状态。下次用时就直接紫外照射就可以了。在实验过程中，要把你需要的器具摆放好，试剂准备好，摆放要方便拿取，做原代培养时要用到手术器械，这时，就可以先把这些器械从容器中拿出来摆放好了，用时就会很方便，暂时不用的东西可以放在操作台外面，这样节省空间，操作期间，进进出出的双手一定要用酒精棉球擦拭，不要怕麻烦，作实验尽量处于安静环境中，如果长时间不做细胞培养实验，就是再熟悉过程也要拟一份protocol，我上次就是在配完全培养液时忘记加胎牛血清（24h），此时正是细胞从血管段爬出来的过程，虽然换液时加了，可是细胞生长状态很不好，一天的辛苦全废，真是疏忽！只是刚入门，以上建议仅供参考。

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作者: wu11998866    时间: 2012-1-17 12:11

几条教训：
1.传代时不能传的太稀。因为细胞自身会分泌一些促生长因子，若细胞密度太低，其分泌的促生长物质不足以相互促进生长。
2.胰酶切不可以用蒸馏水配制。因为消化时低渗的环境会把细胞胀得圆圆的，从而影响到细胞的生长。
3.不要等到培养基的颜色发生明显的变化时才想起换液。因为此时许多代谢产物堆积，培养液的PH值就已经发生了很大的变化，容易对细胞产生损伤。
4.终止消化用培养基结可以了，不要加血清。因为加血清吹打时极容易产生气泡，容易导致细胞损伤。
5.买血清不能图便宜，不然感染了虫子、或者支原体就麻烦了。
6.对数生长期的细胞活力好、数量多是冻存成功的关键啊。

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作者: loli    时间: 2012-1-17 12:12

偶现在也在养细胞，在细胞技术版学到了不少东西，收获颇多。前一阵我养细胞因为消化时间掌握不好费了不少周折。现在把我在细胞消化程度的掌握中的体会和大家分享一下。
养哺乳动物细胞时，细胞传代中的消化是关键的一步。一般用0.25％的胰酶消化，书上有的说消化3～5min，有的说1～2min，有的说在37度消化，有的说是在室温消化。偶的建议是在室温消化，这样可以随时观察一下消化情况。胰酶用量不要太多，薄薄一层铺满细胞瓶底即可。偶养的是BHK细胞，消化到看着细胞层变得有点疏松，镜下细胞间隙变大、多数细胞变圆即可，倒掉胰酶，Hanks液洗一遍，加入适量生长液吹打分散，分装细胞瓶即可。
若是做得多了，不用每次都拿到镜下去观察，待看到细胞层不是那么致密了，用无菌的1ml吸管在细胞层上轻轻划一道，如果划痕边缘毛糙，说明消化好了，若是边缘光滑，说明消化时间还不够。这样可以减少细胞瓶拿出超净台的机会，从而减少污染的机会。如果消化好了不能立即倒掉胰酶吹打，可以将细胞瓶倒放，使细胞层面向上，放一两分钟没问题。

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作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-17 12:12


我才开始养细胞一个月不到(养的是悬浮细胞),一开始配配基的时候,有点偏碱了,当时也没调,想着在培养里有着5%的CO2,我只要把培养瓶的瓶口旋的松一点,这样的话,CO2就可以进入配基,可以自行调节pH值了,结果,每次我 要从培养箱里取细胞的时候,由于,瓶口旋得太松,再加上拿的饿时候不小心,总会从瓶口漏液,搞的细胞都污染了.

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作者: 阿敏    时间: 2012-1-17 12:13


很遗憾没有早点到DXY多看看，回想起来如果能够早些看到这些站友的经验的话很多弯路都是可以避免的。一口气把这个主题看完，觉得还是有些东西想提出一下，以供参考：

首先，不要偷懒！看似很简单的一点，但以我们组为例，好几个人都有过“也许让它再长一晚上没有关系吧？”的想法，结果导致细胞长过了甚至死亡，严重影响实验结果和实验的延续性。
二、及时冻存细胞。尤其是研究衰老、神经等相关的细胞模型，不同传数的细胞 在活力、敏感度等方面都有很大的差异，如不及时冻存很可能导致实验结果无法重复。
三、实验设计的时候使用什么细胞一定要看准了。我的一个师弟今年博二了，几乎是还刚刚开题，就因为头一年没有仔细查文献，选用的细胞做了一会儿后又发现不适合自己的实验设计或者特别难养或者周期太长。反复换了三四种细胞，好不容易才定下来。期间的辛苦真是不足为外人所dao啊！
四、注意卫生，严防污染。一旦污染要当机立断，全部扔掉！救是救不活的，就算救过来了，细胞的性状也发生了极大的改变，实验结果无法重复。老老实实的灭菌，复苏吧。
五、最后一点也是最重要的一点：遇到问题了就问师兄师弟师姐师妹，也别忘了还有那么多的DXYer。人多力量大，总能够找到解决办法的。

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作者: yysr238    时间: 2012-1-17 12:13

我也说几句吧，实验要有好结果、重复性，就必须有固定的、成熟的实验方案。
实验室的同道称我为MTT专家，只是做的较多而已：）
1.做MTT必须要进行细胞计数，细胞必须为单细胞，可根据实验目的调整细胞浓度，但每批细胞数应一致（如果做增殖抑制实验以5000个为好）。
2.加样量要准，加MTT前要弃去培养上清，老板主张翻板法，但我觉得不妥，于是自创了一套：把吸管套在抽吸机的橡皮管上，再在吸管上套一个10ul的枪头，然后将压力调到最小。本方法既保证吸的干净，又不会损失已经形成的结晶。
3.我还做相关的其它实验，以及体内实验，如裸鼠移植瘤等。希望有时间了和同道商榷。

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作者: glass    时间: 2012-1-17 12:13


第一次买来骨肉瘤u2os细胞的时候，十分小心，我们用DMEM高糖进口原装培养基，10％进口胎牛血清。传了一代后，观察培养液颜色基本上没有变化，由于初次培养没有经验，还以为是血清质量好，营养丰富，四天才换一次培养液，后来细胞的生长状态越来越不好，细胞所老师提供信息u2os细胞的酸性代谢率较低，培养液颜色变化较慢，但久不换液，营养会不足，最好两天换一次液，以后均隔天换液，但生长状态一直不佳，最后考虑到可能是第一次消化时间过长，对细胞造成损伤，培养了一个月未见起色，好心的细胞所老师又为我们复苏了一瓶，这次我们用的消化液是0.25％的胰酶与0.02％EDTA混合液，但生长情况与原来相同，看来不是消化的问题，正在感到无望的时候，师兄养的一瓶居然奇迹般的快速生长起来，原来他把培养液换成了MEM，哦，原来是培养基的问题，细胞养不好真是有好多原因，每个培养细胞的人都应该细心，耐心。细胞长好啦，都是师兄的功劳啊，虽然中间耽误了好长时间，但在这个过程中学会了如何分析问题找原因，收获挺大的。

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作者: caihong    时间: 2012-1-17 12:14

看了大家的经验，我收获很大，也谈谈我这半年细胞培养的经验吧：
1、传代用胰酶消化时，要让胰酶迅速接触所培养基底部，使所有细胞消化均匀，才能够均匀吹打下来，同样接种到培养瓶中的细胞，及时混匀细胞，让培养液迅速分布到整个培养基，不要拿培养基做旋转的动作企图混匀培养基里的细胞，这样细胞可能聚集在中央，应水平振荡混匀；吹打注意用力适度，避免气泡形成，减少细胞损伤。
2、在培养细胞成功时，如果细胞比较多，即时把状态较好的细胞冻存部分，最好是2-5代的细胞，这样既可以节约培养的材料，可以让细胞停止分裂，特别可以防止意外情况发生，以后再根据自己的需要将细胞解冻，合理安排实验。
3、培养细胞最好多取几个标本，我最初取两个标本就满足了，到出现问题时，才重来，这样既花费时间有花费精力。后来，先后取了10个标本，发现不同个体细胞生长不同，细胞和动物一样，有的长的快有的长得慢，材料多了就有很多的选择余地，可以避免浪费时间，即使死掉部分还有其余可用。
4、关于污染的问题，我有几点收获：工作台、器械每天消毒是关键；做实验室宜少说话，不要聊天，所有的操作都要在火焰附近，工作台器械排列有序，方便为主，避免手从瓶口和开着的培养基上面经过；要即时鉴别污染细胞，对于新取的组织材料，每天都要观察，出现污染即时处理，不要有懒惰心理，特别是遇到放假就不去看；培养瓶的瓶颈处不能留有液体，将培养瓶放到培养箱时要动作轻柔且不要倾斜；在处理细胞时尽量缩短时间，动作迅速且轻柔，所以每步操作都得小心。
5、对于试剂，大家容易忽视一点：购买要事先计算剂量，再购买足量的试剂。我的一个师妹为了节约经费，问厂家购买时要的是最小剂量的试剂，等到要用时，计算用量才傻了眼，还足足差一半的用量，这样既花费了时间，又没有达到预期的要求。常用的试剂要配成高浓度，预计用量和次数分装，避免反复解冻对试剂的效果影响。

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作者: tangxin_80    时间: 2012-1-17 12:14

看大家都说了这么多,我说说我的一些经验.
我最近做的细胞培养主要是白细胞,做生物治疗用,相对于其他细胞来说血液细胞可能比较容易培养,不过在生物治疗中,不单只要细胞增殖,还要增强其免疫性.在最近几个月的摸索中,我认为培养的关键是在一开始,加了细胞因子要有足够的刺激时间,一般三或四天,第三天可以加液,但是不要换液,因为这时还有很多潜伏期的细胞贴壁,这些细胞活性不强,如果换液时吹下来的话扩增的细胞增殖能力不强,培养时间不长,细胞活性下降快,不能达到治疗目的.

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作者: bamboo16    时间: 2012-1-17 12:15

读了大家的经验，收获颇大，我养的是破骨细胞，摸索条件花了很长时间和精力，也谈谈自己的一些体会：
1.破骨细胞是终末分化细胞，不能传代，目前还没有细胞株。细胞比较脆弱，原代培养要求条件较高，数量也少。
2.如果用机械分离法分离成熟的破骨细胞，最好用骨质疏松的动物模型，用正常生理状态下的实验动物，无论在什么年龄段，细胞的数量都不足以进行有关定量分析的后续实验。如果一定要用，只有加大动物数量，工作量非常大。
3.骨髓诱导法获得的细胞数比机械分离法的多，我查的所有文献中都是用新生1天---4周的动物，在开始养的时候，用2-3周动物（在我们动物中心比较容易买到），但是细胞数量不理想，又用新生1天的，好一点，但还是少。和实验室老师、一起养细胞的同学交流，才发现是自己的操作还不熟练，原代分离的时间太长，而且周围的软组织分的不彻底。体会是原代处理动物的时间越短越好，30mins以内，注意无菌，周围的肌肉软组织一定要分干净，否则这些杂细胞会严重干扰破骨细胞的诱导。而且最好用新生1天--1周的动物，我做了比较对照，超过2周的动物骨髓单核细胞的活力明显下降，破骨细胞培育的数量有明显区别。另外，培养基最好用胎牛血清，量大一点，破骨细胞很娇气，只要培养基颜色变黄，最好及时换液，保证营养充足。

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作者: 西子    时间: 2012-1-17 12:15

虽然我只是一个新手，但是我也想说几句。我是养肿瘤细胞的，一般来说这个是比较好养的。刚开始做的时候，也确实没费什么劲，肿瘤细胞长得特别好。后来换了一种血清后，就怎么也长不起来了。而细胞破坏挺严重的。同时，我发现放在－20的培养基在解冻后底下一层沉淀，于是我就开始补救。由于没有经验，一会认为是血清的问题，一会又认为是培养基的问题。可是换了什么都是没用。真是愁眉不展啊。最后，一看原来是二氧化碳孵箱里二氧化碳不足，换了充足了二氧化碳后，现在我的细胞长得很好。所以提醒大家，不要一味的找主观因素，而忽视了客观因素。呵呵

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作者: yysr238    时间: 2012-1-17 12:16


我所在的单位以前几乎没人做过细胞培养,老师让我去学习,去培养.我走了很多很多弯路,现在还在走...呵呵.总结一下,希望新手能少走弯路.
第一,不会的东西先去看书,找资料,打好基础,再联系一下能给你帮助的单位学习.总之,凡事预则立.开始实验前,尽量作好准备工作.
第二,原代培养步骤较多,因此一定要作好记录,记录详细.可以参考建立细胞系的标准以及培养细胞的观察步骤来记录.时间长了,操作得规律也就知道了.而且问题发现得就多了.可以看司徒镇强的书,看完就知道哪里做得不够了.
第三,无菌原则. 所有得器械/用品都要按规矩来,不能有半点马虎.也决不能为了省事省着用吸管等.其实这一点很容易作到,只要你克服懒惰就行.
第四,文献报导的方法有它的道理,我们这些没经验得人在起步阶段最好完全参考文献,千万别因为什么东西太贵改用其它最而耽误了时间.

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作者: yes4    时间: 2012-1-17 12:16

我再来讲一个，用惨痛教训换来的态度转变。

我是做放射工程的，因为其中牵涉到我们研制放射线的应用问题，所以在用PC3细胞作contrast media enhanced的放射存活曲线。之前并没有专业上过相关的课做过相关的培训，只是实验室的一个师兄带了一下。最开始的时候细胞传代什么相关操作的时候我还比较认真，后来养了将近一年，因为我们的实验设备也不齐，东拼西凑，也就慢慢觉得什么都可凑合，加上一年里发现细胞比我想象中要tough,于是便越来越随便，protocol越用越松。

两个星期前我们有一次千载难逢的机会到芝加哥国家实验室同步辐射中心去做三天实验，于是上飞机前准备样品时自己觉得比平时态度认真了3倍不止。谁知从芝加哥飞回来再花了一天一夜的时间作完后续实验把细胞放回孵育箱里，心想这一次花了这么大的力气，一定可以做出点成绩来了，离毕业总算近一些了。谁知第二天打开孵育箱一看，居然全部样品都被细菌感染，培养液全变混浊了。后来发现原来是准备样品的时候就带进了细菌，真是如雷轰顶，连夜在坛子上查对抗细菌的文献和帖子，后来用了好几种补救措施，10%的两性霉素培养，细胞一贴壁后就吸光培养液，用PBS反复冲洗，再重新加入10%两性霉素的培养液养几天换回正常的。一番努力下来细菌倒是被控制住了，细胞也有一定量存活，但是对于我们真正重要的实验结果就全部打了水漂。在这次惨痛的失败事故里我才真正意识到态度问题有多么重要。

痛定思痛，正在努力阅读园子里的东西，一点点补基础，重新再来。

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作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-17 12:17

我也来说说我养pc12细胞的一些经验！
我养的pc12细胞是细胞所买回来的，所以特别小心。买之前也查了很多资料，说pc12细胞是半悬浮细胞。买回来的细胞是用一次性塑料瓶子装的，细胞贴在瓶底，长得好好的。细胞长满后我就传一部分细胞到我自己的玻璃细胞培养瓶里，可是每次一传代，原来的塑料瓶里的细胞还是长的挺好，可是玻璃瓶里的细胞就是不贴壁的，特别着急，打电话问细胞所，他们就要我不用玻璃瓶，换一次性塑料瓶。可是我换了塑料瓶后还是如此。那段时间就反复的找原因，怀疑每一个环节，每天小心翼翼，可是细胞还是飘起来，真是绝望，因为是买来的细胞，也不舍得扔，就把它们放在培养箱里，过了有2天没有动它们，打算看看能不能再向别人要一瓶，2天后又习惯性的看了看细胞，当时很惊讶，原以为已经死了的pc12细胞现在长得好好的贴在瓶底。原来pc12细胞贴壁特别特别的慢，也不能每天换液，3天换液一次就可以了。

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作者: ha111    时间: 2012-1-17 12:23

我学习养细胞是从研一下开始的 看了半年师兄养细胞 以为看懂了 其实到操作是还是蛮紧张的 我认为培养细胞一个要注意操作 一定要严格 比如打火机的放置这样微小的操作都不能防过,因为像我做的单克隆抗体的筛选一般要两三个月,这么长时间如果污染了都要返工,所以我想既然养细胞,那么要从第一次就要注意无菌,这样才能养成习惯,还有我们老师说的一句话就是对待细胞要像对待自己的孩子那样.还有细胞的密度要注意.这只是偶的小小的想法,想大侠们交流,有助于准备养细胞的人形成无菌的认识!

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作者: ha111    时间: 2012-1-17 12:23

我们常配1640，一般是搅拌一小时再加NaHCO3,然后在搅拌一小时，很好溶啊，你用的是Gibco的干粉吗？好象我们实验室有用Hyclone的就难溶些。

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我们配的1640，我看我们师兄用的gibco干粉，他很快就配好了没有很难溶阿，我没有具体计算时间但是绝对小于半小时，大约15-20分钟吧？

NAHCO3、HEPES、GIBCO干粉一起加的，然后去离子水溶解，最后测个PH值就可以了

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作者: hot_hot_hot    时间: 2012-1-17 12:24


细胞消化害苦了新手，我的经验分享：
1、消化细胞要掌握适当时间，每种细胞的耐受性不同，正常和原代细胞较难消化。
2、消化受温度影响很大，我习惯不用冰冷的D-hank‘s ，温得有利于消化。尽可能不在孵育箱内消化，内偏酸性，会减低胰酶活性，对细胞也不好。所以操作前调好操作间温度在20度左右。
3、消化前一定要观察细胞，培养基不干净时，尽量用缓冲液多冲洗几次，消化快结束时用吸管吸弃消化液后用培养基终止，怀疑污染时可再用D-H离心冲洗细胞一次。有时这可能是补救细胞污染的好方法。
4、有的细胞在镜下观察消化状态不理想，特别是新接触细胞，一个好方法，消化过程中可以用长头吸管轻轻吹细胞，细胞能多数脱落时可终止消化。据此可以估计适当消化时间。

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作者: 气泡    时间: 2012-1-17 12:25

我养的是成骨细胞 ， 养好了， 看到细胞一个个都贴壁展开了， 是一件很开心的事 。 刚开始的时候很小心 ， 每天都拿出来看看， 消化后唯恐细胞因为密度低了长不好， 每次都传的密度较大。 这样就的天天换液 过个两三天就要消化传代了。 当时想啊， 细胞： 我天天给你洗澡（PBS）给你好吃的（血清），你就应该长好 呵呵
结果是我自己累的要死， 每天都要消毒 ，消毒的阿姨都认得我了 。
但是就是那么一次， 细胞消化的时间长了， 细胞就状态就很差了， 想想也是啊 ，消化的次数太多了也是一种干扰和伤害， 细胞生长也需要一个稳定的环境 ，不能天天去冲洗呵呵 。
现在消化传代 ，密度就控制的恰当 一半两三天才需换次液 ， 五六天再 消化传代， 养细胞就变得轻松多了， 而且细胞的状态也还蛮好的 。呵呵。

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作者: sunnyB    时间: 2012-1-17 12:25

我现在才刚刚开始养细胞，现在只是在无菌条件下取新生小鼠的大脑皮层匀浆后来培养星形角质细胞，第一次做就犯了一个很严重的错误，在吹打成匀浆时，实验员老师告诉我要轻轻的吹打，但是由于没有经验，我也不明白这个轻轻是什么程度，一会儿就全部给吹打好了，接着离心，加培养液，但是做到最后看结果时很多细胞都被吹打碎了，白白浪费了那么多时间。刚开始就受到了挫折，很伤心。
我感觉做细胞培养最主要的是要细心，细心，再细心。一不小心，好几天的努力就毁于一旦，尤其是刷瓶子，培养皿，离心管还有吸管，很费劲的，所以为了能少费点时间，还是细心慢慢做好，说得不对的地方请批评指教。谢谢！

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作者: jujuba    时间: 2012-1-17 12:25

以前觉得教材是最好的老师，百问不厌，所以在实验中遇到的问题都喜欢去教材和文献中找。前些天和师姐一起取小鼠内脏进行病理切片，摘下器官用福尔马林泡着。还剩下一些福尔马林，想知道福尔马林的保存条件——是室温还是4度。如果是我，就会去网上查，网上肯定有的。可是我师姐抓起电话就打给了另一个以前也做过病理切片的师姐，三言两语就问出了保存条件。

事情小得不能再小了，却给我触动很大，查书查资料固然是很经典的方法，但有时候请教有经验的前辈会带来很多益处，比如方便快捷，而且交谈中会透露许多资料上没有的实践经验，类似偏方的东东等等。

再想想，向别人请教问题还可以增进彼此了解，使原本陌生的实验室成员相互熟悉，建立“人脉”嘛，呵呵，并不是只有给与才能加深彼此感情的。

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作者: 铜雀    时间: 2012-1-17 12:27

看到这个帖子不禁想在这发几个牢骚
1. 我是分大鼠HSCs的,前些日子分了两次,奇怪,细胞不贴壁,成团,搞的我特郁闷,以前都没出现过这个问题,后来把培养皿拿出来测了下培养液PH值到8.12了,我一直在DMEM里加2.0G的NaHCO3,从不调PH值,可是DMEM说明书和实验室protocol上写着都是3.7G,我最近一次配的时候就糊涂的加了3.7G,而且没有调值,偷了一下懒,犯了这么一个低级的错误, 浪费了时间和经历这么多.
2. 老板一直要求按照他的protocol来分,可是效果不好.于是自己摸索定了个浮力密度上限值,效果显著.没有最好的protocol,只有不断优化.实验中最重要的是用脑子分析.
3. 关于细胞株的消化,没有胰酶的时候就直接加冰冷的培液,效果不错,又省钱.

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作者: fei1226com    时间: 2012-1-17 12:28

我开始的时候养死了一批细胞，由于是和人要的，已经很老化了，又是初学，相当郁闷。分析了所有的原因，以为污染了，把无菌室弄了次大扫除，所有的东西都重新配制，重新灭菌，但后来发现其实原来的试剂等并没有污染，个人认为是细胞本身的问题。
后来我又在园子里要到了一瓶，结果养得相当不错，还送了别人几瓶。现在养的是从细胞库买的，轻车熟路，感觉没象前辈们说得那么恐怖，只要该灭菌的灭了，保证无菌室清洁，培养箱水盘里的水每周换一次（灭菌的双蒸水）。换液等时在无菌操作台里进行。只要细心一点，把准备工作做充分，养细胞很简单。
反而是我做RT-PCR时有教训，一定要保证提取的总RNA质量较高，我深有体会，摸索了2个月才摸索出一对引物的条件，结果我今天一次就搞定另外一对引物，哈哈，超有成就感！（有点离题了，呵呵。）
一个词，细心！

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作者: HP007    时间: 2012-1-17 12:28


痛定思痛，痛何如哉
养了四个月HUVEC，污染了两次。
刚开始一直用的是实验室老师介绍的国产胎牛血清，细胞长得也不错，用完之后又买了一瓶，用上新血清没几天镜下观察细胞周围就出现了黑色、线状、快速游动的小虫，以为是细菌，加入双抗后小虫有所减少，但第三天又多了起来，密密麻麻分布在细胞周围，只能扔掉，仔细排查各方面原因，最后确定跟国产血清有关，心痛啊，十多瓶细胞瞬间化为乌有，呜呜，之后换成了GIBCO的特级胎牛血清，就再也没出现过这种情况了，这次吸取教训尽量用进口产品，起码质量能够保证，万不可因小失大。
第二次污染原因比较复杂，说不好究竟是哪里的问题，是培养箱的问题呢？还是***作的问题？总之肉眼可见培养瓶里菊花似的霉菌团，又在培养箱的水盘里看到了2个同样的霉菌团，吓得我赶紧把细胞扔掉，把培养箱的架子用75%酒精擦了，正反两面各在紫外灯下照了1h，还好其他人的细胞未发现污染，这次污染之后我清醒的意识到无菌操作的重要性，更加认识到细节决定成败的深刻含义。
实验还要继续，细胞要重新购买，希望我下面的实验能够顺利，在实验进程中，非常感谢dxy的xdjm们，大家教会我很多东西，不仅仅是知识上，祝愿所有的dxyer们实验顺利，offer多多。

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作者: dotaaa    时间: 2012-1-17 12:28

我是养动脉平滑肌细胞(SMC)的，给大家介绍我的一个小心得：
在传代过多的时候在消化的时候有个现象，就是从第一个细胞变圆到最后一个细胞变圆相隔时间很长。于是就存在最先脱壁的细胞有过度消化的现象，弄得传代有状态不好。后来我想了个方法，就是分两次消化，第一次消化一部分，不待所有细胞都变圆，及时终止消化，吸出细胞悬液，然后在加入胰酶做第二次消化，把两次所得悬液混合然后在传入两个瓶中。这样可以保证细胞不消化过度，有时候甚至需要做三次消化，虽然麻烦点，但是养细胞的人要有不怕麻烦的精神，你要是忽悠它，它就要忽悠你，大家一起加油！

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作者: flower-201    时间: 2012-1-17 12:30

我在国外试验室作细胞培养的体会，兼谈细胞污染问题：
良好的实验室要有一套见诸于文字的严格规范，不是将超净台放到任何地方就可以作细胞培养。举个例子：如果生产豆腐的作坊隔壁就是公共厕所，这种豆腐敢吃吗？因此没有良好的清洁设施，即使培养的细胞没有污染，出来的实验结果可信度恐怕也成问题。所以从大的方面说，整个实验室要有通风过滤设施，并保持一定范围的温度和湿度。细胞培养间需单独设置，而不是“公共场所”。如有风淋设备最好不过。操作时带无菌手套。能带口罩帽子当然是最好了。
有个比较简单方便的东西国内常没有，就是超净台里最好安装负压吸引器。在移去培养液的时候将消毒玻璃管接上负压，轻轻的吸去液体，又方便又干净。
细胞培养箱是个“卫生”死角，常不被重视。需要定期清洁。多人培养细胞时不要互相混放。

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作者: tieshazhang    时间: 2012-1-17 12:31

我完成课题的地方的细胞培养室条件真的很不错。配有风淋，臭氧发生器，中央空调等，最重要的是有上楼朋友所说的负压吸引器，我们每次都消毒一些枪头，在移培养基的时候，只要将连接在吸引器上的移液管套上消毒枪头，就可很方便的移去液体。也在其他培养室待过，发现在这点上有吸引器真的很方便。
我们做的L02细胞，很多时候一瓶长了3天也没有长满，不好传代，我们就换液让它再长一天，通常这样第四天细胞就会脱落更多，状态更差，后来我们得出经验，这种细胞一次不能够超过3天不传代，即使没长满也要传代，有时候长到第三天细胞状态已经很差了，可是给它一传代反而状态会变好。
不知道大家有没有这样的感觉，我们养细胞的时候都是把它当作自己的宝贝一样爱护着的，假日休息日也会去照顾他，刚开始养时，深怕他营养不够，天天给它换液，看见细胞长势均匀，胞壁光滑就开心的不得了，一看见“小黑点”，细胞分布不均或颗粒粗糙，就忙着上dxy，请教师兄师姐，这一年多的养细胞生活真的收获多多，有郁闷也有开心

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作者: 爱老虎游tt    时间: 2012-1-17 12:31

看到这么多站友和大家一起分享教训和心得,受益非浅.本人做培养细胞2年了,没有出现过污染的情况,现将一些自己对细胞培养的认识写出与各位交流.
1.充分的准备是开始培养就存活的关键.培养前将所有的细节考虑清楚,准备好一切所需的试剂和器皿,并将所需要的玻璃器皿刷洗好,泡好酸,消毒好.备用.
2.仪器的准备.(1)培养箱其实也是非常重要的,注意到许多站友都不太注意培养箱的维护.我在新培养一种细胞前都会很认真的清洁培养箱,先用无菌纱布将内壁擦干净,然后再用70%酒精擦拭.并且经常注意水盘和CO2气罐的检查.尤其是水盘,是很容易长菌的,基本我是每月定期清理消毒.(2)超净台也是非常需要注意的,里面只摆放极少的东西,比如加样枪,吸管,酒精灯等.千万不要把超净台当储物间了,许多污染原因即是此处.超净台在每次使用前都需要用酒精擦拭然后紫外灯照射.
3.建立细胞培养实验室管理制度,及时记录并定期按制度操作.如房间的灭菌照射制度,培养箱检查制度,玻璃器皿定期泡酸清理制度,卫生管理制度,入室人员管理制度等等,这是保证实验室正常运转和防止污染的长期保证,极其重要!
4.如何避免其他地方污染的问题许多群友说的已经很好了.

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作者: milkdog    时间: 2012-1-17 12:32

养细胞只有三个月的经历，但是其中的苦乐可能只有自己才能感受的深刻。实验的初期，自己忙着重组质粒的构建，直到构建完事乐才开始接手细胞的培养。向别人要了一瓶MDCK开始养，别人说消化2－3分钟，我放在培养箱中3分钟，吹打分散，转瓶，结果第二天一看细胞只有少数的贴壁，才知道消化过头了，又只有到处向别人讨要细胞练练手，经历几次失败后，磕磕碰碰的终于理解了一些基本过程，摸索着把细胞养起来了。复苏自己实验要用的HEK293，刚开始细胞状态很好，一边传代一边做转染，冻细胞（在别人的指导下把DMSO高压了，配冻存液）。我还以为这样我慢慢做，多做几次，包装出病毒出来，开始后续的实验就行了。没有想的是传的41代的时候细胞出现黑色的能够游动的小虫，那时候我的心都凉了。转染后病毒的噬斑还没有出现，正是需要细胞的时候。没办法只有复苏自己冻的细胞，几次复苏失败的经历，把自己高的灰头土脸的，请教高手查书，在丁香园发帖求教，发现自己在细胞培养方面又很多不足，也算给自己究了一些错吧。下面说一说我的体会吧：
（1）配培养基时，我以为按说明书加3.7克就行，其实我们用的是5%的二氧化碳培养箱，我看上面的帖子说应该加2.0克。同时几次的复苏，培养液在37 度水浴过好几次了，以没有考虑到培养液的PH值问题。看了一些帖子后才已是到这个问题，一查7.55，果然超出了。叫盐酸调过滤，复苏还是失败，伤心之极，干脆换了培养液，并且在加血清之前测PH，7.22，杂菌培养没有问题后在加血清。确认了细胞培养基没有问题。
（2）DMSO不能高压，这可能是我细胞复苏不起来的关键原因，每次复苏后死细胞特别多。其实在高压之前我也有过疑虑，因为我记得化学里学过DMSO见光都容易分解，不过但是没有多查一下就高压了，还用0.22微米的过滤。一查才知道DMSO本身就有毒性，细菌根本就不能在里面生长，并且其能腐蚀塑料，普通的滤器根本不能用于其过滤。
（3）HEK293细胞贴壁比较弱，消化时要特别小心。我看一本手册有说用柠檬酸钠和氯化钾所配置的消化液效果较好，并且其特意提到不宜用胰酶消化。也有提高用手拍击瓶底即可。这两种我都还没有用。以前一直用的胰酶消化。其对细胞的形态及做转染肯定会有影响。
（4）关于“小黑点”，有说是黑胶虫的，有说是细菌的，液有说没有定论的。还有说是PH改变有机和无机钙的析出，也有说是玻璃培养瓶中的硅颗粒
（应该是不会动而且很少的那种）
（5）还有就是冻存细胞后，不妨趁还有细胞复苏一只，看看懂得效果怎么样，我可是复苏了多次花了近两个月的时间买到了这个教训，直道细胞彻底完了再来复苏验证了自己冻的有问题，当然有高手带的话这个问题的可能性还是小的，就怕完全自己摸索做。
这些是我自己复苏失败几次后的经验总结，今天贴出来，希望有一点用吧！

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作者: guagua    时间: 2012-1-17 12:32

我最近养RAW264.7颇有感触：

我一开始养的RAW264.7是我们自己实验室的保存的，曾经经历过污染。
后来不知怎么就被救过来了。
我没用任何抗生素去养，都没发生污染。
但检测我需要的蛋白就有问题了。
按文献报道，我的目的蛋白在加药后才会产生，用WB可以检测出来
然而，在我的实验中，这批RAW无论加药和未加药的，用WB检测都有表达，而且表达量没有差异，无论用多大剂量的药

于是我问别的实验室要他们保存的RAW264.7。
当时是从液氮罐复苏的细胞，同时复苏了其他细胞。
第二天观察，就那瓶从别的实验室要他们保存的RAW细胞几乎全死了，本来细胞就少，飘着细胞尸体。我很沮丧，但没把它扔掉（我居然没一气之下丢掉。。。= =！）。
后来就一直没管它，直到一周后，我再一看，居然长出了一点点细胞！！！
细胞很稀疏，有细胞的地方都是十几二十多个细胞长在一起，就像打靶后的细胞克隆一样。
我试着把它们消化下来，尝试用小皿养。
但那些细胞超级难消化！
我加胰酶37度消化了半小时，那些克隆细胞仍大部分是贴壁的。我又狠下心把细胞放在4度冰箱，让细胞受冷收缩，与壁分离，放了半个多小时，终于大部分细胞脱落下来。但我不感抱太大希望，在想这么折腾有多少还能幸存。。。
我放在小皿里培养，第二天观察发现死细胞也不多，太神奇了！
后来细胞覆盖率达到差不多80%~90%了，我再消化，这次胰酶加入后，细胞一下子就脱落下来，把我吓了一跳。
怎么RAW264.7 这么奇怪？？？

然而不知道经历了这么多的RAW，生物性状会否又改变，检测我需要的蛋白是不是跟以前的一样没有变化

我觉得养这个细胞真让我经历了不少意想不到的事

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作者: baidukk    时间: 2012-1-17 12:33

我是养细胞的新手,才养了不到一个月.养过两种细胞,奇怪的是两种细胞同时养,一种被污染了,严重污染,另一种却很好,分析起来原因可能是自己某一步的操作失误造成的.现在和大家分享一下我的体会:
1首先要记住养细胞是一件慢工出细活的工作,绝对不可以马虎了事,否则一步疏附可能满盘皆输.
2保住种子非常重要,并且要尽量选细胞生长状态好的进行保存,要多保存,出现意外时应对起来就方便的多.并且最好分次保存,以免一次保存时的操作失误使所有的冻存细胞over
3实验时掌握原理非常重要,如果知其然而不知其所以然,就会犯一些难以预料的错误
4复苏细胞时要注意尽量用蒸馏水40度左右,可以减少污染的几率,并保证较快的融化,保持细胞活性.而且细胞的密度不能太小,因为细胞之间如果没有一点接触也会影响细胞的增值,这个很重要,如果一味的希望细胞量大一些而稀释细胞只会欲鼠而不达.
5对于污染的判断:我的Hela细胞本身时很好养的,但是还是过不了污染这一关.
当时是三瓶细胞,有两瓶出现了明显的污染,细胞之间以及培养液里长满了比细胞小的黑点点一样的东西.总之是一片混浊, 但是还有一瓶好一些,只是细胞长得看上去不是那么轮廓清晰,我原以为是细胞时间比较长了,需要传代了,就传了一代,第一天还好,但是瓶壁上可以看见细胞之间不干净一样,有黑点,有人说是杂质,但是由于那两瓶的经验,直觉告诉我是污染,结果是第二天,出现前面两瓶一样的情况.于是我马上复苏种子,由于急需细胞我把细胞种子接了两大瓶,而我原来冻存时是一小瓶.第一天细胞贴壁不少,但是培养液里悬浮了一些细胞,第二天悬浮的细胞很多,而贴壁的长得液不是很好,我急了:是不是又污染?我把细胞认真的看了好几遍,并且和别人的对比了一下,估计可能是细胞复苏是密度太小,细胞间不能很好的接触,反而不利于细胞的生长.于是我只有慢慢的等待观察,第三天换液后,情况好一些了,第五天也就是昨天,又换了一次液总算死细胞越来越少,贴壁的细胞液轮廓清楚,慢慢出现细胞团互相融合成片的迹象.happy啊.不过细胞从周一到现在还是一代都没传,还算长得很慢的.所以到底问题出在哪还有待进一步分析.如果周一长满了.那污染的可能性就不大了.很可能是冻存和复苏时对细胞活性影响太大以及复苏时接种太稀疏引起的.

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作者: 麦丽素1986    时间: 2012-1-17 12:34


尽管我来实验室已经有接近二年的时间了,但我在细胞培养上却完完全全是一个新手,在我决定进行细胞培养之前,我们实验室总是会出现这样那样的细胞污染,其实有经验的人都说是真菌污染,但我也无从得知,那次师妹为了搞清楚是什么东西污染,硬是把污染的细胞继续培养.最后大家只好转移自己的细胞,怕了她,但她仍然不死心,又哟暖和培养基光养,就是为了确定是什么细菌污染,但结果仍然不知道,做细胞其实是什么污染并不是很重要,知道了其实也没有什么用.还是重新养,但确实是费时费力,吃里不讨好的事情,我刚进细胞间那会,一个老技术员,应该有五六年的细胞培养经验,那天刚好星期五,做的很急,结果第二天一看,细胞培养液已经浑浊,污染了,其实做细胞关键还是要小心,细心,不要贪快,做实验还是非常磨练自己的,我以后做的时候也一直没有污染过,万幸啊,如果贪快,质量无法保证,最终的结果往往就是重新来过,吃力不讨好,还是应该细心,小心点,尤其是实验条件不是很好的实验室那样你的实验顺利,你也会很开心的.祝大家实验顺利!

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作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-17 12:34


刚开始养细胞，血清10％，一周才能传代，换成20％得 血清四天传代一次

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作者: glass    时间: 2012-1-17 12:35

说起来我养了有5个月的细胞，开始一直很顺利，到第3个月的时候出现过一次污染，是因为配好的培养基被污染了结果忘记检查。后来想要找办法补救，就照文献提到的低速离心的方法，用PBS洗了离心后用棉签把残留水分吸干。这时候就犯了最低级的错误，因为低速离心后细胞是不会老老实实沉底的，而我却直接按平时离心完了以后的做法把上清倒掉了～～～结果等离了3次之后，我把离心管里的“残余物”接种到瓶里后才发现，一共就剩了8个细胞！

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作者: 阿敏    时间: 2012-1-17 12:35

今天的一个失误，把一瓶DMSO打翻，刚巧撒到了一堆离心管上，24支5ml配好的二级母液都撒上了，虽赶紧抢救，但1分钟后还是有10支离心管上的标签看不清了（我用签字笔在标签纸上写的），晚上对着台灯仔细分辨笔画痕迹，也只能分辨其中4支，痛心啊，都是纯品配的母液啊~~~！

教训：1、操作时心要静，动作要稳——即使不在超净台上。
2、经常用的离心管上的标签，由于常喷酒精什么的，最好用铅笔写，然后覆盖上透明胶。
3、用DMSO等准危险品一定要小心，不只是有毒，溶解性也可怕。

唉~~~~全是眼泪啊，我的母液啊~~~全是纯品啊~~~~~！~

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作者: 了了    时间: 2012-1-17 12:35


我也来说说细胞培养吧,这是个让人头疼的事情,我们实验室培养的多数是乳腺癌细胞,如:T47D MCF-7 MCF-7/Bos 435 453 293 SkBR3 ZR-75-30 还有就是3T3细胞,好象就这些吧.我也是先看了师姐做了很久才开始自己养的,就算是这样,自己养的时候也出现了很多错误,最开始,不知道每个细胞对消化液的耐受程度不一样,所以消化的时候也没有注意时间,消化完后没吸掉消化液,结果有一次养453的时候出现了问题,花了很久的工夫才知道自己应该在消化完后把消化液吸掉,因为这个细胞不耐受消化液,所以,每次培养一种细胞时,一定要了解这种细胞是不是娇气.然后,出现的问题就是所谓的黑胶虫问题,我现在也还在为这个问题烦恼,它有时候又不是那么可怕,有时候又会影响细胞的生长,但是,最头疼的事是我还不知道这东西到底是不是细菌,按照站友们的意见试试,也还可行.当然,培养细胞最首要的问题还是要防止污染,所以,一些实验操作大家还是尽量按照别人的经验,最好不要嫌麻烦.呵呵 .

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作者: 社会主义好    时间: 2012-1-17 12:37

RAW264.7细胞是我实验使用最主要的细胞，前后养了接近一年，但是其中2个月是痛苦的徘徊期，因为细胞状态不好，不能用作实验，只能周而复始得复苏-培养。
这两个月得出养RAW264.7细胞的心得是：密度控制。
RAW264.7细胞是鼠巨噬细胞，用于免疫等方面的研究，状态的好坏主要可以从它的细胞形态看出，当细胞处于悬浮状态时，细胞透亮，没有小黑点，贴壁后，细胞边缘清晰，没有伸出的“触角”，像铺路石一样。过密或过疏则状态均不佳，做相关实验结果都会很糟糕。平时多观察细胞，调整适当密度，换液不要全换，一半新一半旧，对细胞生长比较稳定。
至于培养液的选择，ATCC上说用DMEM，其实1640我们实验室用得也不错，只要把PH调整到7.2左右，都没有问题。其中请注意培养液在PH7.2左右的色泽，有一次我们实验室的酸度计坏了，调出颜色总觉得不正，到隔壁实验室一对，天，差点坏事，误差有0.5以上。
培养这类较娇气的细胞可以用不贴壁的细胞皿进行扩增，可以去掉酶液消化对细胞的伤害。细胞状态良好时种入贴壁细胞皿中进行实验。
培养液不加双抗，双抗也是药物，虽然量少，但毕竟是干扰，而且做好无菌操作，并不会引起 污染。
血清很重要，我们用的是HYCLONE的高级进口血清，因为其内毒素含量低，而国产血清很多达不到这个要求。
愿以上内容对养RAW264.7细胞的战友有参考作用。

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作者: 克隆鱼    时间: 2012-1-17 12:39


我在原来实验室管细胞间很多年，与许多学生朝夕相处深知他们的辛苦、痛苦。养细胞除了技术上问题（大多数学生很快就能掌握）外，就是细心是关键，细胞是活体应当用体贴人的心去对待它，倾注积极的感情去对待它们，关心它们的温饱及时换液不能犯懒，有的细胞饥饿一次就完蛋了；关心他们的冷暖，不能忙时或情绪不好时培养基从冰箱拿出来就用，有的细胞这样可能也挺好那是境界高的细胞，大多数细胞不行会发生许多复杂问题。还有许许多多方面都是一样，细胞这个活体是能与人交流的，人的感情、精神状态、都能影响细胞状态，同时也就影响了实验结果，这是我的一点体会，可能不带有普遍性。

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作者: yhz1973    时间: 2012-1-17 12:39

本人正在郁闷中呢，我养的是大鼠血管平滑肌细胞，可是老是有许多内皮细胞夹杂其中，不知如何去除，而且实验就卡在这里了，没有细胞啥也干不了唉，高手请赐教啊多谢了

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作者: 缘yuan    时间: 2012-1-17 12:40

感谢前面群友分享经验。谈谈我自己的经历吧。
前一阵子我养的SMMC-7721发生白色念珠菌污染，向高手请教：
1、培养液中加两性霉素，针对真菌污染，终浓度5μg/ml；青霉素，针对细菌污染，终浓度500U/ml；丁胺卡那霉素：针对细菌和支原体污染，5μg/ml。做过对比，感觉三药连用比单用两性霉素效果要好。
2、三药连用作用一周，其间细胞长至80-90%左右，胰酶消化后离心，再用PBS离心，共计两次，注意原瓶不要继续使用，换新瓶传代。
3、具体药量视具体情况加减，镜下观察药物作用后细胞形态稍有改变，一周后救活细胞，换用含1%双抗+10%血清的培养液继续培养，细胞形态恢复正常。
4、若预防污染，可适当减少药量。如：两性霉素，1μg/ml；青霉素，100U/ml；丁胺卡那霉素：1μg/ml。
另外我现在碰到个棘手的问题：细胞发生细菌污染，PBS清洗干净后，加5-10倍抗生素剂量，第二天细菌还是大量繁殖，不知如何是好，最后只有放弃了。请高手指点迷津，谢谢！

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作者: 缘yuan    时间: 2012-1-17 12:40

呵呵，忘记说了，应采用低速离心，我用的是500rpm/min，3min。其它细胞的低速离心还应具体摸索。

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作者: 缘yuan    时间: 2012-1-17 12:41


自己补充一下，发生细菌污染如果不严重，换液一天后见培养液混浊发黄，但未见细胞死亡，PBS洗干净，换培养液，加5-10倍抗生素，如果细菌污染仍未危及细胞，经常低速离心，记住换新的培养瓶。此方法费时费力费钱，但对抢救珍贵细胞株可能有帮助。

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作者: toy    时间: 2012-1-17 12:41


我也是一个刚开始养细胞的,马上要开始正式养细胞了,而养细胞主要是做流式,所以觉得比较迷茫,流式抗体很贵,如果细胞养不好的话就做流式会前功尽弃的!晓得这个道理后,我特别担心自己养不好细胞,所以来园子里看各位xdjm的心得觉得受益非浅.同时也觉得应该把自己在做预实验的一些感受告诉大家,与大家一起分享
由于我也是老板的开山大弟子,没有师兄师姐们帮忙(我特别羡慕那些有师兄师姐的人,呵呵),所有的一切都只能靠自己(老板忙啊!整天都顾不上我),从洗洗刷刷到泡酸、冲洗、消毒等等一系列繁重、单调、枯燥的准备工作之后，我觉得“万事开头难”这句话真是至理名言，没想到后来在培养细胞时遇到的问题才叫我头大，总会有一些小问题会不时的来骚扰你，比如说培养箱出了问题了，CO2瓶又漏气了、气流量大了又把管子冲掉了等等，等我把所有这些都弄好后开始培养细胞了，第一天还好了，比较满意，细胞长得还不错，但是，第二天去看细胞就没有头一天的好，开始还以为是细胞不适应，等一天再看，后来在镜下发现里面有一些小黑颗粒，胞内出现空泡，培养瓶口也长霉菌了，郁闷！想想反正是预实验，从头再来吧，于是把培养箱里面用75%的酒精擦拭一遍，还是不行，又到处找原因，怀疑是培养间的问题，上网查资料，先用冰醋酸熏蒸，后用高锰酸钾和甲醛熏蒸，从此再也没有出现这种问题了:-）从这些预实验的过程中我得到的心得是:1、一定要做预实验,因为在做预实验时你可以发现一些你始料不及的事情；2、做预实验你可以熟悉你的实验室里的仪器，把它们调到最佳状态；3、不要忽视一些小问题、细节问题，我发现我们所谓的这些问题往往让我们举步唯坚，很痛苦！就是这些所谓的小问题、细节问题就可以让我们的实验瘫痪，进行不下去，我想很多人都会有我这种感受的。以上只是自己的一点愚见,希望大家不要见笑!最后，忠心希望各位xdjm们的实验能够顺利进行！达到预期目标！谢谢!

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作者: loli    时间: 2012-1-17 12:42

我进实验室也有一段时间了，记忆深刻的教训有2次。一次是第一次泡酸，忘了穿白大褂，结果一不小心，就把酸溅到自己的裤子上了，当时没什么感觉呀，完事以后才发现自己的腿就怎么那么热呢，到第二天起床一看，裤子都去了一块了，腿上也灼了，汗。
所以我现在泡酸都必须穿白大褂，不存在侥幸心理了，也不偷这个懒。泡酸的时候，把瓶底对着自己，减低酸跑到自己身上的概率；拿出来的时候更要这样。
第二次是最近发生的事情。那是做细胞实验的时候，带着手套，往手套上喷酒精，然后立马进操作台中，在酒精灯附近操作，结果，手套起火了！我也酸反应快的了，大叫一声的同时就把手伸出来，扯掉手套，好险啊。
所以现在记住了，要等酒精挥发一下再在酒精灯附近操作，否则......

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作者: 穿越时空    时间: 2012-1-17 12:42


我也说两点吧！自己养细胞的时间不长，但还是有点经验．
一．自己已经养过肝癌，胃癌细胞，c6，u251，Ｈsc等几种细胞了，首先想强调的是我建议千万不要不同的细胞混在一起做，很容易污染，特别是条件稍微差一点的实验室和人比较多的实验室，相当的容易污染．
二．　不同的细胞的消化时间是不同的．比如c6细胞超级容易消化，百分之０．１的胰酶放上去不到一分钟的时间就差不多了．而例如ＳＭＣ这类细胞就比较难消化．所以一种细胞和一种细胞千万要注意它们的消化时间，万一消化过了头，对细胞的生长是很不好的．

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作者: dotaaa    时间: 2012-1-17 12:42

我们实验室曾经因为水中的化学物质污染而导致细胞不贴壁、脱落、甚至死亡。
事情是这样的：我们制三蒸水的玻璃蒸馏器上的连接管因老化需要更换，我们就换上了从市面上买的普通橡胶管。但从那以后细胞就一直出问题：要么原代细胞养不出来；要么细胞不贴壁；甚至以前状态很好的细胞脱落、崩解。我们排除了各种可能出现的问题，最后才考虑是否出在水的质量问题上。因更换的普通橡胶管经水蒸气受热后明显有股刺鼻的臭味，分析这种管子中的有毒有害物质释放到水中，而用这种水配制的培养基、PBS等用液都含有有毒有害的化学物质，一旦加入到细胞中必定导致细胞死亡（细胞必须在无毒无害的环境中才能生存）。
查找到原因后，我们立即换用临床用作体外循环的医用无毒无制热源的特殊管子后，再没出现以上问题。所以正确分析、查找原因很重要，有些看似不可能出现的问题就出现在容易被忽视的小环节上，希望兄弟姐妹们不再出现类似的问题！

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作者: 伊莎贝拉    时间: 2012-1-17 12:43


说一下我的惨痛经历吧，细胞都换液传代完了，放培养基适才发现，原来已经有了污染，以后一定要先观察培养基的性状，并且一次只处理一株细胞，希望各位吸取教训

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作者: hyuu    时间: 2012-1-17 12:43

其实，我个人以为对于培养细胞只是进行实验的最基本一步，就好比整体动物实验时养实验动物一样的。因此，对于新手而言，个人建议不要花特别多时间去追求培养细胞的种种细节，只要是能和实验室的前辈一起把细胞培养稳定已经足够。一旦出现问题，问问实验室的师兄师姐，尽快跳过在培养上摸索的阶段，宁可多花时间在后续的课题设计上，这个是我个人的一个大教训。因为，即使把细胞培养的再好再完美也没有什么特别大的意义，我们进行科研的目的不是单纯培养细胞而已，重点是发现新的现象，新的机制，利用手中培养的细胞做好特定研究，发现并解决问题。
但是，对于实验过程中出现的细节肯定也要特别留意的，这个不仅仅是在培养细胞方面存在，在任何一个是实验中都需要细心。个人意见，仅供参考。

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作者: junjie05    时间: 2012-1-17 12:43

开始养细胞的时候，实验室里没有一个人是养过的，很多东西都不懂，我就看师徒正强的书和一些有关于细胞培养方面的书籍，自己做笔记总结，对比各本书上的方法，发现各自有各自的说法，都有各自的道理，一下子闷了，不知道该相信哪本书。后来还是主任发话教我不要怕浪费，凡是都得有个开头。于是我就从洗管子、买耗材、去上海瑞金医院拿细胞、配培养基、消化、冻存、复苏。刚开始犯了很多错误，消化的时候严格按照参考书上写的来，结果细胞都消化过度了；冻存的时候在-20度放置时间过久，结果复苏的时候细胞状态都不好等等。后来知道光看参考书是没有用的，相同的细胞在不同的条件下实验条件也不同，需要自己摸索，参考书只能参考，不能照搬，现在差不多一个人同时养5个细胞没问题，最多时同时养了7株细胞。还有我比较勤快，细胞室差不多我一个星期打扫消毒的，培养箱里的水也是差不多一个星期换一次，虽然累点，但是细胞不污染，比什么都强。
现在算来从开始养细胞到现在也差不多有半年了，是我们实验室里养细胞时间最长的认了。心里有点成就感，毕竟经历了从不会到会的整个过程。这里面所学到经验是宝贵的。

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作者: 831226    时间: 2012-1-17 12:44

我是培养人原代前脂肪细胞的，其中过滤组织的金属筛网如80目200目300目，很难清洗，泡上一天都洗不干净，对着阳光就可看到筛网上的很多孔都堵着，过滤的时候老半天滤不下去，想请教一下该怎么清洗筛网？用一次就得换吗？

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作者: 西子    时间: 2012-1-17 12:44

我是培养人原代前脂肪细胞的，其中过滤组织的金属筛网如80目200目300目，很难清洗，泡上一天都洗不干净，对着阳光就可看到筛网上的很多孔都堵着，过滤的时候老半天滤不下去，想请教一下该怎么清洗筛网？用一次就得换吗？
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我们实验室也有类似的经历,我想说两点: 一, 如果操作时时间允许,一过滤完,就试着用枪头等把筛网上组织挑出去,免得到洗的时候,真的很难洗下来啊,之前一个小动作免去日后不少麻烦呢 二, 将筛网在火焰上轻轻烤几下,再用刷子刷,师姐教的办法,经本人试验,挺管用的,残留组织基本上都下来了
希望对你有帮助

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作者: skytree    时间: 2012-1-17 12:45


观察细胞,照相时,显微镜一定要用酒精好好擦拭.我就吃过亏.实验室条件不好的话,要每周用高锰酸钾和甲醛熏蒸一次,每次24小时.甲醛盖住高锰酸钾粉末即可.不过要小心操作,这两种反应挺激烈!!效果不错

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作者: wu11998866    时间: 2012-1-17 12:45

我养细胞有几个月了吧，说下我的感受。
刚进细胞间的时候，没有人指导，自己只好硬着头皮上了，还好细胞第一次养出来了，虽然还需要纯化，但是没有污染，渐渐一个月过去了，就是暑假。暑假过后，又开始养细胞，开学时还和师妹说，自己的细胞从来没出现过污染，结果一连三次全是霉菌污染。搞得我头都大了，这是怎么回事？我百思不得其解，后来同学帮我发现培养基有问题，另外的原因是我的大意，本来认为自己已经过了无菌培养这一关，原来是自己操作是太粗心，可能是枪头碰到某些地方或手碰到瓶口引起的连环污染。我把培养基换了，加强了操作，再也没有出现污染。
结论：无菌操作是一个时刻要在脑中绷紧的弦，只要养细胞就不能放松。

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作者: ha111    时间: 2012-1-17 12:46

我现在也找到好方法了，用完泡热水里，纯热水，最好是开水，立即清洗，可以洗的很干净。没热水时，我就泡在三蒸水里，加点洗洁精，过会也很好清洗。

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作者: ha111    时间: 2012-1-17 12:47


给细胞照相时，显微镜上总觉得模糊，我们有时用眼镜布擦显微镜的镜头，效果还可以。

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作者: rxcc33    时间: 2012-1-17 12:47


哪位有GIBCO公司生产的DMEM/F12培养基？我用这个养脂肪细胞，快用完了，能不能互换一下？我有1640,DMEM。不知道买需要多少钱？

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作者: woshituzhu    时间: 2012-1-17 12:47


我刚开始做鸡胚成纤维细胞时，消化老是掌握不好，消化过了和消化轻了，都会使死细胞的量增加。消化过了，细胞被消化死了；轻了细胞，吹打得 力度比较大，细胞机械损伤比较大，死细胞也不少。后来，就是组织块要剪的比较均匀，还有消化看到组织块边缘呈絮状，就中止消化，吹打是力度要适中。

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作者: eric930    时间: 2012-1-17 12:48


我是新手，只养了三个月的癌细胞（有贴壁的和悬浮的），也谈一下体会：
1.贴壁细胞的话传代过程中最为重要的是胰酶消化这一步（消化不到细胞大面积呆在原地或者大多团状分布；消化过度细胞活性下降，不易贴壁）。
消化适度说着容易做着难。文献的时间均是参考值，至于实际操作时一定要以镜检为准：自己要用心去体会，去摸索一下！
2.细胞要象宠物那样去养，他们是有生命的！要按时消化，有最佳消化时间点，过去那个时间，即使消化很好，其活性也会下降！
3.细胞培养过程中，细胞生长良好时一定要多冻存几管。

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作者: whitesheep    时间: 2012-1-17 12:48


我是养人前脂肪细胞的，最后用雌激素雄激素干预，性激素溶解在冰醋酸与无水乙醇中活性有区别吗？

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作者: +小生怕怕+    时间: 2012-1-17 12:49


细胞是个生命体，他是需要关爱的，要用心他才会在你的呵护下茁壮成长啊。肿瘤细胞繁殖的是相对较快的，一般是隔天就要换液的，对于MCF-7细胞我们也发现传代到一定次数后他的状态是会有所改变的，所以他跟人一样，也是有寿命的。在培养其他细胞的过程中，我们还发现在瓶底常常布有黑渣，具体原因还真是不慎明了，简单解释为细胞状态不好似乎过于敷衍，我们采用低速离心倒是能够使情况改善。每次在镜下观察他们时就好像在看自己的孩子一样，各个都是宝贝。在用MTT筛活时我们在加MTT前后都会对细胞拍照，这些资料性的文件还是要多留一些的。对于中药提取物溶解性常常是个问题，一般是用控制在千分之一的DMSO无血清培养基配原药液，一方面不含血清使过滤较为容易，另一方面DMSO作为万能溶媒能使药物更好的溶解，对于脂溶性较大的药物溶解完全实在是困难，无论怎样最好使药物澄清，因为MTT会和药粉结块，那测定的OD值自然是不准确的。细胞培养我们也是刚刚起步，还请各位战友多多提点指教。

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作者: utt0989    时间: 2012-1-17 12:49


我养细胞的经验：
1、严格规范操作，避免人为的，器具的，培养液的污染。经常对细胞房消毒（可用新吉尔灭等对地面墙壁等处喷洒）。
2、细心观察细胞长势及形态，及时处理倍污染的细胞，及时冻存细胞。发现细胞有异常可拍照请教高手。

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作者: mickeylin    时间: 2012-1-17 12:50

经验：当用Ficoll对细胞进行梯度离心收获单个核细胞时，启速可快(4或5档)，但降速一定要慢(1档)，这样不会破坏离心好的MNC界面。本人所用过的进口离心机均有档速调节钮，所用过的国产离心机均没有。细胞培养室的离心机是收集细胞不可惑缺的仪器，购置、使用得当，会收益多多！

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作者: 兔唇    时间: 2012-1-17 12:50


经验：溶解Gibco的1640时，一包（10克）先加超纯水900ml，在磁力搅拌器上搅拌溶化，然后通入CO2气体，使其PH达6.2左右，继续在磁力搅拌器上搅拌，这时加入2.0克NaHCO3，搅拌均匀，此时一般PH达7.2，补足超纯水至1000ml，不锈钢滤器0.22μ抽滤除菌、分装。1640培养液在超净台上使用很易PH值升高（偏碱），不妨用1M的HEPES（PH为6.8～7.0）调节PH为7.2。

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作者: fsdd817    时间: 2012-1-17 12:50

本人养了近一年的细胞，现来交流一下污染细胞的处理经验：如果细胞比较多就干脆扔掉，避免污染其他细胞，如果比较珍贵可以采用以下方法处理，不过要和好的细胞分开处理避免污染其他细胞。方法：先用PBS或加双抗的生理盐水荡洗细胞1-2遍，再用胰酶消化比平时消化细胞的时间稍长点，以摇晃胰酶时便可见有少量细胞脱落为宜。不倒胰酶，直接加培养液，吹打混匀，移入离心管内离心，1000R/MIN 5-8MIN为宜。再加培养液混匀，移入一次性细胞瓶内培养，4-5H 后细胞贴壁后再用PBS或加双抗的生理盐水荡洗细胞2-3遍，这样细胞的背景就非常干净了。一次性细胞瓶比循环利用的细胞瓶细胞更容易贴壁，而杂物不易贴壁。一般的污染都能解决。

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作者: TAT    时间: 2012-1-17 12:51

我刚开始复苏细胞时，细胞总是污染，后来想可能跟37度水域箱的水不干净有关系，我就试着把要复苏的细胞放在培养细胞的孵箱里。结果复苏的细胞没有污染，状态还可以。

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作者: 吴才子    时间: 2012-1-17 12:51

我养了四次细胞了,只有跟师姐配合的一次才成功了．
　　四次，两种组织，两种方法，感觉组织块培养的方法要好养一些，用的是人的角膜缘组织．细胞消化的方法就比较烦琐了，用各种各样的酶，还要在羊膜上种植生长，羊膜还需要消化去上皮，需要极大的耐心．
　　最后做的这次对消化羊膜的方法还不太熟练，用了不少的时间精力，等开始消化细胞，种植时就有些疲惫了，几乎是草草了事．结果可想而知了，培养皿里污染的一塌糊涂，几乎找不到消化出来的单个细胞．
　　自己总结一下：１，虽然已经知道操作的基本步逐，但要了解原理以及为什么要这么做，心理有数，灵活应变；２，对顺序要熟练，尽量缩短时间，可以减少污染的机会；３，集中精力排除一切杂念，提高效率；４可以在没有羊膜的培养皿里养细胞，等有了＂感觉＂再在羊膜上种植．
　　希望自己下一次可以成功．

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作者: BUK    时间: 2012-1-17 12:51

我养肿瘤细胞养了近一年，虽然肿瘤细胞很好养，但是不小心的话它们也会刷小脾气的，我就分享一下我的经验和教训，希望版主加点小分让我的分数突破“个位数”
1.我们刚开始学的时候是看师兄师姐做实验，他们高兴了就教教你，不高兴了就一句话也不说，闷头闷脑的做，如果我们问问题吧怕说太多话会污染细胞，可是不问吧又不太明白，虽然书上说的看得懂，可是毕竟他们做起来又是另外一回事，这是根据自己实验室的条件和个人习惯不同而有所差异，我觉得刚开始学的新手要勤快点，主动帮助师兄们洗瓶子，主动担负起实验室的卫生，千万不要急功近利，觉得看了点书就可以开始做，前辈们的经验教训肯定很宝贵很实用，但是人家没有必要一股脑全告诉别人，所以我们表现好一点他们就说得多一点，以后我们做实验就少走很多弯路，
而且随身要带纸笔，他们的经验有时是偶尔说的一句话，如果你不赶着记下来，说不定就马马虎虎过去了，好记性不如烂笔头嘛
2.千万不要被污染吓怕了，细胞会污染就像人会生病一样，虽然不常见，但是出现了也不奇怪，我有同学养细胞都快养出神经质了，经常拉着我问，你看细胞之间的黑点是什么，白点是什么，我都快烦死了，细胞如果出现可疑状况首先要从操作方面考虑，如果细胞状态好就观察观察，细胞越来越差就扔了再自己好好查资料好好反省一下，问这个问那个，大家都莫衷一是，权威也会有出错的时候，何必不退而结网，多练习自己的基本功，多查些资料和帖子呢？
3.自己的事情自己做，过年过节我们都想回家，可是细胞长得好好的不知该怎么办，我觉得要么就自己之前咬牙拼了老命做完细胞实验，或者冻存好了彻底放自己的大假，要么就扔了算了，千万不要去麻烦别人，养细胞这么辛苦又细致的活让其他人干，自己不放心，别人也如履薄冰啊，而且很耽误人家的时间，至少我知道的就没有几个代养细胞长得好的例子，基本上不是死了就是很久没有处理最后只能扔掉了

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作者: baidukk    时间: 2012-1-17 12:52

后来，我的MSCs细胞在一次传代时，胰酶刚加进去，马上在镜下观察就只见到了细胞碎片，让我心痛不已。到现在我还没弄懂原因，因为那次的胰酶是我师弟刚配好的，以后，我自己用的东西全都自己准备
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你的师弟是不是用蒸馏水配的胰酶？

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作者: lixi559    时间: 2012-1-17 12:52

目前我正在原代培养养猪骨髓间充质干细胞（MSC），刚开始前三周很顺利，养了八瓶，没见污染，然而其中七瓶相继形成球形霉菌污染，只有第一瓶未受污染，逐步排查原因，发现是在取骨髓时未做创造无菌环境造成的，第一次取时比较小心，把猪麻醉后放在手术台上，做好局部消毒，周围点上酒精灯，分离培养细胞一周后未见任何污染，但以后逐步麻痹了，结果损失惨重。因为猪MSC生长较慢，要近一个月才能传代，而猪生活环境阴暗潮湿，恰恰霉菌生长速度也较慢，污染一点点过一至三周后才出现小白斑，所以无菌操作显得更为重要。每次进行原代培养极耗人力物力财力（猪又凶力气有大，逮它打麻药都费力），以前做的都打水漂了，欲哭无泪啊。知道原因后，每次抽骨髓尽量创造无菌环境，猪打上麻药前，动物中心的手术室进行紫外消毒，所需器材进行高压灭菌烘干，接着培养细胞才比较顺利。通过这次深刻教训，我感到原代培养的无菌操作太重要了。

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作者: 伊莎贝拉    时间: 2012-1-17 12:53

总结自己的一点教训吧：

前几天养了一种胃癌细胞系。开始长得特别顺利，那么就任其生长，直到培养瓶里面长得满满的才传代，这样没经过几次，我的细胞形态就开始变了，当时也没有太注意，但是后来细胞长得特别慢，而且爱聚堆，这是才开始觉察到细胞不对了。后来细胞也死了，实在没有办法去找了老板，老板的话我觉得特别深刻，也是细胞培养非常需要注意的.从中我总结了一下：
1.培养细胞千万不能懒惰，细胞一定要及时传代，大约长到90%是最佳传代时期（也看是什么细胞）你要是偷懒，实验结果不会好的。
2.对自己要有信心，不要一天总看细胞长得怎么样了，细胞不会是你看了就长得好了，你不看就长得不好，反而看的次数过多会影响细胞的状态。
3.操作要仔细。
4.作细胞之前要对细胞的基本信息有一定的了解，比如用什么培养基、抗生素、血清浓度、以及基本的细胞形态等等。这些ATCC上都有。
5.最后一点体会就是，做细胞越多的人越害怕细胞，做的越少的人越不害怕细胞。

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作者: greenbee    时间: 2012-1-17 12:53

我也来说说我的一些经历吧。。
我养的细胞是属于微贴壁细胞，所以无需通过消化等其他步骤，只要细胞状态好吹下来传代就可以了。。。 到目前为止接近3年了也遇到了一些细胞染菌的问题，刚学养细胞时我的师傅跟我说很容易，只要自己注意操作就好的，他说一般新人都很细心不容易染菌的，那时我就更担心了就怕自己染菌了，每次操作细胞时那么晚上肯定睡不好，一直想着细胞不会出问题吧（因为我们的细胞都是唯一的，外面是买不到的）。。搞得自己好紧张的。。后来一位美国也是做我们这一行的一个专业来我们实验室指导，他告诉我们做细胞不要太紧张，随意地点，他说染菌是没有那么容易的，之前我们都是用弯管吹细胞的，他说不需要可以用手轻轻的拍，细胞就全部下来的，这样操作很简单的，动用越少的物品越好，后来我们也慢慢的学习他的做法，心也慢慢松下来了，就在大家松弛的时候，问题来了，我们的好多细胞染了真菌，当时大家就想一定是培养基的问题，可是培养基测试也都没有问题，那会是什么原因，后来大家就发现是我在拍打细胞的时候瓶盖有问题导致细胞染菌，而且在超净台内拍打细胞瓶，细胞瓶不紧液体外泄导致影响了这一瓶培养基。。。后来我们整个月的工作全部白费，全部从头开始。 我们大家总结： 国外的方法有些可以学，有些不可以照搬照学，毕竟环境不同。。

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作者: 铜雀    时间: 2012-1-17 12:54

说说我的经历吧，我培养心肌细胞半年了，完全是自己做的，没有导师指导，没有师兄师姐可请假，完全是摸着石头过河，刚开始的几次就是污染，害的我胆战心惊了好几天，不仅仅是因为自己没有培养成功，而是因为用的别人的培养箱，每当我的细胞污染时别人的脸色就很难看了，我也理解，因为存在着相互污染的问题，自己心里那个着急啊，经历了一段查找原因的时期，污染的问题也解决了，更加重要的是我的心肌细胞也开始跳动了，自己心里那个高兴啊，可好景不长，因为要检测心肌细胞的大小而实验室里又没有专门的摄像装置，自己只好做成细胞爬片利用HE染色来测定大小，说一千道一万，虽然前面的路很长很崎岖，我仍然要走下去

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作者: 小野花    时间: 2012-1-17 12:54


我养原代一个多月了，虽然仍会不时出点这样那样的问题，但在不断的摸索中也得到了一些经验，希望与战友们分享。
1.我样的是皮肤的成纤维细胞。一开始原代取出来细胞活性超差，几乎不怎么生长。想了很多方面的原因，缩短消化时间也没用，测培养基PH和无菌实验也没用。后来想到，由于我取的组织是皮肤，我怕皮肤上面细菌多所以在取原代时用碘酒啊酒精啊对老鼠反复消毒，却没想到这些东西对细胞都是有损伤的。后来我就不用碘酒只用酒精消一下，然后用无菌PBS把整个老鼠狂冲几次，皮肤剪下来之后又用PBS狂冲几次。细胞活性才渐渐好起来。
2.我的细胞总是在瓶子边缘长的较满，尝试了很多方法都解决不了。希望站里的高手们帮帮忙解决一下。我想说的是，对于那些长的不均匀的原代细胞，传代时没必要等到覆满瓶底80%以上，因为有的已经长了很久了，到时候会消化不下来，新老细胞消化时间不同，就很难把握消化时间。长了先消化下来的新细胞就死了，时间不够大批的老细胞又不下来。很烦人的。所以我认为原代不均匀的时候看着有的地方已经很密了就可以消化了。细胞数还是够的。
有不对的地方还请大家指正。
还有，帮我解决一下细胞在边边长得密中间长的少的问题吧！不胜感激！

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作者: feima+    时间: 2012-1-17 12:55

本人养Caco-2细胞一个月了，以前从来没有接触过细胞实验，所以要从头学起。刚开始很好，细胞状态不错。可是后来需要把细胞种到Transwell的六孔板里，在这之前需要先加Collagen，这样可以使细胞更容易贴壁，可就是这里出了问题。因为Collagen事先要用水溶解，本来水是高压灭菌的，溶完Collagen后就没有过滤，结果就染菌了，真是追悔莫及啊。所以在这里给大家分享一下我这个月来的一些体会：1.养细胞一定要保证无菌环境，每一个步骤要事先想清楚，宁可多一步，也要保证所有的东西是无菌的，要不然会因为一个很小的方面毁了整个实验。2.做实验一定不能着急，想好了再做，不能图快，比如说在大家公用某个通风厨时可能时间来不急，也就不对东西进行消毒，或者是也不预热培养基什么的，那样很容易操作不慎而染菌。3.不要怕浪费。有时候往往觉得没必要，就用同一根移液管来执行很多步操作，比如说换培养基时，可能同事吸放培养基到几个不同的瓶子里，觉得无所谓，只要不沾壁就没问题，但有时可能因为不注意，碰到了那个地方，就可能把整瓶培养基污染掉，所以莫不如勤换移液管，不要怕浪费。以上是我的一些心得，供大家，尤其是刚开始接触细胞实验的站友参考，呵呵。

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作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-17 12:55


我养细胞那叫痛苦啊，因为当时我老板学生养细胞的都毕业了，刚开始帮着师姐，师姐没养过细胞，她跟别人学了，再教我，还真叫搞笑，发生很多的笑话，虽然看了书，但是犯了不少低级错误，还好有边上实验室的同学的帮助指点，那叫不耻下问啊，渐渐的我会养最简单的hepG2了，忽然有一天，老板说去养大鼠血管平滑肌细胞去吧，于是啃书，请教别人，不停的杀老鼠，刚开始很顺利长出了点，没过两天细胞死了，于是欣喜又低落了，继续，杀老鼠，那时候真的要做恶梦了，可是为什么我的组织块就是不长出细胞呢？每天晚上回来对着电脑看资料，园子里学习，有时候看着看着就想哭了，老板说真的不行就算了，我坚持着，不停的调整摸索，终于忽然两个多月后的一天，我的细胞长出来了，那种欣喜若狂的感觉我一辈子都记得，后来就怎么养都都长出来，而且叫疯长啊。真的叫哭过笑过，虽然说最后成功了，但是这种自学的经历太折磨人了，我在想一个实验室要延续，真的应该一代传一代啊，这样让后来者多点经验，少走弯路。对了，发现血管平滑肌细胞养的两个问题：血清质量及切记倒置时间宁长勿短

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作者: pengke1983    时间: 2012-1-17 12:56

请问:ATCC是什么专业网站？

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作者: 园丁##    时间: 2012-1-17 12:57     标题: 回复 #229 pengke1983 的帖子

American Type Culture Collection

cuturl('http://www.atcc.org/About/AboutATCC.cfm')

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作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-17 12:57

失败
实验目的：做免疫印迹预实验来摸转膜时间

实验原理：参考文献上的时间转完膜（PVDF膜）后同时用考马斯亮蓝染膜和胶，再洗脱。如果胶上没有蛋白条带，而膜上有，则说明转膜成功，时间合适，可以用来做正式实验。

实验方法：膜与胶同时浸入考马斯亮蓝染液中，且浸入时间一致，然后洗脱。

实验结果：胶上可以看出没有蛋白条带，但膜上也看不到蛋白条带。

思考：考虑转膜时间过长，蛋白跑到外面去了，重复实验依然如此。
交流：考虑到样品有限不能盲目的做实验，于是请教导师。

收获
原来在染胶与膜方面，时间是不一致的，染胶的时间远比染膜的时间要长，染膜时将膜浸入染液涮两下就立即要洗脱，否则会因为背景高而看不出膜上的条带而误以为蛋白没转上。

成功
吸取教训后重试，果然看到膜上清晰的蛋白条带。遂开始做正式实验。

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作者: one    时间: 2012-1-17 12:57

说一个小细节：
在高压 瓶子的时候都放个小绳子
可是我放的时候一头 在瓶子里
可是另外一头却 被瓶塞给包住了
结果 高压的PBS 一部分瓶子都 裂了
刚开始都不知道原因

后来一个师兄告诉我才知道

只要简单的用一个绳子 一头在瓶子里 另外一头彻底在外面就可以

特别是新瓶塞的时候一定要注意

高压结束 如果是空瓶子 里面有些 水蒸气我想这说明里面应该没问题了

要是象我那样 就算高压了 都不敢用

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作者: 月牙牙    时间: 2012-1-17 12:58


养细胞也很长时间了，说一点可能大家都容易忽视的问题，但是我认为还是很有用处的：
灭菌时候瓶子或者培养基瓶子的放置。可能实验室条件好的细胞培养瓶都是只用一次，培养基都是自己买，但是没钱的毕竟还是多数，所以培养瓶等东西反复用就是一个很现实的东西（玻璃培养瓶）。不知道大家包扎的时候都是用什么包扎的，我们实验室是用牛皮纸包扎的。原来灭菌的时候我都是将瓶子正置放下去，后来有一次，我们老板看见了，啥也没说，直接拿了一个我灭好瓶子，里面倒了一些双蒸水，结果就看见那水进去之后就变的很黄。老板说，灭菌的时候，由于内部水蒸气的存在，牛皮纸上面的脏东西直接就灌回瓶底去了，这么脏的瓶子你那细胞能养好吗？（醍醐灌顶啊）后来灭菌我就一直平放或者直接倒置了。很不起眼的一点，希望大家注意啊。

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作者: bongte    时间: 2012-1-17 12:58


用0。125%的胰酶消化下来的心肌细胞得率太低。，不知道怎么解决

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作者: dragonkilly    时间: 2012-1-17 12:59

细想一下，我断断续续的养细胞也有一年多的时间了，先后养过HEK-293，A549，TE细胞，现在谈谈我的经验。
第一，一定要用自己的东西，千万不要偷懒。记得研一上学期，因为有理论课，所以在科里的时间比较散，但老板布置了任务，没办法只好做实验，因为我觉得我的实验时间比较短，所以用点别人的培养基就好了，自己要是配的话用不完都浪费掉了，还是因为自己太懒。于是用了师姐的培养基，开始复苏细胞，可是怎奈怎么复苏都不活，我快要疯掉了，因为细胞是我之前建的稳转细胞系啊，就那么几株！！！刚开始我还怀疑是当时冻存时状态太差，后来才知道是因为师姐的培养基里根本就没加血清！我的细胞是被活活饿死的！！

第二，讲讲我养过的各种细胞。1，HEK-293细胞贴壁不牢，换液时一定要轻柔。而且我发现用一个培养瓶养细胞传代久了后细胞状态会不好，这是换一个新瓶就会好很多。2，A549细胞贴壁极牢，传代消化时，可先吹打洗一下后再加胰酶，约5分钟后倒掉，残留一点，然后将瓶放入培养箱5分钟后拿出吹打，另外需注意A549比较娇气，消化久了状态会变很差，所以时间一定要掌握好。3，TE细胞比较好养，就是刚复苏时长的特别慢，一定要等细胞长起来后再传代，刚开始细胞可能会扎堆长，这时不要怕扎堆的细胞长不好，一定要等到堆与堆之间连接起来后再传代，否则细胞总也长不快。

先写到这吧，以后想起什么再补充，谢谢！

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作者: abc816    时间: 2012-1-17 13:00


我们做PC12细胞复苏，发现复苏后细胞长势刚开始还好，可传代后，培养瓶底壁出现出现不溶性黑色物质，但培养基不浑浊，请教老师，说不像微生物污染，于是考虑胶和胰酶还有培养基问题，改变条件可仍出现相似问题，我们复苏了3代细胞，冻存细胞耗损很多，后在一次偶然机会，发现是PBS污染。我把这段经历写出是想和大家看看我的教训，以后做实验等考虑全面了。

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作者: utt0989    时间: 2012-1-17 13:00

我也说几句吧，实验要有好结果、重复性，就必须有固定的、成熟的实验方案。
　　实验室的同道称我为MTT专家，只是做的较多而已：）
1.做MTT必须要进行细胞计数，细胞必须为单细胞，可根据实验目的调整细胞浓度，但每批细胞数应一致（如果做增殖抑制实验以5000个为好）。
2.加样量要准，加MTT前要弃去培养上清，老板主张翻板法，但我觉得不妥，于是自创了一套：把吸管套在抽吸机的橡皮管上，再在吸管上套一个10ul的枪头，然后将压力调到最小。本方法既保证吸的干净，又不会损失已经形成的结晶。
3.我还做相关的其它实验，以及体内实验，如裸鼠移植瘤等。希望有时间了和同道商榷。

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我想请问一下，MTT最后溶解甲瓒的时候战友有没有用过三联液？有资料说三联液效果也很好，而且毒性比DMSO小，但是溶解比较慢，可能要过夜。还有一个问题，做MTT实验细胞计数是关键，但是细胞计数板记得也只是大概的数目，战友只是就记一遍？铺板有什么注意事项或者技巧吗？希望您详细的分享一下MTT的各细节！谢谢！！

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作者: milkdog    时间: 2012-1-17 13:01

前一段时间我们养的A549一直状态很不好，细胞中又很多黑色颗粒，细胞有点肿胀。后来发现是因为用DMEM高糖+10％血清培养液并不适合A549的生长。我们换成了1640+10％血清，A549的状态非常好。协和细胞库的老师说A549在F12中生长也没问题。看来培养液还要真对细胞的种类进行选择，对细胞的生长影响很大呢！

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不会呀。我们实验室的A549,DMEM高糖+10％血清或1640+10％血清，都长的很好呀。

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作者: 二丫头466    时间: 2012-1-17 13:01


刚开始养细胞，养的是293 ，突然一夜之间，细胞全崩解了。

郁闷！

重新开始吧

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作者: 911    时间: 2012-1-17 13:01


我也来说一个。才养了一年多CHO细胞的小菜鸟。
养的293细胞，大半年一直挺好的，生长也很快，但是后来发现细胞不够透亮，有小黑点，增长和贴壁速度都明显变慢。开始怀疑是不是细胞污染了，就重新复苏，但是还是一样的状态。想尽了各种方法还是不行，后来又找人要了细胞还是不行。最后追查实验记录发现出问题时换了新一批的血清，换了原来批号的，果然恢复了。
其实新一批血清在开始用的是时候就发现颜色有点异常，只是摇床摇了没发现问题，又是进口的，一直在用的品牌，没提前试一下。所以试剂，血清什么的换批号还是得试一下啊，保险！

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作者: fei1226com    时间: 2012-1-17 13:02

我以前曾那过一株细胞，回来时发现很满，觉得该传代了，但是老板说别传，过一个晚上比较好，明天早上再传，结果第二天早上发现全飘起来了。这个时候想离心一下收集细胞，离心完之后继续培养，发现细胞完全不行，死翘翘了。

第二次再取得时候，发现细胞长的很满，我回来放了两小时之后，就立即给它传代，第二天早上观察，发现长的还是很好的。
还有，有一株细胞是半贴壁的，拿回来之后，发现漂了很多，就离心后培养，第二天观察一下，发现效果很好。
以上我总结出：要是贴壁细胞，只要是长满了，你立即处理，也 是没有关系的，不处理的结果可能比处理的结果要糟糕很多；不论是什么样的细胞，拿回来的时候，漂起来一点也没有关系，可以将上清离心后收集再培养，效果也还是可以的。

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作者: lixi559    时间: 2012-1-17 13:02

养细胞已有一段时间了，从好养的恶性肿瘤细胞开始到原代细胞，细胞系相对好养，只要注意无菌一般不会有什么情况，原代细胞一般比较娇贵，取时费时费力，更加要注意无菌，我养细胞都没有加过双抗，一定要相信自己的实验技术，自己准备一切物品，准备充分，培养基开瓶后也不宜放置过久，PH值会发生改变，此外胰酶的污染也不容小觑，现在在培养原代肝细胞，用的是胰酶消化法，同时也在用胶原酶消化作比较分析，肝细胞取出后相继污染了几次，应该是同一种东西污染，发黄，有恶臭，其中有一次加了一点青霉素抑制住了，但是并没有从根本上解决问题，肝脏和肠道离得较近，和肠系膜还有连接，不知道是否为肠道菌群，请各位高手指点。

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作者: 中国特色    时间: 2012-1-17 13:03

各位前辈们好，小弟我也刚刚开始养心肌细胞，我要做的是昆明小鼠乳鼠心肌细胞，有哪位高人指点一下怎么分离养小鼠乳鼠心肌细胞，最好有具体的不走，不胜感激。
还有一问题想请教就是做流式细胞分选的话，最低细胞数量要求多少？急求。谢谢

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