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标题: [分享帖]流式图片专区 [打印本页]
作者: 了了    时间: 2012-1-19 14:39     标题: [分享帖]流式图片专区




我先发一张关于PI染色的uv诱导凋亡的图片，请大家点评！
这是con。

图片附件: 33189372.jpg (2012-1-19 14:39, 52.33 KB) / 该附件被下载次数 25
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10283

作者: 了了    时间: 2012-1-19 14:39

这是诱导凋亡的流式图
我们称之为sample
0

图片附件: 51570500.snap.jpg (2012-1-19 14:39, 50.02 KB) / 该附件被下载次数 22
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10284

作者: 了了    时间: 2012-1-19 14:40

那么怎么看这两张图呢？？
首先，我们要知道各个参数的意义。这在流式原理中有介绍。
然后，我们要知道各个图之间的联系。大家看一下下面的图。
R1主要代表粘连细胞
R2主要代表G2/M期细胞
R3主要代表G0/G1期细胞
R4主要代表s期细胞
R5主要代表凋亡细胞
我说“主要”是因为大家可以看到设的gate后各个gate中的细胞有位置重叠。

图片附件: 90064363.snap.jpg (2012-1-19 14:40, 45.39 KB) / 该附件被下载次数 28
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10285

作者: 了了    时间: 2012-1-19 14:40


FL2-W/FL2-A和FL2-A/COUNT之间的关系。
这两张图的最大区别在于G0/G1期前面的亚G1峰。这个峰就是FL2-W/FL2-A图上的左下方的“小尾巴”，小尾巴越大，SUB-G1峰就越高。也就是说凋亡的越多。当然这需要跟整张图比较，就是选取mark后测量其gate％。

图片附件: 22478679.snap.jpg (2012-1-19 14:40, 53.87 KB) / 该附件被下载次数 24
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10286

作者: sunnyB    时间: 2012-1-19 14:44

我没有确定您指的是检测造血干细胞还是检测骨髓细胞。造血干细胞的检测主要是应用于临床骨髓移植的患者，造血干细胞需要经过动员，收集和分离才能得到。而骨髓细胞的检测主要临床用于白血病等疾病的诊断。
造血干细胞检测目前我们用的是美国BD公司的试剂盒和Procount配套软件，检测方法非常稳定。
流式细胞辅助白血病诊断和残留白血病检测，已有很多家单位在开展，还是不错的。
发帖子的同志尽量能说得详细一点，这样可能更有利于解决关键问题。
作者: ha111    时间: 2012-1-19 14:45

我要分析骨髓间充质干细胞的表面抗原，以分析我提纯的细胞是否有许多造血干细胞和成纤维细胞。请赐教！！
作者: 了了    时间: 2012-1-19 14:45     标题: 回复 #6 ha111 的帖子

骨髓间质干细胞的检测并不难，只要有荧光标记得抗体，操作非常容易，但是，对于骨髓间质干细胞的特异性标记我并不熟悉，请查找专业的文献，然后，按生产公司定购产品即可。如果您有间质干细胞的特异标记分子，别忘了回复帖子让大家共享，谢谢。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 14:46


研究新基因功能的同志请留意该方法。

表达EGFP的质粒和目的基因共转染用于检测目的基因对细胞周期的影响

在基因功能研究过程中，常常使用的一种方法就是将目的基因转到靶细胞内进行瞬时表达（transient expression），以流式细胞仪检测细胞周期的变化，观察转基因对细胞增殖的影响。由于各种转基因方法的不同，转基因的效率也不同，往往是仅有一部分细胞可以表达目的基因，没有转基因的细胞将影响检测的结果。如何将已经转基因的细胞同未转基因的细胞区分开来进行检测，是一个技术上的难点。常用的一种方法就是将表达绿色荧光蛋白的质粒和目的基因共转染；在共转染时，加入目的基因表达质粒的量远高于表达GFP质粒的量，以保证表达GFP基因的细胞能够表达目的基因。由于普通的GFP是表达于细胞胞浆内，在细胞周期检测过程中进行乙醇固定时，GFP会从胞内泄漏，造成无法区分转基因细胞和阴性细胞。解决的方法是在GFP蛋白的末端加入膜定位信号，使GFP定位表达于细胞膜或胞内膜上，这样可以大大减少处理过程中GFP的泄漏、丢失，从而可以有效地 区分转基因和未转基因细胞。我采用以下几种表达绿色荧光蛋白的载体：pBB14、pCMVEGFPspectrin、pEGFPN-1对这种方法进行了评价。
该文献将近期发表。
作者: 小糖块    时间: 2012-1-19 14:47

将GFP与目的基因融合表达，再结合流式细胞术，不仅可以衡量基因转染的效率，还可以用来分选表达GFP-目的基因的细胞，这使得筛选稳定表达的单克隆细胞系非常方便。
作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-19 14:49

请教高手：
流式与westen在检测蛋白表达方面各有什么优缺点？
流式可以检测在胞浆中表达的蛋白吗？敏感性怎么样？
操作上有什么特殊要求？
作者: 了了    时间: 2012-1-19 14:49

流式细胞仪当然可以检测细胞内蛋白，这一点，并不是很难，当然要比检测细胞表面抗原复杂些，好在都已经有现成的方法，不成问题。
不过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、免疫组化没有本质差别，但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用western（尤其是化学发光底物更佳）和免疫组化更好。当然，流式最大的一个特点就是，可以定量（百分比），如果是高表达的用流式细胞仪非常有优势。
流式检测时要求有抗体，可以是直接标记或简介标记的荧光抗体。细胞需要预先固定处理，常用的是多聚甲醛、TritoonX－100、75％乙醇等，具体步骤可参考相关文献，都有详细说明。
作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-19 14:50

我想检测细胞内的cyclinD及P14，P15，P16，P21等的表达，不知可行性如何？

多多交流，共同进步！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-19 14:50


请问流式可以检测活体莹光蛋白吗，细胞如何处理？
作者: 了了    时间: 2012-1-19 14:50


回复上面两位同志：

实验室曾经有人检测过cyclin以及P21，效果还行，不过细胞处理是别人做的，我建议你还是要读原版的操作步骤较好，毕竟我们有丁香园，可以找到相关的文献。

流式可以检测活体细胞的荧光，非常简单，只要消化成单个细胞就可以上机检测了。
不过要注意流式多是采用激光激发，对于荧光蛋白能否检测关键是其激发波长和检测波长必须流式仪装配才行，流式仪经常配的是488nm的激光器，我室的流式还有另外一个激光器，是630nm左右，所以可以检测的荧光分子会多一些。常用的绿色荧光蛋白检测采用的是488nm激发，530nm检测。至于其它的蛋白，我尚未检测过。只要弄清楚其激发波长（excitation wave length）和检测波长（emission wave length）即可。
我有一个各种荧光标记的激发波长（excitation wave length）和检测波长（emission wave length）的汇总表，我会发上来，其它需要进行流式检测的同志在选择公司给的各种各样标记的抗体时，可以按照其说明进行选择，千万不要到时候，买了抗体却不能检测，那才冤枉呢。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 14:51

荧光抗体标记的选择指南：

对于流式检测最初的一步就是选择何种方法，通常是何种荧光物 质标记的抗体。厂家根据需要开发了各种荧光标记的抗体，进行 选择时首先要满足的就是所选择的抗体必须在流式上能够检测， 各单位买的流式仪功能不完全一致，首先要和检测方进行联系， 看能否检测。在附表里我将常用的荧光标记物质的激发波长和检 测波长给出，可以参考。有几个原则一起说一下：
1 流式检测时首推荧光物质直接标记的抗体，如果没有直接标记 的抗体，用间接发，即二抗上标记荧光分子同样可以。不过这增 加了处理的难度，处理步骤增多，往往会不同程度影响检测结果 。
2 厂家推出的抗体有一些明确写明适合流式检测，而另一些则表 明适合免疫组化、western等，首选前者，可以保质保量，但是后 者并不是不可以用，一般来说如果没有明确的表明适合流式检测 的抗体，采用后者也是可以的，不过要注意其检测结果不一定非 常理想。
3 单抗和多抗均可应用。
4 绿色荧光蛋白等本身有荧光的物质在检测时会占据一个荧光通道，我也曾碰到几次有人将转了绿色荧光蛋白的细胞再采用FITC 标记的抗体来检测目的蛋白（据说还有人用此方法得出了满意的 结果！），岂不知绿色荧光蛋白和FITC是一个荧光通道，更本不 能一起检测。
5 如果是检测淋巴细胞这类细胞，经常用到多种抗体同时标记， 选择时切勿选错。我自己比较倾向于多重标记，因为这样可以减 少抗体和细胞用量，特别是对于小鼠的血标本，经常采到的血量 微少，采用多重标记更有利。当然这要求流式操作者有较高的水 平，注意调节流式仪的各种参数。
暂且只记得这麽多，如有新的发现，会及时补充。

图片附件: 51085--embed.jpg (2012-1-19 14:51, 202.61 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10288

作者: 园丁##    时间: 2012-1-19 14:52


非常感谢，我还有一个问题请教：
1、绿色荧光蛋白在转质粒后在细胞可以发光多久？
2、我打算做双标，那么两种一抗应如何加，是同时加还是做完一种以后再加另一种？
3、我要用转了绿色荧光蛋白的细胞来做另一种荧光检测，目的是进行两种荧光同时检测，会不会影响绿色荧光蛋白的检测，最好应如何处理，采用哪一种荧光抗体最好？我的检测对象为包浆蛋白？谢谢！
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-19 14:52


请问培养的JEG-3细胞成团块难以制备单细胞悬液有什么好的解决方法？
作者: 小糖块    时间: 2012-1-19 15:01

非常感谢，我还有一个问题请教：
1、绿色荧光蛋白在转质粒后在细胞可以发光多久？
2、我打算做双标，那么两种一抗应如何加，是同时加还是做完一种以后再加另一种？
3、我要用转了绿色荧光蛋白的细胞来做另一种荧光检测，目的是进行两种荧光同时检测，会不会影响绿色荧光蛋白的检测，最好应如何处理，采用哪一种荧光抗体最好？我的检测对象为包浆蛋白？谢谢！

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1. 绿色荧光蛋白GFP只要蛋白不降解,荧光不会萃灭.若做稳定表达,那就可以随时观察荧光,但做稳定表达时程很长;若做瞬时表达,在转染后48小时左右应该就有GFP表达,可以观察荧光.
2. 做荧光双标,一抗可以同时加,二抗也同时加.但是,两个一抗要不同种属来源,两个二抗用不同的荧光标记.比如说,第一个一抗为鼠抗A(单抗),第二个一抗为兔抗B;第一个二抗为抗鼠IgG(cy2标记,绿色荧光),第二个二抗为抗兔IgG(cy3标记,红色荧光).在荧光显微镜下观察时,可以在同一个视野分两次激发观察,并分别照相,再将两次照相叠加.这样可以在同一个细胞内,观察抗原A和抗原B的亚细胞定位.
3.用转了绿色荧光蛋白的细胞来做另一种荧光检测,不会有什么问题.最好用cy3标记的二抗去染另一种蛋白.因为绿色和红色的差别很分明,二者叠加又是黄色的信号.
我说的cy2标记的抗鼠IgG和cy3标记的抗兔IgG在KPL公司有买.
作者: 了了    时间: 2012-1-19 15:01

不知道你实验过何种方法。
我没有太多的经验，一般来说消化细胞先采用胰酶消化，如果不行，则考虑用胰酶和胶原酶合用，或者采用加入pronase、EDTA等，在经过一定的酶消化之后，一般来讲会得到较多的单个细胞，再用筛网过滤一下将成团的细胞去处，可以进行进一步的流式检测。
土人兄在上面发表了很好的帖子，不知在此方面有何高见。
欢迎各位有经验者发表高见。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-19 15:05

感谢！帮了我的大忙！请问你用tritc和绿色荧光做过双标吗？效果如何？
作者: 了了    时间: 2012-1-19 15:06

不用客气。
我没用过TRITC做过双标。它是发什么颜色的荧光？
做荧光染色一个关键的问题就是有的荧光素（如cy2）很容易萃灭，所以在其后的步骤中应尽量避光；染色完后尽早在荧光显微镜下观察并照相；荧光显微镜下观察时，室内也要关灯，并尽量减少在激发光下的照射时间。

想起一个问题——你是如schoman所说的那样，在转染了GFP的细胞中作除了GFP以外的另两种蛋白的免疫染色吗？
要是那样，就不能按我前面所说的那样，用绿色荧光做双标了，因为GFP也是绿色的。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-19 15:08


TRITC为红色荧光（罗丹明）。我已经注意到你提到的事（想起一个问题——你是如schoman所说的那样，在转染了GFP的细胞中作除了GFP以外的另两种蛋白的免疫染色吗？
要是那样，就不能按我前面所说的那样，用绿色荧光做双标了，因为GFP也是绿色的。） 但同样感谢你，非常的热心，应向你学习。
作者: vvmmoy    时间: 2012-1-19 15:08


请问哪位大侠知道如何以流式细胞仪检测细胞核内蛋白。上次问过BD公司的工程师，说需要将核膜打孔，不知有没有人做过？具体方法如何？效果怎样？
另外以流式细胞术怎样测定进行所需检测物质的定量研究？（不是做细胞亚群分析）
作者: 了了    时间: 2012-1-19 15:08

流式仪检测细胞核内蛋白我也没有检测过，但是应该是按照BD工程师所说进行固定穿孔，这种检测和细胞内蛋白的检测方法差别不大，应该是有现成的方法可以参考。
进行检测物质的定量最简单的方法就是统计检测蛋白的平均荧光强度。常用的流式检测统计方法：一个是阳性率，另外一个就是平均荧光强度，平均荧光强度是一种观测蛋白表达相对定量的简单常用方法。细胞表面表达的蛋白越多，其结合的荧光标记抗体越多，因此其平均荧光强度就越高。进行这种方法检测要求每次流式检测的机器条件要完全一致，并且整个试验过程不能拖得太长，因为随着时间的推移，即使前后使用的仪器条件完全一致，但是机器本身的效能也会改变。我曾经观察过，仪器经过半年时间其效能就要发生明显得改变，需要进行光路的调整。因此，最好整个试验过程不要超过半年，否则前后的可比性就较差了。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 15:10


这里提供几个流式细胞方法学的网站，关心流式检测的可以从中获取一些知识。
1 联科生物的流式网站cuturl('http://www.gotofcm.com/')
有很多试验操作步骤，可供大家参考。
2 美国BD公司的中文网站，国内流式的老大。
cuturl('http://www.bd.com/china/')
3 晶美生物
cuturl('http://www.jingmei.com/site/site/practice/practice.htm')
作者: 了了    时间: 2012-1-19 15:12

上面一个很长的幻灯片将其分成14部分，下载后，不知为啥自动加了一个前缀，请将其改为FLOW CYTOMETRY.part01、FLOW CYTOMETRY.part02、FLOW CYTOMETRY.part03。。。。。。等形式，即可以解压缩。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 15:12

关于流式细胞检测后的统计学处理

常常有人在检测完细胞后问我如何进行结果的问题。

常见的检测结果如有明确的分组和例数，例如有人检测患者在治疗前后淋巴细胞免疫分类的变化，如果各检测了50例，可以按照常规的统计学方法，如采用配对T检验进行统计处理。

常常见到的是另外一种情形，如有人检测一种药物或者转基因后对细胞周期的影响，或者某种物质对细胞一种蛋白表达的影响。像这一类实验，常常仅仅有实验细胞和对照细胞，在得出结果后，有人喜欢进行统计学处理，还有人不进行统计学处理，仅给出典型的流式检测图进行描述。两者都可以，但是要求是必需重复实验三次以上，否则，不可能进行统计学处理。对于后者，尽管不进行统计学处理。但是必需说明，重复多少次，结果基本一致。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-19 15:13

以下是群友在干细胞讨论组给我的答复，我贴过来与大家共享。
实际上人、大鼠的MSC具有许多相似的特点。
不表达分化相关的细胞标记如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及碱性磷酸酶或osteopontin,也不表达造血干细胞系的表面标志，如脂多糖受体CD14 、CD34 以及白细胞表面抗原CD45等。
但表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白。
在骨髓中同时存在MSC和MDSC（骨髓源基质细胞），都有贴壁性。他们的区别如下
MSC用密度1.073的Percoll梯度离心获得，MDSC用密度1.077的Ficoll-Paque梯度离心获得.
体外培养原代和一代的MDSC包括的细胞是非均质的，有造血干细胞和基质细胞。而原代和一代的MSC却是同质性的成纤维样细胞。MSC 和MDSC都表达SH2 和SB10，但MSC不表达CD14和CD45，而MDSC表达CD14和CD45，原代和一代的MDSC和MCS 都不表达CD34。

来源于脐血培养后出现的贴壁细胞有两种表型
1、破骨样细胞表达TRAP、CD45、CD51/CD61。
2、间充质样细胞表达SH2、SH3、SH4 ASMA、MAB1470、CD13、CD29、CD49e.这与骨髓MSC完全一致。
作者: 伊莎贝拉    时间: 2012-1-19 15:14

请问你的流式细胞技术幻灯下载后有多大，是4.2M吗？为什么14个rar文件逐个解压后是一样的？或许我做的不对，请指教。谢谢！
作者: 了了    时间: 2012-1-19 15:15


用WinRAR解压，直接解压第一个文件即可，不必逐个解压。
作者: whitesheep    时间: 2012-1-19 15:16

为什么不能解压缩？也改了前缀，但是他还是提示要压缩卷。
作者: duoduo    时间: 2012-1-19 15:17

请问哪位大侠知道如何以流式细胞仪检测细胞核内蛋白。上次问过BD公司的工程师，说需要将核膜打孔，不知有没有人做过？具体方法如何？效果怎样？
另外以流式细胞术怎样测定进行所需检测物质的定量研究？（不是做细胞亚群分析）
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如果你检测的是胞内分泌性蛋白（如细胞因子），应在细胞培养过程中加入莫能霉素，以阻断细胞因子的分泌；收获细胞后以4％多聚甲醛固定20min，加入0.1Triton X-100破膜10min，以后步骤与检测膜表面分子相同。也可采用皂素进行破膜。
作者: baidukk    时间: 2012-1-19 15:18


我近期也要做流式细胞仪，但是同实验室没有人做过，所以这方面的经验比较少，看了这里发的帖子以后明白了许多，请问细胞固定后怎么保存呢？可以保存多少天呢？因为做time course的时候不能同时收集那么多的samples，而且要排队才能做上。
多谢啦，先！
作者: yychen    时间: 2012-1-19 15:18

大家好！我用流式检测血小板活化标志物----CD62p以及MPA（血小板-单核细胞聚合物）。
   
我查阅不少资料，总结全血法双标测血小板活化的步骤如下，请您指正！
1，采血抗凝，血液以9：1与抗凝剂（3.8％枸橼酸钠）混合；
2，等体积多聚甲醛固定（终浓度1％），室温孵育10－15min；
3，PBS洗涤一次（2000rpm×5min)；
3，取试管2只，均加入5ul 全血和100ul BSA－PBS缓冲液；
4，标本管加入10ul CD62p－FITC以及10ul CD42b－PE，对照管加入10ul IgG1－FITC以及10ul CD42b－PE，室温避光孵育30min；
5，加1ml PBS，上机检测。
6，用CD42b表达量和侧向散射光（SSC）设门来选定血小板；
7，做对照管，调节阳性区的假阳性率为1－2％；
8，做标本管，得出CD62p的平均荧光强度，及CD62p的阳性百分率。

而今问题是：
1，洗涤时用全血还是静置后上清？如果后者，与富血小板血浆法有何区别？
2，CD42b阳性率不高，它可否作为血小板设门的抗体？我知道常用的有CD41和CD61。
3，先标记后固定的标本可保留几天检测？

烦请各位赐教！谢谢！切切为盼！
作者: 了了    时间: 2012-1-19 15:19

回复：
我近期也要做流式细胞仪，但是同实验室没有人做过，所以这方面的经验比较少，看了这里发的帖子以后明白了许多，请问细胞固定后怎么保存呢？可以保存多少天呢？因为做time course的时候不能同时收集那么多的samples，而且要排队才能做上.

       一般来讲，实验是观察不同时间点对细胞的影响，我的建议是先作时间最长的点，依次递减。譬如：观察药物作用12h、8h、4h、2h对靶细胞的影响。可以同时培养细胞，12h的药物先加入培养细胞中，过4个小时后，加入药物预定观察8h的细胞，再过4h加入到预定观察4h的细胞中，再过2小时，加入药物到2h组。这样，可以同时收集各个时间点的细胞，同时处理上机检测，避免了细胞固定或者多次检测 的麻烦。
一般来讲，固定的细胞或多或少对检测有一定影响，我比较推崇采用新鲜细胞进行检测。所以我建议还是采用上述方法，同时检测，这样的结果会更好。
在我们实验室，我曾经多次回答类似的问题，希望其它想进行不同时间检测的同道采用这种方法。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 15:22


回复：

而今问题是：
1，洗涤时用全血还是静置后上清？如果后者，与富血小板血浆法有何区别？
2，CD42b阳性率不高，它可否作为血小板设门的抗体？我知道常用的有CD41和CD61。
3，先标记后固定的标本可保留几天检测？


流式细胞仪设门区分血小板最简单的方法是采用FSC和SSC，当然采用CD42、41、61都可以，但是如果为了设门还要再买一个抗体似乎并不合算，而且多个抗体同时加入增加了检测的难度。一般来讲采用采用FSC和SSC来区分血小板是能满足需要的，当然采用抗体标记更准确。由于采用FSC和SSC设门可以有效的区分血小板和红细胞，所以采用全血或者分离富集血小板并没有太大差异。

另外，在加入抗体后最好用PBS洗涤一次，这样可以去除非特异性结合。

我没有对固定的血小板进行保留天数的观察，原则上还是新鲜标本，早做早好，一般来讲固定72h还是效果不错的。你可以在检测时比较一下，如果新鲜标本和固定72h或者更长时间没有明显差异就可以。
血小板活化受多种因素影响，一般在抽血后血小板一旦暴露到空气中即会活化，所以，我提醒你在抽血后尽早处理标本，否则抽血后到处理的时间长短很可能影响实验结果。具体事项可以参考相关文献。
作者: TAT    时间: 2012-1-19 15:22

我想把血管外膜上的神经细胞在荧光标记后用流式细胞仪单独分选出来，然后再用Westen immunoblotting方法测定蛋白含量（因为这种蛋白平滑肌细胞也有），这种方法是否可行？
作者: 了了    时间: 2012-1-19 15:24


我想把血管外膜上的神经细胞在荧光标记后用流式细胞仪单独分选出来，然后再用Westen immunoblotting方法测定蛋白含量（因为这种蛋白平滑肌细胞也有），这种方法是否可行？
理论上没有问题。但是有几点必须要注意：
1 要将血管外膜作成单个细胞，因为流式细胞仪检测的是细胞。
2 必须找到血管外膜细胞和平滑肌细胞的理想区分标记：抗体，这种抗体必须是血管外膜特异的。
3 流式细胞仪的分选成本较高。
4 流式细胞仪的分选纯度在95%左右，是不是少量混入的细胞（低于5%）会对检测有影响。
作者: 白白的    时间: 2012-1-19 15:25


关于血小板，每次检测全血标本时都需阴性对照的意义何在？
如何读出标本管的阳性率？是否先读对照管，控制阳性率1－2％？
作者: 铜雀    时间: 2012-1-19 15:27


没错，检测是首先要确定阴性对照，一般来讲采用同型对照抗体，设定阴性对照的“阳性率”不能超过1%较好，但是没有必要每次都要作同型对照。一般来讲，进行比较的是实验各组之间的差异，与阴性对照的关系可能并不是很大。而且血小板大多数是比较的荧光强度。
作者: glass    时间: 2012-1-19 16:07

我的实验需要检测人内皮细胞表面的黏附分子ICAM-1、VCAM-1。今天跑了一家医院的细胞仪实验室，由于他们没有这种抗体而未能完成我的实验，自己购买这种抗体价格比较贵，而且肯定用不完。不知你处是否有这种抗体。有没有可能我去你处完成我的实验？
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-19 16:08

我现有的问题是CD62p的阳性率表达过高。通常文献急性心梗组10－20％，而我的数据可达50－60％。是否为体外激活所致？请教应该如何改进？
作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:08

很抱歉，我这里只有鼠的ICAM-1和VCAM；人的只有ICAM，没有VCAM。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:08

血小板检测时确实应注意活化问题，你可以参照我前面一个帖子里检测血小板方法的附件。我提示一下：
1 每次取血的时间和过程尽量一致
2 每次的处理也要尽量一致。
3 取病人血时，同时取一个正常人，同样条件处理，如果正常人也活化非常多，可能是人为所致，否则，说明方法没问题。
作者: TNT    时间: 2012-1-19 16:09

请问我要测细胞内细胞因子分泌的情况。要注意些什么问题？我上次做的时候，发现表达率都很低。是不是因为打孔的问题？有什么指标能检验打孔的效率吗？另外，固定的时候用多聚甲醛和甲醛有什么区别吗？
作者: 蒲公英    时间: 2012-1-19 16:10

楼上的大虾：

请问作红细胞表面CD分子的流式检测

须注意哪些方面？

包括红细胞的分离，固定，离心速度等等！！

谢谢！
作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:10

红细胞我曾经检测过多种分子，方法简单，采用FSC和SSC设门可以区分红细胞。
一般采用直接标记的抗体可以取得较好的检测结果，操作不难。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:10

1,散点图经常被划分成四个象限，如何根据X，Y轴来解释结果
2,亚二倍体是不是调亡的标志，有时峰值图上出现八倍体说明是什么现象
回复：
1 散点图根据 x、y轴分为四个象限，分别表示为UL（上左）、UR（上右）、LL（下左）、LR（下右）。UL区为Y轴阳性细胞，LR为X轴阳性细胞，LL是双阴性细胞，UR是双阳性细胞。
2 八倍体很少见，一种情况是确实存在，如肿瘤细胞等。令一种情况是细胞聚集在一起的细胞团，后者流式可以区分。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:11

我上面提到进行流式细胞内检测的一篇文章。这里进行一下评论。
看着这样一篇发表在中华风湿病上的文章，我真的感到很诧异。
这里我将作者的检测结果的一副图摘录下来，前面我提到采用散点图根据 x、y轴分为四个象限，分别表示为UL（上左）、UR（上右）、LL（下左）、LR（下右）。UL区为Y轴阳性细胞，LR为X轴阳性细胞，LL是双阴性细胞，UR是双阳性细胞。
有眼力的同志很容易看出在这样的图上很难区分X轴Y轴上的阴性、阳性细胞。
根据我的经验判断，这种结果表明作者在刺激时PMA根本就没有作用，因为一般来讲，PMA刺激其IFN是应该明显升高的，而作者的图上显示，根本没有明显升高，可以比较一下我的附图，我不明白流式检测时到底是如何来定阴性标准的。
这样的结果，实在不太好。

图片附件: 88423-2-embed.jpg (2012-1-19 16:11, 13.56 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10289

作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:11


既然上面我再次提到了细胞内因子的检测。我就继续述评一下，希望对准备进行细胞内细胞因子检测的站友有所帮助。
细胞内因子的检测牵涉到细胞培养、细胞固定、细胞穿孔多个环节，需要小心操作，好在有现成的试剂盒和Protocol可以参考，我感觉，只要选用好的试剂和抗体，还是能取得较好的检测结果的。
这里我要声明一点，国内发表的采用PMA和离子霉素刺激后来检测Th1和Th2的结果，我私下认为大多数结果是不可靠的，最主要的原因就是因为采用CD4标记Th细胞，然后采用CD4设门，无法准确的定量CD4阳性细胞。
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-1-19 16:12

我在做肿瘤细胞DNA倍体分析的时候，因为分析模式不同一种分析有，而另一种分析出来没有，遇到这样的问题该怎么办？
作者: @STAR@    时间: 2012-1-19 16:13



一般来讲，实验是观察不同时间点对细胞的影响，我的建议是先作时间最长的点，依次递减。譬如：观察药物作用12h、8h、4h、2h对靶细胞的影响。可以同时培养细胞，12h的药物先加入培养细胞中，过4个小时后，加入药物预定观察8h的细胞，再过4h加入到预定观察4h的细胞中，再过2小时，加入药物到2h组。这样，可以同时收集各个时间点的细胞，同时处理上机检测，避免了细胞固定或者多次检测 的麻烦。
一般来讲，固定的细胞或多或少对检测有一定影响，我比较推崇采用新鲜细胞进行检测。所以我建议还是采用上述方法，同时检测，这样的结果会更好。
在我们实验室，我曾经多次回答类似的问题，希望其它想进行不同时间检测的同道采用这种方法。
请教：观察药物作用12h、8h、4h、2h对靶细胞的影响。可以同时培养细胞，12h的药物先加入培养细胞中，过4个小时后，加入药物预定观察8h的细胞，那么4个小时后的细胞无论是细胞数还是细胞状态不是和4小时前的细胞不一样了吗？越到后面，细胞的起点不是差得更远了吗？细胞不在同一起点，能观察时效关系吗？
作者: caihong    时间: 2012-1-19 16:26


请问：流式细胞术能否检测结肠标本？我想测结肠肌间丛cajal间质细胞凋亡以及stem cell factor（SCF)含量。谢谢
作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:29

请问：流式细胞术能否检测结肠标本？我想测结肠肌间丛cajal间质细胞凋亡以及stem cell factor（SCF)含量。谢谢
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流式细胞术检测细胞是比较好的，组织必须进行酶消化等处理，使其成为单细胞，因此不论是何种组织作流式检测都存在这个问题，操作起来比较麻烦。另外，冻存的组织解冻后细胞很容易破碎，一般不再适宜进行流式检测。
结肠肌间丛cajal间质细胞位于结肠组织内，含量少，很难将其与其他细胞区分开来，因此单纯检测这种细胞比较困难。如果
凋亡检测可能不是很难，采用Tunel方法可以检测（免疫组化，有试剂盒），最关键的还是如何区分是结肠肌间丛cajal间质细胞的凋亡，还是其它细胞的凋亡。
stem cell factor（SCF)含量很少，检测比较困难，没有经验，觉得采用免疫组化可以试一下，或者干脆组织匀浆后进行Elisa检测。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:29

请教：观察药物作用12h、8h、4h、2h对靶细胞的影响。可以同时培养细胞，12h的药物先加入培养细胞中，过4个小时后，加入药物预定观察8h的细胞，那么4个小时后的细胞无论是细胞数还是细胞状态不是和4小时前的细胞不一样了吗？越到后面，细胞的起点不是差得更远了吗？细胞不在同一起点，能观察时效关系吗？
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其实即使你反向加入等到你收集的时候12小时的细胞肯定和4小时收集的细胞也不一样多。细胞的多少和生长状态对于实验结果可能会有影响。如果有影响，可以采用这种方法：传代时12h的细胞加入的多一些，8h、4h的细胞少一些，这样可以平衡一下。只要细胞是处于对数生长期，不要完全铺满造成接触抑制，我觉的一般是不会影响的。
作者: yes4    时间: 2012-1-19 16:30


我在观察白蛋白受体反义质粒的功能，用荧光显微镜可以判定细胞对白蛋白吞饮的确减少，但感觉主观性太强。请问能否直接用流氏细胞仪检测转染组与未转染组细胞对荧光标记白蛋白（FITC-HSA）摄取量的区别？若可以，标本怎样制备。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:31

回复：我在观察白蛋白受体反义质粒的功能，用荧光显微镜可以判定细胞对白蛋白吞饮的确减少，但感觉主观性太强。请问能否直接用流氏细胞仪检测转染组与未转染组细胞对荧光标记白蛋白（FITC-HSA）摄取量的区别？若可以，标本怎样制备。
采用流式检测自然可以非常准确的定量其吞饮的多少，但是我没有作过这方面的实验。但是FITC 标记白蛋白是不难的，有现成的荧光素标记试剂盒可以购买，跟标记抗体的方法一致，国内有很多标记抗体的文章可以参考。
有一点请注意：荧光标记后，会不会影响白蛋白与其受体的结合？
流式检测很简单：只需要荧光标记的白蛋白与转质粒的细胞共孵育后，洗涤未结合白蛋白。直接上流式检测。
cuturl('http://www.probes.com/handbook/boxes/0421.html')
该网页有荧光标记试剂盒。可能其它公司也有你用google搜：Fluorescent Protein Labeling kit会得到不少信息。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:31

小弟以前没接触过流式，有谁做过用流式细胞仪检测小鼠T细胞Fas、caspase8、3的吗？
急！
盼回复！
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Fas和FASL位于细胞表面，采用FITC 等荧光素直接标记的抗体检测非常容易。可以直接向代理商 订购抗体。
CAspase 8和3位于细胞内，细胞需要进行固定穿孔，常用的固定穿孔剂有Pharmingen公司和Caltech公司的产品，国内分别是基因公司和联科公司代理。可以向他们订购。Pharmingen公司还提供caspase的整套流式检测试剂盒，检测效果要好于自己建立的方法，推荐采用整套试剂盒。
对于单参数的检测一般采用直方图而不是散点图，分析其阳性率和平均荧光强度。
作者: yes4    时间: 2012-1-19 16:35

我已经买了FITC-HSA（SIGAMA），但是我的细胞用胰酶＋EDTA消化后很难制成单细胞悬液，请问有其他好的办法解决这个问题吗？
作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:49


胰酶不行，那就试一下胶原酶吧。胶原酶是用来消化组织的能力较强。
另外一个就是Proanse，也可以试一下。
作者: 了了    时间: 2012-1-19 16:50

我的课题经费有限,大概得控制在2500以内,老板没钱又什么事都不管,感觉我就是个没人要,没人爱的孩子.
目前我打算做有关血小板活化的课题.打算买CD62P-FITC请问是否可行.
1.实验用的鞘液是否需要购买?
2.如果我要用FITC,是否需要先打听学校的仪器支持这种标记否?
3.有文献说最后要调节细胞浓度为1×10的7次方,如何调节?

万分感谢!

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1 买CD62P-FITC应该可行。
2 实验用的鞘液无需购买，用蒸馏水替代没问题。
3 没听说流式不能检测FITC的，检测应该没问题。
4 加入的抗体标记的细胞（指血小板）不能超过10的7次方。这个简单，用血球计数仪技术一下即可。我推荐你每个检测用的量不要超过10UL，应该可以。
5 我最近的总结发现，检测血小板受的干扰很大，最重要的问题是如何设门区分血小板，因为血小板小，和杂质分部开，这个问题最好的解决办法是另外加入一个血小板标记抗体，如：CD41或者CD61。采用双标记法，即另外加入一个CD41的抗体，如：PE标记的CD41。
6 另外血小板活化检测受很多影响，要求实验条件尽量一致。
作者: duoduo    时间: 2012-1-19 16:51


有人说可以用流式分选处于不同时期的细胞，可能吗？哪里能够做？
作者: 831226    时间: 2012-1-19 16:51

听说可以用流式分选处于不同时期的细胞，哪里可以做？效果如何？
作者: 中国特色    时间: 2012-1-20 08:21

刚提到过TUNEL，我最近恰好也要做TUNEL和PI 双染，但由于试剂盒比较贵，所以希望能尽量减少由于摸条件造成的浪费。根据文献和KIT 上提供的PROTOCOL，似乎要准备5个对照样品。分别是：1：cell only 2: untreated cells + lable and enzyme 3: cells+lable without enzyme 4: cells +DNase + lable and enzyme 5: cells +PI without lable and enzyme. 这里请教schoman学长，它们分别代表什么呢？一定要做吗？多谢了，先！
作者: 了了    时间: 2012-1-20 08:22

我做糖尿病血管病发症和血小板活化的课题,设计的实验步骤如下,请指正:
1.采空腹静脉血2ml,按9:1用3.8%枸橼酸钠抗凝,混匀
2.加2ml 1%多聚甲醛固定20min
3.PBS洗涤1次,2000rpm×5min;去上清
4.用1ml PBS重悬细胞成分 (含血小板2~6×107)
5.标本管和对照管中各加5ul全血和PBS缓冲液100ul;(含血小板1~3×105)
6.标本管中加10ul CD2P-FITC,对照管中加10ul IgG1-FITC,室温,避光孵育30min;
7.用PBS洗一次, 2000rpm×5min
8.加300ul PBS;
9.上机检测,用FSC和SSC设门选定血小板;
10做对照管,调节假阳性率为1-2%
11做标本管,得出CD62P平均荧光强度及阳性百分率
作者: 二丫头466    时间: 2012-1-20 08:22


请问，待检标本固定或不固定，结果有多大影响？
作者: 生物迷    时间: 2012-1-20 08:29     标题: 回复 #65 了了 的帖子

我觉得可以。请注意以下几点：
实际上使用的血非常少，可以减少取血的量。
采血
EDTA抗凝采血（枸橼酸抗凝不是很合适。），取后段血。因前段血中可能有组织液存在，造成人为血小板活化。
作者: 了了    时间: 2012-1-20 08:30

请问，待检标本固定或不固定，结果有多大影响？
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标本固定后由于固定剂的影响，可能会干扰抗体与抗原的结合。这种影响受使用的固定剂不同，影响也不一样。具体所受的影响不同的抗原和抗体并不相同。常使用的多聚甲醛比较温和，影响较小。
所以新鲜的标本更容易检测到抗原。但是固定后可以延长标本的保存，所以还是很有用处。
作者: 了了    时间: 2012-1-20 08:31

国内一些免疫学相关的书中提到一些原理等，但是流式也不容易很快理解。建议你找当地操作流式的人实际了解以下再看些资料可能更好。
作者: 了了    时间: 2012-1-20 08:34

刚提到过TUNEL，我最近恰好也要做TUNEL和PI 双染，但由于试剂盒比较贵，所以希望能尽量减少由于摸条件造成的浪费。根据文献和KIT 上提供的PROTOCOL，似乎要准备5个对照样品。分别是：1：cell only 2: untreated cells + lable and enzyme 3: cells+lable without enzyme 4: cells +DNase + lable and enzyme 5: cells +PI without lable and enzyme. 这里请教schoman学长，它们分别代表什么呢？一定要做吗？多谢了，先！
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Tunel试剂盒采用流式检测并不容易，我曾经进行一些实验，但遗憾的是没有得到很满意的结果。所以我感觉流式方法检测难度还是不小，因此我觉得还是严格按试剂盒操作步骤进行为好。
另外你提到的是Roche公司的碱性磷酸酶试剂盒，我感觉该试剂盒主要是用于组化的方法，免疫荧光或流式可能会因为检测敏感度较低而受影响，组化方法由于采用Ap放大系统，比较容易检测，但是其缺点是不能准确定量凋亡细胞的百分比。
在试剂盒中并没有要求做你上述的对照，我觉得还是作一下更好。
1 单纯细胞对照
2 未诱导凋亡细胞进行标记和加入酶（我觉得这里enzyme指TdT酶）
3 细胞进行标记但不加入酶
4 细胞加入DNAase是为了诱导明显的凋亡，应该是作阳性对照。
5 单纯PI染色，这是设对照用。
作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-20 08:41

我现在完全理解了。而且我今天做了一次，但是正象你说的，效果很差，FITC几乎没有信号，奇怪的是显微镜底下也没有显色，我怀疑是哪个步骤出了问题，我会再对照说明分析一下。不管怎么样，还需重复一次。
作者: tianmei001    时间: 2012-1-20 08:42

我还有如下问题
1.步骤3和7离心后是否都应该弃上清,而留下层细胞成分,再用PBS重悬细胞
2.上机时血小板浓度调到多少适宜.
3.抗凝全血用800rpm离心得到的上清为富含血小板的血浆,而用2000rpm离心得到的是无血小板的血浆,血小板被沉在下层,和细胞混在一起,这种说法对吗?
4,多大的离心转速会破坏红细胞和白细胞,如果细胞被破坏细胞碎片会干扰血小板设门吗?

请赐教！ 谢谢！
作者: 了了    时间: 2012-1-20 08:42



QUOTE:
原帖由 tianmei001 于 2012-1-20 08:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我还有如下问题
1.步骤3和7离心后是否都应该弃上清,而留下层细胞成分,再用PBS重悬细胞
2.上机时血小板浓度调到多少适宜.
3.抗凝全血用800rpm离心得到的上清为富含血小板的血浆,而用2000rpm离心得到的是无血小板的 ...

1 是的
2 浓度以流式检测的细胞速度低于3000/秒合适。
3 基本正确。
4 一般3000转不会破坏。
作者: 了了    时间: 2012-1-20 08:42

听说可以用流式分选处于不同时期的细胞，哪里可以做？效果如何？
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当然可以，只要方法适当，其分离效果甚至要好于磁珠分离系统。
流式分选需大型的机器，如BD公司的FACAS vantage型号。
作者: 缘yuan    时间: 2012-1-20 08:43


请问了了，对于空白对照标本平均荧光强度应该怎样设定？
作者: tianmei001    时间: 2012-1-20 08:44

       再次向您请教!
       我想一次上机操作多收集些病人血样,所以想存放一下标本.您看应该采取下列哪个方案:
        1. 全血--固定--4℃存放多长时间--加抗体
        2.全血--固定--加抗体--4℃存放多长时间(4℃温度是否合适?)
        或请您推荐一种方法.
作者: greenbee    时间: 2012-1-20 08:46     标题: 回复 #76 tianmei001 的帖子

第二种方法标本可保留3天。第一种方法如果采用富血小板血浆检测，有关资料提及可存放5天。建议你自己试几管。
了了前辈，您的意思如何？
作者: moonlight45    时间: 2012-1-20 10:34

我还真得请你帮我分析分析，因为进展不顺。我这两天同时做了两种条件下的染色，一种是细胞种在coverslip上，然后加上反应混合物（lable+enzyme)，用于显微镜观察；另一种是把细胞用Trypsin收集下来，然后加入反应混合物,用于做流式。其步骤包括固定（4%paraformaldehyde at RT for 1hr) 和permeablization（0.2%TritonX-100 on ice for 3 min) 然后加混合物 （50ul at 37C for 1hr in dark)基本上是一样的，但是奇怪的是，在coverslip上做出来的信号非常强，而把细胞收集下来的在显微镜底下几乎没有特异性的信号，这样子的肯定也做不了流式了。不知道是为什么？
   
作者: 了了    时间: 2012-1-20 10:34

对于空白对照标本平均荧光强度应该怎样设定？
-------------------------------------------------------------------------
这个没有特殊要求，一般对照只要不太高就可以了。
作者: 了了    时间: 2012-1-20 10:34



QUOTE:
原帖由 moonlight45 于 2012-1-20 10:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我还真得请你帮我分析分析，因为进展不顺。我这两天同时做了两种条件下的染色，一种是细胞种在coverslip上，然后加上反应混合物（lable+enzyme)，用于显微镜观察；另一种是把细胞用Trypsin收集下来，然后加入反应混合物,用于做流式 ...

我不知道你做：“一种是细胞种在coverslip上，然后加上反应混合物（lable+enzyme)，用于显微镜观察；”时有没有设对照，如果设对照，且对照没有显色，我觉得是可行的，如果没有设对照，必须考虑到是不是非特异反应。
你在多摸索一下试验条件吧。
祝成功。
作者: 了了    时间: 2012-1-20 10:35

再次向您请教!
       我想一次上机操作多收集些病人血样,所以想存放一下标本.您看应该采取下列哪个方案:
         
       1. 全血--固定--4℃存放多长时间--加抗体
        2.全血--固定--加抗体--4℃存放多长时间(4℃温度是否合适?)
      或请您推荐一种方法.


第二种方法标本可保留3天。第一种方法如果采用富血小板血浆检测，有关资料提及可存放5天。建议你自己试几管。
了了前辈，您的意思如何？
--------------------------------------------------------------------------
没有做过具体试验，文献报道可能是这样的。
作者: 气泡    时间: 2012-1-20 10:37

我的细胞经70%乙醇固定，-70度保存两周后，发现固定细胞已结冰，请问对细胞周期和凋亡分析有无影响？
作者: mickeylin    时间: 2012-1-20 10:38

小弟正准备做FCM，有几处不明，想向您请教：
1.培养细胞的固定方法各家报道不一，有的用甲醇，有的用乙醇，还有的用甲醛等，我想知道一般应该用什么固定，固定多少时间？
2.我看文献上经常用PI和RNAase A来复染细胞核，请问二者各是什么作用，为什么有些不用复染？
3.要是做免疫荧光化学，增加细胞膜的通透性用Triton-X-100还是soponin好呢？
不好意思，问您这么多问题，先多谢了！
作者: 了了    时间: 2012-1-20 10:39

我的细胞经70%乙醇固定，-70度保存两周后，发现固定细胞已结冰，请问对细胞周期和凋亡分析有无影响？
---------------------------------------------------------------------
只要细胞没有明显破坏，影响不大，是可以的。
作者: 了了    时间: 2012-1-20 10:39

小弟正准备做FCM，有几处不明，想向您请教：
1.培养细胞的固定方法各家报道不一，有的用甲醇，有的用乙醇，还有的用甲醛等，我想知道一般应该用什么固定，固定多少时间？
2.我看文献上经常用PI和RNAase A来复染细胞核，请问二者各是什么作用，为什么有些不用复染？
3.要是做免疫荧光化学，增加细胞膜的通透性用Triton-X-100还是soponin好呢？
不好意思，问您这么多问题，先多谢了！

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多聚甲醛的的固定相对温和，用1-4%左右的常用，一般固定至少10min，我有时用1%的多聚甲醛一直固定直到使用。
75%乙醇常用于细胞周期染色的固定，甲醇用的相对较少，我记得戊二醛也是固定剂，但详细的区别，我说不太清楚。
PI染色是用于细胞周期的分析，75%]的乙醇固定细胞后，通常置于4℃保存，固定的目的是在于细胞穿孔，PI进入细胞内对DNA进行染色，细胞周期的分析是根据各个期的细胞含DNA多少进行确定的。简单的说就是G2M期的DNA含量是G0G1期的两倍，而S期介于两者之间。由于RNA同样会被PI染色会干扰检测，所以要加入RNA酶以去除RNA。我认为不用复染是错误的 ，或者说是不准确的。
免疫荧光化学染色我两者都曾进行实验，感觉都可行，文献说soponin的固定穿孔作用相对温和，对抗原抗体的影响小，因而常用。
作者: sunnyB    时间: 2012-1-20 10:40

我的实验是用egfp+目的基因（增强型绿色荧光蛋白和别的基因的融合蛋白，发亮绿色）转染神经干细胞，检测转染egfp+目的基因的神经干细胞分化为神经元的比例。我采用nse（神经元特异抗体）和罗丹明标记，之后计划上流式，行两种标记均为阳性的细胞检测，同时检测绿色细胞的百分率和红色细胞的百分率，可行吗，该采用哪种模式？
非常感谢！很着急，马上要答辩了，实验结果一直不理想，请您一定帮我这个忙！
作者: 了了    时间: 2012-1-20 10:45     标题: 回复 #86 sunnyB 的帖子

转染egfp的细胞占用了一个荧光通道，nse只能采用PE或其它标记的抗体（FITC标记不行）。不知你加入罗丹明有什么用处？
作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-20 10:46

我最近使用流式检测细胞上一种抗原的表达，结果不是很好。有同学说，因为流式太灵敏，无法区分高/低的抗原表达，只要是有，哪怕是一点点抗原存在，就和正常的抗原表达是一样。因为我不是很懂，请指教
作者: 了了    时间: 2012-1-20 10:46



QUOTE:
原帖由 笑弯了腰 于 2012-1-20 10:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我最近使用流式检测细胞上一种抗原的表达，结果不是很好。有同学说，因为流式太灵敏，无法区分高/低的抗原表达，只要是有，哪怕是一点点抗原存在，就和正常的抗原表达是一样。因为我不是很懂，请指教 ...

这种说法是错误的。
作者: 小螺号    时间: 2012-1-20 10:47


我在做HELA细胞的thymidine双阻断同步化,准备用流式检测细胞周期,为什么我送检的细胞总是碎的特别多,有没有哪位大侠指点一下如何收细胞?谢谢
作者: 社会主义好    时间: 2012-1-20 10:48

请教几个关于流式结果的问题！
1，每次检测同一种细胞膜表面糖蛋白（比如血小板表面CD62p），FSC、SSC、FL1及FL2通道的voltage和gain不变，对否？
2，每批标本可能存在处理差异，是否gate可以稍微移动一下范围和位置？是指批之间gate可否不同。
3，分析直方图时每个标本的mark是否都需一致，抑或同一标本来源（包括对照管和标本管）mark一致即可？如果是前者，那么isotype的意义何在？如果是后者，MFI差异岂不很大？
4，了了学长，您做过CD62p的流式检测吗？望告知结果。
作者: 社会主义好    时间: 2012-1-20 10:48

还有一个问题：我要订购一种荧光标记的试剂，有0.2mg和2mg两种，我不知道做流式 ，前一种够不够用，是sigma的lectin. 用老美的钞票买，真是心疼。
作者: 了了    时间: 2012-1-20 10:49



QUOTE:
原帖由 社会主义好 于 2012-1-20 10:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
还有一个问题：我要订购一种荧光标记的试剂，有0.2mg和2mg两种，我不知道做流式 ，前一种够不够用，是sigma的lectin. 用老美的钞票买，真是心疼。

国外的抗体一般0.2mg可以检测100份。
作者: 了了    时间: 2012-1-20 10:50



QUOTE:
原帖由 小螺号 于 2012-1-20 10:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我在做HELA细胞的thymidine双阻断同步化,准备用流式检测细胞周期,为什么我送检的细胞总是碎的特别多,有没有哪位大侠指点一下如何收细胞?谢谢

我觉得不是收集细胞的问题，可能是同步化处理过头了，可以尝试时间和剂量减低后的条件。
作者: 了了    时间: 2012-1-20 10:50



QUOTE:
原帖由 社会主义好 于 2012-1-20 10:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教几个关于流式结果的问题！
1，每次检测同一种细胞膜表面糖蛋白（比如血小板表面CD62p），FSC、SSC、FL1及FL2通道的voltage和gain不变，对否？
2，每批标本可能存在处理差异，是否gate可以稍微移动一下范围和位置？是指批之间gate可 ...

1 流式检测后的条件一旦确定，是不应该改变的。
2 gate是可以移动，但是如果没有必要，建议还是不要移动。这样实验的可比性更好。
3 分析直方图时每个标本的mark原则上是应该一致的，但也不排除少数情况需要调整，这主要是看同型对照的位置，假如同型对照的位置发生明显的偏离，说明则需要调整mark的位置，否则，为了前后一致，还是保持一致。
做得太多，我已经记不清楚CD62P的结果了。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-20 10:51

我在做HELA细胞的thymidine双阻断同步化,准备用流式检测细胞周期,为什么我送检的细胞总是碎的特别多,有没有哪位大侠指点一下如何收细胞?谢谢

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我们实验室也有用thymidine双阻断的方法（2mM thymidine for 18hrs, then release for 8hrs, then 2mM thymidine again for 18hrs)来同步细胞，但是好象效率很低，一般同步到M phase的细胞只有30~40%左右，不知了了朋友的结果怎样？
作者: 气泡    时间: 2012-1-20 10:51

isotype是阴性对照还是同型对照呢?两者有何区别?
作者: 了了    时间: 2012-1-20 10:53     标题: 回复 #97 气泡 的帖子

isotype是同型对照，主要用于检测抗体的结合。
阴性对照是实验设置的阴性标本，即不表达该抗原的实验标本。
由于阴性对照和同型对照的流式检测结果很接近，有时可以以同型对照来代替阴性对照。
作者: 穿越时空    时间: 2012-1-20 10:54

您好！我们实验室刚买一流式细胞仪，实验室的老师是一窍不通。当然自己也是。请问流式测细胞周期需要买什么试剂，我在文献上看有人用溴化丙啶（PI）。不知道做流式时需不需要调节浓度，还是直接用买来的试剂。另外，恶性转化的细胞与正常细胞在细胞周期上有何不同表现？谢谢！
作者: windy+++    时间: 2012-1-20 12:14

是呀，我作的方法和你们实验室的方法基本一样（2mM thymidine）很多文献的方法都是这样呀，我的结果压很差，而且处理后细胞状态特别不好，我打算改进方法，请问你们实验室有比较成熟的方法吗
作者: 了了    时间: 2012-1-20 15:18

您好！我们实验室刚买一流式细胞仪，实验室的老师是一窍不通。当然自己也是。请问流式测细胞周期需要买什么试剂，我在文献上看有人用溴化丙啶（PI）。不知道做流式时需不需要调节浓度，还是直接用买来的试剂。另外，恶性转化的细胞与正常细胞在细胞周期上有何不同表现？谢谢！

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检测细胞周期的最常见步骤：
以胰酶消化处理细胞，离心收集细胞后，以PBS重悬细胞，浓度为106个/ml。加入两倍体积在－20℃预冷的75％乙醇固定细胞1小时，以PBS洗涤细胞一次。加入含有50μg/ml的PI（碘化吡啶）和100μg/ml的无DNA酶污染的RNA酶（RNase A）PBS染色液，置4℃避光染色1小时。上机检测。
BD公司也提供周期检测试剂盒，但是价格较高。
恶性转化的细胞通常比正常细胞增殖快，或者细胞内DNA含量（染色体）有变化，这用流式检测很容易检测出。
作者: lixi559    时间: 2012-1-20 15:18

我们实验室还用Nocodazole（100ng/ml for 18hr)，只是同步化在M phase, 效果要比double thymidine高很多，如果有必要，你可以试一下。
作者: zhezhe    时间: 2012-1-20 15:19

我试了半个小时才明白SCHOMAN的附件解压的方法,真是惭愧.在3页有几位回帖也不会解压,才使我好受点.其实看看WINRAR的帮助就知道了.

在这我还想请教各位高手,我做了凋亡和细胞周期的检测,因为只有处理组和对照组,用统计学处理时,不知是否该用方差分析,还是用二项分布(OR泊松分布)进行统计???因为我每个组只做了3次重复,故用方差分析时没有显著性差异,但我做凋亡率用非方差分析则有显著性差异,是不是该用后者?
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 09:03

介绍一本新书，不能下载的留条

cuturl('http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/booktoc?ID=89011951')

Flow Cytometry: First Principles (Second Edition)

Published Online: 27 Dec 2001

Author: Alice Longobardi Givan

ISBN: 0471223948 (Electronic) 0471382248 (Print)
Copyright © 2001 by Wiley-Liss, Inc.



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i-xviii Frontmatter and Index
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 178K)
DOI 10.1002/0471223948.fmatter_indsub


Chapter 1:
1-9 The Past as Prologue
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 198K)
DOI 10.1002/0471223948.ch1


Chapter 2:
11-14 Setting the Scene
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 47K)
DOI 10.1002/0471223948.ch2


Chapter 3:
15-39 Instrumentation: Into the Black Box
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 458K)
DOI 10.1002/0471223948.ch3
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 09:03

Chapter 4:
41-57 Information: Harnessing the Data
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 451K)
DOI 10.1002/0471223948.ch4


Chapter 5:
59-80 Seeing the Light: Lasers, Fluorochromes, and Filters
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 374K)
DOI 10.1002/0471223948.ch5


Chapter 6:
81-113 Cells from Without: Leukocytes, Surface Proteins, and the Strategy of Gating
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 1115K)
DOI 10.1002/0471223948.ch6


Chapter 7:
115-122 Cells from Within: Intracellular Proteins
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 168K)
DOI 10.1002/0471223948.ch7


Chapter 8:
123-158 Cells from Within: DNA in Life and Death
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 709K)
DOI 10.1002/0471223948.ch8


Chapter 9:
159-174 The Sorting of Cells
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 200K)
DOI 10.1002/0471223948.ch9
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 09:04

Chapter 10:
175-194 Disease and Diagnosis: The Clinical Laboratory
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 427K)
DOI 10.1002/0471223948.ch10


Chapter 11:
195-223 Out of the Mainstream: Research Frontiers
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 559K)
DOI 10.1002/0471223948.ch11


Chapter 12:
225-228 Flowing On: The Future
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 56K)
DOI 10.1002/0471223948.ch12


229-233 General References
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 62K)
DOI 10.1002/0471223948.biblio


235-256 Glossary
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 131K)
DOI 10.1002/0471223948.gloss


257-261 Figure Credits
Alice Longobardi Givan
Summary PDF Full Text (Size: 107K)
DOI 10.1002/0471223948.credit
作者: 了了    时间: 2012-1-21 09:04

我试了半个小时才明白SCHOMAN的附件解压的方法,真是惭愧.在3页有几位回帖也不会解压,才使我好受点.其实看看WINRAR的帮助就知道了.

在这我还想请教各位高手,我做了凋亡和细胞周期的检测,因为只有处理组和对照组,用统计学处理时,不知是否该用方差分析,还是用二项分布(OR泊松分布)进行统计???因为我每个组只做了3次重复,故用方差分析时没有显著性差异,但我做凋亡率用非方差分析则有显著性差异,是不是该用后者???
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我觉得方差分析应该更好。不知你的具体结果如何？
作者: 大尾巴    时间: 2012-1-21 09:05

我想测结肠肌层某间质细胞数目，采用组织裂解后，特异性荧光抗体标记检测FCM可以吗？能否提供方法？谢谢。
作者: dog002    时间: 2012-1-21 09:05


我的结果是：对照组调亡率分别为3.46％，4.58％（对照只做了两次重复）；处理组有好几组，我就拿其中一个组的3个结果说吧，分别为6.98％，8.45％，7.48％；如果采用SPSS分析做样本均数的T检验则没有显著性差异；如果把这两个组分别计算平均率，再以计数的细胞数为样本例数作二项分布或泊松分布的正态U检验，则U值很大，有显著性差异。
请了了帮忙指正。

还有我的处理组和对照组比较，细胞于S,G2期多，G1期明显少于对照组，也就是说处理组细胞阻滞于S G2期，对吗？这多见吗？需要用统计说明吗？
作者: junhun    时间: 2012-1-21 09:06

用nocodazole处理后可以像用thymidine处理完那样培养一定时间后得到不同周期的细胞吗？我用nocodazole处理过一次，细胞状态也不是很好，我再实验一下。用双阻断处理后，细胞最初应该停在G1/s期，在这一点的效率怎么样呢？谢谢
作者: 兔唇    时间: 2012-1-21 09:07

请问各位前辈:
我单位准备买台BD的FACSCalibur作CD4 cell count, 选件(细胞分选系统/媒介机/SP-1血液预备)用处大不大,怎么选?
急用！
谢谢！
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-21 09:16


我用荧光质粒（pcdna3.1/GFP）转染细胞后，显微镜下观察转染效率还可以，于是上流式定量，结果却是和对照无明显差别，流式不是很敏感吗？不知和胰酶消化太久有没有关系（台盼蓝染色细胞基本均蓝染）？还有我的细胞数比较少，约10万？？初次接触流式，请多指教。
作者: 小野花    时间: 2012-1-21 09:16


请问各位高手：
流式检测胞浆蛋白时所需固定剂多聚甲醛和triton x－100如何配置是用PBS配吗？浓度多少？另外，破胞与破核膜有区别吗？
希望尽快得到指点，谢谢！
作者: yysr238    时间: 2012-1-21 09:22

非常感谢你对FCM的介绍，我以前没接触过FCM，但以后我的实验可能要用到它，因为我要做血小板活化的相关课题，我想知道CD62P、CD41/CD61、TPA1及其它一些反应血小板活化的指标的半衰期长短，但我找了很久也找不到，能帮我留心一下吗？
作者: yysr238    时间: 2012-1-21 09:23

介绍一本新书，不能下载的留条
cuturl('http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/booktoc?ID=89011951')
Flow Cytometry: First Principles (Second Edition)
Published Online: 27 Dec 2001
Author: Alice Longobardi Givan
ISBN: 0471223948 (Electronic) 0471382248 (Print)
Copyright © 2001 by Wiley-Liss, Inc.

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该书价格：
amazon.com $44.95
wileyeurope.com £30.50 /
作者: pengke1983    时间: 2012-1-21 09:23

各位大虾，请教一下流式细胞术鉴定大鼠骨髓间充质干细胞和其分别诱导为成骨、脂肪细胞的金标准?
作者: fei1226com    时间: 2012-1-21 09:24

我买了EBioscience 的FITC-CD62P试剂,上面无实验步骤,说明也不清,只有Applications tested: This lot of AK-4 has been pre-titrated and tested by flow cytometric analysis of human peripheral blood leukocytes and can be used at 20ul per million cells(100ul blood).
试剂2瓶共2ml(100T), 它的意思是不是20ul FITC 用于100ul 全血.
若我只用5ul 血标本是否可按比例少用些试剂.
作者: one    时间: 2012-1-21 09:24

请教了了老师，为什么要加RNA酶？还有我想给刺激后再看看细胞的周期，一般来讲，给刺激之前要用无血清的培养基培养静止细胞，加刺激时候也用无血清培养基，请问这样作会不会影响流式测出来的细胞周期？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-21 09:25

请问各位高手：
      流式检测胞浆蛋白时所需固定剂多聚甲醛和triton x－100如何配置是用PBS配吗？浓度多少？另外，破胞与破核膜有区别吗？
    希望尽快得到指点，谢谢！

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多聚甲醛配制见：
cuturl('http://www.jiansuo.net/cgi-bin/ut/topic_show.cgi?id=13978&h=1#52389')

triton X-100我一般先配成20%储存液：
用吸管或量筒取一定量的100% triton X-100，加入适量的水，50度水浴使其溶解，最后定容。
100% triton X-100很粘稠，用Tip是吸不准的，所以要用吸管或量筒量取。或者，把大Tip的尖头剪掉，也可以。
作者: jujuba    时间: 2012-1-21 09:29


我一开始看到这个专区就兴奋不已,因为我是临床的研究生,可是老板给了一个很基础的课题,要我从周围血液中分离出表面抗原为CD34阴性和阳性的细胞.现在我有几个问题想请教大虾:
1、国外的文章设计的是用CD34抗体包被的磁珠来分离细胞，然后用FACS计数，请问这个FACS（fluorescence activated cell sorter)是不是就是流式细胞细胞检测呢？如果不是有什么区别呢？
2、分离表达这种抗原的细胞如果用流式细胞仪的话，对于标本要做哪些处理呢？这个问题可能回答比较麻烦，有劳您了。
thank u very much!
作者: 了了    时间: 2012-1-21 09:30



QUOTE:
原帖由 jujuba 于 2012-1-21 09:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我一开始看到这个专区就兴奋不已,因为我是临床的研究生,可是老板给了一个很基础的课题,要我从周围血液中分离出表面抗原为CD34阴性和阳性的细胞.现在我有几个问题想请教大虾:
1、国外的文章设计的是用CD34抗体包被 ...

国内能进行流式分选的单位目前很少，因此，建议采用磁珠分选系统。磁珠可以直接购买使用，分离效果很好。
不过CD34干细胞的分选可不是简单的事情。你的试验设计要仔细考虑。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 09:30

[请教了了老师，为什么要加RNA酶？还有我想给刺激后再看看细胞的周期，一般来讲，，请问这样作会不会影响流式测出来的细胞周期？
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加入RNA酶是为了去除对DNA染色的影响。
无血清培养基对细胞增殖肯定有影响。你参照文献作不会有太大问题。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 09:31

我用荧光质粒（pcdna3.1/GFP）转染细胞后，显微镜下观察转染效率还可以，于是上流式定量，结果却是和对照无明显差别，流式不是很敏感吗？不知和胰酶消化太久有没有关系（台盼蓝染色细胞基本均蓝染）？还有我的细胞数比较少，约10万？？初次接触流式，请多指教。
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估计是检测条件不对，一般流式的阳性率要高于显微镜。
作者: wu11998866    时间: 2012-1-21 09:31

我现在需要分离单个核细胞中的T 、B淋巴细胞，一般的免疫学方法分离的效率不高，T淋巴细胞中还含有较多的B细胞，不能满足实验需要，所以，向了了兄请教，如果采用流式来分离，其效率有多高？操作是否简单？需要准备什么？
      多谢了！
作者: ffooll    时间: 2012-1-21 09:32


可否赐教该是怎样的检测条件？由于自己不是“主刀”，可以向“主刀”提出什么样的要求呢？我自己估计的转染效率大约也只有10％，流式应该可以给我这个结果吧？ 谢谢了了
作者: baidukk    时间: 2012-1-21 09:33


我做分选后的细胞周期检测，结果很奇怪，请帮忙分析一下，谢谢

图片附件: 132090-ResizeofResizeofMSCCYTOMETRYpart-embed (1).jpg (2012-1-21 09:33, 30.61 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10291

作者: junjie05    时间: 2012-1-21 09:33

请问了了，
1。在用流式细胞仪检测细胞周期的时候，是否每次都需要用CEN和CTN进行质控？能否不进行质控，直接用PI染色进行鉴定？
2。如果要检测经过转染后的鼠细胞是否恶性变，此时是否要用鼠的血液单个核细胞作为正常二倍体细胞对照？能否用人的血液单个核细胞作为正常二倍体细胞对照？
谢谢！
作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-21 09:34


请教北京哪家单位有细胞流式仪？如果对外使用，如何收取费用？
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-21 09:36     标题: 回复 #128 笑弯了腰 的帖子

1）地坛医院
2）晶美公司
作者: TNT    时间: 2012-1-21 09:57

我参考的文献细胞周期均阻滞于G2/M期，这是指G2还是M期？
作者: 了了    时间: 2012-1-21 09:58

我现在需要分离单个核细胞中的T 、B淋巴细胞，一般的免疫学方法分离的效率不高，T淋巴细胞中还含有较多的B细胞，不能满足实验需要，所以，向了了兄请教，如果采用流式来分离，其效率有多高？操作是否简单？需要准备什么？
多谢了！

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流式分选需要标记的抗体，如分离T细胞，应加入荧光标记的CD3标记T细胞才能分选，流式的分选效率还是很高的，操作也比较简单（当然，如果是分选后培养就要注意无菌操作）。
由于能进行分选的流式很少，所以我还是推荐采用磁珠等分选系统。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 09:58

可否赐教该是怎样的检测条件？由于自己不是“主刀”，可以向“主刀”提出什么样的要求呢？我自己估计的转染效率大约也只有10％，流式应该可以给我这个结果吧？ 谢谢了了

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流式检测无非是设好对照，注意区分死细胞等的干扰。
往往流式检测比较简单，最难的是细胞的处理，我建议你还是改进细胞转染等的处理，这样自然会得到更好的结果。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 09:59

我参考的文献细胞周期均阻滞于G2/M期，这是指G2还是M期？

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流式常用PI染色方法无法区分G2期还是M期，因为两者的DNA含量是一样的，所以统称为G2/M期，是为两者之和。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 09:59

1。在用流式细胞仪检测细胞周期的时候，是否每次都需要用CEN和CTN进行质控？能否不进行质控，直接用PI染色进行鉴定？
2。如果要检测经过转染后的鼠细胞是否恶性变，此时是否要用鼠的血液单个核细胞作为正常二倍体细胞对照？能否用人的血液单个核细胞作为正常二倍体细胞对照？
谢谢！

================================================================================================

1。一般没有必要每次都进行质控，因为周期的检测是相对稳定的。一般在前几次进行质控就可以了。
2。当然以鼠细胞的单个核最标准，人的DNA含量和小鼠的是不同的，因此是不合适的，鼠的血很容易得到，何必用人的呢。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 09:59

我做分选后的细胞周期检测，结果很奇怪，请了了帮忙分析一下，谢谢

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这个图我也看着有点怪，能否将实验条件说的详细些。
作者: baidukk    时间: 2012-1-21 10:00



QUOTE:
原帖由 了了 于 2012-1-21 09:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做分选后的细胞周期检测，结果很奇怪，请了了帮忙分析一下，谢谢

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这个图我也看着有点怪，能否将实验条件说的详细些。 ...

我是将培养原代取材的正常组织细胞第六代用胰酶消化后PBS分散，上FACS vantage根据FSC、SSC分选，然后部分细胞PI（细胞周期检测试剂盒）染色后检测细胞周期。为什么异倍体这么多？会不会是检测或者数据分析的问题？如何改进？
作者: junhun    时间: 2012-1-21 10:01

流式分选需要标记的抗体，如分离T细胞，应加入荧光标记的CD3标记T细胞才能分选，流式的分选效率还是很高的，操作也比较简单（当然，如果是分选后培养就要注意无菌操作）。
由于能进行分选的流式很少，所以我还是推荐采用磁珠等分选系统。

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不知武汉同济的流式能否进行分选？
当然我也会考虑您的分选方法。
作者: junhun    时间: 2012-1-21 10:02

我是将培养原代取材的正常组织细胞第六代用胰酶消化后PBS分散，上FACS vantage根据FSC、SSC分选，然后部分细胞PI（细胞周期检测试剂盒）染色后检测细胞周期。为什么异倍体这么多？会不会是检测或者数据分析的问题？如何改进？

请问，你做原代培养的正常组织细胞是来自于人的吗？是什么组织？能否请教你用什么培养方法可以培养到第六代？先谢了！
作者: baidukk    时间: 2012-1-21 10:03


我培养的是大鼠的组织取材的细胞，我想如果条件合适培养到第6代是很容易的事情

武汉协和医院有FACS vantage，能分选
作者: tie8    时间: 2012-1-21 10:04

请教了了老师，我们现在的流式也是BD公司的，现在想装一个筛选的装置，请你提供一些信息，好吗？Thank you very much !
作者: tie8    时间: 2012-1-21 10:04


还有一个问题，一般染表面的抗原，可以用所用抗体的同型抗体作为对照，而不需要固定，是不是这样？作双染时，对照的设定应该如何考虑？
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:17

我是将培养原代取材的正常组织细胞第六代用胰酶消化后PBS分散，上FACS vantage根据FSC、SSC分选，然后部分细胞PI（细胞周期检测试剂盒）染色后检测细胞周期。为什么异倍体这么多？会不会是检测或者数据分析的问题？如何改进？

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我看图分析觉得不象是异倍体，更象是一个凋亡峰，或者是两种细胞的混合（不知你的分选纯度如何？纯度高，则这种可能就不大了）。
不知实验的重复如何，是不是多次都是这种结果？
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:18

请教了了老师，我们现在的流式也是BD公司的，现在想装一个筛选的装置，请你提供一些信息，好吗？Thank you very much !!!
还有一个问题，一般染表面的抗原，可以用所用抗体的同型抗体作为对照，而不需要固定，是不是这样？作双染时，对照的设定应该如何考虑？

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如果是FACSCalibur这种型号的流式仪分选效果并不理想，主要是分选速度慢。具体可以联系BD的工程师。
同型抗体作对照是设阴性阳性的界限用的，细胞表面染色一般的是不需要固定的，但是一些表达变化很快的分子，如血小板活化后的蛋白通常会随时间有变化，所以最好是先固定后，再抗体标记。另外，如果抗体标记后不能当天检测，最好也固定，一般可以放置1-4天，基本检测结果不受影响。常用的固定液是2%的多聚甲醛。
双染时要分别加入同型的抗体对照。双染是最重要的是进行仪器的补偿调节，所以除了同型对照的抗体，还要采用单标记的两管进行仪器的补偿调节。
作者: nn255    时间: 2012-1-21 10:19


请指教：测定冷冻保存（-196度）复温后的脐血CD34+细胞（%），为何跟冷冻前的结果相差悬殊（经常有2-3倍）？
[我设计的方法是：冷冻前标本测5管：1空白，2）FITC-CD45调机3）PE-CD8调机，4）FITC-cd45/pe-IgG 阴性对照别 5）FITC-cd45/PE-CD34 。
冷冻后标本测6管：4、5、6、管加7AA-D 。 ]
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:21

SCHOMAN老师,各位大虾我有几个问题想请教你们
1 将CD34阳性和阴性细胞用磁珠分离后,还要做哪些准备才能用FACS上机检测呢?
2 如果不预先用磁珠分离,可否直接把用离心分离的白细胞上机用FACS来分离上述细胞呢?上机检测之前标本需做哪些处理?
3 用磁珠分离后,如果不用FACS来检测,是否还有别的方法来计数所分离的细胞呢?
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进行磁珠分选后，进行流式检测分选细胞的纯度时就必须考虑到一个重要的问题：由于细胞表面已经标记了抗体，这个抗体已经占据了细胞表面CD34的一个抗原结合位点，所以进行流式检测时一定要搞清楚原来的抗体型号以及其抗体结合位点，这样进行纯度检测是选一个和原来的抗体有不同的结合位点的荧光标记抗体。我们通常用的是BD公司的专门检测用的一个抗体，其他公司的抗体我不太清楚是否合适，你可以咨询公司的销售。
流式和磁珠的分选纯度差别不大，都可以达到90%以上，所以两者择其一即可。不过，最好不要采用离心分离的白细胞来上机检测，为了分离的效果更好，我建议先将细胞采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞然后再上机，这样可以避开中性粒细胞的干扰，中性粒细胞很容易死亡，死亡后容易非特异性的结合抗体，造成分选纯度下降。
磁珠分选后我觉得最简单的方法还是有流式来分析纯度。荧光显微镜计数不准确，况且流式检测干细胞的纯度方法非常成熟。
作者: 蒲公英    时间: 2012-1-21 10:22

我培养的是大鼠的组织取材的细胞，我想如果条件合适培养到第6代是很容易的事情
武汉协和医院有FACS vantage，能分选

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我想做人的正常上皮细胞的原代培养，而且细胞量要达到1*106，请教了很多人，都说很难，哎，没办法。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:23

请指教：测定冷冻保存（-196度）复温后的脐血CD34+细胞（%），为何跟冷冻前的结果相差悬殊（经常有2-3倍）？
[我设计的方法是：冷冻前标本测5管：1空白，2）FITC-CD45调机3）PE-CD8调机，4）FITC-cd45/pe-IgG 阴性对照别 5）FITC-cd45/PE-CD34 。
      冷冻后标本测6管：4、5、6、管加7AA-D 。 ]
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increase or decrease?
作者: baidukk    时间: 2012-1-21 10:23

我看图分析觉得不象是异倍体，更象是一个凋亡峰，或者是两种细胞的混合（不知你的分选纯度如何？纯度高，则这种可能就不大了）。
不知实验的重复如何，是不是多次都是这种结果？

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谢谢了了 兄，但如果是凋亡峰（亚二倍体峰）也不太好解释，因为我培养的细胞生长尚可，未加其他影响因素，应该不会有很大的凋亡发生率。
同一个体正常组织培养的两种细胞的DNA含量会有很大差别吗？分选的纯度还可以，>90%
实验目前只做过一次。

请指教
作者: baidukk    时间: 2012-1-21 10:24

请指教：测定冷冻保存（-196度）复温后的脐血CD34+细胞（%），为何跟冷冻前的结果相差悬殊（经常有2-3倍）？
[我设计的方法是：冷冻前标本测5管：1空白，2）FITC-CD45调机3）PE-CD8调机，4）FITC-cd45/pe-IgG 阴性对照别 5）FITC-cd45/PE-CD34 。
      冷冻后标本测6管：4、5、6、管加7AA-D 。 ]
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increase or decrease?
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CD34+增加了.会不会是因为设门（7AA-D标记死细胞）后使CD45+细胞总数减少（亦即分母减少），而导致？
谢谢。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:24

如果是凋亡峰（亚二倍体峰）也不太好解释，因为我培养的细胞生长尚可，未加其他影响因素，应该不会有很大的凋亡发生率。
同一个体正常组织培养的两种细胞的DNA含量会有很大差别吗？分选的纯度还可以，>90%
实验目前只做过一次。
请指教
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有时两种细胞的混合并不是DNA的含量，细胞的大小也会造成这样的图。
最重要的还是再重复一次吧。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:25

CD34+增加了.会不会是因为设门（7AA-D标记死细胞）后使CD45+细胞总数减少（亦即分母减少），而导致？
谢谢。
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如果是死亡可能两个等比都死亡。我觉得还是死亡之后，死亡细胞非特异染色造成，能否上传检测图以准确分析？
作者: eric930    时间: 2012-1-21 10:25

请教了了老师：我对于流式双染仍然不是很清楚。对照的设立应该是如下（举例）：1.cell only
                       2.PE-同型抗体1
                       3.FITC-同型抗体2
                       4.PE-抗体1
                       5.FITC-抗体2
                       6.双染样品
但是，到上样具体操作时，我就不是很清楚，应该如何作啊？
谢谢！
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:26     标题: 回复 #152 eric930 的帖子

先用这三管（1cell only 2.PE-同型抗体1 3.FITC-同型抗体2）调节FL1和FL2的电压，以细胞的位置低于10E1位置较合适。
用FITC-抗体2调节FL2－FL1的补偿。
用PE-抗体1调节FL1－FL2的补偿。
最后用双染的样品进行验证补偿的正确与否。
多实践几次肯定会得到满意的效果，而且会越来约熟练的调节好补偿。
作者: eric930    时间: 2012-1-21 10:27

各位大侠：本人现在正在做关于stromal cell /mesenchymal stem cell的工作，目前所拥有部分抗体，但是大多是阴性的，只有一个CD29为阳性抗体。对于CD44,SH2/3/4 等抗体限于经费问题以及所用较少，所以希望能够得到你的支持，我们可以共享或者各种形式的交流。
多谢！
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:27

流式的抗体还是挺贵的，而且有些实验用了一些稀有的抗体，下次难得再用一次，白白放着过期失效也实在可惜，希望有更多的人能够参与流式抗体的交流，因为抗体还是很抗折腾的，国内普通邮寄也不会使抗体失效。
有多余抗体的人可以将抗体贴到流式区或者试剂区以便进一步交流。
作者: 小鱼鱼    时间: 2012-1-21 10:28


我有抗血小板膜表面糖蛋白CD62p的单抗，PE和FITC标记的都有。还有抗CD42b和CD14。
作者: dotaaa    时间: 2012-1-21 10:30

我想问一个很菜的问题：
我准备做一些肿瘤的石蜡标本。
我想提取里面的血管内皮细胞，然后用流式观察它的凋亡情况

我想问的是根据单细胞悬液制备后如何能分离出血管内皮细胞？

另外是否有必要用流式还是用TUNEL法就可以了，谢谢
作者: milkdog    时间: 2012-1-21 10:31


请教流式测胞内钙，应采集那些数据，数据如何分析
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:32

我想问一个很菜的问题：
我准备做一些肿瘤的石蜡标本。
我想提取里面的血管内皮细胞，然后用流式观察它的凋亡情况

我想问的是根据单细胞悬液制备后如何能分离出血管内皮细胞？

另外是否有必要用流式还是用TUNEL法就可以了，谢谢

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石蜡固定后的标本提取细胞进行流式检测很困难，更不要说单独找出含量不多的内皮细胞了。因此，建议用TUNEL法检测石蜡标本的凋亡，流式就不要考虑了。
作者: 麦丽素1986    时间: 2012-1-21 10:33


有人在做流式时用过可以校正仪器，做标准曲线的微球吗？
（不用细胞表面抗原做对照）
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:33

有人在做流式时用过可以校正仪器，做标准曲线的微球吗？
（不用细胞表面抗原做对照）
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This product can be purchased from BD Bioscience.
作者: yychen    时间: 2012-1-21 10:34


老板要求开始做流式，可是心里有点惴惴的。去年有一段时间尝试着做DNA PI染色测定细胞凋亡，由于没有经验也没有指导，导致进样针堵塞，还好在保修期内，工程师来维修。从此，就没有做。
现在又要做了，所以来这里请教几个基础问题，希望不要见笑。我们的流式细胞仪是BD的，3荧光。
首先，鞘液，自配的PBS溶液经0.22um膜过滤处理后可否替代BD的成品。
PI 溶液，自配的效果应该可以吧？
关于样品的处理，为了防止粘连细胞干扰结果以及阻塞进样针，是否需要用膜过滤，膜的孔径是多少比较好呢？
最后，关于机器的维护，清洗液：次氯酸钠溶液的浓度是多少呢？
又各种相关的溶液都需要过0.22um的膜吗？那清洗液呢？
市售的次氯酸钠原液杂质好像很多，该如何处理呢？
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:36



QUOTE:
原帖由 yychen 于 2012-1-21 10:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

老板要求开始做流式，可是心里有点惴惴的。去年有一段时间尝试着做DNA PI染色测定细胞凋亡，由于没有经验也没有指导，导致进样针堵塞，还好在保修期内，工程师来维修。从此，就没有做。
现在又要做了，所以来这里请教几个基础问 ...


如果按照标准的要求你所提到的事情可都要照办。
1 鞘液，自配的PBS溶液经0.22um膜过滤处理可以替代BD的成品，让BD的东西见鬼去吧，不就是个PBS还要收我们这么多钱，老美可真有钱。
2 PI 溶液，自配的效果可以替代BD产品。
3 如果是细胞粘连很多，可以用滤膜过滤，细胞的大小为数十um，只要孔径比细胞略大让细胞通过就可以了。
4 次氯酸钠用10%就可以。市售的次氯酸钠原液杂质多，可以稀释后过滤去除杂质，或者更换好的试剂。
但事实上，我们没有严格按照BD 的要求进行。
鞘液我都是用的3蒸水替代。实验是没有问题的（分选除外）。
作PI染色检测细胞周期，我过滤过几次，但是后来嫌繁，就再也没有过滤过。到现在没有堵住过机器，我的经验是有时会有大的细胞团会堵住机器，马上用Prime进行反冲，可以将细胞团块反冲回来，然后继续检测。
如果你万一堵住了，还是让工程师来吧，BD以售后服务好著称。
作者: eric930    时间: 2012-1-21 10:36

介绍一个流式的专业网站 cuturl('http://pingu.salk.edu/flow/sitelink.html')
里面什麽东东都有 ，从流式的基础知识 ，到各种检测的PROTOCOL ，应有尽有 ，绝对好用 。
  觉的好的顶一下 ：）
作者: junjie05    时间: 2012-1-21 10:37

请问图D，最左边的一个峰代表什么意思？

图片附件: 150239-endo-2-embed.gif (2012-1-21 10:37, 19.36 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10292

作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:38

请问图D，最左边的一个峰代表什么意思？
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最左边是细胞的debris，流式中出现这种情况最多见的是细胞经实验处理后发生了破碎，胰酶消化过度，或者固定时间太长也会出现这种情况。另外，如果是污染了杂质也会出现这个峰。
顺便评价一下你的流式结果，我觉得像这样的DNA检测结果是不错的。说明你的前期处理达到了要求。
我一直强调的一点就是在分析流式的结果时，不能只看图和结果，必须考虑到实际的实验设计和操作对结果的影响，只有两者结合，才会有很好的分析结果。
作者: junjie05    时间: 2012-1-21 10:38

再请教一个问题：一般来讲，细胞在培养时如果太满就会有生长抑制。在做流式时是否要注意这个问题，让细胞不要生长太满时，而在90％汇合时消化固定。另外，如果要做几种不同的细胞，而细胞生长速度又不一样，此时该怎么办？因为如果将细胞固定了等，可能会出现你说的情况（固定时间太长细胞发生了破碎），但如果分次做的话，每次不同的操作又会造成人为误差。BD公司的工程师告诉我，检测细胞流式时，细胞可以固定在70％乙醇中一、两个月而不影响检测结果，你对这个问题怎么看？
作者: sunnyB    时间: 2012-1-21 10:41


请教：我目前想检测胞内的几种蛋白的表达，不知道如何用流式进行检测啊？细胞如何固定，通透？还有对照的设立？因为我是采用间接标记，是不是只用加二抗不加一抗的样品作为对照就可以了？
作者: 分子式    时间: 2012-1-21 10:42

请教：我目前想检测胞内的几种蛋白的表达，不知道如何用流式进行检测啊？细胞如何固定，通透？还有对照的设立？因为我是采用间接标记，是不是只用加二抗不加一抗的样品作为对照就可以了？

METHOD FOR STAINING OF INTRACELLULAR ANTIGENS

MATERIALS:

1. 2% formaldehyde solution (preparation method attached)

2. 1 X PBS (without sodium azide and serum)

3. 1 X PBS + 2% newborn calf serum + sodium azide (buffer)

4. Polyoxyethylensorbitan monolaureate (Tween 20)

5. Human AB serum, heat-inactivated (HA

6. 37°C water bath, refrigerated centrifuge.

作者: 分子式    时间: 2012-1-21 10:42

METHOD:

Fixation

1 x 106 PBS-washed cells from a single cell suspension are pelleted in a 12 X 75 mm culture tube. The pellet is resuspended in 0.875 ml of cold PBS and the suspension is mixed gently. Then, 0.125 ml of cold 2% formaldehyde solution is added and the mixture is immediately vortexed briefly. The suspension is incubated for at least 30 min or for up to 1 h at 4°C, centrifuged for 5 min at 250g, then the supernatant is removed.

Permeabilization

The pellet is gently resuspended in 1 ml of room temperature Tween 20 solution (0.2% in PBS) and the mixture is incubated for 15 min in a 37°C water bath. One ml of buffer is added and the suspension is spun for 5 min at 250g. The supernatant is removed and the internal staining then proceeds as described in the direct staining method for antibodies directly conjugated to a fluorochrome or in the indirect staining method for unlabelled antibodies.

Direct Staining Procedure

1. Resuspend cell pellet first in 50 microliters of HAB for approximately 1 min, then add 50 microliters of buffer and the appropriate amount of the fluorochrome-conjugated antibody.

2. Vortex briefly and incubate for 30 min at 4°C in the dark.

3. Wash twice with 1 ml of 0.2% Tween 20 solution by centrifugation at 250g for 5 min.

4. Resuspend samples in 1 ml of buffer and hold them at 4°C protected from light prior to analysis.

Indirect Staining Procedure

1-3. Process samples as above using a working dilution of unlabelled antibody.

4. Resuspend cell pellet first in 50 microliters of HAB for approximately 1 min, then add 50 microliters of a working dilution of the fluorochrome-conjugated second antibody.

5. Vortex briefly and incubate for 20 min at 4°C in the dark.

6. Wash twice with 1 ml of 0.2% Tween 20 solution by centrifugation at 250g for 5 min.

7. Resuspend samples in 1 ml of buffer and hold them at 4°C protected from light prior to analysis.

Note: do not use HAB for staining of immunoglobulin chains. Whenever available, use a monoclonal antibody and/or a reagent directly conjugated to a fluorochrome to minimize unspecific binding. Always use isotypic controls of the same heavy chain class at the same protein concentration as your relevant antibody for determination of background staining. For storage of samples longer than overnight and for biohazard considerations the samples can be resuspended in 1% formaldehyde solution after the internal staining procedure has been completed.
作者: 分子式    时间: 2012-1-21 10:43

PREPARATION OF 2% FORMALDEHYDE STOCK SOLUTION (2 METHODS)
METHOD 1:
Formaldehyde preservative – 2% formaldehyde solution in protein-free phosphate-buffered saline (PBS).

Prepare as follows:

Add 2 g paraformaldehyde powder (e.g., Sigma, St. Louis, MO) to 100 ml of 1 X PBS. Heat to 70°C (do not exceed this temperature) in a fume hood until the paraformaldehyde goes into solution (note that this happens quickly as soon as the suspension reaches 70°C). Allow the solution to cool to room temperature. Adjust to pH 7.4 using 0.1 M NaOH or 0.1 M HCl, if needed. Filter and store at 4°C protected from light.



METHOD 2:
Formaldehyde preservative – 2% formaldehyde solution in protein-free PBS.

Prepare as follows:

10% formaldehyde*
20 ml

10 x PBS
10 ml

Distilled water
70 ml


* 10% formaldehyde solution (e.g., Polysciences, Warrington, PA, ultrapure, Cat.#04018), depolymerized paraformaldehyde, EM grade, methanol-free solution.

Background information for intracellular staining by flow cytometry

For correlation of surface immunofluorescence with intracellular antigen expression the surface antigens are stained according to the "Monoclonal Antibody Staining Procedure" before fixation and permeabilization. However, please note that if a particular antigen is expressed on the cell surface as well as internally the surface antigens will also be detected by the antibody staining procedure after the fixation and permeabilization procedure. If you have stained surface antigens with mouse monoclonal antibodies, you either have to use a directly labelled antibody, an antibody made in a different species, or the avidin-biotin system for intracellular staining, because any anti-mouse second antibody that you are using for internal staining will also react with the mouse monoclonal antibody bound to surface proteins.

For correlation of intracellular antigen expression with DNA content please refer to the procedure "Staining Procedure for Correlation of Surface Antigen Expression Simultaneously with DNA content". Staining for internal antigens is done on fixed and permeabilized cells before staining for DNA content.

The fixation and permeabilization method described here employs a very mild treatment of cells with 0.25% buffered formaldehyde and Tween 20. Thus it offers a valuable alternative to alcohol fixation in cases where the immunoreactivity of the antigen is compromised by conformational changes due to excess crosslinking and harsh fixation conditions. In addition, it allows the preservation of cell surface immunofluorescence and the light scatter profiles of cell clusters for gating purposes in flow cytometry and gives very low coefficients of variation on DNA histogram distributions. It is therefore particularly suited for correlation of internal staining with surface antigen staining and DNA content.

The method described here was successfully used for internal staining of differentiation antigens, intracytoplasmic m , and vimentin in leukemic cell lines. In addition, the current method was able to permeabilize a variety of other cell types including human lymphocytes and thymocytes, and murine thymocytes and spleen cells for DNA staining. Thus it appears that the fixation and permeabilization procedure may be broadly applied to many different cell types as well as tissue culture lines. However, the current method may not be applicable to all cells and internal antigens.
作者: 分子式    时间: 2012-1-21 10:43

Whenever the results you are obtaining with this method are not satisfactory, please consider the following: the precise optimal conditions for staining of intracellular antigens may be influenced by the nature of the antigen and its localization. It might be necessary to modify the length of the incubation with the antibody and/or the temperature of the reaction. Keeping the antibody in the detergent solution during the incubation step has also been described as a measure to improve penetration of the reagent to the reaction site. In addition, it is also known that some cytoplasmic or nuclear antigens require a higher degree of fixation and/or a different fixative. Therefore, modification of the concentration of the fixative and/or the temperature of the fixation step can improve staining of some internal proteins.

For any quantitation of expression of intracellular proteins the results should be evaluated critically in each case to verify the specificity of the antibody-antigen reaction. The antibodies and their controls should be used at the same protein concentration. Antibodies from different manufacturers directed at the same antigen can display different properties when they are used for intracellular staining. All reagents should be titered for optimal internal staining and may require different amounts than those used for detection of surface antigens. The flow cytometric results should be verified by a comparison to results obtained with non-flow cytometric methods. Known negative cell controls should be fixed, permeabilized and stained to detect non-specific reactivity of the antibodies with fixed cells. The localization of the fluorescent reaction should always be verified by fluorescence microscopy.
作者: lixi559    时间: 2012-1-21 10:46


purdue大学的FCM教学材料，有全面的介绍,大量的幻灯提供免费下载
cuturl('http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate/pptslide.htm')
作者: lixi559    时间: 2012-1-21 10:46


CD-ROM材料，也可免费在线观看，非常详细，是最好的FCM材料之一
cuturl('http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/cdseries.htm')
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:47

请教：我目前想检测胞内的几种蛋白的表达，不知道如何用流式进行检测啊？细胞如何固定，通透？还有对照的设立？因为我是采用间接标记，是不是只用加二抗不加一抗的样品作为对照就可以了？

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补充一点，细胞固定穿孔采用Pharmingen或联科的固定穿孔液相对操作要简单，二抗采用间接标记的作为阴性对照是可以的。
作者: moonlight45    时间: 2012-1-21 10:47


多谢多谢!
不知道是否可以采用丙酮固定啊？因为我的细胞比较少，所以采用多聚甲醛+通途剂的方法，会增加几次洗的过程，细胞损失加大。
作者: hold住    时间: 2012-1-21 10:48

《流式细胞术的原理和应用》　北京师范大学出版社，１９９２　年３月第一版　　写得很好，直至今天也不算陈旧过时，而且浅显易懂。希望对你有用。
　
作者: hold住    时间: 2012-1-21 10:48

　请教：作细胞周期分析，哪里能分析到细胞亚周期，并能区分G0和Ｇ１期，G2与M期倒无所谓，最好能做单个细胞每一周期停留时间分析。
作者: guagua    时间: 2012-1-21 10:49

我已在流式的黑暗道路上摸索了二个多月。每次我满怀希望的拿着样本去上机，总揣着失望回。你们谁能告诉我上机前样本去杂质的方法，向常规的过滤什么的就不用说了。因我做的是视网膜上的色素细胞，细胞数量本来就少。过滤一次，再离心几次，细胞就没了，叫人伤心啊！！！听说加血清离心可以去杂质，不知加多少血清，离心多少转。对付杂质还有偏方吗？谁能给我一只蜡烛？
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-21 10:50


最近在做流式检测，检测对象是白细胞表面表达的CXCR4分子，取材是外周血和骨髓，目前遇到了一个问题：取材样本红细胞含量较高，打算用tris－NH4CL来裂解红细胞，几次处理下来，发现白细胞也遭到了破坏（我是在荧光抗体染色后裂解红细胞的，没办法，试剂盒要求先染色后裂解），不知哪位大虾检测过类似因子，能否提点建议和解决方法
作者: 穿越时空    时间: 2012-1-21 10:50

向了了学长求教：急！
我将血细胞膜糖蛋白基因转染到cos细胞，然后通过流式细胞仪检测血小板糖蛋白的表达，用的是FITC标记的cd-41,cd 61单抗，还想用PAC-1 检测一下血小板活化功能。我有如下疑问：
1、我用胰酶消化细胞的话，发现标记得不好，是不是胰酶可以破坏血小板表面抗原？
2、由于问题1，所以我用刮子将细胞刮下来，发现细胞难以完全成为单个悬液，总有一点细胞团，用TIP反复吸打的话，是不是会大量破坏细胞，造成细胞死亡？我该怎么办？
3、用ADP活化转染后COS-7细胞表面表达的血小板膜糖蛋白，操作步骤如何？
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:51

最近在做流式检测，检测对象是白细胞表面表达的分子，取材是外周血和骨髓，目前遇到了一个问题：取材样本红细胞含量较高，打算用tris－NH4CL来裂解红细胞，几次处理下来，发现白细胞也遭到了破坏（我是在荧光抗体染色后裂解红细胞的，没办法，试剂盒要求先染色后裂解），不知哪位大虾检测过类似因子，能否提点建议和解决方法
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CXCR4的检测很简单，直接标记的荧光抗体可以解决问题。我有抗人的抗体。而且我觉得没必要先染色后裂解，先裂解后染色也应该没有问题。
另外，Tris－NH4Cl裂解红细胞是轻而易举之事，是不是你的配方有问题？
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:51

我将血细胞膜糖蛋白基因转染到cos细胞，然后通过流式细胞仪检测血小板糖蛋白的表达，用的是FITC标记的cd-41,cd 61单抗，还想用PAC-1 检测一下血小板活化功能。我有如下疑问：
1、我用胰酶消化细胞的话，发现标记得不好，是不是胰酶可以破坏血小板表面抗原？
2、由于问题1，所以我用刮子将细胞刮下来，发现细胞难以完全成为单个悬液，总有一点细胞团，用TIP反复吸打的话，是不是会大量破坏细胞，造成细胞死亡？我该怎么办？
3、用ADP活化转染后COS-7细胞表面表达的血小板膜糖蛋白，操作步骤如何？
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你可以采用Tip吹打细胞制成悬液，比较好分离的细胞可以通过这种方法，但是COS如果黏附力比较强，则很难得到较好的效果。除了机械法之外，可以用EDTA分散细胞。标记的不好，不见得就是胰酶破坏抗原的原因，自身表达量的高低同样重要。
我没有试过ADP活化COS-7，是不是可以参照血小板的活化过程？
作者: yysr238    时间: 2012-1-21 10:53

我有如下疑问：
2、由于问题1，所以我用刮子将细胞刮下来，发现细胞难以完全成为单个悬液，总有一点细胞团，用TIP反复吸打的话，是不是会大量破坏细胞，造成细胞死亡？我该怎么办？
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我没做过你些。但是我有个使细胞成为单细胞悬液的土方法。就是将细胞悬液用1ml的空针抽吸两遍。我使用此法用来获取肿瘤细胞的单细胞悬液，效果很好。
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-21 10:53


谢谢了了的关注，我的荧光抗体为CXCR4 IgG2b，帮我做流式的老师说IgG2b很容易受到其他试剂的影响而出现假阳性，因此我尽量希望能够先染色，如果按您所说可以直接用NH4CL裂解再染色，是否能够不产生假阳性结果

谢谢再次关注！
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-21 10:54


还有一点，关于染色后细胞的固定，有人建议我用PBS+多聚甲醛，具体的固定液配置浓度是多少？固定后细胞可以保存多久？

谢谢指教！
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 10:54

我经常通过网络拜读您的一些关于流式细胞术的文章。我也打算做这方面的课题。最近我从一本受体研究的书上看到一篇关于用流式细胞仪检测平滑肌细胞内钙调素测定的文章。有一些地方有疑问，恳请schoman老师在百忙中抽时间帮我解答一下。
钙调素（CaM）的测定
[原理]钙调素是一种广泛存在于真核细胞内具有重要生理功能的钙调节蛋白，参加体内多种代谢的调控。对钙调素的测定，可通过钙调素拮抗剂（如：三氟哌嗪、氯丙嗪、长春花碱等）特异阻断或抑制CaM对其靶酶的激活作用，作为一种CaM生理功能的检测方法。
[试剂]
（1）无钙PBS。
（2）三氟哌嗪（TFP）：100mmol/L
[步骤]
（1）将待测组织切成1 cm3 的小块，放入2 ml 胰蛋白酶液中，37度振荡消化20 min。
（2）消化后的组织块过200目筛网，2000 rpm 离心 10 min 后收集细胞，无钙PBS洗涤2次，每次 4 ml。
（3）混匀后快速通过4号半注射针头，离心后用 1 ml 预冷的百分之75乙醇混匀，4度固定过夜。
（4）2000 rpm 离心 10 min，收集固定后的细胞，无钙PBS洗涤2次，每次 4 ml。
（5）加入 1 ml 100mmol/L TFP 混匀，250?256nm紫外光照射 20 min，离心收集，无钙PBS洗涤。
（6）2 ml 无钙 PBS 混匀，流式细胞仪测定 10000 个细胞平均荧光强度，激发波长 488 nm 。

以上就是那篇完整的文章，但我有三点不清楚。
[1]：改文中所说的检测CaM生理功能到底是指钙调素（CaM）哪项或哪些项生理功能？是仅指浓度吗？
[2]：250?256nm紫外光照射 20 min的作用是什么？
[3]：实验中为何没用荧光染料，如果是自发荧光，是哪种物质？

另外，我想问一下，若丹明123 （Rhodamine 123 ）的激发峰为505nm ，发射峰为534nm ；2',7'-bis(Carboxyethyl)-5-Carboxyfluorescein (BCECF) 的激发峰为450nm ，发射峰为530nm。但我们的流式却只有488nm的激发光，我如果用488nm将就做实验，结果会怎样。会不会很惨。
谢谢
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:55

谢谢了了的关注，我的荧光抗体为CXCR4 IgG2b，帮我做流式的老师说IgG2b很容易受到其他试剂的影响而出现假阳性，因此我尽量希望能够先染色，如果按您所说可以直接用NH4CL裂解再染色，是否能够不产生假阳性结果
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这个问题你自己尝试一次，比较一下裂解前和裂解后就明白了。希望作完之后将结果通报一声。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:55

还有一点，关于染色后细胞的固定，有人建议我用PBS+多聚甲醛，具体的固定液配置浓度是多少？固定后细胞可以保存多久？
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我自己一般用1-2%，通常保存1-3天是可以的（可能具体细胞不玩全一样，我没有系统观察）。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:56

这个地方真好我怎么早没发现。你知道吗？我已在流式的黑暗道路上摸索了二个多月。每次我满怀希望的拿着样本去上机，总揣着失望回。你们谁能告诉我上机前样本去杂质的方法，向常规的过滤什么的就不用说了。因我做的是视网膜上的色素细胞，细胞数量本来就少。过滤一次，再离心几次，细胞就没了，叫人伤心啊！！！听说加血清离心可以去杂质，不知加多少血清，离心多少转。对付杂质还有偏方吗？谁能给我一只蜡烛？
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假如有人咨询我用流式来检测视网膜上的细胞，我是不会推荐用此方法的。主要原因如你所述，细胞太少，无法得到一个好的结果。
我建议你用免疫组化或者western方法来检测目的蛋白的表达。
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-21 10:56


按照学长的意见重新处理了样本,结果还是不令认满意,友人最近劝我先去用ficoll分离了白细胞再说,我有点犹豫,不知道学长用流式测CXCR4的时候是否能先分离白细胞(MNC)再测,对结果有影响吗?
还有,如果样本需长期保存,用-70度低温冻存1月后再测表达的话,CXCR4表达是否有衰减,衰减大概是多大的比例
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 10:57

我问的关于钙调素的方法我也没查到更多的文献。不过你能否先为我看一下若丹明123 （Rhodamine 123 ）的激发峰为505nm ，发射峰为534nm ；2',7'-bis(Carboxyethyl)-5-Carboxyfluorescein (BCECF) 的激发峰为450nm ，发射峰为530nm。但我们的流式却只有488nm的激发光，我如果用488nm将就做实验，结果会怎样。因为我在中国医学科学院学报上看到一篇文章就是用 488nm作为若丹明123 （Rhodamine 123 ）的激发峰。我给您的邮箱发了一封。请您看一下。
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 10:57

求教了了老师：
我刚开始用流式细胞进行检测结肠癌细胞，是从手术病人取得新鲜组织，我使用机械分离细胞的方法，请问这样的可行性有多大，该有应该注意事项有那些？还有测凋亡时候的阴性对照该怎么设立！谢谢！
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 10:58

我用流式测细胞内pH，请问具体的步骤。那条曲线该怎么做？Thank you！
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 10:58

我想用流式细胞仪做肠道平滑肌细胞内钙离子浓度的测定，但我们医院只有激发光波长488的光源，请问下面两种试剂可以做吗，哪种更合适
谢谢！！！
1 PRODUCT NAME:   FURA-2(AM)
CATALOG NUMBER:   102 and 103
APPEARANCE:   Pale Yellow Solid
TLC :   1:1 Ethyl Acetate:HexaneRf = 0.25Purity: 100%
ABSORPTION SPECTRUM:   l max: 371 nm Extinction: 33,000 M-1cm-1
EMISSION SPECTRUM:   lmax: 475 nm (EtOAc) Does not respond to Calcium until hydrolysed
EXCITATION:   lmax:373 nm (EtOAc) Does not respond to Calcium until hydrolysed
HPLC:Solvent System:Column:   Purity: .96%Water/MeOH gradient 40-100%C18

NMR:        (CDCl3) all AMs present
2 PRODUCT NAME:  FLUO-3 (AM)
LOT:   
  C51H50Cl2N2O23
  M.W. 1129.86 g/mol
  Kd = 390 nM (After hydrolysis)*
  Store Frozen (-20°C)
  PROTECT FROM LIGHT
  Soluble in DMSO
CAS Number/Name:  121714-22-5 Glycine, N-[4-[6-[(acetyloxy)methoxy]-2,7-dichloro-3-oxo-3H-xanthen-9-yl]-2-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxyethyl]amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]phenyl]-N-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxyethyl]-, (acetyloxy)methyl ester
DESCRIPTION:   Red solid. Cell-permeable acetoxymethyl ester (AM) derivative of Fluo-3 with spectral properties similar to the parent compound. Insensitive to magnesium.
CATALOG NUMBER:   0116
APPEARANCE:   Orange Red Glossy Solid
TLC :   Ethyl Acetate: Hexane 2:1Rf = 0.4Purity: 100%
ABSORPTION SPECTRUM:   l max: 459 nm (Ethyl Acetate)Extinction: 25,000 M-1cm-1
EMISSION SPECTRUM:   lmax: 526 nm (after hydrolysis)*
EXCITATION:   490-510 nm (after hydrolysis)*
HPLC:Solvent System:Column:   Purity: >95%Water/MeOH gradient 40-100%C18
* Fluorescence and binding to calcium is only observed after hydrolysis to the Fluo-3 cation.
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:59

按照学长的意见重新处理了样本,结果还是不令认满意,友人最近劝我先去用ficoll分离了白细胞再说,我有点犹豫,不知道学长用流式测CXCR4的时候是否能先分离白细胞(MNC)再测,对结果有影响吗?
还有,如果样本需长期保存,用-70度低温冻存1月后再测表达的话,CXCR4表达是否有衰减,衰减大概是多大的比例
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我没有进行细胞的分离后再测，MNC是指单个核细胞。
低温保存后可能部分会受影响，我没有观察，根据通常的理论，细胞冻存在液氮中，再次复苏后对细胞的表型影响不大。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 10:59

我问的关于钙调素的方法我也没查到更多的文献。不过你能否先为我看一下若丹明123 （Rhodamine 123 ）的激发峰为505nm ，发射峰为534nm ；2',7'-bis(Carboxyethyl)-5-Carboxyfluorescein (BCECF) 的激发峰为450nm ，发射峰为530nm。但我们的流式却只有488nm的激发光，我如果用488nm将就做实验，结果会怎样。因为我在上看到一篇文章就是用 488nm作为若丹明123 （Rhodamine 123 ）的激发峰。我给您的邮箱发了一封。请您看一下。
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该方法是正确的（中国医学科学院学报）。如果学报连这个也搞不清楚，早该关门了。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:00

我刚开始用流式细胞进行检测结肠癌细胞，是从手术病人取得新鲜组织，我使用机械分离细胞的方法，请问这样的可行性有多大，该有应该注意事项有那些？还有测凋亡时候的阴性对照该怎么设立！谢谢！
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机械分离细胞后本身会造成一定细胞的凋亡，对结果有一定的影响。总的来说流式检测组织细胞的凋亡效果不理想。我觉得还没有TUNEl法好。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:01

我想用流式细胞仪做肠道平滑肌细胞内钙离子浓度的测定，但我们医院只有激发光波长488的光源，请问下面两种试剂可以做吗，哪种更合适
谢谢！！！
1 PRODUCT NAME:   FURA-2(AM)
CATALOG NUMBER:   102 and 103
APPEARANCE:   Pale Yellow Solid
TLC :   1:1 Ethyl Acetate:HexaneRf = 0.25Purity: 100%
ABSORPTION SPECTRUM:   l max: 371 nm Extinction: 33,000 M-1cm-1
EMISSION SPECTRUM:   lmax: 475 nm (EtOAc) Does not respond to Calcium until hydrolysed
EXCITATION:   lmax:373 nm (EtOAc) Does not respond to Calcium until hydrolysed
HPLC:Solvent System:Column:   Purity: .96%Water/MeOH gradient 40-100%C18

NMR:        (CDCl3) all AMs present
2 PRODUCT NAME:  FLUO-3 (AM)
LOT:   
  C51H50Cl2N2O23
  M.W. 1129.86 g/mol
  Kd = 390 nM (After hydrolysis)*
  Store Frozen (-20°C)
  PROTECT FROM LIGHT
  Soluble in DMSO
CAS Number/Name:  121714-22-5 Glycine, N-[4-[6-[(acetyloxy)methoxy]-2,7-dichloro-3-oxo-3H-xanthen-9-yl]-2-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxyethyl]amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]phenyl]-N-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxyethyl]-, (acetyloxy)methyl ester
DESCRIPTION:   Red solid. Cell-permeable acetoxymethyl ester (AM) derivative of Fluo-3 with spectral properties similar to the parent compound. Insensitive to magnesium.
CATALOG NUMBER:   0116
APPEARANCE:   Orange Red Glossy Solid
TLC :   Ethyl Acetate: Hexane 2:1Rf = 0.4Purity: 100%
ABSORPTION SPECTRUM:   l max: 459 nm (Ethyl Acetate)Extinction: 25,000 M-1cm-1
EMISSION SPECTRUM:   lmax: 526 nm (after hydrolysis)*
EXCITATION:   490-510 nm (after hydrolysis)*
HPLC:Solvent System:Column:   Purity: >95%Water/MeOH gradient 40-100%C18
* Fluorescence and binding to calcium is only observed after hydrolysis to the Fluo-3 cation.
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从资料上看第一种的激发波长不适合，第二种可以用。
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 11:01

感谢您的及时回复。但是Fluo-3/AM试剂比较贵，请问从您的实际工作中，有没发现比较便宜的、效果尚可的用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的荧光染料。再次对您表示感谢。
作者: 白白的    时间: 2012-1-21 11:02

我想用流式细胞仪测定肠道平滑肌细胞内的钙离子浓度，请问有没有物美价廉的荧光指示剂，该方案可行吗？thank you very much!
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:03     标题: 回复 #202 kent 的帖子

如果消化效果不好，可以加胶原酶，低速离心去处细胞团块不如用过滤法，效果好。
作者: bamboo16    时间: 2012-1-21 11:04

我查的资料对用流式测凋亡，但阴性对照的怎么设立，我怎么也看不明白，请您给予指教，谢谢！
作者: yychen    时间: 2012-1-21 11:04

我想用流式检测石蜡包埋的样本中抗原的表达，可是样本制备存在问题。用胰酶消化经过脱蜡、复水的组织后收获的细胞数太少，达不到106/ml的要求。我也尝试用胃蛋白酶，但是我要检测的抗原会被酶消化掉。
另外，我现在也在用流式检测一些新鲜样本的抗原表达。所检测的阳性细胞群虽然和阴性细胞群分的很开，但是按照阴性对照设立坐标轴后，部分本该是阴性的细胞群却变成了阳性。我觉得应该是设门或是条件的问题，设门调整后没有改观，条件设定怎么调我不太会，也许还有什么其他方面的问提，请给予指教，万分感谢！
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:05

谢谢大侠夸奖，顺便问一下过滤是用筛子还是用戴有滤膜的滤器？我呈试过300目的筛子，可细胞悬液都被筛网给吸收了，没省多少细胞给我做实验，怎么办？
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有滤膜的滤器不行，用筛网，换大孔径。
作者: 伊莎贝拉    时间: 2012-1-21 11:08


询问一下了了：BD和Beckman的流式细胞仪哪一个更好一些？功能和稳定性！
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:09

我查的资料对用流式测凋亡，但阴性对照的怎么设立，我怎么也看不明白，请您给予指教，谢谢！
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流式凋亡的阴性对照很难设，任何细胞都会有些凋亡，没有绝对的阴性。我觉得阴性对照的设立并不是很重要。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:09

BD和Beckman的流式细胞仪哪一个更好一些？功能和稳定性！
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没有比较过，应该是不相上下。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:10

我想用流式检测石蜡包埋的样本中抗原的表达，可是样本制备存在问题。用胰酶消化经过脱蜡、复水的组织后收获的细胞数太少，达不到106/ml的要求。我也尝试用胃蛋白酶，但是我要检测的抗原会被酶消化掉。
另外，我现在也在用流式检测一些新鲜样本的抗原表达。所检测的阳性细胞群虽然和阴性细胞群分的很开，但是按照阴性对照设立坐标轴后，部分本该是阴性的细胞群却变成了阳性。我觉得应该是设门或是条件的问题，设门调整后没有改观，条件设定怎么调我不太会，也许还有什么其他方面的问提，请给予指教，万分感谢！

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阴性阳性的标准不不一定完全按照阴性的界限，有时是需要根据自己的实验情况进行调整。造成这种原因可能是非特异性结合所致。调流式的条件可能凑效不大。
作者: pengke1983    时间: 2012-1-21 11:11

筛子用多少目的较好？可以用注射器吗？多少毫升的注射器、戴针头吗？几号针头？我是不是很罗嗦。（我的细胞直径约16um）
作者: caihong    时间: 2012-1-21 11:11


看到前面有位同志准备用流式测肠平滑肌细胞的钙，我个人认为该方案不可取，虽然也有人报道过类似的试验。原因是：
1. 试验很难控制。钙内流时间很短，加入刺激因素后几分钟后就有变化，因此处理组与对照组很难保证条件一致。更重要的是，流式上机时，温度无法保证37度，而细胞的钙变化与温度的关系应该是非常密切的，我用的是FACScan，也用过Callibor，不知道更复杂的机器能否有恒温功能。
2. 实质脏器的细胞用流式检测，总是不如悬浮细胞理想。建议你考虑共聚焦或默片钳吧。
顺便问一句，这里有人用Anexin V试剂盒检测贴壁细胞凋亡作出过理想效果的吗？我们实验室总是不理想。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:12     标题: 回复 #213 caihong 的帖子

支持上述观点。
至于贴壁细胞Anexin V，我有约一半效果不理想，主要是处理时造成假阳性太高。
解决这个问题主要看操作的时候能否小心 。当然，有些细胞根本就不能用此方法。
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 11:12

流式测平滑肌细胞的线粒体膜电位及细胞内pH，条件要求苛刻否。可行性有多大。
作者: milkdog    时间: 2012-1-21 11:12

最近我做了一些流式细胞仪的检测，按不同的药物浓度，不同的时间点（每六小时收集一次，共30个小时）。可是，这么多标本，竟然没有一个出现凋亡峰，但是从对数图上看到凋亡百分率随药物浓度和时间延长逐渐增多，最多可达30%（不包括死亡，但是细胞碎片也增多）多，我现在想不通的一个问题是，流式细胞仪检测要出现凋亡峰，需要什么条件，单是一个凋亡百分率的问题这么简单呢，还是还有别的因素在影响，或者我的处理过程有差错？请您多指教，谢谢您，很急！
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:13

流式测平滑肌细胞的线粒体膜电位及细胞内pH，条件要求苛刻否。可行性有多大。
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我没有测过，但是我觉得可行。
作者: yes4    时间: 2012-1-21 11:13


我欲检测细胞阴性组、加药组核抗原的表达高低，用流式检测不知可不可行？它与检测胞浆的抗原一样敏感可靠吗，处理方式一样吗？
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:14

我欲检测细胞阴性组、加药组核抗原的表达高低，用流式检测不知可不可行？它与检测胞浆的抗原一样敏感可靠吗，处理方式一样吗？
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最好有国外的方法可以参照，否则只能试一下了。通常是按照细胞内染色步骤处理。
作者: duoduo    时间: 2012-1-21 11:14

我也说不太清楚，我们是自己处理好标本，然后由我们学校专门管理流式细胞仪的老师来做的，我只知道这种对数图可以表示出凋亡细胞在总细胞中所占的比例。是不是我表达的太不清楚，其实我也是不太明白，等我再请教一下，可是我还是不明白，为什么凋亡都达到30%了，却没有凋亡峰呢？为什么？还有什么别的影响因素吗？
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:16     标题: 回复 #220 duoduo 的帖子

凋亡达到30％是用什麽方法知道的？如果是流式应该有峰的，可以上传检测结果分析一下。
作者: eric930    时间: 2012-1-21 11:16

如果我的细胞上原有的蛋白表达很强，经过试验干预后使其表达下调，那么用流式能检查出区别吗 ？是不是都显示出同样的阳性细胞百分率 （因为都还是有表达，只是表达量有区别）
我打听到可以用平均荧光强度来表示表达量的强弱，是吗？
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:18

插句嘴

你把干预前和干预后的histogram 结果overlay一下也可以，就是把两个结果（直方图，不是散点图）重叠在一个图里，哪个荧光强，哪个荧光弱就显而易见了，这种方法很常用。
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:18

支持上述观点。
至于贴壁细胞Anexin V，我有约一半效果不理想，主要是处理时造成假阳性太高。
解决这个问题主要看操作的时候能否小心 。当然，有些细胞根本就不能用此方法。

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今天恰好看到有人用Annexin V 检测神经元细胞的凋亡，结果也是怪怪的。看起来死细胞比例很大，而且Annexin V 阳性和阴性细胞间界线不清，可是检测淋巴细胞凋亡时结果却很好。

想请教2个问题：

1. 您说的处理时造成假阳性太高，能不能说的再具体点？
2.有些细胞根本就不能用此种方法，是什么细胞呢？
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:19

1. 您说的处理时造成假阳性太高，能不能说的再具体点？
2.有些细胞根本就不能用此种方法，是什么细胞呢？
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帖壁细胞的处理往往用胰酶等消化，或者其它方法作单细胞悬液，所以容易造成假阳性。
至于什么细胞合适，完全要靠自己去摸索，有时老外报道的方法挺好，可是我们没有办法重复，这往往就是我们在具体的技术细节上赶不上人家了。
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:20

想知道overlay是什么样子的，那我就贴张图。
我电脑里目前没有测表型的这种图，我发一张其他染色的，不过你一看应该明白什么意思了。

图片附件: 80977951.jpg (2012-1-21 11:20, 47.05 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10293

作者: eric930    时间: 2012-1-21 11:21

abc816能否耐心解释一下，重叠后高的峰是否就是荧光强度大的细胞群 ？
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:22     标题: 回复 #227 eric930 的帖子

不是的，峰的高矮代表对应于横轴某一荧光通道的细胞数目的多少。
重叠后，处理组较未处理组图左移或者右移，分别代表荧光强度相对降低或升高。

另外我这张图不是染表型的，所以跟你的图还不太一样，你去试一下就知道了。
作者: eric930    时间: 2012-1-21 11:22

继续提问 ：
在我的实验中，因为细胞处理前后都有蛋白表达，只是表达量不同。那么在上流式时，是不是要用一管未处理且完全不染FITC的作对照，另未处理和处理的都染FITC作分析？还是未处理的染FITC作对照，处理的染FITC分析

我的细胞是在处理后蛋白表达减少，但不一定全部减少
谢谢专家解答
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:24     标题: 回复 #229 eric930 的帖子

最好要用一管未处理且完全不染FITC的作对照，另未处理和处理的都染FITC作分析。
未处理且完全不染FITC的作对照可以作为阴性对照，同时用于标定流式的仪器参数，未处理的作为阳性对照。然后比较处理后的荧光变化。
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-21 11:24


请教了了老师：感谢您前几次的热心帮助，我目前测定的CXCR4的结果部分已经出来了，但表达不高，正常人仅12％的表达，而白血病的表达也只有20％，我查过相关的文献，有报道白血病最高时可表达到90％以上，不知道您在以前测定CXCR4的表达时是否也遇到过低表达的情况，什么原因？中国人白细胞CXCR4的正常表达有没有一个标准值？
作者: toy    时间: 2012-1-21 11:25

我用美国Becton Dickinson 公司的FACSACalibur型号流式，正在测量全血中的 T, NK, NKT三种淋巴细胞的分布。开始一切结果都很正常，最近的结果出现了异常，T细胞(T3)比正常的位子高了，如下图所示。我用了正常对照（没有荧光染色的）设定，并且也做了 Compensation，但这T细胞的就是比正常的位子高（见图所示）。我找过公司的人，他们来两次也没有找到原因！ 请你帮我找一找原因，多谢了！

图片附件: 30457779.snap.jpg (2012-1-21 11:25, 65.92 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10294

作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:25

我用美国Becton Dickinson 公司的FACSACalibur型号流式，正在测量全血中的 T, NK, NKT三种淋巴细胞的分布。开始一切结果都很正常，最近的结果出现了异常，T细胞(T3)比正常的位子高了，如下图所示。我用了正常对照（没有荧光染色的）设定，并且也做了 Compensation，但这T细胞的就是比正常的位子高（见图所示）。我找过公司的人，他们来两次也没有找到原因！ 请你帮我找一找原因，多谢了！
另外，顺便问一下，流式细胞仪能不能测量细胞内钙的浓度，能的话，能不能给简单地介绍一下具体方法？多谢了！
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我作这个有千余，像这种情况碰到好多次，不仅仅在这种情况，还在其它CD3CD4等的检测中也会碰到，我的判断并不是仪器的条件或补偿不对，而是非特异结合，或者细胞内吞（或渗入）荧光物质造成（未得到确切证实，有待探讨）。像这种情况可以自己根据情况调节一下分界的MARKER，当然你的这副图上并没有影像分界，就没有必要调整了。
细胞内钙我没有测过，很多文章都有介绍，我的感觉不会太难，但是细节的问题，还是要具体操作才有体会。祝你顺利。
作者: toy    时间: 2012-1-21 11:26

非常感谢！
像这种情况可以自己根据情况调节一下分界的MARKER
你说的这个MARKER是指的什么？是我显示的右图中的分界线？其实，我在做正常对照时，这个分界线是设在10X10部位交叉，也就是正常对照控制在10X10部位以内，但分析结果后，T细胞上升，没有办法，我根据人为经验判断，把横行的分界线抬高了（见右图），不知道这样做是否合理？
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:27



QUOTE:
原帖由 toy 于 2012-1-21 11:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
非常感谢！
像这种情况可以自己根据情况调节一下分界的MARKER
你说的这个MARKER是指的什么？是我显示的右图中的分界线？其实，我在做正常对照时，这个分界线是设在10X10部位交叉，也就是正常对照控制在10X10部位以内，但分析结果后 ...

我同意应该自己根据情况上调。
作者: eric930    时间: 2012-1-21 11:27

我用FITC－lectin标记细胞 ，不知用什么溶剂溶解LECTIN ，一般是不是就用PBS 。sigma公司没有说明 ，烦您解答
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:28

我用FITC－lectin标记细胞 ，不知用什么溶剂溶解LECTIN ，一般是不是就用PBS 。sigma公司没有说明 ，烦您解答
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FITC-lectin我没用过，你为什么要溶解lectin呢？
作者: eric930    时间: 2012-1-21 11:29

不溶解lectin ，我怎么去标定细胞呢 ？直接拿干粉？ 只有芝麻粒大小啊
作者: moonlight45    时间: 2012-1-21 11:29

请教：观察药物作用12h、8h、4h、2h对靶细胞的影响。可以同时培养细胞，12h的药物先加入培养细胞中，过4个小时后，加入药物预定观察8h的细胞，那么4个小时后的细胞无论是细胞数还是细胞状态不是和4小时前的细胞不一样了吗？越到后面，细胞的起点不是差得更远了吗？细胞不在同一起点，能观察时效关系吗？
建议：（原来前面Schoman的回复应该是一般实验室作这类实验的常用方法，但你的考虑也有道理）
根据细胞生长的情况而定，建议设立一个对照组，就是同时培养12小时，而不加药物，用培养液和药物溶剂作空白对照
作者: moonlight45    时间: 2012-1-21 11:29

我用美国Becton Dickinson 公司的FACSACalibur型号流式，正在测量全血中的 T, NK, NKT三种淋巴细胞的分布。开始一切结果都很正常，最近的结果出现了异常，T细胞(T3)比正常的位子高了，如下图所示。我用了正常对照（没有荧光染色的）设定，并且也做了 Compensation，但这T细胞的就是比正常的位子高（见图所示）。我找过公司的人，他们来两次也没有找到原因！ 请你帮我找一找原因，多谢了！
-----根据我们的经验，似乎是补偿有些问题，FL2减Fl1的补偿还应该增加（补偿不足）， 而FL1减FL2的补偿应该降低（现补偿过度），尽管后者对百分率影响不大， 但前者对计算双阳性细胞，比如在这个例子中对NKT细胞的比例的计算就会有影响，
通常，FL1减 FL2 <0.5%（对PE而言）；FL2减FL1<25%(对FITC而言），但有的时候，确实会发生需要将FL2减FL1的补偿调整到 25%以上。,
作者: moonlight45    时间: 2012-1-21 11:30

我用美国Becton Dickinson 公司的FACSACalibur型号流式，正在测量全血中的 T, NK, NKT三种淋巴细胞的分布。开始一切结果都很正常，最近的结果出现了异常，T细胞(T3)比正常的位子高了，如下图所示。我用了正常对照（没有荧光染色的）设定，并且也做了 Compensation，但这T细胞的就是比正常的位子高（见图所示）。我找过公司的人，他们来两次也没有找到原因！ 请你帮我找一找原因，多谢了！
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你肯定补偿没有问题吗？根据我们的经验，应该是补偿有些问题，FL2减FL1的补偿还应该增加（现补偿不足）， 而FL1减FL2的补偿应该降低（现补偿过度），尽管后者对百分率影响不大，但前者对计算双阳性细胞，比如在这个例子中对NKT细胞的比例的计算就会有些影响。
通常，FL1减 FL2 <0.5%（对PE而言）；FL2减FL1<25% (对FITC而言），但有时候，确实会发生需要将FL2减FL1的补偿调整到 25%以上。另外，补偿数字的设定 与FL1和FL2的电压和放大参数设定有直接关系，这些也许都是flow的基本常识，这里多言了。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:30

不溶解lectin ，我怎么去标定细胞呢 ？直接拿干粉？ 只有芝麻粒大小啊
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好像博士德公司有专门的抗体稀释液。
PBS可以溶解，但是不利于保存，一般要加一些防腐剂和蛋白保护剂。
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:31

不溶解lectin ，我怎么去标定细胞呢 ？直接拿干粉？ 只有芝麻粒大小啊

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因为你写的不明不白，你说的FITC-lectin是指FITC标记的抗lectin抗体，还是FITC直接标记的lectin呢？如果是前者，那么你溶解的应该是抗体冻干粉，而不是lectin，是两个概念；如果指的是后者，那么我还没看过荧光染料直接标记lectin的，所以想学习学习，你想让FITC-lectin跟细胞上的什么蛋白结合。

我用过IMMUNOTECH公司的抗体冻干粉，里面平衡盐、NaN 3（防腐）和BSA（抗体保护）都已经加好的了，只加适量的蒸馏水溶解就可以。不知你买的抗体是什么情况，如果没有就自己加。
作者: eric930    时间: 2012-1-21 11:31

因为你写的不明不白，你说的FITC-lectin是指FITC标记的抗lectin抗体，还是FITC直接标记的lectin呢？如果是前者，那么你溶解的应该是抗体冻干粉，而不是lectin，是两个概念；如果指的是后者，那么我还没看过荧光染料直接标记lectin的，所以想学习学习，你想让FITC-lectin跟细胞上的什么蛋白结合。

我用过IMMUNOTECH公司的抗体冻干粉，里面平衡盐、NaN 3（防腐）和BSA（抗体保护）都已经加好的了，只加适量的蒸馏水溶解就可以。不知你买的抗体是什么情况，如果没有就自己加
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我买的就是sigma的fitc－lectin ，它不是抗原抗体反应，而是直接和内皮细胞上的某种糖残基结合，我估计就是一般的生化反应吧？：）
具体的我也不懂，它的产品上没有说清楚，但好像提到过用PBS.
作者: @STAR@    时间: 2012-1-21 11:32

小弟有一问题请教：GFP既然可发荧光，为何还需它的抗体，我发现有许多人还在买他的抗体。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:33     标题: 回复 #245 @STAR@ 的帖子

GFP的抗体是为了增强检测的敏感性，虽然细胞可以表达GFP，但经常会出现表达量少，难以检测到其荧光，加入抗体二抗之后，自然可以增强检测的敏感性。
作者: @STAR@    时间: 2012-1-21 11:33

首先感谢你的解答，关于GFP抗体小弟还有3个疑问：1、不同种属的GFP抗体各有何优点，如何选择使用鼠源抗还是兔源抗。2、EGFP的抗体能检测
GFP吗？3、为何抗体的说明讲有的可以用于蛋白印迹、免疫荧光，有的用于免疫沉淀等实验？
作者: rxcc33    时间: 2012-1-21 11:34

本人有多种DC抗体: CD1a CD40 CD54 CD80 CD83 CD86 MHC-I MHC-II
并有相应的同型对照: IgG1 IgG2a IgG2b

上述抗体均为Caltech(杭州联科代理)公司产品, 使用无任何问题, 但100Test的包装远远用不完,故愿如大家交流....

另有未开封的sigma公司的丝裂霉素C(细胞培养级)可供交流
作者: rxcc33    时间: 2012-1-21 11:34

我自己一般用1-2%，通常保存1-3天是可以的（可能具体细胞不玩全一样，我没有系统观察）。

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这只是书上这样说D...偶曾经试过保存7天对结果基本没有什么影响....
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-21 11:35

请教了了兄以及各位热心的学哥学姐，我们实验室最近来了一台流式细胞仪，我想利用他做XY精子的分离试验，其中有一个关键的步骤，就是分离好的X或Y精子重新上机分析，通过数学模型曲线拟合法（curve-fitting math model to fit to a double-gaussian-peak curve)比较出分离后的X或Y精子的百分率(Welch GR and Johnson LA Sex preselection: laboratory validation of the sperm sex ratio of flow sorted X- and Y-sperm by sort reanalysis for DNA Theriogenology 1999；52：1343–1352)。请问这一拟和比较是如何操作的？是否需要专门的数量统计软件？

图片附件: 46868233.jpg (2012-1-21 11:35, 43.71 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10295

作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:36     标题: 回复 #250 ladyhuahua 的帖子

我没有做过类似的实践，但是从图上看XY精子的区分是根据DNA的含量不同进行的。
在流式中分析细胞周期的modifit软件是专门分析曲线下的面积来进行百分比计算的。从作者给的图分析，其原理类似于modifit的软件原理。但是modifit软件的原理在其说明书上并没有给出原始的说明，是不是可以采用modifit软件来代替这种方法来进行百分比的分析？可以将两个峰分别人为的定为G0期和s期，然后分析其百分比。当然作者给出的double-gaussian-peak curve分析方法可能是经过验证有效的方法。不知道spss和sigmplot这类统计软件能否进行这样的分析。可以请统计学的高手帮忙。
作者: dog002    时间: 2012-1-21 11:36

检测胞核内抗原的表达，到底要不要固定呀？用Triton处理是在4度还是室温或是37度，时间10分钟够不够？一抗二抗的孵育呢？
我做了一次所有步骤都是在37度进行的，Triton 孵育了半个小时，结果细胞粘连很厉害，没法检测，不知是不是因为Triton的时间和温度处理的不对？
作者: yes4    时间: 2012-1-21 11:37

GFP的抗体是为了增强检测的敏感性，虽然细胞可以表达GFP，但经常会出现表达量少，难以检测到其荧光，加入抗体二抗之后，自然可以增强检测的敏感性。

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你好，理论上我懂了，但实际如何做，又因为GFP本身发荧光，加入一抗、二抗后，结果如何检测？
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 11:40

GFP的抗体是为了增强检测的敏感性，虽然细胞可以表达GFP，但经常会出现表达量少，难以检测到其荧光，加入抗体二抗之后，自然可以增强检测的敏感性。
小弟还有几个问题：1、不同种属的GFP抗体各有何优点，如何选择使用鼠源抗还是兔源抗。2、EGFP的抗体能检测
GFP吗？3、为何抗体的说明讲有的可以用于蛋白印迹、免疫荧光，有的用于免疫沉淀等实验？
请指教。多谢！
作者: junjie05    时间: 2012-1-21 11:41

在用流式细胞仪分析转化细胞的细胞周期时，可以发现有部分细胞表现为四倍体或者异倍体。请问此时如何确定细胞群的核型？是否等这些四倍体或者异倍体达到一定比例时，才能认为转化细胞的核型发生改变？如果是这样，那么这个比例应该是多少？如果不是这样，能否利用流式细胞仪来达到经典核型分析时结果，即如何用流式确定转化后细胞的核型是否发生改变？
作者: pengke1983    时间: 2012-1-21 11:45

我现在打算作胰岛B细胞的功能实验，当然首先要把B细胞分选出来。查了一些资料，称可以不用荧光染色，直接利用胰岛内A、B、D细胞的光散射特性即可对这三种细胞加以分离。在活细胞的光散射直方图上可见到两个峰，通过测定取自两个峰下的细胞Insulin、Glucagon、Somatostatin含量确定为B、A、D细胞。这里我有些不明白（没有实际操作经验），细胞分选是预先确定脉冲高度的。它这里是不是先把所有细胞过一遍，得到一个直方图，再根据得到的光散射信号确定每种细胞的脉冲高度分别分选？
另外，还有一个问题，因为要作B细胞的功能实验，细胞必须是活的，所以制成单细胞悬液后怎样固定？用70%冰冷乙醇会不会影响细胞功能？
多有打扰！万分感谢！
作者: rxcc33    时间: 2012-1-21 11:46

我是一位新手,准备做课题,想用FCM分离T细胞,请问在西安有实验条件吗?
另外,如果用磁珠分选,不知道联系那家公司,需要什么硬件条件?

谢谢指导!

（我的课题方向是观察淋巴组织中T细胞亚群,主要是Treg细胞亚群，比如Th1/Th2,或Tr1，或CD4＋CD25＋细胞的分布，数量和功能变化）
作者: yhz1973    时间: 2012-1-21 11:46

最近配了tris-氯化铵溶解红细胞，结果裂解后细胞成团，不知何故，请赐教。配方：90ml 0.16M氯化铵,10ml0.17Mtris缄，ph值7.2.
tris-氯化铵与BD公司的RBC裂解液相比，有优点吗？
那一种对白细胞的通透性有影响？
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:47

我是一位新手,准备做课题,想用FCM分离T细胞,请问在西安有实验条件吗?
另外,如果用磁珠分选,不知道联系那家公司,需要什么硬件条件?

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你在西安，去问问第四军医大学有没有带分选功能的流式细胞仪。最好是大型机，分选速度快，比如FACSvantage或者早期的FACStarplus。

如果用磁珠分选，首先要有磁性细胞分选器（MACS），目前国际上主要有德国美天旎（Miltenyi Biotech GmbH）和瑞典Dyanl biotech两大品牌。你可以到德国美天旎驻上海代表处的网址去看一下相关知识：cuturl('http://www.ebiotrade.com/macs/macs1.htm')，也可以跟他们了解一下能否代理做分选工作。就算有人提供分离器，分离柱和磁珠标记抗体肯定是要买的，总之比较贵，要有心里准备。
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:48

最近配了tris-氯化铵溶解红细胞，结果裂解后细胞成团，不知何故，请赐教。配方：90ml 0.16M氯化铵,10ml0.17Mtris缄，ph值7.2.
tris-氯化铵与BD公司的RBC裂解液相比，有优点吗？
那一种对白细胞的通透性有影响？

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我没用过加tris的裂解液，我们实验室长期用的是
NH4CL 8.29g
KHCO3 1.00g
Na2EDTA 37.2mg
溶于1000mL蒸馏水， pH 7.2-7.4， 效果一直很好。
注意：1. 裂解液一定要预热，37度即可。
2. 加裂解液后要混匀，但不要剧烈
3. 裂解时间不超过5min
4. 避光保存，最好一次不要配多，尽量新鲜。
作者: yhz1973    时间: 2012-1-21 11:48

我还想问细胞裂解完后离心还能看到RBC碎片吗？裂解液对细胞通透性有影响吗？这是在加入一抗，标的是细胞表面的抗原还是细胞浆内的部分，因为我做的那个因子细胞膜及细胞内都有表达。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:49

我还想问细胞裂解完后离心还能看到RBC碎片吗？裂解液对细胞通透性有影响吗？这是在加入一抗，标的是细胞表面的抗原还是细胞浆内的部分，因为我做的那个因子细胞膜及细胞内都有表达。

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细胞裂解后还能看到红细胞碎片，对细胞通透性有一定的影响。但是不至于让细胞膜穿透，抗体进入细胞内，与胞内抗原结合。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:49

最近配了tris-氯化铵溶解红细胞，结果裂解后细胞成团，不知何故，请赐教。配方：90ml 0.16M氯化铵,10ml0.17Mtris缄，ph值7.2.
tris-氯化铵与BD公司的RBC裂解液相比，有优点吗？
那一种对白细胞的通透性有影响？

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BD的裂解液保持细胞的形态要好于tris-氯化铵，但是BD的裂解液含有多聚甲醛，有细胞固定作用。所以对细胞的通透性影响较大，我曾用FITC标记annexin V来观察细胞膜的变化，结果发现BD的裂解液裂解后细胞膜受到了很大的破坏。因此想检测外周血细胞凋亡的时候，就不能用BD裂解液来破坏红细胞，而是采用离心分离法。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:50

我现在打算作胰岛B细胞的功能实验，当然首先要把B细胞分选出来。查了一些资料，称可以不用荧光染色，直接利用胰岛内A、B、D细胞的光散射特性即可对这三种细胞加以分离。在活细胞的光散射直方图上可见到两个峰，通过测定取自两个峰下的细胞Insulin、Glucagon、Somatostatin含量确定为B、A、D细胞。这里我有些不明白（没有实际操作经验），细胞分选是预先确定脉冲高度的。它这里是不是先把所有细胞过一遍，得到一个直方图，再根据得到的光散射信号确定每种细胞的脉冲高度分别分选？
另外，还有一个问题，因为要作B细胞的功能实验，细胞必须是活的，所以制成单细胞悬液后怎样固定？用70%冰冷乙醇会不会影响细胞功能？
多有打扰！万分感谢！

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分选靠的是细胞的荧光值，你的理解有些错误，分选时是检测到信号后，再捕获。
细胞经乙醇固定后已经死亡，不知你是什么功能试验。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 11:50

在用流式细胞仪分析转化细胞的细胞周期时，可以发现有部分细胞表现为四倍体或者异倍体。请问此时如何确定细胞群的核型？是否等这些四倍体或者异倍体达到一定比例时，才能认为转化细胞的核型发生改变？如果是这样，那么这个比例应该是多少？如果不是这样，能否利用流式细胞仪来达到经典核型分析时结果，即如何用流式确定转化后细胞的核型是否发生改变？

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我没有试过这种试验，但是分析异倍体确实很难，临床上有人建议检测检测异倍体来确定肿瘤，我觉得难度太大，放弃了。
作者: yhz1973    时间: 2012-1-21 11:51

我做细胞表面一种抗原的表达情况，是间接荧光标记，查文献看到别人在做这种活细胞染色的工作时要同时做PI染色去除死细胞，这就是我的现在的问题，要同时做PI，只能选一种对细胞通透性最小的裂解液，如果不成的话，只能放弃了。
不知这种死细胞对荧光染色有没有影响，还得请教各位
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:51

我做细胞表面一种抗原的表达情况，是间接荧光标记，查文献看到别人在做这种活细胞染色的工作时要同时做PI染色去除死细胞，这就是我的现在的问题，要同时做PI，只能选一种对细胞通透性最小的裂解液，如果不成的话，只能放弃了。
不知这种死细胞对荧光染色有没有影响，还得请教各位

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tris 对细胞通透性影响比较大，含有固定剂的裂解液就更不合适。
你可以试试你知道的几种配方，先不染抗体，只是裂解，用PBS洗过后染PI。如果PI阳性率很低证明没有问题，你可以进入正式实验，但要注意染完抗体并裂解后不能固定，PBS悬浮染PI；如果阳性率高，就要重新考虑方案。

死细胞会与抗体非特异结合，所以在双色荧光散点图上，这些细胞是双阳性的，呈对角的斜线，影响结果。

但用PI染色划除死细胞并不是所有的实验都必须的，因为死细胞通常SSC增大，而FSC缩小，一般可以通过设门划除。所以即使裂解液会影响细胞通透性，不能用PI方法来划除死细胞，也可以一试。

希望听到你的好消息。
作者: 西子    时间: 2012-1-21 11:52


我所在的实验室主要利用流式细胞仪进行药物的活性筛选，请问用流式细胞仪是否可以做治疗心脑血管方面疾病药物的活性筛选呢？应该用什么细胞？有没有现成的方法呢？请各位给予帮助及指教！谢谢：）
作者: mickeylin    时间: 2012-1-21 11:52

小弟是新手，准备用流式检测肝癌细胞DNA及细胞周期，请问：
1、检测DNA，放射性核素与流式那种方法更好一些？
2、如果用流式检测DNA及细胞周期，PI染液如何配制？这里有一个配方可以吗？
柠檬酸三钠 　 　　0.25g
Triton-X 100 0.75ml
Propidium iodide 0.025g
核糖核酸酶　　　　 0.005g
蒸馏水　　　　　　250ml
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:54

我现在遇到得一个问题是红细胞不能在五分钟之内裂解，令人气恼。

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我最近每天都做外周血，5分钟裂解的很好啊。
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:54

2、如果用流式检测DNA及细胞周期，PI染液如何配制？这里有一个配方可以吗？
柠檬酸三钠 　 　　0.25g
Triton-X 100 0.75ml
Propidium iodide 0.025g
核糖核酸酶　　　　 　0.005g
蒸馏水　　　　　　　　250ml

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Na2EDTA 0.1 mmol/L
Triton-X 100 0.1%
Propidium iodide 50 ug/mL
核糖核酸酶　　　　 50 ug/mL
溶于PBS
注意：上面写的都是终浓度。
作者: ha111    时间: 2012-1-21 11:55


组织分离成单细胞悬液时死细胞较多，渣子较多，如何处理？
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-21 11:55

问题：
我用流式细胞仪检测细胞内阿霉素的荧光强度，仪器在另外一个地方离我的实验室有一个小时的路程，请问标本处理一个小时后再检测会不会影响结果，路途中标本中要不要放入冰盒中？
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 11:56


我觉的你可以用目数大一点的网滤一次。至于死细胞，要注意你分离时的酶浓度和分离的速度了。
作者: abc816    时间: 2012-1-21 11:59

问题：
我用流式细胞仪检测细胞内阿霉素的荧光强度，仪器在另外一个地方离我的实验室有一个小时的路程，请问标本处理一个小时后再检测会不会影响结果，路途中标本中要不要放入冰盒中？

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想向你学习一下，细胞内阿霉素的荧光强度是如何检测的？也是抗原抗体法吗？

一般的流式样品一个小时后检测都没问题啊，有些也可以数天后才检测。常规都是放在冰盒中携带比较好
作者: abc816    时间: 2012-1-21 12:16

NH4CL 8.29g
KHCO3 1.00g
Na2EDTA 37.2mg
溶于1000mL蒸馏水， pH 7.2-7.4， 效果一直很好。
注意：1. 裂解液一定要预热，37度即可，裂解期间试管最好也能水浴；
2. 加裂解液后vortex 短时混匀；
3. 裂解5min后立刻离心（从所有管都混匀后计时间）；
4. PBS离心洗涤2次；
5. 裂解液pH值很重要，最好一次不要配多，时间长效果不好，我一般一次配100mL，避光保存。
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 12:17


各位：我用流式检测细胞内抗原的表达水平，同样的细胞同样的处理方式，结果两次检测的荧光强度相差很大，一次是平均在100左右，另一次在500左右，但是每次所反应的趋势还是基本一致的。不知这到底是细胞本身的差异性需要重复验证还是流式检测本身就不能保证可重复性，该不该重复了呢？写文章的时候都不知道该取哪一次数值好。
作者: abc816    时间: 2012-1-21 12:18

各位：我用流式检测细胞内抗原的表达水平，同样的细胞同样的处理方式，结果两次检测的荧光强度相差很大，一次是平均在100左右，另一次在500左右，但是每次所反应的趋势还是基本一致的。不知这到底是细胞本身的差异性需要重复验证还是流式检测本身就不能保证可重复性，该不该重复了呢？写文章的时候都不知道该取哪一次数值好。

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一般检测细胞周期DNA含量时用线性坐标轴，而利用荧光标记抗体检测抗原含量时用对数坐标轴，根据你的叙述好像用的线性坐标轴，能否把你的图传上来？
流式细胞术是一种可重复性非常好的检测手段，但样品处理要严格控制，包括细胞培养（处理）时间，细胞数，抗体量，染色时间等等都要保持前后一致。上机检测时仪器参数设置也不能变，这样才能保证重复性。
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-21 12:18


我测的是细胞表面一个抗原的表达水平,前面关于裂解液的问题Scheman与TCR还见仁见智.现在已经测完,我还是用的BD公司的裂解液,没有用PI除死细胞.
在结果处理的问题上有出现了问题,又要向各位请教.我的问题是:
MFI应该怎么计算,是那一部分的值.
作者: abc816    时间: 2012-1-21 12:19

这是其中的一个结果，能否告诉我MFI是那一部分
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MFI即mean fluorescence intensity 是平均荧光强度的意思，就是图中mean下面对应的数字，第一个图是8.32，第二个图是50.43。
作者: DNA    时间: 2012-1-21 12:21


兄弟请教问题：
1、为什么有关DC的文章都不测TH1/Th2?
2、大鼠抗小鼠单抗杂交瘤细胞株B220/CD45R抗B细胞和 B21.2抗I-a阳性细胞用来干嘛的?好象文献上只标明CD3、CD4、CD8、NK1.1的结果嘛！那前面这两抗体测什么的呢？
3、文献上说的流式细胞仪抗CD3抗体是什么啊？
4、经抗原肽刺激的C57BL/6小鼠DC表型流式常测那些分子？
作者: dotaaa    时间: 2012-1-21 12:22

一般检测细胞周期DNA含量时用线性坐标轴，而利用荧光标记抗体检测抗原含量时用对数坐标轴，根据你的叙述好像用的线性坐标轴，能否把你的图传上来？
流式细胞术是一种可重复性非常好的检测手段，但样品处理要严格控制，包括细胞培养（处理）时间，细胞数，抗体量，染色时间等等都要保持前后一致。上机检测时仪器参数设置也不能变，这样才能保证重复性。
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因为没有工具所以无法扫上图象。所用的是线形坐标轴，后来我又测了一次，结果未加药组荧光强度绝对数是差不多的（一次489.19，另一次459.26），但两次加药后荧光强度升高百分数又相差比较远了（一次25.63％，另一次52.3％）。这到底是怎么回事？？我加药及处理绝对一致的。
作者: flower-201    时间: 2012-1-21 12:22

准备做有关细胞周期的一些东西，不知S学长和TCR学长能否给一些建议呢？
我初步设想是通过FSM分选不同时相的细胞，然后再进行分析。可是，是否能通过FSM来分选到细胞？而且在经过各种处理后，会不会对我要继续检测的指标（一些细胞周期调控的重要因子）有影响呢？
作者: flower-201    时间: 2012-1-21 12:24


我想利用细胞流式仪测定实验组和对照组细胞的增殖的能力。
不知能行否？ 是不是要用BrdU标记？
小弟还是第一次用细胞流式仪，请高手指点！
作者: abc816    时间: 2012-1-21 12:24

准备做有关细胞周期的一些东西，不知S学长和TCR学长能否给一些建议呢？
我初步设想是通过FSM分选不同时相的细胞，然后再进行分析。可是，是否能通过FSM来分选到细胞？而且在经过各种处理后，会不会对我要继续检测的指标（一些细胞周期调控的重要因子）有影响呢？

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你打算用什么方法标记细胞周期呢？只要你选用的方法能鉴别出不同时相的细胞，分选是没问题的。
另外用什么方法检测细胞周期调控因子？如果也用流式为何不同时标记呢?
因为一般标记细胞周期的染料，比如PI，标记后分选的细胞应该没有活力了。
作者: abc816    时间: 2012-1-21 12:24

我想利用细胞流式仪测定实验组和对照组细胞的增殖的能力。
不知能行否？ 是不是要用BrdU标记？
小弟还是第一次用细胞流式仪，请高手指点！！

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用BrdU标记是可以的。
作者: 969    时间: 2012-1-21 12:27

请问，我要做PE-FITC-的双染，需要买同型抗体么？非常感谢！
作者: 969    时间: 2012-1-21 12:29


问过试剂公司的人，说是很少有人买同型抗体的！不知为什么？使用阴性对照就可以了么？
作者: 969    时间: 2012-1-21 12:38

若要标记三种表面抗原，除了PE- FITC-,再选什么标记能取得最好的区分呢？
作者: 盼盼    时间: 2012-1-21 12:39

可是目前我还没有找到合适的方法!我还想问一下,hoechest是否能用于分选细胞呢?而且,关于不同时相的细胞的分选,我应该查阅哪一方面的文献呢?真是不好意思,我对于这方面真的是一点都不懂!
谢谢
作者: 生物迷    时间: 2012-1-21 12:39     标题: 回复 #290 盼盼 的帖子

hoechest是能用于分选，但不知道你们的流式仪能不能做，因为它要用UV激发。
作者: +小生怕怕+    时间: 2012-1-21 12:40


我最近准备用流式细胞仪测th1/th2,请问用cd4标记还是cd3+/cd8-标记好，前者可行吗?另外，用全血或先分离出淋巴细胞做都行吗？
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 12:41


求助：
请问各位，用流式测细胞内的pH时,矫正曲线该怎么做？
作者: qqq111    时间: 2012-1-21 12:41

我刚刚接触流式细胞术，请问流式细胞仪能否分别检测出Th1和Th2淋巴细胞．能告诉我大概的方法吗？
作者: 社会主义好    时间: 2012-1-21 12:42

请教：

流式中，是否可以使用人的CD荧光抗体代替大鼠的，来检测大鼠CD表面抗原？

谢谢大家！
作者: hyuu    时间: 2012-1-21 12:42


我用流式细胞 术测细胞内蛋白，细胞用4%多聚甲醇固定，后破膜，加一抗, 但在加二抗的时候发现FITC标记的二抗不够，现在重新将细胞加一抗置于4度冰箱保存，不知过夜后明天能否继续加二抗上流式,对结果有没有影响？请有经验者指教，不胜感激！（很急！！！）如果能这样保存的话，最多能放多久？
作者: guagua    时间: 2012-1-21 12:43

若要标记三种表面抗原，除了PE- FITC-,再选什么标记能取得最好的区分呢？

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可以用Tc-啊 ，我们经常用的 很不错
作者: vvmmoy    时间: 2012-1-21 12:43


本人因试验初做流试，请教一个简单问题，请勿见笑。
我做单核细胞HLA－DR，用过的试管能洗后再用吗？若能，如何洗？
我不是要节约管子，而是订的试管未到才出此下策。
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-21 12:44

我刚刚接触流式细胞术，请问流式细胞仪能否分别检测出Th1和Th2淋巴细胞．能告诉我大概的方法吗？

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你可以到cuturl('www.gotofcm.com')上去查，这是联科公司的网站。
作者: wu11998866    时间: 2012-1-21 12:44

你好！我有几个问题向您请教：
1. 如何用Rhodamine 123在流式上检测细胞凋亡？结果应该是如何的？
2. 您知道如何使用 WinMDI 这个软件吗？我一直不知道如何在细胞群中选一个Gate去分析，选了之后，按什么选项？
非常感谢！
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-1-21 12:44


有谁用流式细胞仪分离小鼠外周血的树突状细胞吗？指点一下！
作者: tangxin_80    时间: 2012-1-21 12:45


BD公司有专门的破膜剂（PERM2），如果太贵的话可以自己配制，但我目前还不知道具体的配方。如果有谁知道请告知？
作者: tangxin_80    时间: 2012-1-21 12:45


那就要看你所使用的机器了，如果是BD的FACSCALIBUR四色的话，
你可选PerCP和APC，如果是三色的话，只能选PerCP
作者: tangxin_80    时间: 2012-1-21 12:51


你最好是选用CD3/CD4/CD8，因为有文献报道，三色的准确性要比二色或单色的好，你可查一下北大王建中流式方面的文章，大体题目是：流式细胞仪检测淋巴细胞亚群的方法学研究。
作者: tangxin_80    时间: 2012-1-21 12:52

我刚刚接触流式细胞术，请问流式细胞仪能否分别检测出Th1和Th2淋巴细胞．能告诉我大概的方法吗？

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你可以到cuturl('www.gotofcm.com')上去查，这是联科公司的网站。

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你最好是选用CD3/CD4/CD8，
你可查一下北大王建中流式方面的文章，大体题目是：流式细胞仪检测淋巴细胞亚群的方法学研究。
作者: tangxin_80    时间: 2012-1-21 12:52

可以用Tc-啊 ，我们经常用的 很不错

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还可选PerCP和APC
作者: 了了    时间: 2012-1-21 12:53

这是其中的一个结果，能否告诉我MFI是那一部分
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MFI如TCR所言，是平均荧光强度。同时该图中还给出一个geo mean，是几何均数。这两个指标均可以表示细胞抗原的强弱，但是后者由于采用了几何均数，所以统计的时候，组内的SD可能会小些。由于统计时一般要求方差齐，所以如果MFI方差不齐，可以采用geo mean进行统计分析。

图片附件: 84503630.jpg (2012-1-21 12:53, 19.75 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10296

作者: 了了    时间: 2012-1-21 12:53

请教：
流式中，是否可以使用人的CD荧光抗体代替大鼠的，来检测大鼠CD表面抗原？
谢谢大家！

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我没有试过，如果抗体有交叉，可能行（凭我的感觉单抗一般不行，厂家在生产时，已经检测过了）。但是没有必要这样做，有专门的抗大鼠的抗体。
作者: eric930    时间: 2012-1-21 12:54

我没有试过，如果抗体有交叉，可能行（凭我的感觉单抗一般不行，厂家在生产时，已经检测过了）。但是没有必要这样做，有专门的抗大鼠的抗体。

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现在手里的的确是单抗，看来是不行了。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 12:55

若要标记三种表面抗原，除了PE- FITC-,再选什么标记能取得最好的区分呢？

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可以选用percp和cyc标记。同型对照严格要求是需要的，但是由于大多数抗体的特异性较好，特别是细胞表面的CD分子，很容易检测，往往可以用阴性对照来替代，省掉一笔开支。
如果检测结果不好，或者检测的抗原很低，阴性和阳性的对照界限不清，或者检测细胞内的抗原，还是需要同型抗体的，这对于检测结果的准确非常重要。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 12:55

本人因试验初做流试，请教一个简单问题，请勿见笑。
我做单核细胞HLA－DR，用过的试管能洗后再用吗？若能，如何洗？
我不是要节约管子，而是订的试管未到才出此下策。

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可以，直接刷洗。最好清洗后高压消毒 ，如果是血标本，有很多有肝炎病毒等传染病。
作者: utt0989    时间: 2012-1-21 12:56

本人想购买大鼠抗小鼠的B7-2单抗、大鼠抗小鼠的H-2K(右上角b)单抗、大鼠抗小鼠的I-A(右上角b)单抗
大鼠抗小鼠的CD3、CD4、CD8、NK1.1 用做小鼠测TBNK
大哥，哪儿有买啊，确切一点，我在上海啊。
作者: whitesheep    时间: 2012-1-21 12:57

我想用流式细胞仪检测肝细胞中的HBV DNA，请各位高手指点一下具体的方法。
作者: 彼岸花opp    时间: 2012-1-21 12:57


请教大侠：用流式细胞仪检测细胞凋亡结果可靠吗？是不是还需要做TUNEL法检测证实吗？还是二者结合更好？
作者: 了了    时间: 2012-1-21 12:58

本人想购买大鼠抗小鼠的B7-2单抗、大鼠抗小鼠的H-2K(右上角b)单抗、大鼠抗小鼠的I-A(右上角b)单抗
大鼠抗小鼠的CD3、CD4、CD8、NK1.1 用做小鼠测TBNK
大哥，哪儿有买啊，确切一点，我在上海啊。
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为什么一定要买大鼠抗小鼠的抗体？其它种属来源的也可以检测。
常用的抗体的定购公司是
晶美
联科
达科为
基因公司
苏州基因
等。你可以查到他们的电话，自己比较一下。
作者: 缘yuan    时间: 2012-1-21 12:58

可以，直接刷洗。最好清洗后高压消毒 ，如果是血标本，有很多有肝炎病毒等传染病。

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直接用清洗剂洗后，用超声清洗就可以了，但不如新的效果好
作者: misswu61    时间: 2012-1-21 12:59

我是一只刚涉入流式的莱鸟，有很多问题请教。现在检测了白血病K562细胞株的细胞周期分析，发现结果不理想，表现为：在第二张散点图上细胞DNA积分由低到高几乎均匀呈斜线分布，不能反映明显的细胞周期。如果与正常对照相比，表现为异倍体细胞含量很多。对这样的情形不知道该如何分析？
作者: toy    时间: 2012-1-21 12:59

介绍一本新书，不能下载的留条

cuturl('http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/booktoc?ID=89011951')

Flow Cytometry: First Principles (Second Edition)

Published Online: 27 Dec 2001

Author: Alice Longobardi Givan

ISBN: 0471223948 (Electronic) 0471382248 (Print)
Copyright © 2001 by Wiley-Liss, Inc.
作者: 了了    时间: 2012-1-21 13:00

请教大侠：用流式细胞仪检测细胞凋亡结果可靠吗？是不是还需要做TUNEL法检测证实吗？还是二者结合更好？

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流式结果可靠，前提条件是处理没问题。
tunel当然可以进一步说明问题，两者结合会更好。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 13:00

我是一只刚涉入流式的莱鸟，有很多问题请教。现在检测了白血病K562细胞株的细胞周期分析，发现结果不理想，表现为：在第二张散点图上细胞DNA积分由低到高几乎均匀呈斜线分布，不能反映明显的细胞周期。如果与正常对照相比，表现为异倍体细胞含量很多。对这样的情形不知道该如何分析？？？

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我一直用modifit软件分析细胞周期，你的结果我想软件应该能够分析。
作者: fsdd817    时间: 2012-1-21 13:00

我初做流式，检测th1/th2，关于方法学请教：
步骤：
1、淋巴细胞加了刺激剂后，直接在试管中放入co2箱中incubating,还是放入培养板中啊
2、标记TH细胞用cd4行吗，还是必须用cd3+/cd8-
3、三色法、四色法相差大吗，哪个方便。
作者: 小糖块    时间: 2012-1-21 13:01

有关流式细胞仪以下几个问题：
1实体瘤组织（如乳腺癌）可以用流式细胞仪做膜蛋白吗？实体瘤组织制成单细胞悬液会不会造成膜蛋白大量损伤？
2同时作几个指标时，是否必须用直接法及双标或多标？
有关于“实体瘤”的流式细胞仪的检测胞膜或胞奖蛋白（非DNA）的材料 ，尤其具体步骤，帮我收 集一下。拜托，多谢！！！急用。
作者: yychen    时间: 2012-1-21 13:01

我是做的不同时间点的抗原量的变化，然后阴性对照也不是同一管的，所以最后比较结果时，对于这个平均荧光强度的比较有点迷茫，有个老师告诉我用标本的MFI比对照的MFI的数值来前后比较。不知道你们都是怎么作的。
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 13:02

您可否为我查一下检测细胞内PH值时的pH标准曲线怎么做，我这里资料太少，谢谢。
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 13:02

我现在在做细胞内pH，你如果有这方面的资料，可以给我推荐点吗，尤其是那条标准曲线的制作。
作者: junhun    时间: 2012-1-21 13:03

其实，bcl-2部分就是在细胞核内的，如果按照bcl-2的做法打多一次孔即可，不知可否？
作者: 薄荷侠    时间: 2012-1-21 13:03

我想请教临床上做白血病细胞免疫分型时，当怀疑为杂合白血病时，你会怎样组合单抗做双标？是不是需要临床在送检单上注明怀疑髓系合并淋系，或是双表型，双克隆？
此外免疫分型时做CD29有什么意义吗？
作者: abc816    时间: 2012-1-21 13:04

我初做流式，检测th1/th2，关于方法学请教：
步骤：
1、淋巴细胞加了刺激剂后，直接在试管中放入co2箱中incubating,还是放入培养板中啊
2、标记TH细胞用cd4行吗，还是必须用cd3+/cd8-
3、三色法、四色法相差大吗，哪个方便。

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1. 淋巴 细胞一般放到培养板中培养。
2. 你用什么刺激剂？如果是PMA或PDB＋ionomycin刺激，人的CD4细胞的CD4分子下调非常明显，不能用CD4直接标记，要用CD3+CD8- ;如果是小鼠的细胞，CD4虽有所下调，但仍能分辨，可以直接用CD3+CD4+，但只用CD4不可取，因为单核细胞也可表达CD4。
3. 如上所述，检测时使用两种标记细胞亚群的CD分子抗体，再加上一种细胞因子抗体，应该是三色荧光标记；如果是同时检测2种细胞因子就是四色荧光标记。一般来讲用荧光种类越多，对操作者的要求越高，荧光补偿调得漂亮不容易。
作者: fei1226com    时间: 2012-1-21 13:05

请问可不可以用双染色-流式细胞术检测培养的内皮细胞的NF-kB?
其中使用到NF-kBp65单克隆抗体，用FITC标记的IgG做阴性对照。
如果不行的话，请高手指点用其它便宜的方法检测培养的EC的NF-kB。
用EMSA法检测太贵了。
谢谢！
作者: 了了    时间: 2012-1-21 13:05     标题: 回复 #329 fei1226com 的帖子

我正准备建立NF-kBp65的流式检测方法。目前尚无结果，好像国外有人已经发表结果了。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 13:06

我想请教临床上做白血病细胞免疫分型时，当怀疑为杂合白血病时，你会怎样组合单抗做双标？是不是需要临床在送检单上注明怀疑髓系合并淋系，或是双表型，双克隆？
此外免疫分型时做CD29有什么意义吗？

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我没有太多经验，通常我是所有表型一起检测。需要增加再进一步染色。
作者: 了了    时间: 2012-1-21 13:06

BD 网站上还是有不少好东西。
这两个资料肯定是流式检测者常用的东西。
cuturl('http://www.bdbiosciences.com/spectra/')
系统形象的介绍了荧光标记的光谱，选择抗体的时候可以参照。
cuturl('http://www.bdbiosciences.com/pdfs/mouse_alloantigens_chart.pdf')
我想很少有人会记住这张表，还是把它收藏起来吧，哪天说不定能用的上。
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-21 13:06

“我一直用modifit软件分析细胞周期，你的结果我想软件应该能够分析。”

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了了兄：我用modifit软件分析细胞周期，可它不能分析凋亡的百分率，它显示G0/G1期前都为碎片，是怎么回事？那G0/1期前的凋亡峰是怎样分析出的？
我想将我的图片上传给你看一下，可我不知怎么上传呢？
另外，我想问一下：你做白血病的免疫分型吗？如果做的话，你能介绍一点入门的资料吗？我准备做，首先要去买抗体，我还没定下来要选哪些？
作者: junjie05    时间: 2012-1-21 13:07



QUOTE:
原帖由 ladyhuahua 于 2012-1-21 13:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
“我一直用modifit软件分析细胞周期，你的结果我想软件应该能够分析。”

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了了兄：我用modifit软件 ...

1. 我想你可能选择的是auto的分析方式，只要你不去指定软件分析凋亡，那么软件是不会主动识别凋亡的。因此你需要做的是在mode的选项中选择fit apoptosis，然后再来分析。
2. 我这里有一些白血病入门的资料，是.pdf格式的，另外买抗体之前，最好先决定你需要检测哪些抗原表达，怎么搭配才能最好的诠释结果，哪些是
用来初筛的，哪里是用来进一步定型的。
作者: junjie05    时间: 2012-1-21 13:07

我是做的不同时间点的抗原量的变化，然后阴性对照也不是同一管的，所以最后比较结果时，对于这个平均荧光强度的比较有点迷茫，有个老师告诉我用标本的MFI比对照的MFI的数值来前后比较。不知道你们都是怎么作的。

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我个人认为做抗原量的变化最好是做荧光定量，它的结果显示为每个细胞的抗体结合数，如果你知道抗原抗体的化合价，就可以得到每个细胞上的抗原表达量。这种方法可以说是抗原的绝对定量，所以可以避免每次实验处理及机器状态对于结果比较的影响。但这种方法目前来说还是有些限制，抗体需要特殊制作，BD公司提供了一些现成的荧光定量抗体，如HLA-DR,CD64,CD38,CD20,CD3,CD19,CD8 等，但不是太全。

若不用荧光定量，是可以用MFI来进行相对比较，抗原表达多则MFI大。这种方法下，我觉得阴性没有太大意义，你所需要的是做一个你的实验对照组。阴性只是用来确定阳性的位置，而不参与比较。
作者: junjie05    时间: 2012-1-21 13:08

我想用流式细胞仪检测肝细胞中的HBV DNA，请各位高手指点一下具体的方法。

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有人用flow-fish来检测细胞内的特异性核酸，你可以到medline上搜索，试试看，不过很遗憾我自己没有条件做。
作者: bohe221    时间: 2012-1-21 13:08


请教各路英雄：
我目前采用Annexin-V的方法检测脑组织海马神经元的凋亡，但结果与tuunnel免疫组化和采用凋亡周期检测方法得到的结果出入很大。比如正常大鼠海马神经元凋亡率，前人采用tunnel法约10%，而我用流式做了几次都只有0.8%~1%。我非常希望高手解惑，并指点关于Annexin-V的一些技术要点。不胜感激！
作者: bamboo16    时间: 2012-1-21 13:08

我觉得可以。请注意以下几点：
实际上使用的血非常少，可以减少取血的量。
采血
EDTA抗凝采血（枸橼酸抗凝不是很合适。），取后段血。因前段血中可能有组织液存在，造成人为血小板活化。

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我有看到一些介绍流式检测血小板活化的文献(如Preparation of Sample for studying platelet function by flow cytometry.Lori A.Krueger,Marc R.Barnard,A.L.Frelinger III,Mark I.Mark I.Furman,and Alan D.Michelson Center for platelet function studies,University of Massachusetts Medical School,Worcester,MA)有提到：Sodium citrate(a weak calcium chelator ) is the most commly used,EDTA(a stong calcium chelator)should be avoided because it causes dissociation of the integrinαⅡbβ3(GPⅡb-GPⅢa)complex,Heparin should also be avoided because it binds to,and may activate platelets.Non-chelating anticoagulants,e.g.PPACK(a direct thrombin inhibitor),may be preferable.
作者: loli    时间: 2012-1-21 13:09     标题: 回复 #338 bamboo16 的帖子

我的概念中也是这样，枸掾酸纳是通常用于血小板活化的抗凝剂，EDTA和肝素都不合适，去血时不能扎绷带。BD公司的真空采血管中有一种加有抑制血小板体外活化的物质，不知能否用于流式检测血小板活化，一直想去试试，希望能有机会。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-21 13:09

我也正在做流式，有一点不明的是我做的实验室老师没有说细胞浓度的问题，只要求细胞的个数达到1万个即可，而在其他地方检测的同学被告之还需要考虑细胞的 浓度，我们都是检测细胞抗原的含量，不知是否要注意浓度的 问题？
作者: eric930    时间: 2012-1-21 13:10

我作了细胞上某蛋白表达的流式 ，因为要比较，所以两条曲线要放在一张图上 ，可是我们这里的操作员不会 ，我只有上这来请教了 ，是美国BD。听说峰值曲线是可以放在一起的 ，希望原来做过类似试验的群友也来帮忙
作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-21 13:11

我作了细胞上某蛋白表达的流式 ，因为要比较，所以两条曲线要放在一张图上 ，可是我们这里的操作员不会 ，我只有上这来请教了 ，是美国BD。听说峰值曲线是可以放在一起的 ，希望原来做过类似试验的站友也来帮忙

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操作如下：1. 只有直方图是可以进行叠加的，因此，你首先需要选择直方图，显示曲线1；
2. 然后进入plot 下拉式菜单，点击overlay命令，选择你需要叠加的曲线的data，打开数据即可将两个曲线叠加在一起了。
希望能帮到你。
作者: dog002    时间: 2012-1-21 13:11

我看到好多标记细胞表面标志的protocol,但是差异很大，有的要用荧光标记的同源的IgG做对照，我没有买这个抗体，可以用空白细胞做对照么？
还有在标记时，用双标的话可以同时加入两种抗体么？
有没有比较好用的protocol，可以贴上来一份么？
非常非常感谢！
作者: toy    时间: 2012-1-21 13:12

请教各位高手：
我目前采用Annexin-V的方法检测脑组织海马神经元的凋亡，但结果与tunel免疫组化和采用凋亡周期检测方法得到的结果出入很大。比如正常大鼠海马神经元凋亡率，前人采用tunel法约10%，而我用流式做了几次都只有0.8%~1%。另外，试剂说明上要求一小时内尽快做，但实验室老师认为要求没有那么严格。所以我一般下午2点开始，5点才上机。不知阳性率低是否与此有关。我非常希望高手解惑，并指点关于Annexin-V的一些技术要点。不胜感激！

为什么没有人愿意回答我的问题？我好郁闷。
作者: 铜雀    时间: 2012-1-21 13:12

请教各位高手：
我目前采用Annexin-V的方法检测脑组织海马神经元的凋亡，但结果与tunel免疫组化和采用凋亡周期检测方法得到的结果出入很大。比如正常大鼠海马神经元凋亡率，前人采用tunel法约10%，而我用流式做了几次都只有0.8%~1%。另外，试剂说明上要求一小时内尽快做，但实验室老师认为要求没有那么严格。所以我一般下午2点开始，5点才上机。不知阳性率低是否与此有关。我非常希望高手解惑，并指点关于Annexin-V的一些技术要点。不胜感激！

为什么没有人愿意回答我的问题？我好郁闷。

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1.我觉得前人的和自己的结果应该比较价值不大，因为每个人的样本收集及处理过程及采样条件不可能保证完全一样。主要是自己的不同实验组相互比较得出有用的结论。
2.流式要得到好的漂亮的正确结果，处理样本处理的要好，仪器条件的正确调节也很重要。
3.试剂说明上要求一小时内尽快做，应该是有其道理的，比如时间长了荧光会萃灭减弱，或者细胞本身的凋亡率会整加等，这些都会影响最终的结果。
4.另外，标准的染色步骤为（以BD的Annexin V : FITC Apoptosis Detection Kit II试剂盒为例 ）：
Staining
1. Wash cells twice with cold PBS and then resuspend cells in 1X binding buffer at a concentration of 1 x 106 cells/ml.
2. Transfer 100 µl of the solution (1 x 105 cells) to a 5 ml culture tube.
3. Add 5 µl of Annexin V-FITC and 5 µl of PI.
4. Gently vortex the cells and incubate for 15 min at RT (25°C) in the dark.
5. Add 400 µl of 1X binding buffer to each tube. Analyze by flow cytometry within one hour.
其中商家提供的binding buffer中含有Ca+，它好像和annxin v与PS之间的结合有关，不知您是否使用相应溶液作为反应体系，它可能会影响最终结果。

希望罗嗦的这些有用
作者: eric930    时间: 2012-1-21 13:13

请教了了兄 ：
我作了细胞上某蛋白表达的流式 ，因为要比较，所以两条曲线要放在一张图上 ，可是我们这里的操作员不会 ，我只有上这来请教了 ，是美国BD。听说峰值曲线是可以放在一起的 ，希望原来做过类似试验的站友也来帮忙

操作如下：1. 只有直方图是可以进行叠加的，因此，你首先需要选择直方图，显示曲线1；
2. 然后进入plot 下拉式菜单，点击overlay命令，选择你需要叠加的曲线的data，打开数据即可将两个曲线叠加在一起了。
希望能帮到你。

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谢谢张兄的帮忙 ，我去试试
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 13:13

紧急求援啊！！！
了了,&各位高手！！！
我看到好多标记细胞表面标志的protocol,但是差异很大，有的要用荧光标记的同源的IgG做对照，我没有买这个抗体，可以用空白细胞做对照么？
还有在标记时，用双标的话可以同时加入两种抗体么？
有没有比较好用的protocol，可以贴上来一份么？
非常非常感谢！
作者: moonlight45    时间: 2012-1-21 13:15

紧急求援啊！！！
了了,&各位高手！！！
我看到好多标记细胞表面标志的protocol,但是差异很大，有的要用荧光标记的同源的IgG做对照，我没有买这个抗体，可以用空白细胞做对照么？
还有在标记时，用双标的话可以同时加入两种抗体么？
有没有比较好用的protocol，可以贴上来一份么？
非常非常感谢！！！

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1。流式实验一般都需要选用同型对照，目的是为了扣除非特异性染色。空白对照往往不能很好的替代它，往往会造成由空白对照设定阴阳性界限所得到的样本的阳性率会比实际高，就因为空白对照不能扣除非特异性染色。当然，对某些抗原其阴阳性之间有很明确的区分的，可以不做对照有经验的操作者也能得到很好的结果。对那些抗原由低到高连续表达的，一般还是有必要做同性对照的。
2。在做多色标记时，抗体选择合理的情况下当然是可以同时加的。
3。详细的protocol见上一贴。
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 13:17

不过当时买抗体时没有定同型抗体，这可怎么办呢？？！！
“某些抗原其阴阳性之间有很明确的区分的，可以不做对照”不知该怎样界定？象小鼠CD11c和 CD11b（这两个是小鼠树突状细胞DC的表面标志）算不算这个范围内的抗体呢？抗原由低到高连续表达的这一种表面标志是不是比较普遍？我看好多二维图都是UR、UL、LR之间交界的地方或多或少存在一些点，是由低到高连续表达的吧？
不知谁有isotype Rat(DA)IgG2b和Armenian Hamster IgG1 ?这是说明书上标的同型。
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 13:23


我的样本是从小鼠脾脏，制备成单细胞，然后测其中DC的含量。
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 13:24

sotype Rat(DA)IgG2b FITC标记
和 Armenian Hamster IgG1 PE标记
若是没有这两个同型对照，不知对实验结果的影响大不大？
作者: greenbee    时间: 2012-1-21 13:24

我现在准备作骨髓间充质干细胞的表面抗原分子鉴定，而流式细胞术对我来说是空白一片，菜鸟一个，我有以下问题请教：
1 什么是同型对照，阴性对照，阳性对照？
2 我需做CD29(+),CD44(+),CDw90(+),CD34(-),该如何设计试验，既经济又高效？
3 没有阳性对照，只有阴性对照和同型对照可不可以？
非常感谢各位
作者: 气泡    时间: 2012-1-21 13:25

请问我做的是内皮祖细胞的鉴定，
要求用CD133的流式细胞仪，
请问CD133哪有卖，除了买带荧光的CD133外还要对照剂吗，
对照剂是买什么，有亚型之分吗？
谢谢！
请哪位大虾赐教
作者: TNT    时间: 2012-1-21 13:26

请教，对细胞杀伤无周期特异性的药物作用肿瘤细胞后，在流式细胞中能否反映出，用什么方法？谢谢
作者: abc816    时间: 2012-1-21 13:27

请教，对细胞杀伤无周期特异性的药物作用肿瘤细胞后，在流式细胞中能否反映出，用什么方法？谢谢

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如果你的药物对细胞杀伤无周期特异性，是否检测每组的活细胞数就能达到你的目的了？这样你可以选择MTT、WST-1等检测活细胞的方法。
如果想用流式细胞术可以在培养结束后取出各组细胞染PI，检测死细胞（或活细胞）百分率。
作者: sunnyB    时间: 2012-1-21 13:27

我购买的试剂是北京宝赛公司的产品，我已用阳性株试过，应该可以排除试剂和方法的问题。但由于我做的是实体组织，所以做流式的老师在划分象限时有一些困难。正如你所说annxin-v检测的是早期凋亡细胞，我说的0.8~1.0%的阳性率也是指单阳性，虽然与tunel和周期的方法有本质不同，但由于出入太大，所以还是有些不自信。毕竟0.8~1.0%的数值有可能是假阳性？
文献上介绍annxin-v双阳性主要为严重坏死的细胞。但我们研究所做流式的老师认为严重坏死的细胞核已崩解，染不上pi，所以双阳性应该代表晚期凋亡，早期坏死的细胞。不知jadezhang兄对此有何看法。
再次感谢各位的回帖。
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 13:28

同型对照的非特异染色是在流式细胞仪的电脑里由应用程序扣除掉，还是自己拿到这两张十字图，再进行后期处理？我们这儿操作流式仪的人以前不知道同型对照，也没有扣除过同型对照的非特异染色，说只是由他检测，其余都是自己回去处理云云！不知是否如此？再，我们所的仪器是黑白的那种，且只能打给我们一份结果，没有电脑备份
作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-21 13:28

1。同型对照是和你的抗体同来源同亚型同标记的一种蛋白，主要为了扣除非特异性结合产生的本底，阴阳性对照通常是已知阴性或阳性的标本用于检验实验设计，操作及试剂质量等方面的可靠性，相当于质控。一般流式实验同型对照做的最多，后两者相对较少做；
2。不知您要测的这几种抗原的阴阳性是必须同时具备的才是你要的骨髓间充质干细胞吗？若这样的话，在仪器条件合适下，最好进行四色标记，即四种抗体分别选择不同的荧光染料。有点纳闷的是:为什么CD34-？会不会是CD34+？具备你所描述的表型就一定是骨髓间充质干细胞吗？
多多交流，共同进步！

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我这样做的目的只是作为此细胞的表型鉴定, 当然还不能确定一定是骨髓间充质干细胞,比如还得做其分化特性的鉴定.CD34-是造血干细胞的标记,这样就可以表明MSC 是骨髓中区别于造血干/ 祖细胞的一群未分化的非定向干/ 祖细胞。
多多交流，共同进步！
作者: HP007    时间: 2012-1-21 13:31



正如留上所说，实体组织在处理过程中不可避免会对膜的完整性造成损害，所以我在处理时没有采用酶处理，而是采用机械法，用眼科剪剪碎，同时用pbs冲，尽量使细胞只受一次损害，当然这仍然不可避免人为造成部分细胞的坏死。实验结果annexin双阳性比例不大，而pi阳性的结果不稳定，有时还是很高，估计是受处理因素影响。
现在我对实验结果的解释也很发愁，pi单阳性的是不能说明什么问题的了（因为有处理因素的干扰）。而annexin-v双阳性所代表的细胞目前看法也不一致。
更糟糕的是我重复不出以前的结果了。
太郁闷了。
作者: greenbee    时间: 2012-1-21 13:33


想做动物细胞流式分析，哪位高手能否给我具体的方案及步骤。非常感谢！！
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-21 13:34


请教各位高手：我准备做大鼠CD4+CD25+T细胞的分离和培养，请问用流式是否可以从脾细胞中将此亚群分选出来？流式后培养是否会影响其生长？做此分选需要CD4.CD25外还需要其他标记抗体吗？先谢谢大家了！
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 13:35

一般都是用同型对照调好仪器电压条件及界定好阴阳性的界限，即同型对照上样时要使所采集的细胞98%左右都落在阴性区，在采集你的样本时电压和已画好的阴阳性界限不再改变，你这样做的同时就扣除了样本染色时的非特异性影响，得到正确的阳性率。这些当然要由操作的老师完成。
请问你是哪个所的？仪器是那个厂家的？仪器一般都不会是黑白的，各群细胞的颜色都是可以自己设定的。或许你们的打印机是黑白的。
没原始数据可不好，万一老师帮你分析错了，就没的纠正的机会了。他这么做可能是为了节省硬盘空间，你可以每次带个u盘拷贝自己的数据阿。这可是实验中最重要的东东了。
祝你好运

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kent，你好，我是协和基础所的。仪器是coulter的，比较老了，存了盘之后，在普通电脑上是打不开的，我估计它用的软件比较特别吧！你们仪器上的资料存了盘之后，用什么软件在PC上打开呢？不知有没有通用的软件？上周去做了一次，用的对照组设门，我想这个道理可能与同型对照差不多吧。同一组织取的细胞，只是对照组的小鼠未经目的蛋白处理过。然后根据文献值设门，这样如果有一些非特异染色，由于实验组与对照组之间有可比性，通过对照组设门，是不是也可以取得扣除非特异染色的效果呢？这是我的初步想法，不知有无道理，还请kent多多指点！！
不过，这样对照组的非特异染色与特异染色就分不开了，只能依靠文献大体设一个数值，不是太准确了！是么？
作者: TAT    时间: 2012-1-21 13:36

我也是刚刚接触科研，对很多问题不是很清楚，只是碰巧实验中涉及了Western和流式，所以，想就你的问题探讨一下。
Western和流式都是利用抗体来检测抗原的有无，所不同的是流式利用的是标有荧光的抗体或二抗，通过仪器检测，Western对抗体没有太多的要求，最终利用各种显色原理来检测。相对而言，流式可以定量，要更精确一些；Western是定性或半定量，通过与不变的、已知蛋白的比较判断目的蛋白的多少。
流式理论上可以检测胞浆中的抗原，但必需使抗体进入细胞，这确实需要某些附加条件，具体是什么，我不大清楚。

to all：
大家好，我有一个问题想问一下：
我要用流式检测抗原的有无，但目前培养的细胞无法成单细胞悬液，怎么办呢？
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 13:36

1。流式数据文件都是FCS格式的，一般电脑都不能直接打开的，WinMDI是最常用的装在PC机上可以读取分析这种文件的很小的一个应用软件,可以到cuturl('http://facs.scripps.edu/')上免费下载，或和BD公司技术支持有联系的话，也可以问他们要，还可以让他们教一下如何使用的，他们服务一向很热诚的。
2。你这样做实际上还是不能扣除非特异性结合的，或者你可以采用jadezhang曾经提到的用确定不表达你所要测的抗原的同类细胞加抗体标记做对照也可以的。再有如果你所测的样本中就有某群不表达你所要测的东东的，直接用这群细胞做内参也是可以的。这样再不行，你干脆就用未染色的细胞做对照好了，也有不少人这么做的，只是这样得到的不管是对照组还是处理组的阳性率对可能会比实际高点，不是特别严谨；但因两组同时升高，结果两组间比较还是可以比较的。
3。不知你要测的指标是什么？开始做了吗？结果如何？
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我是要测小鼠脾脏中的DC含量，正常情况下，其含量是很少的，只有1%左右，经处理后，可以使其含量升高，我用没经过处理的小鼠脾脏细胞做对照，应该还是可以有比较的吧，用它来设门，就要按照文献上的阳性率拉。如果用未染色的细胞做对照的话，自体荧光不会有很多吧？这样对照组的阳性率岂不是很高？这样的话，还不如根据文献用对照组设门更好一点？反正与实验组是同时升高的，还有必要再加入一个未染色的细胞做对照么？
我已做过一次仅稍稍有些升高。我一般不固定细胞，立即去测。今天本来要测一次，谁知中心实验室的流式仪出故障了，只好用多聚甲醛固定上明天再去测了，不知固定与否对结果影响大不大？你有没有比较过呢？谢谢

还有，关于WinMDI，在你推荐的网站上没有找到可下载的版面
作者: duoduo    时间: 2012-1-21 13:36

哪位高手朋友，能否出出点字：
我现在体外培养小鼠造血干细胞，培养之后，我想用流式直接检测同时带有这四种标记的造血干细胞，Lin-Sca-1+c-kit+thy1.1+, 应该如何设同型对照？
我是采用FACS的方法直接将PE-Lin-, Streavin texas red-Sca-1+, FITC-Thy1.1 , ApC-c-kit,筛选， FACS的准备不需要同型对照的设置，所以最后做分析的时候不知如何设置试验，请多多指教！！
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 13:37

我如果作同型对照，是用对照组的细胞加入同型抗体作对照呢？还是用实验组的细胞？还是两者都可以或必须分别做各自的同型对照？
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 13:39

样品在固定了一天之后到协和医院去测，结果好像没有出现太大的差漏，不过我没有未经固定的新鲜样品做对照。试验组的阳性率有一些升高，不过不是太显著。
记得以前定购抗体时，问过公司的代理商，她说国内定购同型抗体的人不多。国内的杂志也许没要求那么严格把？其价格竟然比标记的一抗还要贵一千左右！！
你在前面发的protocol里，在收获细胞后，紧接着一步是“Block Immunoglobulin Fc Receptors”， 用到purified antibodies directed against mouse FcγII/III and rat FcγIII Receptor ，这一步的功能好像与同型对照差不多啊？
还有，即使有同型对照也还有2%的阳性率，这是不是很难全都归如阴性区域？我这里的老师把阴性对照设在了92.7%，是不是设的太低了呢？
谢谢
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 13:40


请教各位：
我用流式做细胞内的Ph值，哪位可以给我讲讲那条对比曲线的作法。或者提供条现成的供我参考。本人将不胜感激。
作者: 911    时间: 2012-1-21 13:40

你好，本人刚踏入实验殿堂，想知道目前分离纯化细胞：有免疫磁珠分离，请问可否用流式细胞仪分离，如果能，那么分离之后的细胞还能继续培养存活吗？
作者: zhezhe    时间: 2012-1-21 13:41

没什么，大家相互学习，共同探讨。
1。我碰到的同型对照一般都比抗体便宜，可能你要的那种同型对照比较罕用，价格才会贵的。
2。“Block Immunoglobulin Fc Receptors”这是为了封闭细胞表面的Fc受体的，而你所加的抗体如果是完整Ig蛋白的话存在着Fc段，其就会和这种Fc受体结合，会造成假阳性的结果。和同型对照的作用还不完全一样，不过这也是目前国内学者很少做的一步。一般如不做这步直接用只有Fab段的荧光抗体结果更好些，当然这种抗体一般价格可能要贵些。
3。阴性对照多习惯设98%左右的细胞落在阴性区。
4。“即使有同型对照也还有2%的阳性率“所以有人会拿样本测得的阳性率减去这2%作为最终值。

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记得前述，“同型对照是和你的抗体同来源同亚型同标记的一种蛋白，主要为了扣除非特异性结合产生的本底”，它不是与Fc段的受体结合的么？那么与细胞上的什么部位结合，产生的非特异染色呢？
还有，每次去做流式，阴性对照是不是都需要设定的一致？但是前两次的阴性率设得偏低，还有必要改到98%么？
作者: 二丫头466    时间: 2012-1-21 13:41

你好，本人刚踏入实验殿堂，想知道目前分离纯化细胞：有免疫磁珠分离，请问可否用流式细胞仪分离，如果能，那么分离之后的细胞还能继续培养存活吗？

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你们实验室有可以用于分选的流式细胞仪吗？是什么型号的？你想分选什么细胞？流式分选可以继续培养，这个不是问题，问题是流式分选和磁珠分选各有侧重，最好是根据你的细胞种类及分选要求来选择合适的方式
作者: 二丫头466    时间: 2012-1-21 13:42

请教各位：
我用流式做细胞内的Ph值，哪位可以给我讲讲那条对比曲线的作法。或者提供条现成的供我参考。本人将不胜感激。

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你目前用何种荧光探针来检测pH值？你所说的对比曲线是calibration curve吗？
作者: 二丫头466    时间: 2012-1-21 13:42

请教各位高手：我准备做大鼠CD4+CD25+T细胞的分离和培养，请问用流式是否可以从脾细胞中将此亚群分选出来？流式后培养是否会影响其生长？做此分选需要CD4.CD25外还需要其他标记抗体吗？先谢谢大家了！

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你的流式什么配置？原则上来说是可以分选并培养的，并有很多国外文献报道过。细胞的活性及某些功能指标可能会收到影响，但这是很难避免的。你所需要的细胞是CD4/CD25双阳性的T细胞，如果能够在加入CD3的抗体，就更合理了。但是条件限制越多，实施起来结果越很难预计。总体说起来，你的这个实验难度还不大，值得试试哦。试过以后给大家说说结果如何。
作者: guagua    时间: 2012-1-21 13:42

感谢各位的热心应助，我是武汉同济协和医院的，昨天我去咨询做流式的老师，她说用CD4.CD25两种抗体分选细胞没问题但最好是做同型对照，另外我原想是把脾脏淋巴细胞先用分离柱分出T细胞，然后再做流式分离CD4CD25细胞，但流式的老师说直接用分离后的脾细胞作就可以了，想请教：同型对照一定要作吗？不做的话是否影响最后的结果？是否有补救的方法？直接用脾细胞是否会影响分选的纯度以及是否会耗费更长的时间(我们这儿一小时是1200RM?当然了我做了以后一定向大家说说结果！在这儿谢谢你和众多热心助人的战友们！
作者: 911    时间: 2012-1-21 13:43


我想知道目前有关骨髓干细胞向内皮细胞分化有无好的办法，当然价廉物美最好，我现在知道的方法只有：CD 34阳性标志 的免疫磁珠分离法，请问还有什么办法呢？谢谢！
作者: @STAR@    时间: 2012-1-21 13:43

请教高手指点：
我是临床的研究生，现在做的课题偏基础，是体外培养人外周血干细胞，然后用流式检测细胞表面抗原CD34，CD14，KDR等。现有以下一些问题请教各位：
1）我买了直标的抗体，如何设立阴性对照组，是否还需要购买单色标记的阴性对照抗体？如何选择种类？若没有荧光标记的阴性对照抗体，该如何建立阴性对照组？
2）KDR的FITC直标我一直不到，只有HRP标记的KDR，请问这种可以用来做流式吗？若可以，它和FITC标记的有何区别？
3）若用间标来检测抗原，如何设立阴性对照组？是不是阴性对照组中加一抗，不加荧光标记的二抗？
4）我已经购买了FITC－CD34，FITC－CD14直标的一抗，说明书上写：将分离的外周血白细胞首先与一定浓度，体积的人IG共同孵育5分钟，其目的是为了封闭非特异性抗体，然后再加一抗的工作液，请问上述步骤是要求每一份检测标本都要求做吗？阴性对照组中是否也需要该步骤呢？
谢谢！
作者: duoduo    时间: 2012-1-21 13:45

各位，我最近想做流式测细胞周期，用BD公司的DNA复制标志抗体，PCNA和BrdU抗体检测。我有两组试验细胞，一组为超高表达基因的细胞系，另一组则为空载细胞系，很明显，超高表达的细胞长得慢，如果我现在想用流式检测这种客观指标，我是否要控制这两种细胞的生长状态，还是直接取细胞，只要够做流式就可以了，麻烦各位高手多多指教。
谢谢
作者: 831226    时间: 2012-1-21 13:45


谢谢kent的指教。我还有一些问题请教：
1）我不知道自己培养的细胞CD34 和CD14的表达情况，我查的文献结论一般是CD34和CD14表达不高，而CD144，KDR,VWF表达是较高的。现在我买的CD144，CD14，CD34都是FITC标记的，KDR和VWF的二抗也是FITC标记的，按你所说不能用同一种荧光素标记，那现在还有什么挽救办法吗？
2）另外我也看到有人做阴性对照，就是在阴性对照管里不加任何东西，请问这样是否可以呢？如果可以对结果的影响大吗？
3）如果标本没有用人IG处理，对结果会有什么影响吗？有人告诉我在流式抗体的缓冲液里已加有胎（小）牛血清，这也可以起到封闭的作用，请问是这样 吗？人的IG可以自己制备吗？比如用自己的血清？
不好意思，这些菜鸟问题有劳各位了。
作者: 克隆鱼    时间: 2012-1-21 13:45

求助：在进行CD40L检测时怎样活化CD40细胞？
我在资料上看到“CD4+ Tcells were stimulated with 20ng/ml PMA and 1.5uM ionomycin for 6h" , 请问PMA 及ionomycin 的中文名称分别是什么、剂量多少、整个步骤是如何？
作者: ffooll    时间: 2012-1-21 13:46

严格说起来同型对照是必须的，设同型对照的目的是为了正确区分阳性与阴性群体之间的界限，因此如果说界限非常分明的话，省略同型对照问题不会太大（比如CD4)，但如果界限模糊的话，你只能通过对照来判断界限在哪（比如CD25)。但提醒你，同型对照并不能解决所有问题。
你的老师说得没有错，可以直接用流式来分选，不一定需要磁珠分选，但你的顾虑是有道理的（你们那钱收得不低啊），流式分选的速度和纯度与细胞浓度及靶细胞在样本中的百分率有关，用磁珠先富集后再来流式分选肯定可以提高分选的速度和纯度。另外你考虑过细胞的得率和活性吗？每一次分选，无论是磁珠还是流式，都有40％－50％的细胞丢失，而且两次分选对细胞的活性都会有影响。
作者: ffooll    时间: 2012-1-21 13:46

我想知道目前有关骨髓干细胞向内皮细胞分化有无好的办法，当然价廉物美最好，我现在知道的方法只有：CD 34阳性标志 的免疫磁珠分离法，请问还有什么办法呢？谢谢！

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你是想先纯化干细胞，然后再看它的分化方向吗？
作者: ffooll    时间: 2012-1-21 13:46

各位，我最近想做流式测细胞周期，用BD公司的DNA复制标志抗体，PCNA和BrdU抗体检测。我有两组试验细胞，一组为超高表达基因的细胞系，另一组则为空载细胞系，很明显，超高表达的细胞长得慢，如果我现在想用流式检测这种客观指标，我是否要控制这两种细胞的生长状态，还是直接取细胞，只要够做流式就可以了，麻烦各位高手多多指教。
谢谢

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你想通过细胞周期来反应转基因细胞比空白载体的细胞生长缓慢吗？在我的印象中是不需要做同步化的，其他人有什么建议吗？
作者: ffooll    时间: 2012-1-21 13:47

求助：在进行CD40L检测时怎样活化CD40细胞？
我在资料上看到“CD4+ Tcells were stimulated with 20ng/ml PMA and 1.5uM ionomycin for 6h" , 请问PMA 及ionomycin 的中文名称分别是什么、剂量多少、整个步骤是如何？

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如果我没有记错的话，PMA是佛波酯，ionomycin是离子霉素，你可以在cuturl('www.bdbiosciences.com')的网上查到相关资料，但你确定这种方法能够激活你的CD40细胞吗？
作者: ha111    时间: 2012-1-21 13:47


是CD40还是CD4细胞。如果是CD4细胞你最好使用CD3/CD28磁珠来激活你的
CD4细胞。
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-21 13:48

你目前用何种荧光探针来检测pH值？你所说的对比曲线是calibration curve吗？

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我用的染料是BCECF-AM，我也不知是不是你说的calibration curve。烦您再帮忙查一下，小妹感激不尽。
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-21 13:48

我那是从文献上看到的，请问你做过流式检测CD40L吗？怎样激活CD40细胞？我上那个网站看了，好象就是没找到CD40L的资料。你要是看到你告诉我具体位置吗？
再次感谢！

作者: 爱老虎游tt    时间: 2012-1-21 13:49

比如CD34阳性细胞是骨髓干细胞的一个亚群，我想先纯化它，再将其在特定的protocol下进行分化。主要是想知道纯化的具体方法，当然是廉价物美的最好了，谢谢！
作者: caihong    时间: 2012-1-21 13:50


我的实验要用流式细胞仪将细胞按细胞周期G1、S、G2/M进行分选， 然后做western, 检测细胞中一蛋白分子的表达， 以确定它的表达是否有细胞周期依赖性， 但是我苦恼的是不知道流式进行这种分选的原理是什么？在上流式之前我应该对细胞进行怎样的处理， 是PI染色DNA还是荧光抗体标记cyclinD1分子或是其他分子？ 这种处理是否会影响后面的western结果？请赐教！ 急盼！
作者: yhz1973    时间: 2012-1-21 13:52

非常感谢，我那是从文献上看到的，请问你做过流式检测CD40L吗？怎样激活CD40细胞？我上那个网站看了，好象就是没找到CD40L的资料。你要是看到你告诉我具体位置吗？
再次感谢！

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是没有激活CD40L的资料，但有PMA和inomycin的使用方法，我没有做过CD40L的检测，很遗憾。
作者: yhz1973    时间: 2012-1-21 13:52

比如CD34阳性细胞是骨髓干细胞的一个亚群，我想先纯化它，再将其在特定的protocol下进行分化。主要是想知道纯化的具体方法，当然是廉价物美的最好了，谢谢！

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我觉得磁珠分选就不错，方法成熟，简单易行
作者: yhz1973    时间: 2012-1-21 13:53

我的实验要用流式细胞仪将细胞按细胞周期G1、S、G2/M进行分选， 然后做western, 检测细胞中一蛋白分子的表达， 以确定它的表达是否有细胞周期依赖性， 但是我苦恼的是不知道流式进行这种分选的原理是什么？在上流式之前我应该对细胞进行怎样的处理， 是PI染色DNA还是荧光抗体标记cyclinD1分子或是其他分子？ 这种处理是否会影响后面的western结果？请赐教！ 急盼！

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除了kent所说的之外，还有一点需要注意的是，由于PI染色或者通过检测cyclin系列蛋白来区分细胞周期，都存在细胞打孔的过程，可能会导致胞内蛋白的流失。既然你可以用western来检测这个蛋白，为何不试试kassen的建议，直接用流式来检测，更直接。你可用PI和该蛋白的特异性抗体双标记来实现
作者: yhz1973    时间: 2012-1-21 13:53

另外给你一个提示，PI区分的细胞周期比较简略，而cyclin周期蛋白相对来说就细致得多了，它可以通过不同cyclin的表达将细胞周期划分成至少5个时段，因此如果你的经费够的话，同时检测cyclin周期蛋白和你的特定蛋白似乎更严谨一些。举个例子来说，PI无法区分G0和G1期，也无法区分G2和M期，而S期又相对比较长，没有细分，如果你需要检测的蛋白在这些区域没有量的变化，你并不能绝对得出这种蛋白与周期无关的结论，那么你的这个实验就显得比较苍白了。
作者: utt0989    时间: 2012-1-21 13:53

你好，感谢帮助。这里具体有关免疫磁珠的内容，我不清楚，通过公司问过，说包装是磁珠、抗体分离的，需要自己包被，一般20mg 2ml。不知实验能用几次，价格约3000元左右。还有 “过的柱子（夹子）”能否共用他人的呢？
作者: hyuu    时间: 2012-1-21 13:54

非常感谢，我那是从文献上看到的，请问你做过流式检测CD40L吗？怎样激活CD40细胞？我上那个网站看了，好象就是没找到CD40L的资料。你要是看到你告诉我具体位置吗？
再次感谢！

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我做过流式检测CD40L。 你所用的CD40细胞是什么细胞？
作者: yychen    时间: 2012-1-21 13:54

请教：
我最近在制备流式细胞样品（培养贴壁细胞），检测细胞内蛋白，采用间标法 ，一抗处理后细胞数目没有太多丢失，但是加入FITC标记的二抗后，PBS 洗涤后发现细胞数量丢失明显，做过几次都是这样，寻求帮助。
作者: yychen    时间: 2012-1-21 13:54

请教：
我想确定一蛋白在小鼠骨髓细胞中的分布，有何方法？请赐教！
作者: 四福晋    时间: 2012-1-28 08:45

请教各位高手
测大鼠脾脏淋巴细胞NK活性用哪些抗体？请指教，急盼！
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-28 08:45

谢谢你的帮助！有点不好意思的是，我自己弄错了一个地方。我们要检测的是B淋巴细胞上的CD40，这个没问题，另外需检测CD4+ T淋巴细胞上的CD40L，我们碰到的问题是怎样激活CD4+ T细胞？
谢谢你发给我的邮件！那是一张非常漂亮的图片！
作者: TNT    时间: 2012-1-28 08:46



QUOTE:
原帖由 ladyhuahua 于 2012-1-28 08:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢你的帮助！有点不好意思的是，我自己弄错了一个地方。我们要检测的是B淋巴细胞上的CD40，这个没问题，另外需检测CD4+ T淋巴细胞上的CD40L，我们碰到的问题是怎样激活CD4+ T细胞？
谢谢你发给我的邮件！那是一张非常漂亮的图片！ ...

CD40L就是CD154，T细胞活化的早期标志，能刺激T细胞活化的方法都可以激活T细胞表达CD154。比如多克隆刺激剂anti-CD3、ConA、PHA、PDB（或PMA)+ionomycin，超抗原SEB，甚至特异性抗原都可以。多克隆刺激剂作用后4－6小时应该检测得到。
作者: TNT    时间: 2012-1-28 08:46

请教：
我想确定一蛋白在小鼠骨髓细胞中的分布，有何方法？请赐教！

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有抗这种蛋白的抗体吗？如果有，用荧光标记抗体利用破膜（细胞打孔剂，如saponin）和不破膜的方法分别染细胞，激光共聚焦显微镜观察，也许会得到你想要的结果。
作者: hyuu    时间: 2012-1-28 08:51

你最好使用CD3/CD28磁珠来激活你的CD4细胞。如果你没有CD3/CD28磁珠的话，可以用ConA、PHA，或PMA。 但是阳性的比例会远远低于CD3/CD28磁珠激活的CD4细胞。 要在FACS提高阳性的比例， 你就要gate CD25阳性T细胞而非CD4细胞. 但是激活CD4细胞的时间要长。 因为CD154的up-regulation要比CD25早点。  
作者: TNT    时间: 2012-1-28 08:52

如果Luck-tang 只是想检测CD40L，并不是进行细胞分选，那应该检测实际的表达百分率，没必要通过CD25一个中晚期活化标志来提高CD154的阳性百分率吧。
anti-CD3/CD28抗体是常用来刺激T细胞活化的，CD3/CD28磁珠没用过，有什么优越性吗？
作者: +小生怕怕+    时间: 2012-1-28 08:55

请教：
我最近在制备流式细胞样品（培养贴壁细胞），检测细胞内蛋白，采用间标法 ，一抗处理后细胞数目没有太多丢失，但是加入FITC标记的二抗后，PBS 洗涤后发现细胞数量丢失明显，做过几次都是这样，寻求帮助。

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检测细胞内蛋白最好用直标的；
丢失太多，离心时转速加大点或时间延长点了。
作者: +小生怕怕+    时间: 2012-1-28 08:55

有抗这种蛋白的抗体吗？如果有，用荧光标记抗体利用破膜（细胞打孔剂，如saponin）和不破膜的方法分别染细胞，激光共聚焦显微镜观察，也许会得到你想要的结果。

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请问一下激光共聚焦的激发波长范围？检测波长范围？谢谢！
作者: 吴才子    时间: 2012-1-28 08:58

CD3/CD28磁珠刺激T细胞活化的效果非常的好  
作者: vvmmoy    时间: 2012-1-28 08:58

各位请帮忙：
我已经用293细胞系逆转录转染了我的目的基因，并得到高表达目的基因的细胞系，从细胞培养来看，转染目的基因的细胞系比转染空载质粒的细胞系长的慢。现在我想用PE-PCNA抗体来检测实验组是否在S期发挥作用。目前我的实验设计如下：待细胞长满后传代（实验组长的慢，不需同步），等待两者分别到达指数增长期，处理细胞，固定后加抗体流式检测。我的实验依据是实验组和对照组都是稳定细胞系，应该有各自的细胞周期。因此不应同步化。
但是我现在想想，这样检测也不行，待细胞长至指数增长期，检测指标相同了。所以应该同步化，也就是说同时传代，以相同细胞数接种，过一定时间后同时取细胞检测，可能更有意义。
我不知那种实验设计是正确的，烦请各位高手帮助。
急盼回复
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 09:00     标题: 回复 #431 vvmmoy 的帖子

细胞长得快慢与否体现在细胞周期上的区别在哪？细胞长得快是否应该指该组细胞中进行有丝分裂的细胞多，而不是指分裂所需的细胞周期短，也就是说一旦细胞进入细胞分裂周期，它完成整个周期的时间是一样的。所以长得快的细胞的S期与G2/M期的比率应该比长得慢得细胞高，反之以增值系数也可用来推断生长快慢。所以我觉得不用做同步化。你认为呢？
作者: 穿越时空    时间: 2012-1-28 09:01

这里具体有关免疫磁珠的内容，我不清楚，通过公司问过，说包装是磁珠、抗体分离的，需要自己包被，一般20mg 2ml。不知实验能用几次，价格约3000元左右。还有 “过的柱子（夹子）”能否共用他人的呢？

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磁珠抗体的使用我不是特别清楚，但据我所知有些公司提供的抗体是直接标记的，不需要自己包被，而抗体的量是根据能够分选多少细胞来定的。还有关于柱子，什么叫共用他人的？怎么共用？我知道的是有些公司提供的磁珠抗体可以用其它公司的柱子，但不知道你用的抗体是哪里的呢？这些问题你询问公司应该能够有答案，他们应该有技术支持呀
作者: bongte    时间: 2012-1-28 09:02

细胞长得快慢与否体现在细胞周期上的区别在哪？细胞长得快是否应该指该组细胞中进行有丝分裂的细胞多，而不是指分裂所需的细胞周期短，也就是说一旦细胞进入细胞分裂周期，它完成整个周期的时间是一样的。所以长得快的细胞的S期与G2/M期的比率应该比长得慢得细胞高，反之以增值系数也可用来推断生长快慢。所以我觉得不用做同步化。你认为呢？

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但我还是不明白，如果按您的意思，目的基因不应该影响细胞周期的时间，只是影响了某一期内比如S期的细胞数目，或者说细胞的周期是固定的，目的基因如果影响了S期，使其变长，必然导致G1或G2期缩短以保持固定周期，应该这样理解吗？
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-28 09:03

但我还是不明白，如果按您的意思，目的基因不应该影响细胞周期的时间，只是影响了某一期内比如S期的细胞数目，或者说细胞的周期是固定的，目的基因如果影响了S期，使其变长，必然导致G1或G2期缩短以保持固定周期，应该这样理解吗？

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目的基因可以影响某一个时期的长短嘛？有这方面的报道嘛？对此我没有深入的理解。
作者: fsdd817    时间: 2012-1-28 09:04

各位大虾：
我想检测巨核细胞多倍体分析，我根据文献报道，将我在体外培养的巨核细胞收集后，PBS洗1遍，抗人的FITC-CD41a与细胞孵育后，70%的甲醇固定20分钟，加入PI（50ug/ml）及RNAse(50ug/ml)4度避光孵育40分钟后上机，先用FITC-CD41a射门，再检测其中2倍体，4倍体及8，16等等倍体的比例，这好象在国外文献中是很easy的，但目前却成了我的难点，不知哪位大虾有做过？可否指教？不胜感激。。。
另外想求教国内有哪家会做？
作者: rxcc33    时间: 2012-1-28 09:06

最近打算用PMA和ionomycin刺激检测T细胞内cytokine(FACS) ,查了一下CALIBOCHEM的产品目录，发现有两种形式的ionomycin：FREE ACID; CALCIUM SALT不知用那一种形式的ionomycin更合适一些？
期盼答复，谢谢先

个人倾向于前者，FREE ACID，但是心里没底
作者: ha111    时间: 2012-1-28 09:09

你的问题在哪里？流式测时是没有CD41a阳性的细胞还是没有发现所谓的2倍体，4倍体及8，16等等倍体？

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我将我的流式图上传，希望能得到高手的帮忙，第一张图是以人外周血单个核作为阴性对照，以找到2倍体峰的位置，在200左右，第2，3张是我的实验组，CD41a阳性的细胞有一定的比例，有的比例还挺高，可打80%以上，应该是以400做为4倍体，依次寻找多倍体峰的位置及比例，但苦于我们这儿的流式不会分析，而且也不知这样做对不对，请高手们能指点迷经，另外如有什麽地方做过，也请告知，偶将不胜感激  

图1。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10303

作者: ha111    时间: 2012-1-28 09:12


图2。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10304

作者: ha111    时间: 2012-1-28 09:12


图3。

图片附件: 22042763.snap.jpg (2012-1-28 09:12, 26.42 KB) / 该附件被下载次数 6
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作者: yychen    时间: 2012-1-28 09:15


各位高人，我想做ｃｙ３和FITC双间标，并同时做PI，不知道可不可以？
如果可行的话，用什么固定呢？有人说用１％的多聚甲醛，然后用乙醇，是不是这样呀？
需要你的帮助，迫切的！
作者: yychen    时间: 2012-1-28 09:15


还有，我是标记核蛋白和胞浆蛋白。
作者: yes4    时间: 2012-1-28 09:16


请问，我想提纯表皮中的langerhans细胞，对细胞悬液及细胞的数目有没有什么要求，此外，需要无菌操作吗？谢谢
作者: 831226    时间: 2012-1-28 09:16

我也要做细胞流式了，心里一点底也没有，进了这个小区，看了诸多高手的贴子，受益匪浅。
请教大家一个问题，我的一抗是一个都多抗，说明书上表明它用于Western
blot的工作浓度是1：1000-1：2000，那将它用于细胞流式时，应用多大的浓度呢
作者: whitesheep    时间: 2012-1-28 09:17     标题: 回复 #447 831226 的帖子

需要做个滴度看一下，我建议你做1：10稀释，1:20，1:50三个梯度。
作者: whitesheep    时间: 2012-1-28 09:17

最近打算用PMA和ionomycin刺激检测T细胞内cytokine(FACS) ,查了一下CALIBOCHEM的产品目录，发现有两种形式的ionomycin：FREE ACID; CALCIUM SALT不知用那一种形式的ionomycin更合适一些？
期盼答复，谢谢先
个人倾向于前者，FREE ACID，但是心里没底
我使用的Ionomycin和PMA都是Sigma的，货号分别是I-0634终浓度500ng/ml，P-8139终浓度5ng/ml。效果不错的，据我所知的很多人用的都是这个。不过，一般活化过程都是和Ca+有关系的，最好所加试剂对本身环境中的Ca+含量没有太大影响。

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我用的也是sigma产品，活化细胞本身就需要钙离子，我觉得有钙离子的更好。刺激的时候是需要加入钙离子的，所以干脆那个便宜就买哪一个。
作者: whitesheep    时间: 2012-1-28 09:17

图3。

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仅仅这种设门是不够的，还需要FL2-w和FL2－A设门，如果你在上海，我可以帮你检测。
作者: whitesheep    时间: 2012-1-28 09:18

各位高人，我想做ｃｙ３和FITC双间标，并同时做PI，不知道可不可以？
如果可行的话，用什么固定呢？有人说用１％的多聚甲醛，然后用乙醇，是不是这样呀？
需要你的帮助，迫切的！

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这种检测在流式可以说是难度很高了，我觉得只能试一下爱才行，除非有人做过。
作者: whitesheep    时间: 2012-1-28 09:18

NIDDK/Transplantation Branch, Bethesda, MD

Direct Linkage of OKT3 (or UCHT1; anti-CD3), 9.3 (anti-CD28) or Other Antibodies to Tosylactivated Dynal Beads

Reagents
FACS Staining Medium (FSM)        
5% Fetal Calf Serum (Heat Inactivated)  50 ml
2 mM EDTA (0.5M solution)     4 ml
0.2% NaN3 (Sodium Azide)     2 ml
DPBS w/o CA and Mg      q.s. to 1 L
Sterile Filter and store at 4oC

0.1M Borate Solution (Boric Acid, MW 61.83)
Boric Acid        0.618 g
Molecular Grade Water      q.s. to 100 ml
Mix well and pH 9.5 with 10N NaOH
Sterile Filter and store at 4oC

Anti-CD3
Clone OKT3 eBiosciences Cat# 16-0037-81, Lot#E004129
Clone UCHT1 ATCC

Anti-CD28
Clone 9.3 ATCC (purified by Al Black)
Clone 28.6 eBiosciences Cat#16-0288-85, Lot# E000835

Procedure:
1.  Take out 1 ml Tosylactivated Beads and wash in FSM 2X with magnet.
2.  Dilute 300 ug of Antibody and q.s. to 1 ml of 0.1M Borate Solution, Add to 1 ml of beads in 15 ml conical tube
3.  Parafilm wrap conical tube and place on rotator at 37oC O/N
4.  Wash Beads 3X for 5 minutes at RT in FSM with magnet.
5.  Final wash for 20 minutes at RT
6.  Add 3 ml FSM per original volume of Beads and rotate O/N at 4oC
7.  Resuspend in final volume of 10 ml FSM per original ml of Beads used
8.  Bead concentration should be 40 x 106/ml
作者: misswu61    时间: 2012-1-28 09:19

请问各位大虾：在用MTT实验测量抗癌药物的作用时，接种96孔板后，多长时间或者细胞达到多少融合后给药。还有在用流式细胞仪测量抗肿瘤药物的促凋亡作用时，给药的时机如何确定。以及做何种测量，我对流式细胞技术不是很了解，谢谢帮助！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 09:19

请问，我想提纯表皮中的langerhans细胞，对细胞悬液及细胞的数目有没有什么要求，此外，需要无菌操作吗？谢谢

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是要用流式提纯吗？你用哪些标志物提纯表皮中的langerhans细胞？目的细胞在总样本中的大概百分比是多少？要用什么机器分？如果要再培养当然要无均操作了。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 09:20

你这里的图形确实很糟糕。我可以提供些改善的建议：
1，如schoman兄所言，再建个横纵坐标分别为FL2-W/FL2-A目的是为了排除聚集体细胞；
2，70%酒精固定时轻轻加入缓慢晃动样本在4度固定一小时以上一般效果更好；同时固定后的细胞离心时转速要提高些大概400g,5min；
若使用的是自己配的试剂可以考虑一下RNase或PI方面的原因：
3，我看这种图形更像是RNase不起作用细胞内RNA未被消化的的结果，可以考虑一下你的RNase保存是否恰当？活性是否丧失？Treat cells with ribonuclease A (RNase A) (Sigma, Cat. No. R5500;100 Kunitz units/mg protein). The RNase A can be dissolved in DPBS at a concentration of 1 mg/ml, aliquoted, and stored frozen (–80°C). Add 50–100 µl of RNase A to each cell sample and incubate (30 min, 37°C).
4，Stain cells with 5–20 µg of PI (Sigma, Cat. No. P4170; Stock PI is at 1 mg/ml in distilled H2O) added to 1 ml of DPBS. Incubate for ≥ 30 min (room temperature) and then analyze samples by flow cytometry using linear amplification. Store samples protected from light at 4°C until flow cytometric analysis (ie, within 24 hours).
When analyzing, keep the flow rate under 400 events/second.
希望这些建议能改善你的实验结果
另外，可以使用ModiFIT软件分析你的实验结果阿
作者: idea2011    时间: 2012-1-28 09:20

我刚刚开始做流式细胞仪测细胞凋亡，发现一个问题，就是由个药物我加入细胞后培养，用胰蛋白酶消化时，很难消化下来，静置五分钟细胞依然没有变圆，所以我只好加大吹打的力度，测出的结果不太理想，观察不到凋亡峰，不知道是不是因为这个原因，请问如何解决？
作者: sunnyB    时间: 2012-1-28 09:56     标题: 回复 #456 idea2011 的帖子

选择合适的消化方法是可以得到理想的结果的。如果目前检测不理想，可能是药物浓度不够或者无效。
如果真是如你所言，建议检测一下细胞的黏附分子，一般情况下，细胞难以被消化下来说明细胞的黏附力增强，与其黏附分子表达增加相关，如果这种要有这种作用，也是一种新的发现，值得进一步研究。检测黏附分子很简单，用抗体标记一下，上流式即可。
作者: idea2011    时间: 2012-1-28 09:57

我打算加入EDTA试一试，还有，我若要检测黏附分子，是不是什么抗体都可以用？
作者: hyuu    时间: 2012-1-28 09:58

阴性对照,PBMC


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作者: hyuu    时间: 2012-1-28 09:58

培养的巨核细胞，多倍体。
流式的结果显示2倍体，4倍体峰的位置分的不是很开，是否是培养细胞处理的问题？

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作者: hyuu    时间: 2012-1-28 10:00


多倍体检测也有用DNA content 测的，不知流式如何操作和分析？文献见下图。

图片附件: 95896855.jpg (2012-1-28 10:00, 47.46 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10308

作者: hyuu    时间: 2012-1-28 10:01


我做的实验分析结果没有文献中的漂亮，不知是何原因？下面的图是文献的结果。

图片附件: 37210603.jpg (2012-1-28 10:01, 37.13 KB) / 该附件被下载次数 5
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作者: idea2011    时间: 2012-1-28 10:02

不知你不太理想的图示什么样的？一般像你这种处理方法不大会影响到核内DNA含量，有排除其他可能的原因吗？比如染色不好，酶处理不好等。我昨天就曾用错缓冲液洗涤细胞，结果细胞一点都不着色。可用人外周血等样本同样方法染染看结果如何来排除其他可能原因。
另外，很多凋亡情况下并不会出现明显的凋亡峰的，这也有可能。这时可以考虑TUNNEL， Capase3等其他检测方法。

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请老师指正，似乎S期的比例太小，我的细胞实际上是一个快速增殖的细胞smmc-7721，三-四天传一代的

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作者: idea2011    时间: 2012-1-28 10:02

这个是加药后的，S期比例反而大了。

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作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 10:04

多倍体检测也有用DNA content 测的，不知流式如何操作和分析？文献见下图。
我做的实验分析结果没有文献中的漂亮，不知是何原因？下面的图是文献的结果

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所谓的DNA content就是用的PI染色，跟你的方法是一致的。从检测方法看，我觉得已经没什么问题了，主要应该是你的细胞培养的条件可能和实验者的不同所致。如果你能做到相同的细胞培养条件，我想是可以得到原文所列出的图的。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 10:05

这个是加药后的，S期比例反而大了。

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你用的那种流式检测？采用FL3来分析。
作者: idea2011    时间: 2012-1-28 10:06

你用的那种流式检测？采用FL3来分析。

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我就是消化下来，乙醇固定然后加RNA酶PI染色，就交给肿瘤医院的一个老师帮着测的，测细胞周期，就出了这样的图。不好意思，关于流式细胞仪我懂得很少，但是总觉得S期比例太低，总怀疑是我手法的问题。另外冒昧问一句FL3是什么？
作者: qqq111    时间: 2012-1-28 10:06

刚刚做完流式，可是却不会分析结果，赶快来向大家请教：
我表达了一种蛋白，然后用流式检测它与靶细胞（细胞上有该蛋白对应的受体）的结合状况，结果如下:
-------ID----------------Pcn----------------Area
第一组
A(空白对照)-------- -3.9---------------- 194
B(阴性对照)-------- -6.6----------------- 330
E(目的蛋白)---------12.2---------------- 609

第二组：
A空白对照----------1.8---------------- 90
B阴性对照----------2.9----------------144
E目的蛋白-----------13.2---------------661

这种结果能说明表达的蛋白是和细胞结合了吗，是不是特别弱？
第一组的图

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作者: qqq111    时间: 2012-1-28 10:07


第二组的图：

图片附件: 72016721.jpg (2012-1-28 10:07, 49.39 KB) / 该附件被下载次数 6
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作者: 彼岸花opp    时间: 2012-1-28 10:18

请教专家，
FACS分析软件WINMDI28如何使用？
还请不吝赐教
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-28 10:19

阴性对照,PBMC

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你的PBMC是密度梯度离心法获得的吧，FSC vs SSC 那张图的细胞群位置与我们平时做的不太一样，更像是SSC vs FSC 时的位置。

PBMC组的第四张图R4的设置有问题，R4应该是沿FL2-A走向的，这样才既保证纳入所有的倍体细胞，又划除粘连细胞。而巨核细胞组的R4走向是正确的，因为它的横轴和纵轴的设置与PBMC组正好相反，不知你注意到没有。既然是设置对照组为什么不保持各图形设置一致呢。

巨核细胞组第三幅图应符合G3＝R1*R3*R4，看你的图形似乎已经是这样设置了。四倍体峰还是有的，可能如Schoman所言，你的细胞与文献上细胞所处状态不太一样，似乎合成期细胞比例较高。而且它用的是对数坐标轴，倍体之间距离拉得近，峰也会显得窄一些；你的图是线性坐标轴，虽然一般的DNA含量测定都是用线性坐标轴，当细胞如文献中一样为高倍体时，用对数坐标轴会方便些。你的细胞如果有高于8倍体的也可以试一下呀。

总体来说你的实验是可以进行的，只是有一些细节，包括你在这里获得的信息，应该跟给你测样的老师沟通一下。

另外，你提供的DNA content那张文献中的图，倍体标识似乎有问题，或者说我认为是不正确的，32N理论上DNA含量应该是2N的16倍了，但实际上没有。
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-28 10:20

这个是加药后的，S期比例反而大了。

你用的那种流式检测？采用FL3来分析。

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我好像也没见到有人用FL3来检测，但是PI 染色的细胞在FL2 vs FL3 dot plot中是正好处于对角线上的，按理说用FL3检测应该也可以呀，但为什么大家都用FL2呢，是约定俗成还是另有原因？

也希望icepiao能告知在哪里测的，什么机型。
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-28 10:20

请问一下激光共聚焦的激发波长范围？检测波长范围？谢谢！

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各种型号的激光共聚焦显微镜的激光配置是不太一样的，我们这里的是three-line laser，激发器同时发射三种激光：488nm, 568nm和647nm，然后可以通过电脑控制选择其中一种激光通过。检测波长还是要通过各种滤光片来控制，跟荧光显微镜类似。
作者: hyuu    时间: 2012-1-28 10:22

我马上要做DNA含量测定巨核细胞多倍体，到时还要请教。现在有个问题想问一下，因为我是标记的CD41群中的阳性细胞的多倍体比例，是先标记CD41抗体，用多聚甲醛固定呢？还是可先用80%的乙醇固定后，再标记CD41抗体？不知会有什麽区别？还请赐教。我现在还是在实验的摸索阶段，做的满意了和大家一起分享。
作者: TNT    时间: 2012-1-28 10:24     标题: 回复 #479 hyuu 的帖子

你是怕你培养的巨核细胞群不够纯，才用CD41进一步标识吗？上一次的图是按什么程序染的CD41呢？
看你的巨核细胞组的图几乎没有真正的CD41阴性细胞，只是各个细胞表达量有所不同，不知是抗体标记的问题还是说你的细胞已经很纯了。

为什么用80%的乙醇固定而不是70%？

我没用乙醇固定过抗体标记的细胞，只能提一点想法:
1. 不知乙醇固定是否会使抗原构象发生改变，可能还是先染抗体为好
2. 染完抗体后可能没必要先用多聚甲醛固定了，反正要用乙醇固定。

最可靠的还是你自己做一下：
1. 染抗体——洗——多聚甲醛固定
2. 染抗体——洗——乙醇固定
先不染PI，上机检测。乙醇固定细胞脱水也许会变小一些，它们在FSC vs SSC上的位置也许会稍有不同，只要荧光强度基本相同就应该没问题了。

有兴趣再加2管：
3. 多聚甲醛固定——洗——染抗体
4. 乙醇固定——洗——染抗体
看两种固定剂对抗原表位有何影响。

以上除先后顺序不同外，细胞密度，抗体量要一致。

做的满意不满意都希望能和大家分享
作者: fei1226com    时间: 2012-1-28 10:25

我现在想作一点流式试验,我想请教一下流式是否可同时
检测细胞增殖凋亡的改变?另外请指点哪家流式作的比较好?
谢谢!
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 10:25


现在国内有流式的单位越来越多，参与流式讨论的人越来越多，现在TCR、kassen等在流式方面很有造诣的人越来越多的参与了流式专区的讨论，非常让人高兴。我们的目的就是希望能够共享、交流、共同提高。我早期贴了一些流式的基本知识，但是那是些粗制的东西。虽然我们本区的帖子越来越多，但是往往给后来的人一个很大的麻烦，可能会无所是从。希望TCR、kassen等能够写一些基本的介绍性的知识，使得每个新来者尽快的能够了解流式的基本知识，尽早进行实验。国内做流式的高手很多，我限于条件和知识面了解的有限（决不是谦虚。），但愿能有更多的高手能够参与，使得本区越办越好。
作者: skytree    时间: 2012-1-28 10:29

请问高手！
yong 流式细胞术可以测细胞内的钙离子浓度吗/
用FLUO-3负载不知可否？
作者: idea2011    时间: 2012-1-28 10:29

我好像也没见到有人用FL3来检测，但是PI 染色的细胞在FL2 vs FL3 dot plot中是正好处于对角线上的，按理说用FL3检测应该也可以呀，但为什么大家都用FL2呢，是约定俗成还是另有原因？

也希望icepiao能告知在哪里测的，什么机型。

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谢谢了，我是在天津市肿瘤医院测的，机型为COULTER EPICS-XL
还有，能详细讲讲FL2和FL3各有什么区别么，呵呵
作者: idea2011    时间: 2012-1-28 10:30

BD机器通常用FL2因为PI的发射波长相对于FL3接收通道更接近FL2,同样道理Coulter机器则常用FL3,并且后者机器上无法设置A这个参数来排除粘连细胞的，可以看出icepiao的图是使用MultiCycle软件分析得到的应该使用的是Couler仪器，用FL3坐标应该是正确的

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您真厉害，我确实是用MultiCycle软件分析的
作者: duoduo    时间: 2012-1-28 10:31


想用流式细胞仪测经质粒转染后的3,5,7天的细胞周期
1.转染前细胞是否要同步,冰冻法可以吗?

2.因时间长,细胞接种前融合率多少为佳呢?

非常感谢!
作者: milkdog    时间: 2012-1-28 10:32

我对流式知之甚少，我的实验决定采用双标记法用PI来标记DNA，用FITC标记P16， 在我们的细胞系内检测P16的表达与细胞周期的相关性。我不知道流式是否能够一次完成检测细胞周期（G1,S,G2/M)和P16的表达量， 还是必须先用PI进行分选将不同周期阶段的细胞分选出来收集到tube中， 然后再分别上一次流式来定量P16呢？
请指教！盼! 谢谢！
作者: junhun    时间: 2012-1-28 10:32

可以同时检测P16的表达及细胞周期，染色的时候通常先标记P16,wash后，加入打孔剂打孔，最后加入RNAse和PI，也有人将Triton-100,RNAse,PI制成工作液，一步到位。我个人建议第一次做时分成两步，加入P16染色后，先上机检测，看看P16的阳性率及荧光强度，然后再将剩余的细胞继续染色PI，再上机检测，看看P16的阳性率和荧光强度是否有变化。
作者: junhun    时间: 2012-1-28 10:32

可以同时检测P16的表达及细胞周期，染色的时候通常先标记P16,wash后，加入打孔剂打孔，最后加入RNAse和PI，也有人将Triton-100,RNAse,PI制成工作液，一步到位。我个人建议第一次做时分成两步，加入P16染色后，先上机检测，看看P16的阳性率及荧光强度，然后再将剩余的细胞继续染色PI，再上机检测，看看P16的阳性率和荧光强度是否有变化。
作者: junhun    时间: 2012-1-28 10:32

我对流式知之甚少，我的实验决定采用双标记法用PI来标记DNA，用FITC标记P16， 在我们的细胞系内检测P16的表达与细胞周期的相关性。我不知道流式是否能够一次完成检测细胞周期（G1,S,G2/M)和P16的表达量， 还是必须先用PI进行分选将不同周期阶段的细胞分选出来收集到tube中， 然后再分别上一次流式来定量P16呢？
请指教！盼! 谢谢！

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我似乎忽略了一点，P16是表达在膜上的还是胞内的？我记不清了
作者: 阿敏    时间: 2012-1-28 10:33

请问在做流式时抗体的稀释倍数一般是多少（我用的是间接法标记），我买的抗体说明上竟然没写稀释倍数，这可愁坏我了。
另外，待检的细胞溶液浓度多少为宜？
另外我想在荧光显微镜下观察标记的细胞，将细胞溶液直接滴加在玻片上可否？如若不行，应该怎么观察。
请赐教！
多谢！
作者: 气泡    时间: 2012-1-28 10:33


请教大家一个问题,我想用流式同时测定三种荧光物质,现在初步定为FITC,PERCP,PE,不知是否可行,请大家多多指教,谢谢!!
另外FITC和PE我已经确定,如PERCP不行,可否换用其他荧光物质.
还有我用了一个生物素标记的一抗,是否再用一个链酶卵白素标记的percp即可.
作者: junjie05    时间: 2012-1-28 10:34

请教大家一个问题,我想用流式同时测定三种荧光物质,现在初步定为FITC,PERCP,PE,不知是否可行,请大家多多指教,谢谢!!
另外FITC和PE我已经确定,如PERCP不行,可否换用其他荧光物质.
还有我用了一个生物素标记的一抗,是否再用一个链酶卵白素标记的percp即可.

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FITC.PE,PerCP三者搭配可以，除了PerCP外，你还可以选用PE-CY5,PerCP-CY5.5等。
作者: tianmei001    时间: 2012-1-28 10:35

你的抗体是哪个公司购买的，可以问问他们。一般正规公司都有推荐剂量的，但是在具体作实验时，仍应建立自己实验室的稀释倍数，通常从推荐的1/2开始试。与抗体和细胞也有关系。你能否具体说明你的实验（比如抗体名称，购买的公司等）？看看我是否能帮助你。

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请问在做流式时抗体的稀释倍数一般是多少（我用的是间接法标记），我买的抗体说明上竟然没写稀释倍数，这可愁坏我了。
另外，待检的细胞溶液浓度多少为宜？
另外我想在荧光显微镜下观察标记的细胞，将细胞溶液直接滴加在玻片上可否？如若不行，应该怎么观察。
请赐教！
多谢！
作者: moonlight45    时间: 2012-1-28 10:35

我想购买直接荧光标记的糖皮质激素受体的单克隆抗体，用做流式，测骨髓细胞内受体含量的。请知道的人指点一下，我没找到这样的公司购买。
作者: dog002    时间: 2012-1-28 10:35

你好!我前不久做了有关CD34阳性细胞的分离和检测的实验,我用的机子与你一样,我发现用免疫磁珠富集后上机检测后CD34阳性细胞的纯度达不到90%以上,请予指教.谢谢
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 10:36     标题: 回复 #497 dog002 的帖子

用磁珠富集达不到90％以上是正常的，我们通常要两遍才会达到90％以上。我想也不要迷信磁珠，首先你要先把单个核细胞分好，像淋巴细胞分离液要选最好的，还要做的熟练。这样再用磁珠纯化的时候效果会好些。
作者: caihong    时间: 2012-1-28 10:37


请教各位大虾：
我现在做药物对细胞周期影响的实验，我查文献上有的是在加入药物之前，先将细胞静止24小时，有的没有静止。我问老师，意见也不统一，还请各位给予指导，是否应该先静止，再加药检测周期变化呢，原因是什么？谢谢
作者: yes4    时间: 2012-1-28 10:37

我想请教一个问题，我用流式检测膀胱移形上皮起源的肿瘤细胞，样本经400目滤膜滤过后仍出现堵塞进样孔现象，不知如何解决？是否需要在样本中加入些抗黏附的试剂？如果需要的话，加什么，浓度多少？谢谢！
作者: xevin    时间: 2012-1-28 10:38

请问什么叫同型对照，其作用是什么？还要选择相应的抗体？
作者: BUK    时间: 2012-1-28 10:38

请教EGFP与Tex Red可以配合吗?
作者: HP007    时间: 2012-1-28 10:39

请教高手,如何根据流式结果用公式计算增殖指数.谢谢.
作者: utt0989    时间: 2012-1-28 10:40

请教各位大虾：
我现在做药物对细胞周期影响的实验，我查文献上有的是在加入药物之前，先将细胞静止24小时，有的没有静止。我问老师，意见也不统一，还请各位给予指导，是否应该先静止，再加药检测周期变化呢，原因是什么？谢谢

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一般对细胞周期的影响试验很复杂，细胞静止24小时也就是让细胞同步化于G1／G0（一般无学清培养48小时），这样细胞处于同一细胞周期后加入药物可以结合对照观察药物对G1／G0期的影响，利用不同方法可以细胞周期同步化于不同周期（如S期等），在加入药物以观察药物对不同周期的影响。如果不同步化则细胞处于增殖期，此时药物影响较复杂，有可能各个周期都有影响而不好说明问题。
作者: loli    时间: 2012-1-28 10:41

依据你所讲的，如果要观察药物对G1／G0期的影响，就采用静止法
但是，我的药物究竟作用于哪一期，我现在并不清楚，也许是G1／G0期、也许是S期，那我在加药之前先怎么处理呢？
作者: 分子式    时间: 2012-1-28 10:41     标题: 回复 #505 loli 的帖子

你可以先做采用静止法（无血清培养细胞48小时）先做预实验，看看药物对细胞有无影响。同时也可以作药物对增殖期细胞周期（培养细胞处于指数增殖期时加药），观察细胞周期的变化，同时流式细胞仪可同时观察凋亡的变化。
作者: TAT    时间: 2012-1-28 10:42

请问什么叫同型对照，其作用是什么？还要选择相应的抗体？

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为了去除非特异性吸附的影响，采用和实验组相同亚型的抗体，如同为IgG1
作者: sunnyB    时间: 2012-1-28 10:42

请教大家一下:我购买了BD公司的SAv-PerCP(554064),因为一抗用的是生物素标记的抗体,但是说明上却没有写用量,现在有些为难,上面的参考文献又查不到全文,还请大家多多指教.
作者: hold住    时间: 2012-1-28 10:42


请教，我用流式测CD4+/CD8+T淋巴细胞，为什么非特异性染色高达60%--70%，如何降低呢？我的细胞浓度是1X10 7
作者: abc816    时间: 2012-1-28 10:43


我的实验中收集72，48，24，12小时被LPS刺激后的细胞，检测一种分子的表达，一同上流式。我想知道如何处理细胞，以便72小时后一同做，用4%或1%的多聚甲醛？
作者: vvmmoy    时间: 2012-1-28 10:46

你要用什么方法做？一般流式上是不可同时用的。

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EGFP & Texas Red for Confocal, OK?
作者: baidukk    时间: 2012-1-28 10:47

请教各位大虾：
我现在做药物对细胞周期影响的实验，我查文献上有的是在加入药物之前，先将细胞静止24小时，有的没有静止。我问老师，意见也不统一，还请各位给予指导，是否应该先静止，再加药检测周期变化呢，原因是什么？谢谢

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I think it is better to starve the cell for 24 hr to let the cell stop to grow.
The reason is that we want to know the effect of certain drug on the cell only. so before we test the cells. we let the cell at the same growing condition.(i.e. stop growing).
作者: baidukk    时间: 2012-1-28 10:47

请问什么叫同型对照，其作用是什么？还要选择相应的抗体？

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同型对照 又名isotype control
1. direct conjugate Ab. like mouse CD4-FITC, 它有一个subtype of IgG. eg. Ig1a
同型对照 is IgG1a-FITC only. 它只是IG并不认的抗原.
目的是把非特异性反应驱除.
因为每个抗体的subtype的 非特异性反应不一.
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-28 10:48

因为测的是同一细胞上的同一分子，我想通过FACS确定该分子的表达时相，所以要用同样的对照，一同上机。目前我也是和你的建议一样，先给最长时间的那一瓶加药，最后给时间短的加药，再一同收细胞。
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-1-28 10:48

请问哪位做过流式细胞仪的大侠,我检测小鼠树突状细胞上的CD11c,CD8a.
(1)有的试剂公司卖的荧光标记抗体说的是多少微升,有的说的是多少微克,这怎么换算?我如果要做40份血,需要多少量?
(2)需要多少毫升小鼠血提出的DC 才能测到(不经过IL-4和GM-CSF刺激扩增)?

万分感谢!
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 10:49

请问哪位做过流式细胞仪的大侠,我检测小鼠树突状细胞上的CD11c,CD8a.
(1)有的试剂公司卖的荧光标记抗体说的是多少微升,有的说的是多少微克,这怎么换算?我如果要做40份血,需要多少量?
(2)需要多少毫升小鼠血提出的DC 才能测到(不经过IL-4和GM-CSF刺激扩增)?

万分感谢!!!!

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商品化的抗体都有详细的使用剂量，建议购买。
外周血不培养想鉴定为DC，恐怕太难了。
作者: 中国特色    时间: 2012-1-28 10:49


我最近想通过FACS检测LACZ报告基因的表达，想用FDG胞内染色法，查询一下文献， 各说不一，不知有那位老兄用过FDG来检测胞内的LACZ活性的方法，还有，文献上提供的是Micro Probe公司的，不知国内那家有这个代理的。望主任等有经验人士能否告知一二..........
作者: nn255    时间: 2012-1-28 10:50


我是第一次到这里来，简直不舍得走。
我想请教一下，我想用DCFH-DA测定细胞内ROS，若用流式，DCFH-DA的浓度应该多大？作用多长时间？是否处理完就可以直接上机？看过一些文献，说法不一。请指教
作者: tieshazhang    时间: 2012-1-28 10:51

请教大侠:
问题一：我打算用FITC－CD14，34 ，144 上流式检测细胞表面抗原的表达情况，说明书上写要避光，可是在加样的时候不可避免会见光，请问这会有影响吗以及如何尽可能避免？
问题二：荧光标记后用多聚甲醛固定，若不能立即上机检测，标本的荧光能有效保持多久呢？
问题三：因为我是要检测贴壁细胞表面抗原，用胰酶消化细胞会影响细胞的表面抗原吗？有的文献是用EDTA加胰酶，请问有什么好的方法可以消化细胞而尽量不影响细胞的表面抗原？
作者: glass    时间: 2012-1-28 10:56

可以试试加些EDTA

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EDTA浓度多少？作用多少时间？有何温度要求？谢谢！

[ 本帖最后由 glass 于 2012-1-28 10:58 编辑 ]
作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-28 10:59

请教大侠:
问题一：我打算用FITC－CD14，34 ，144 上流式检测细胞表面抗原的表达情况，说明书上写要避光，可是在加样的时候不可避免会见光，请问这会有影响吗以及如何尽可能避免？
问题二：荧光标记后用多聚甲醛固定，若不能立即上机检测，标本的荧光能有效保持多久呢？
问题三：因为我是要检测贴壁细胞表面抗原，用胰酶消化细胞会影响细胞的表面抗原吗？有的文献是用EDTA加胰酶，请问有什么好的方法可以消化细胞而尽量不影响细胞的表面抗原？

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1.一般加抗体时可以不用避光，加完后避光孵育。
2.甲醛固定后，最好在24小时内检测。
3.如果胰酶对所检测的抗原没有消化作用那就可以使用。也可以仅用EDTA 消化贴壁细胞。一般而言，机械分离对细胞表面抗原的损伤较小。
作者: 气泡    时间: 2012-1-28 11:04

我还有一点不明白的是，如何让FDG进入细胞内，我看的文献是利用渗透休克法。想与你仔细探讨一下具体的做法。最好有中文讨论。能得知你的电邮吗？
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-28 11:06


我做过检测CD11c，一般为5*10E5加抗体15ul，在4度冰箱中育30分钟即可检测。
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-28 11:13

同型对照 又名isotype control
1. direct conjugate Ab. like mouse CD4-FITC, 它有一个subtype of IgG. eg. Ig1a
同型对照 is IgG1a-FITC only. 它只是IG并不认的抗原.
目的是把非特异性反应驱除.
因为每个抗体的subtype的 非特异性反应不一.
作者: zhezhe    时间: 2012-1-28 11:16

最近听说一种流式的阴性对照方法，是用同一克隆的未标记抗体封闭细胞，然后再加入标记抗体。你了解此方法么，据说比同型对照更被认可。
作者: zhezhe    时间: 2012-1-28 11:16

我做过检测CD11c，一般为5*10E5加抗体15ul，在4度冰箱中育30分钟即可检测。

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你的抗体的浓度多大，是什么公司的产品。用的什么做对照？有没有做同型对照？
作者: 伊莎贝拉    时间: 2012-1-28 11:19


不知哪位同仁用Annexin-V检测过K562细胞的凋亡. 我最近检测了,对照组的凋亡率达到40%左右.因此我选了培养中状态很好的细胞检测也有25%.我不知是什么出了问题,我是严格按试剂盒来操做的按理说操作应没问题.上机的过程我是将不加任何试剂的完全空白组调在第三相限,单独加PI组几乎是全在第一相限,单独加Annexin-V组细胞群体在第三相限与第四相限的分界两侧,这两个相限的细胞群体仿佛就是一个相连的群体, 之间不能象别人介绍的那样为两个独立的群体.
作者: @STAR@    时间: 2012-1-28 11:43

我也是新手，我培养的是KBv200(耐药性人口腔鳞状上皮癌细胞)，要用间接免疫荧光法在流式细胞仪上测细胞的pgp、MRP、LRP、Topo-Ⅱ、GST、bcl-2等六种与肿瘤耐药相关的蛋白，这六种可以用同样的方法来处理细胞检测吗？是不是需要固定，怎么我发现很多文献都先固定,有不固定的方法吗？请赐教。
作者: @STAR@    时间: 2012-1-28 12:34

还有一个问题，我用流式将细胞进行了分选以后准备提蛋白做Western（细胞泡在80%的乙醇里），1000rpm，离心5分钟以后， 用1ml PBS洗，但是细胞老是离心不下来， 我用6000rpm， 离心了半个小时都没用， 不知道是怎么回事，显微镜下可以看到细胞形态完整， 并没有破碎。有什么好的建议吗？盼！

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可以同时检测P16的表达及细胞周期，染色的时候通常先标记P16,wash后，加入打孔剂打孔，最后加入RNAse和PI，也有人将Triton-100,RNAse,PI制成工作液，一步到位。我个人建议第一次做时分成两步，加入P16染色后，先上机检测，看看P16的阳性率及荧光强度，然后再将剩余的细胞继续染色PI，再上机检测，看看P16的阳性率和荧光强度是否有变化。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 12:42

我也是新手，我培养的是KBv200(耐药性人口腔鳞状上皮癌细胞)，要用间接免疫荧光法在流式细胞仪上测细胞的pgp、MRP、LRP、Topo-Ⅱ、GST、bcl-2等六种与肿瘤耐药相关的蛋白，这六种可以用同样的方法来处理细胞检测吗？是不是需要固定，怎么我发现很多文献都先固定,有不固定的方法吗？请赐教。

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六种蛋白我还没有完全搞明白，原则上讲，膜蛋白可以直接用抗体标记后上机检测，胞内抗原需要先固定、穿孔，然后标记上机检测。固定本身并不麻烦，一般多用2％的多聚甲醛。
作者: bohe221    时间: 2012-1-28 12:42


我是新手,现用的是台式的流式分选机,由于以前没做过分选,按照书上及问了一些老师尝试了做了一次.具体做法是:我用机器中平时用来过滤酒精的滤器替换了sheath的滤器(因为还处于试机阶段,没有用无菌的新滤器替换),这时用75%酒精分别灭菌sheath管道和进样管约30min,同时将房间紫外照射30min,所用的标本分别是2160和NC cell,都是共转染GFP的方法鉴别转染的阳性细胞的,在做流式分选时,前一个标本分选后的细胞再培养染菌了,接下去做的第二个标本分选再培养目前还没发现染菌.(两个标本上样之间用酒精清洗了上样管)而且显微观察是链球菌,不知在无菌分选过程中还有什么疏漏的地方,或者还需要注意些什么,请各位不吝赐教.
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-28 12:43


我在晶美生物有限公司订完试剂，按试剂说明书做即可，或直接问做流式细胞的工作人员也可。效果不错。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-28 12:46


我想问一下有谁知道怎样标记胶体金？还有有实验室为别人标记胶体金抗原吗？
作者: bamboo16    时间: 2012-1-28 12:47


请问各位高手，我的流式结果有时试验组比isotype还低是什么原因？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 12:48     标题: 回复 #543 bamboo16 的帖子

我也碰到过类似的情况，其实本身并不奇怪：
1. 任何细胞都有本底荧光，本底荧光受细胞的类型和内容物及大小等影响，如果你的实验组改变了细胞的大小，内容物等，就可以影响到细胞的本底荧光水平，所以，如果你的实验组没有阳性细胞，往往可以会碰到这种情况，这说明你的细胞没有阳性。
2. 同型对照有时候的非特异性结合可能会高于实验组，造成这种影响主要是同型对照的抗体不好，选择的抗体容易和细胞非特异性结合。区分前一种情况和这种情况，可以加一组空白对照，即不加同型对照抗体，如果空白对照的荧光低于同型对照，说明同型抗体有非特异性结合，否则就是前一种情况。所以实验中加同型对照和空白对照都是需要的。好的同型抗体对照的荧光水平应该和空白对照一致。如果不一致，需要换掉同型的抗体。另外，假如同型对照选择合适，并且同型抗体有非特异性结合，提示实验组有非特异性结合，这时候即使实验组是阳性，往往也提示有假阳性。这种情况最好换掉检测抗体和同型抗体，或者采用同型的IgG进行封闭非特异性位点，但是不是所有的都容易封闭掉。需要具体的摸索实验条件，单纯的非特异性封闭就有好多的知识。当然从你的这个结果，我觉得前者的可能性更大。
祝你有好的结果。
作者: mickeylin    时间: 2012-1-28 12:48


想用流式细胞仪分选细胞，特异抗体是CD1a，说明书未提供标记操作步骤，请问如何标记，此外流式分选细胞，对细胞悬液的细胞密度有无要求，是否越密约好？谢谢
作者: @STAR@    时间: 2012-1-28 12:49

我欲用流式细胞仪做白血病免疫学分型，看见你前面的贴子里提到过，但没有详细介绍，请介绍具体的检测步骤，因为我们流式的老师也不太懂。另外请附一些你所做过的流式图片以便我作参考。谢谢！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 12:50

我把原来一些有关流式的幻灯放在了丁香园的第一个BT航母（xiake航母）上，有关于流式的原理和临床应用的内容。适合于楼上的使用，或者新接触流式的人有个大概的了解。感兴趣的可以去下载，今天开放种子，到明天7：00。以后可以发信要求开放种子。
作者: toy    时间: 2012-1-28 12:51

我是一个流式新手，想检测转染前后细胞的凋亡和增殖，请问一下
1.收集细胞用细胞刮子和胰酶消化两种方法对结果有无影响？
2.培养基中残存的血清对结果有无影响？
3.不同组的细胞收集时间不一样，也就是固定时间不一样，是否会影响结果？
4.不同的细胞收集前融合程度不一样，是否会影响结果，该如何避免这个问题？
谢谢！
作者: BOSS2011    时间: 2012-1-28 12:52


想请教一些问题：
1.最近做了一些凋亡方面的试验，用rhodanmin123 染细胞，观测线粒体电位的变化，我发现影响因素很多，每次检测结果都相差很大。而每次试验条件都尽量一致，rhodanmin123 浓度是10ug/ml，反应时间为4摄氏度30min，其他所用试剂是一样的。但是结果观察荧光强度值可以相差很远。还有什么方面需要注意的？而且，用胰酶消化，是不是本身对细胞的影响就很大？
2.不知道大家做过没有关于细胞表面抗原定量的试验？我做了一些，因为用于标定的beads是后来买的，所以直接先测的细胞的荧光值，然后用这个条件检测beads，作曲线，是否也可以？我用的beads是BD公司的Rainbow Calibration Particles (6 peaks), 3.0 - 3.4 µm。
作者: zhezhe    时间: 2012-1-28 13:01

2. 同型对照有时候的非特异性结合可能会高于实验组，造成这种影响主要是同型对照的抗体不好，选择的抗体容易和细胞非特异性结合。区分前一种情况和这种情况，可以加一组空白对照，即不加同型对照抗体，如果空白对照的荧光低于同型对照，说明同型抗体有非特异性结合，否则就是前一种情况。所以实验中加同型对照和空白对照都是需要的。好的同型抗体对照的荧光水平应该和空白对照一致。如果不一致，需要换掉同型的抗体。另外，假如同型对照选择合适，并且同型抗体有非特异性结合，提示实验组有非特异性结合，这时候即使实验组是阳性，往往也提示有假阳性。这种情况最好换掉检测抗体和同型抗体，或者采用同型的IgG进行封闭非特异性位点，但是不是所有的都容易封闭掉。需要具体的摸索实验条件，单纯的非特异性封闭就有好多的知识。当然从你的这个结果，我觉得前者的可能性更大。

关于这点我有点疑问：做同型对照的目的本身不就是去除非特异荧光和本底荧光的，而空白对照检测到的就只是本底荧光，它的荧光强度在有非特异性结合时一定是低于同型对照的，为什么“好的同型抗体对照的荧光水平应该和空白对照一致”？同型对照抗体的所带荧光素和所用抗体的荧光素一致，是不是就可以很大程度上避免同型对照和实验组的非特异荧光差异？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 13:02

2. 同型对照有时候的非特异性结合可能会高于实验组，造成这种影响主要是同型对照的抗体不好，选择的抗体容易和细胞非特异性结合。区分前一种情况和这种情况，可以加一组空白对照，即不加同型对照抗体，如果空白对照的荧光低于同型对照，说明同型抗体有非特异性结合，否则就是前一种情况。所以实验中加同型对照和空白对照都是需要的。好的同型抗体对照的荧光水平应该和空白对照一致。如果不一致，需要换掉同型的抗体。另外，假如同型对照选择合适，并且同型抗体有非特异性结合，提示实验组有非特异性结合，这时候即使实验组是阳性，往往也提示有假阳性。这种情况最好换掉检测抗体和同型抗体，或者采用同型的IgG进行封闭非特异性位点，但是不是所有的都容易封闭掉。需要具体的摸索实验条件，单纯的非特异性封闭就有好多的知识。当然从你的这个结果，我觉得前者的可能性更大。

关于这点我有点疑问：做同型对照的目的本身不就是去除非特异荧光和本底荧光的，而空白对照检测到的就只是本底荧光，它的荧光强度在有非特异性结合时一定是低于同型对照的，为什么“好的同型抗体对照的荧光水平应该和空白对照一致”？同型对照抗体的所带荧光素和所用抗体的荧光素一致，是不是就可以很大程度上避免同型对照和实验组的非特异荧光差异？

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好的同型抗体对照的荧光水平应该和空白对照一致，这一点没有错。如果不一致就提示有非特异性结合，有非特异性结合的同型对照不是理想的。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 13:02

大家好，我是新来的，看到这个专区，欣喜若狂，因为有schoman老师和其他那么多经验丰富的大侠指导。我从头开始看起，觉得有很多有用的东西，同时觉得自己以后再作试验也会有大家的支持了！！
想请教schoman老师一些问题：
1.最近做了一些凋亡方面的试验，用rhodanmin123 染细胞，观测线粒体电位的变化，我发现影响因素很多，每次检测结果都相差很大。而每次试验条件都尽量一致，rhodanmin123 浓度是10ug/ml，反应时间为4摄氏度30min，其他所用试剂是一样的。但是结果观察荧光强度值可以相差很远。还有什么方面需要注意的？而且，用胰酶消化，是不是本身对细胞的影响就很大？
2.不知道schoman老师做过没有关于细胞表面抗原定量的试验？我做了一些，因为用于标定的beads是后来买的，所以直接先测的细胞的荧光值，然后用这个条件检测beads，作曲线，是否也可以？我用的beads是BD公司的Rainbow Calibration Particles (6 peaks), 3.0 - 3.4 µm。

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罗丹明的实验我做的有限，感觉重复性还行。
我没有做过绝对定量，相对定量是测细胞的荧光数值。
作者: 小鱼鱼    时间: 2012-1-28 13:03

想请教一些问题：
1.最近做了一些凋亡方面的试验，用rhodanmin123 染细胞，观测线粒体电位的变化，我发现影响因素很多，每次检测结果都相差很大。而每次试验条件都尽量一致，rhodanmin123 浓度是10ug/ml，反应时间为4摄氏度30min，其他所用试剂是一样的。但是结果观察荧光强度值可以相差很远。还有什么方面需要注意的？而且，用胰酶消化，是不是本身对细胞的影响就很大？
2.不知道大家做过没有关于细胞表面抗原定量的试验？我做了一些，因为用于标定的beads是后来买的，所以直接先测的细胞的荧光值，然后用这个条件检测beads，作曲线，是否也可以？我用的beads是BD公司的Rainbow Calibration Particles (6 peaks), 3.0 - 3.4 µm。

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据我所知，Rainbow Calibration Particles 是用于校准机器的，它可以用来做荧光定量吗？你是怎么做的？BD公司的确是有一种用于荧光定量的beads，是PE荧光标记的beads，kit内有四种不同荧光强度的PE beads，盒内有资料显示每一个荧光强度对应的PE分子数量。

rhodanmin123染色最近我问过一个曾经做过的人，她说rhodanmin123染色测定线粒体膜电位不敏感，需要刺激较长的时间才能有变化，但没有具体问过她染色方法。这是她的经验仅供参考
作者: milkdog    时间: 2012-1-28 13:04

不知你的样本中所要的阳性细胞所占百分比？流式分选对细胞悬液的细胞密度的要求与你用的机器型号有关。比如用FACScalibur对20-30%左右的阳性细胞2000/s的进样速度比较合适。不知你分选这种细胞后要做什么？

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我的样本中所要的细胞占3－5％，因为我是搞皮肤的，我的样本是交给专做流式的教研室做的，他们流式分选好像做得挺少的，我目前所能努力的是尽量将cd1a标记好，（不知道细胞分选与其他流式检查项目的标记方法有没有区别，说明书没有详细的步骤，查国外公司的网站也没有详细的资料）后面只能看他们发挥了，刚开始叫他们标，好像连我这样的外行都看出来有问题，因此肯请能帮助我。我的细胞分选后，主要是用来看药物对它细胞因子分泌的影响。他们的机器好像是BD的，型号我还没问，分选一次500元，挺贵的，就这样分了一次，连细胞残骸都没看见，郁闷
作者: milkdog    时间: 2012-1-28 13:04

我的样本中所要的细胞占3－5％，因为我是搞皮肤的，我的样本是交给专做流式的教研室做的，他们流式分选好像做得挺少的，我目前所能努力的是尽量将cd1a标记好，（不知道细胞分选与其他流式检查项目的标记方法有没有区别，说明书没有详细的步骤，查国外公司的网站也没有详细的资料）后面只能看他们发挥了，刚开始叫他们标，好像连我这样的外行都看出来有问题，因此肯请能帮助我。我的细胞分选后，主要是用来看药物对它细胞因子分泌的影响。他们的机器好像是BD的，型号我还没问，分选一次500元，挺贵的，就这样分了一次，连细胞残骸都没看见，郁闷

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3－5％的阳性率用FACSCalibur分选够呛，浓度太低，分选速度跟不上，你至少要分选多少的细胞才能达到你的要求？你又条件用磁珠分选吗？
作者: yysr238    时间: 2012-1-28 13:05


我是试验新手，各位的贴子我都仔细拜读了一遍。收获真是不小。我有问题向各位请教：我分离乳鼠外周血单个核细胞想测表面标志，主要是想观察病毒感染时CD30＋T细胞是否升高。
遇到了问题：1、按理来说，应该首先确定T细胞，但是试验经费有限，CD3／CD8双标的试剂都是3千多，可不可以不作CD3／CD4／CD8，直接测CD30，不知道这个思路到底可行么？有没有意义？如果不行，有没有比较便宜的方法比如免疫组化、ELISA方法可以实现我的想法呢？请各位高手给我指点一下光明大道哈
2、我用上海试剂三厂的淋巴细胞分离液，分离效果很不好。几乎没有明确的分离层。到底小鼠的外周血（1。088）可不可以用人的（1。077）淋巴细胞分离液呢？如果不行，怎么才能调整呢？或者有没有专用的小鼠Ficoll？
急切的希望各位予我解惑，谢谢先
作者: windy+++    时间: 2012-1-28 13:05

3－5％的阳性率用FACSCalibur分选够呛，浓度太低，分选速度跟不上，你至少要分选多少的细胞才能达到你的要求？你又条件用磁珠分选吗？

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我想只要能分出来，多少无所谓，（国外有文献能分选出）如果实在不行我只能用免疫磁珠分选了，另外请问一下，用免疫磁珠分选技术要求困难吗，提一次大约需要多少经费
作者: junhun    时间: 2012-1-28 13:06


请教组织单细胞悬液（脾脏淋巴细胞悬液）流式固定程序！
我的抗体说明书上没有。查了一些资料，感觉还是不踏实。
多谢！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 13:08

我是试验新手，各位的贴子我都仔细拜读了一遍。收获真是不小。我有问题向各位请教：我分离乳鼠外周血单个核细胞想测表面标志，主要是想观察病毒感染时CD30＋T细胞是否升高。
遇到了问题：1、按理来说，应该首先确定T细胞，但是试验经费有限，CD3／CD8双标的试剂都是3千多，可不可以不作CD3／CD4／CD8，直接测CD30，不知道这个思路到底可行么？有没有意义？如果不行，有没有比较便宜的方法比如免疫组化、ELISA方法可以实现我的想法呢？请各位高手给我指点一下光明大道哈
2、我用上海试剂三厂的淋巴细胞分离液，分离效果很不好。几乎没有明确的分离层。到底小鼠的外周血（1。088）可不可以用人的（1。077）淋巴细胞分离液呢？如果不行，怎么才能调整呢？或者有没有专用的小鼠Ficoll？
急切的希望各位予我解惑，谢谢先

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CD30, originally identified as a cell-surface antigen and clinical marker of Reed–Sternberg cells of Hodgkin's disease (HD), is also expressed at low levels on 3–31% of human peripheral blood T cells (mostly CD8+), as well as on resting murine B cells, macrophages, and natural killer (NK) cells (45–49). Activation or viral transformation increases CD30 expression on B and T cells, including γδ T cells (50, 51).
这段是从PNAS上摘录下来的，所以必须用CD3才能准确的区分出T细胞。不加抗体，流式细胞只能区分出淋巴细胞。免疫组化同样存在这样的问题。而ELISA测定的是可溶性CD30，意义完全不一样。
分离小鼠的单个核细胞我们常规都用的是人的淋巴细胞分离液，同样能得到较好的效果，如果你的效果不好，我觉得是实验操作的问题，可以向做的多的人多学习一下。专门适合小鼠的分离液不是没有，不过你的经费有限，我建议你不要买了。另外如果你分离单个核细胞的目的是用于流式检测，我觉得你可以省了这一步，因为用全血作流式时，流式可以区分开淋巴、单核、粒细胞。如果加入CD3抗体就可以区分出T细胞了。
每个标本都需要分离单个核细胞，如果做上100次，也会觉得很累，不如直接买个CD3的单抗标记T细胞，用全血标记，裂解红细胞后上机。
我建议你如下步骤：
1.取50ul小鼠外周全血，加入相应量的CD3单抗（建议用FITC标记）和CD30单抗（建议用PE标记，或者两者调换一下）。
2. 室温避光孵育30min。
3.加入红细胞裂解液裂解红细胞。
4.PBS洗涤细胞一次。
5. 上机检测。以FSC和SSC散点图，设门区分淋巴细胞。以CD3和CD30为横坐标轴和纵坐标轴，设立散点图，就可以分析CD30阳性的T细胞。
作者: dotaaa    时间: 2012-1-28 13:09

请问各位高手：我的目的基因和GFP构建在一起，将它转染进细胞，我要检测我的目的基因对细胞的增殖是否有促进作用，因此要用流式细胞仪，那我就检测一下细胞在各个细胞周期的比值吗？我是否还需一个只转载体的对照？另外我用的是GFP融合质粒，是否还要染色？是不是把细胞固定好送去检测旧可以了？先谢谢了！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 13:09

请问各位高手：我的目的基因和GFP构建在一起，将它转染进细胞，我要检测我的目的基因对细胞的增殖是否有促进作用，因此要用流式细胞仪，那我就检测一下细胞在各个细胞周期的比值吗？我是否还需一个只转载体的对照？另外我用的是GFP融合质粒，是否还要染色？是不是把细胞固定好送去检测旧可以了？先谢谢了！

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目的基因对细胞增殖的影响常用的就是流式细胞仪检测细胞的周期。常采用的染色步骤如下：
1 收集>10的6次方个细胞。以-20℃预冷的75%乙醇固定6h。
2 加入PI和RNAase（终浓度均为50ug/ml）染色30min以上。
3上机检测。
由于转基因有一定的效率，所以需要以GFP阳性的细胞设门区分转基因细胞和未转基因细胞。分析GFP阳性的细胞周期。如果你分析的细胞是经过克隆挑选过的稳定细胞株则不存在这个问题，直接分析细胞周期就可以了。
为了观察转基因本身对细胞增殖的影响（基因转染试剂往往会有一定的细胞毒性），所以需要设立转空载体的对照。
由于很多实验用的GFP是位于细胞质内，是可溶性的，在乙醇固定后往往会从细胞内溢出，导致GFP阳性率下降。所以如果你的转染效率不高，则要特别当心这个问题，采用膜定位表达的GFP可以更好的解决这个问题，但是由于你是融合蛋白，GFP的表达定位取决于你的目的基因。如果转基因效率高则可高枕无忧了。所以如果GFP阳性率不高，建议提高转染率，同时可以适当减少乙醇的固定时间，我尝试过1h，即可以达到固定的效果，有可以减少GFP的丢失。
希望对你的实验有用，如果取的了好的效果，别忘了来此详细介绍一下你的实验体会，以利后来者（先谢谢了！）。
作者: ha111    时间: 2012-1-28 13:10

我现在在做小鼠脾中树突状细胞的提取,其中也要分离单个核细胞.文献上看到的是用密度为1.080的淋巴细胞分离液.可是我的经费有限(因为这种分离液太贵了,200ml 要250元),我想就用人的密度为1.077的淋巴细胞分离液,不知道行不行?
万分感谢!
作者: ha111    时间: 2012-1-28 13:11

我现在想做小鼠脾中树突状细胞的提取，我的具体方法如下：无菌取脾，放在200目铜网上研磨，去网下脾细胞，1000r/min离心5min,重悬，用密度为1.080 的淋巴细胞分离液3000r/min，20min.取低密度细胞， 加完全培养基(5%NCF+RPMI1640)，5%CO2,37C 3h后，去非贴壁细胞。在补充完全培养基，5%CO2,37C 18h后取非贴壁细胞，在加入人IgG包被的培养板，60min取非贴壁细胞。即为DC
（1）这种方法能提取多少DC?
( 2 ) 纯度有多少？
( 3 ）做流式细胞仪能检测到吗？（我要检测的表面标志为CD8a 和CD11c）
先谢谢大家！
作者: jujuba    时间: 2012-1-28 13:12

我想只要能分出来，多少无所谓，（国外有文献能分选出）如果实在不行我只能用免疫磁珠分选了，另外请问一下，用免疫磁珠分选技术要求困难吗，提一次大约需要多少经费

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多少当然是一个问题，你还需要做后续培养，你至少需要细胞能够培养的最少数量。国外文献有提出是哪一种流式做的分选吗？不同仪器分选原理和效果相差很大，你最好确认一下你那的流式是哪一种型号。免疫磁珠分选技术也很成熟，费用不是很清楚
作者: xevin    时间: 2012-1-28 13:12

转染效率需要大概多高才能用于流式细胞仪，是否阳性细胞需要10的六次方个，六孔板的一个孔的细胞够吗？如果转染效率不高，可以通过扩大细胞量来弥补吗？还有我转染的是荧光蛋白，已经有荧光了，为什麽还要PI染色呢？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 13:13

转染效率需要大概多高才能用于流式细胞仪，是否阳性细胞需要10的六次方个，六孔板的一个孔的细胞够吗？如果转染效率不高，可以通过扩大细胞量来弥补吗？还有我转染的是荧光蛋白，已经有荧光了，为什麽还要PI染色呢？

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PI染色是染的DNA，所以分析细胞的周期是靠分析各期细胞的DNA含量来区分的。RNAase是为了去除RNA，因为PI同样会染色RNA，造成对DNA的干扰。
阳性率一般的越高越好，但是我觉得即使阳性率只有5％，也可以测定。总的原则是细胞周期需要检测约1-2万个细胞，只要达到这个要求就可以了。所以在低转染率的情况，可以通过扩大细胞的总体数量来达到要求。但是实际准备是决不是这个量，由于流式检测时要浪费很多细胞，细胞处理过程也会丢失很多细胞。所以总是要10-100倍的准备待测细胞。一个六孔板不同的细胞数量并不一样，一般的帖壁细胞我觉的是够用了。你可以尝试一下，如果细胞数量不够，可以再增加。
作者: yychen    时间: 2012-1-28 13:14

我现在也在作流式细胞技术，对其也略知一二。现在临床上主要运用于各种血液科疾病的检测，如AA,白血病，自身免疫性疾病等。常用的的检测有CD3、CD4、CD8、CD59、CD33、CD38等。最常用的是CD3、4、8，这几种单抗。
作者: 分子式    时间: 2012-1-28 13:15

我今天从流式细胞仪上拷贝了很多图片，但是不知道用什么软件打开？哪里有这样的软件下载？我用的流式细胞仪是Beckmen CALIBUR。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 13:16     标题: 回复 #575 分子式 的帖子

我通常用MAC操作系统的office（clariwork）中的画图软件来创建图形，或者用屏幕捕捉来创建图形命令是（苹果键＋shift＋4），该命令产生的图片是默认的pict格式。这两种都容易打开，通常创建的图片格式是bmp或者jpeg。不知道你是怎样创建的。是什么格式？
是不是你创建的图片在mac机器上可以打开，而在windows下无法打开？
我们也曾经遇到类似的情况，其实很简单，只要明确你是什么格式创建的图片就可以了。在mac机器上创建的图片通常拿到windows操作系统是不能打开的。通常我是用两种方法：
1 用word可以打开，选择word中的插入图片，选择来自文件，把创建的图片插入word文档，以上我常用的三种格式都可以打开。因为图片最终是要在word中编辑的，所以这个方法不错。同样，powerpoint也可以打开。
2. 如果你知道图片的格式，只要在wiondows操作系统中将该文件的后缀加入即可。如果是bmp格式的文件，就在文件名中加入".bmp"；同样jpeg格式的图片加入".jpeg"；pict格式的加入“.pict”。所以我在创建文件时，是直接在明明时文件明中加入相应的格式。这样在windows中可以直接用ACDsee等看图软件打开（xp可以直接打开）。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 13:17

请教高手,如何根据流式结果用公式计算增殖指数.谢谢.

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细胞增殖指数(PI)： PI＝［(S＋G2、M)／(S＋G2、M＋G0、G1 )］×100％
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-28 13:17


我要分析骨髓间充质干细胞的表面抗原，以分析我提纯的细胞是否有许多造血干细胞和成纤维细胞。请赐教！！
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-28 13:18

骨髓间充质细胞表面抗原可通过流式细胞仪来检测，一般CD45-、CD34-、CD29+、CD44可以+或-，还有CD10+、CD13+及HLA-DR-等抗原的表达，来鉴定你的细胞是否为真正的骨髓间充质细胞。
drs0861
作者: 生物迷    时间: 2012-1-28 13:19


粘附性受体在造血调控中作用的研究进展

造血是多功能干细胞增殖、分化以补足成熟血液细胞成分的复杂过程。研究人员对于能促进或抑制造血祖细胞增殖、分化的细胞因子和生长因子及其对干、祖细胞的生物效应进行了广泛研究，并已对其中30多种进行克隆和定性，但人们对于有条不紊的造血过程仍认识不足。造血通常发生于骨髓微环境中，干细胞及其后代与存在于骨髓微环境中的细胞和细胞外基质（ECM）配体相对特异性地相互作用，这种粘附性相互作用使造血细胞滞留于骨髓内。造血的细胞因子和生长因子也能特异性地结合细胞外基质成分，基质细胞表面能表达某些细胞因子，祖细胞及细胞因子对于ECM成分或基质细胞的这种选择性粘附作用可导致处于一定分化阶段的祖细胞及一连串相应的细胞因子共同定位于所谓的‘龛’中，在一定程度上调节细胞的发育和分化。大量资料显示，祖细胞和骨髓基质配体间的接触性相互作用在造血调节方面有重要作用。粘附性相互作用本身可作为细胞发育和生存的信号，粘附本身也可调控细胞或生长因子依赖性信号传导。也许正是这一连串的接触介导的作用造血进程得到了有序的调节。在造血祖细胞上发现了20多种粘附分子受体,其中包括整合素家族,它们可使细胞粘附于ECM成分(纤连蛋白、胶原、层粘蛋白或血小板凝血酶敏感蛋白)，也称为细胞表面表达的细胞粘附分子（CAM；血管性的[VCAM]和细胞内的[ICAM]）。祖细胞表达的CD44可助细胞粘附于透明质酸盐和纤连蛋白，细胞粘附分子超家族的一员：血小板-内皮细胞（PE）-CAM-1及L-选择素在祖细胞上均有表达。此外，干细胞抗原CD34、CD43、CD34RA、P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）及CD164等多种唾液酸粘蛋白均表达于祖细胞上。此家族中不表达于造血细胞上的其他成员包括糖基化依赖性细胞粘附分子-1（Glycam-1）及粘膜地址素细胞粘附分子-1（Madcam-1）。究竟是哪些受体导致了干/祖细胞特异性地滞留于骨髓微环境中或者说祖细胞归巢于骨髓，也还未知。体外实验中，大多数受体的抗体可阻止CD34+细胞粘附于基质喂养细胞。活体实验结果提示，β1整合素在祖细胞滞留于骨髓及向骨髓归巢过程中起主要作用，但β1整合素及其配体的表达无处不在，且它不能支持祖细胞和骨髓间的相对专一的相互作用。因此,必然另有受体专职介导干细胞-骨髓间特异性的相互作用,譬如粘蛋白CD164或与之类似的、尚未知的糖蛋白受体等。各种细胞上整合素的结构均相同，而CD164却有几种拼接变异体，其中有些只表达于内皮细胞上，而不表达于造血细胞上，CD164或类似分子在糖基化方式上的变化可使其受体特异性增加。一直推测干细胞向骨髓微环境的归巢依赖于植物凝集素介导的相互作用。若CD164是这种归巢受体，则须行移植CD164-/-动物祖细胞的活体实验证实。粘附性受体除引起细胞的解剖学定位外，还能传递调控细胞对其他细胞外因子的反应的信号，或直接诱导或抑制细胞的增殖、存活和分化。在其他的生物体系中，整合素和选择素能介导信号由胞外向胞内的传递，这一点已得到广泛的研究。这类受体能激活多个与细胞增殖、存活与分化有关的信号传递通道。将祖细胞与基质喂养细胞共培养可抑制祖细胞的增殖，其确切机理未明。一系列的研究显示整合素、选择素和粘蛋白等的参与对祖细胞的存活和发育有较大的影响，并有可能是接触介导机制影响祖细胞增殖、分化和存活的原因。例如：结合了整合素的CD34+细胞与药理浓度的细胞因子共同培养时，可使更多的静止期祖细胞进入细胞周期，若在CD34+细胞的培养液中加入接近生理浓度的细胞因子时，细胞上结合的整合素可阻止CD34+细胞由G1期进入S期，从而抑制祖细胞的增殖。在既无细胞因子又无血清的培养基中，CD34+细胞上结合的整合素可传递存活信号。这些研究显示与整合素的结合可影响造血祖细胞的存活和发育。造血调控可能是细胞因子与接触介导效应相互作用的结果。整合素并未表现出能启动细胞反应的酶活性，信号的传递需要整合素的胞浆尾部与细胞骨架共定位，后者可吸引并活化灶性粘附激酶（FaK）等酪氨酸激酶，进而活化Ras，影响细胞增殖；或活化3-磷酸肌酸激酶（PI-3K），影响细胞的增殖和存活；或引起环素、环素依赖性激酶及其抑制物水平的变化。但其中那一条通路参与了整合素介导的对造血祖细胞增殖、分化和存活的调节，尚不清楚。Zannetino等的研究结果显示正常CD34+细胞上结合了粘蛋白CD164后，能阻止静止期造血祖细胞在混合细胞因子的刺激下进入细胞周期。CD164若结合于CD34+CD38-细胞，则会诱导其中的大部分走向凋亡。至于在其他细胞因子环境下，CD164的结合将产生何种效应，尚未有结论。由于CD164的天然配体未知，只能用抗CD164的抗体来阻滞其粘附作用，这也是在研究整合素介导的信号传递时，常用的方法。粘蛋白受体介导造血细胞信号传递的另一个例子是：髓系细胞被强制表达CD34后，其终末分化受阻，这依赖于CD34分子的胞浆尾部。与体外实验中CD34有阻止细胞终末分化的作用相一致的是CD34-/-鼠的卵黄囊及骨髓或脾中的祖细胞明显减少，这可能就是终末分化未完成的结果。至今，活化粘蛋白受体信号的传递通道还未确定。粘蛋白受体的胞浆尾部未显示内源性激酶或其他酶功能，但粘蛋白可通过肌动蛋白结合的ezrin和moesin与细胞骨架相互作用。研究了各种细胞中(不包括造血干/祖细胞)粘蛋白受体参与细胞内信号传递的效应，发现刺激粘蛋白受体可活化蛋白酪氨酸激酶、磷脂酶C/磷酸肌醇和G蛋白信号传导通路。但在刺激造血细胞上CD164或其他唾液酸粘蛋白受体后，究竟是通过哪一条通路导致了细胞死亡或对细胞增殖和分化的抑制，还有待验证。对表达于造血祖细胞上的一种新粘附性受体进行克隆和初步的功能分析，结果显示造血过程和其他复杂的生物系统一样，不仅受到经典的细胞因子和生长因子途径的控制，还受到造血细胞及其微环境间相互作用的影响。这种细胞-细胞间和细胞-ECM间接触性的相互作用，不仅影响到造血祖细胞在骨髓中的定位，而且在调节细胞的增殖过程中起重要作用。有关造血祖细胞上粘附性受体所发出信号的性质有待进一步研究，以便对支配造血细胞增殖分化的严密的调节机制有透彻的理解，从而有助于改进体外控制造血干/祖细胞的方法。已有证据表明，某些粘附性受体的功能或表达的降低会导致粘附性相互作用的偏差。在某些白血病中，可能就是这种偏差导致未成熟祖细胞被动员到外周血中，从而部分地导致了白血病细胞增殖和分化的失调。
作者: wu11998866    时间: 2012-1-28 13:19

请教做过小鼠脾树突状细胞提取的各位老师:
我现在想做小鼠脾中树突状细胞的提取，我的具体方法如下：无菌取脾，放在200目铜网上研磨，去网下脾细胞，1000r/min离心5min,重悬，用密度为1.080 的淋巴细胞分离液3000r/min，20min.取低密度细胞， 加完全培养基(5%NCF+RPMI1640)，5%CO2,37C 3h后，去非贴壁细胞。在补充完全培养基，5%CO2,37C 18h后取非贴壁细胞，在加入人IgG包被的培养板，60min取非贴壁细胞。即为DC
（1）这种方法能提取多少DC?
( 2 ) 纯度有多少？
( 3 ）做流式细胞仪能检测到吗？（我要检测的表面标志为CD8a 和CD11c）
先谢谢大家！
作者: duoduo    时间: 2012-1-28 13:42

DC在脾细胞中占1%以下，数量较少，直接检测可以检测到，有条件的流式细胞仪可以分选出DC，纯度较高。经过淋巴分离液提取单个核细胞后的DC纯度在30-40%，如在用细胞黏附法去除巨噬细胞后的纯度达50-60%，再用加入人IgG包被的培养板，60min取非贴壁细胞的纯度约为70-80%，其数量较少约5*10E5/只小鼠。此法较便宜。
作者: duoduo    时间: 2012-1-28 13:42


要得到较高纯度和较多的DC可以用细胞因子和免疫磁珠法可达95%以上，6*10E6/只小鼠，如不用免疫磁珠法，我做的实验的纯度为85%左右，数量为2*10E6，你可根据你的实验条件和要求进行选择。
作者: 小野花    时间: 2012-1-28 13:43


一般用流式细胞仪检测较为客观，小鼠可以检测相对较为特异的CD11c、CD205、33D1等指标，如果为成熟的DC要检测CD80、CD86、MHC-2、CD40。你可选择性的检测。只要你按要求做可以检测到。
作者: bamboo16    时间: 2012-1-28 13:44

请教大家：我在做细胞凋亡时，按照前面介绍用4步法设阴性对照。由于没有多聚甲醛，故用丙酮固定细胞半个小时，但流式上细胞分为两群，请问是用丙酮的缘故吗？另外做流式的老师问我为何要用4步法，他认为可以省略2、3步，即第一步只用细胞调电压，将细胞全压到第3象限。第2步细胞加AV、PI调电压，将细胞全压到第二象限。我虽知道他不对，但不知如何解释。请各位帮我解释。
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-28 13:45

因为我的实验条件和经费有限，不能做流式分选细胞，只能用很上述古老的贴壁法分选DC细胞。
我最后想测定分选脾DC细胞的两个亚型（表面标志分别为CD11c+CD8a+; CD11cCD8a-）的比例.我不知道这种方法对亚型的比例有没有影响？因为最后一步用IgG（可以用人IgG吧？）吸附FcrR+细胞时，可能吸附的是一种细胞而使其亚型的比例改变？
谢谢！
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-28 13:45


“我做的实验的纯度为85%左右，数量为2*10E6”是用什么方法做的？淋巴细胞分离液非要用1.080的？人的淋巴细胞分离液1.077行不行？
作者: caihong    时间: 2012-1-28 13:46


我在培养jurkat细胞，培养8小时后上流式检测未刺激组高表达CD69，
达89%。而PHA刺激后只有53%，而且细胞较散。PDB刺激后也是90%，为什么我的jurkat细胞在未刺激情况下高表达CD69，难道它们已经是激活的吗？
作者: 了了    时间: 2012-1-28 13:46


想请教一下大家：
流式细胞仪能用于分离细胞吗？例如在两种混合培养的细胞中，如果想根据荧光染色的不同（一种阳性，一种阴性）借助流式细胞仪使之分离开，可行吗，是否需要特殊的要求？
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-28 13:47


pBB14、pCMVEGFPspectrin、pEGFPN-1，任何一种都可以，谢谢
作者: yes4    时间: 2012-1-28 13:47

请教：看到大家都是用流式测胞膜或胞内蛋白的表达，不知流式能用来测胞核内NF－kappaB的表达么？具体的细胞处理步骤是什么？谢谢答复！
作者: zhezhe    时间: 2012-1-28 13:47


有没有谁用流式检测过PCNA？请把具体的操作步骤告诉我一下，谢谢！
作者: 二丫头466    时间: 2012-1-28 13:48

经过淋巴分离液提取单个核细胞后的DC纯度在30-40%，如在用细胞黏附法去除巨噬细胞后的纯度达50-60%，再用加入人IgG包被的培养板，60min取非贴壁细胞的纯度约为70-80%，

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加完全培养基(5%NCF+RPMI1640)，5%CO2,37C 3h后，去非贴壁细胞。在补充完全培养基，5%CO2,37C 18h后取非贴壁细胞，

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巨噬细胞噬在哪一步除去的？为什么培养3h后去非贴壁细胞，18h后取非贴壁细胞，可否再说的清楚些，我不大了解，谢谢！
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-28 13:48


提取的脾细胞经淋巴细胞分离液分离后主要为T淋巴细胞、巨噬细胞、DC细胞根据他们之间的黏附性不同可以分离。T细胞贴壁为3小时，3小时后将脱落下来；余下的主要为巨噬细胞、DC细胞，巨噬细胞与DC细胞的贴壁时间不同，DC细胞在18小时后也将脱落下来；于是要所要的DC细胞即是，后面的步骤为了进一步提纯！
作者: ffooll    时间: 2012-1-28 13:53


我想把培养的细胞消化后用于流式的测定，结果不知是消化时间有些长，还是PBS出了问题，细胞第一次离心粘乎乎的，第二次干脆就没有了，镜下也看不到了，不知哪位遇到过这种情况或者知道怎么会事，敬请赐教。
作者: vvmmoy    时间: 2012-1-28 13:54

各位大虾：
这里却是很棒哟，初来乍到，请多关照。
我才开始做实验，准备用流式检测乳腺组织的ER PR,关于组织单细胞悬液制备中乳腺中难免有脂肪组织，如何有效去除呢？有人说用胰酶消化，但是机械法本来就容易产生碎片，加上酶可能细胞更容易破坏，所以请教这个火候如何控制呢（加多大量，时间多长）。
另外对于固定细胞悬液，实验室里以前有人用0.25%多聚甲醛室温避光60min后PBS洗涤1次，再用70%冰乙醇（-20度）悬浮，还有一种PBS洗涤后用80%乙醇固定（-20度），到底哪种好呢？
请各位留心我的笨笨问题，感激涕零。
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-28 13:59

是否有朋友将流式细胞检测技术用于组培变异检测？
作者: misswu61    时间: 2012-1-28 14:05

流式可以检测在胞浆中表达的蛋白,这需要你在固定的时候家Triton 100 (按百分之2的比例加)
另请教各位老师:将GFP与目的基因融合表达后行合流式细胞术,如何设计对照可以取得好的效果?谢谢!
作者: 四福晋    时间: 2012-1-28 14:06


请教各位，用PI染色的时候，细胞是必须固定吗？还是为了保存方便
作者: junjie05    时间: 2012-1-28 14:06

回复楼上：在做PI染色时，细胞必须固定。因为活细胞对于PI拒染，只有细胞在固定后，细胞膜通透性增加，PI染料才可以进入细胞内与DNA嵌入式的结合。
就是利用这点，在测细胞调亡时，才用PI 将死亡细胞与凋亡细胞区分开。因为，死亡细胞的膜通透性很高，PI可以染进，而细胞凋亡早期的膜是完好的，不会被染上PI。
作者: glass    时间: 2012-1-28 14:12


各位大虾：
这里却是很棒哟，初来乍到，请多关照。
我才开始做实验，准备用流式检测乳腺组织的ER PR,关于组织单细胞悬液制备中乳腺中难免有脂肪组织，如何有效去除呢？有人说用胰酶消化，但是机械法本来就容易产生碎片，加上酶可能细胞更容易破坏，所以请教这个火候如何控制呢（加多大量，时间多长）。
另外对于固定细胞悬液，实验室里以前有人用0.25%多聚甲醛室温避光60min后PBS洗涤1次，再用70%冰乙醇（-20度）悬浮，还有一种PBS洗涤后用80%乙醇固定（-20度），到底哪种好呢？
请各位留心我的笨笨问题，感激涕零。

作者: 铜雀    时间: 2012-1-28 14:15

(B) ?in vitro,? including killing activity and model.?

IL-2加PHA诱导的LPAK(lymphokine and PHA activated killer)过继免疫疗法较单用IL-2活化的LAK细胞在增殖能力和细胞毒活性方面有所增强，临床应用也取得一定疗效，但尚未有突破性的进展. 而应用树突状细胞(dendritic cell, DC)进行抗肿瘤免疫的研究，特别是在提呈肿瘤抗原和激发CTL活性方面的研究，已取得了长足的进展［1］. 我们比较了诱导?4d?和诱导?7d?的LPAK细胞，在DC的辅助下对人肝癌细胞株BEL-7402体外杀伤力及杀伤模式如下.??

1 材料和方法?

1.1 材料 人肝癌细胞株BEL-7402引自中山医科大学实验动物中心. 人外周血单个核细胞由健康青年志愿者捐赠. Percoll分离液为Pharmarcia公司产品. rhIL-2由南京军区军事医学研究所惠赠，PHA为广州工业研究所产品，人IgG和Ficoll分离液购自上海华美公司. 人外周血DC的分离按本室常规［2］，将人外周血单个核细胞悬液经不连续Percoll密度梯度分离并收集35%～50%界面层细胞，37℃培养?36h?后，置于IgG包被的培养皿中用panning法纯化. 收集的非粘附细胞即为高度富集的DC. LPAK细胞的诱导：调整人血单个核细胞浓度为2×109/L?，加入IL-2 1000kU/L?和PHA?20mg/L?，分别于37℃，?50mL/L? CO2，饱湿条件下孵育?4d?和?7d?. 其中?7d?者孵育期间半保留换液扩增1次.?

1.2 方法 ①抗肿瘤实验：实验按诱导?4d?的LPAK细胞(L-4)和诱导?7d?的LPAK细胞(L-7)分为两大组，每一大组又分成4个实验组. L-4大组：L4组为BEL-7402(B)+L-4，其中B的浓度8×?107/L?，L-4与B的效靶比为?5∶1?和?10∶1?两种；LD4组为相应的L4组+DC，DC的浓度为8×?106/L?. L-7大组：各分组中除将L4改为L7外，其余均与L-4大组相同，即分为两种效靶比的L7组和相应的LD7组. 另设未经任何处理的B组(BEL-7402对照组)和培养液空白对照组. 每组均设3个复孔，置含?100mL/L?新生牛血清的RPMI-1640培养液内，于96孔平底培养板中37℃，?50mL/L? CO2，饱湿条件下培养?48h?后进行效应细胞的细胞毒活性检测. 实验重复4次. ②中性红摄入比色法检测LPAK的细胞毒活性：在上述培养细胞内加入中性红溶液并温育?1h?，再加入盐酸—乙醇溶液，于BIO-RAD3550-UV型全自动酶联检测仪上以?570nm?波长测各孔的吸光度A，用GB-STAT统计软件对实验数据进行方差分析. ③电镜样品的制备：取各组离心沉淀细胞，常规固定、脱水、包埋，超薄切片，电子染色，日立H300型透射电镜观察、摄片.??

2 结果?

2.1 DC对诱导LPAK细胞的细胞毒活性 中性红摄入比色法检测和统计结果表明，L4，LD4和L7，LD7组各自的细胞毒活性均随效靶比的增高而增强(P＜0.01). 而在同一效靶比条件下，各组的细胞毒活性为LD7＞L7，LD4＞L4(P＜0.01，图1).?

2.2 DC对诱导LPAK细胞的杀伤模式 对照组B组的BEL-7402细胞微绒毛丰富，细胞核大而圆，染色质分散，细胞质电子密度较低(图2). 实验组L-4和L-7大组中，不仅在DC与LPAK，LPAK与BEL-7402细胞之间，而且在DC与BEL-7402细胞之间都存在着细胞突起与微绒毛、或微绒毛与微绒毛的犬牙状交错接触(图3，4). 在L4组和LD4组中，BEL-7402细胞呈现不同程度的变性坏死. 细胞膜破裂，细胞轮廓不清，细胞肿胀；细胞核形态不一，有的核肿胀，有的核固缩；细胞质内细胞器明显破坏，内质网扩张，线粒体肿胀、嵴溶解消失，并可见髓鞘样小体(图5). L4组和LD4组的坏死细胞在形态上无明显差别. 在L7组和LD7组中，BEL-7402细胞则呈现不同程度的凋亡改变. 凋亡细胞的形态多样，有典型的改变，如细胞膜微绒毛消失；细胞核移位，染色质或凝聚、浓缩成新月形、弧形边集于核膜下，或固缩成团块状，或碎裂成小块、碎块被内质网包裹形成自噬体；细胞质浓缩，线粒体皱缩变小；浓缩的细胞碎片还向细胞外出芽隆起形成凋亡小体等. 也有不典型的改变，如细胞核核膜虽于核孔处断裂，但核染色质浓缩边集形成“菜花状”；细胞质内肿胀的线粒体中，有的内含致密体，有的嵴紊乱、断裂、甚至空泡化，但遗留嵴的痕迹；内质网或增生肥大，或出现不同程度的退行性变，甚至肿胀空泡化；而细胞器界膜和细胞膜一般保持完好(图6，7). L7组和LD7组的凋亡细胞在形态上无明显差别.??
作者: 铜雀    时间: 2012-1-28 14:16

图1 DC对诱导LPAK杀伤活性的影响.?

图2 对照组BEL-7402细胞微绒毛丰富，核大而圆，染色质分散，核仁清晰可见，细胞质电子密度低，细胞器完好. ×5000?

图3 LD4组DC的突起与BEL-7402细胞膜紧密接触. ×10000?

图4 LD7组DC的突起与BEL-7402细胞的微绒毛呈犬牙状交错接触. ×5000?

图5 LD4组BEL-7402细胞呈明显的坏死改变. ×7000?

图6 L7组BEL-7402细胞呈明显的凋亡改变. ×5000?

图7 LD7组BEL-7402细胞呈明显的凋亡改变. ×10000???

3 讨论?

本实验表明DC对不同诱导时间的LPAK细胞体外杀伤肿瘤细胞都有明显的促进作用，但并不改变LPAK细胞对肿瘤细胞的杀伤模式. 我们认为，DC之所以能增强LPAK细胞的杀伤效应，固然与其表面有大量树枝状突起，使之有利于直接接触肿瘤抗原并提呈给LPAK细胞有关［1］；也与其能分泌多种细胞因子有关［3］；而更重要的则与其可以通过MHCⅠ类分子途径将外源性抗原提呈给CD8+细胞，同时还提供充分的共刺激信号的功能密切相关［4］. 此外，最近又发现DC能通过分泌或外排一种具有抗原提呈能力的小体(exosomes)来诱导免疫反应，这无疑也增强了LPAK细胞的抗肿瘤功能［5］.?
至于肿瘤细胞的死亡模式，我们认为应取决于LPAK细胞本身. LPAK细胞是一个异质性的细胞群体，诱导?4d?的LPAK细胞亚群以表达CD16+，CD8+和CD3-的细胞特征为主，而诱导?7d?的LPAK细胞亚群则主要表达DC16-，CD8+和CD3+的CTL细胞特征［6］. 诱导?4d?的LPAK细胞亚群所含的穿孔素在肿瘤细胞膜上打孔后，向肿瘤细胞内释放溶解素，甚至全部胞质，直接溶解肿瘤细胞，使之崩解、坏死［7］. 而诱导?7d?的LPAK细胞亚群虽然也分泌穿孔素，并在肿瘤细胞膜上形成孔道，但因该细胞亚群含有大量的细胞毒性颗粒，因此穿孔素协助了细胞毒性颗粒进入靶细胞，其中颗粒酶B在穿孔素的协助下，能快速进入靶细胞并诱导DNA降解导致凋亡；而颗粒酶A，则因其反应较慢而诱导凋亡晚期的DNA片段化降解；还存在的颗粒酶C，D，E，F，G，可能也参与晚期的杀伤机制［8，9］. 此外，?7d?的LPAK细胞膜上的纤维连接蛋白也与凋亡的发生密切相关［10］. 在现有应用LPAK细胞的临床治疗中，采用诱导?7d?的LPAK细胞为好；若先以自体外周血DC体外刺激LPAK细胞，再回输体内，可望获得更佳的治疗效果.??
作者: 铜雀    时间: 2012-1-28 14:35

4 参考文献?

1 Girolomoni G, Ricciardi?Castagnoli P. Dendritic cells hold promise for immunotherapy. Immunol Today, 1997;18:102-104
2 Zhang JK, Sun JL, Chen HB, Zhou YQ. Ultrastructural comparison of apoptosis of human hepatoma cells and LAK cells.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6:877-879
3 Winzler C, Rovere P, Rescigno M, Granucci F, Penna G, Adorini L, Zimmermann VS, Davoust J, Ricciardi Castagnoli P. Maturation
stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. J Exp Med, 1997;185:317-328
4 Austyn JM. New insights into the mobilization and phagocytic activity of dendritic cells. J Exp Med, 1996;183:1287-1292
5 Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Flament C, Tenza D, Ricciardi Castagnoli P, Paposo G, Amigorena S. Eradication
of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Nat Med, 1998;4:594-600
6 Wu ZJ, Gao QR, Lin CH, Chai ZK, Xu J, Ye XR. Lymphokine activated LAK/TIL cell and its phenotype. Zhonghua Weishengwuxue
Yu Mianyixue Zazhi, 1997;17:120-125
7 Wang J, Zhang JK, Chen HB, Xu JD. Morphologic observation of the effect of human peripheral blood dendritic cells on LAK cells
killing H-7402 Cells. Zhongguo Zuzhihuaxue Yu Xibaohuaxue Zazhi, 1996;5:72-76
8 Sashchenko LP, Lukyanova TI, Kabanova OD, Mirkina I, Yatskin ON, Pongor S, Gnuchev NV. Different pathways of the release
of cytotoxic proteins in LAK cells. Immunol Lett, 1996;53:25-29
9 Shresta S, Macivor DM, Heusel JW, Russell JH, Ley TJ. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for
the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1995;92:5679-5683
10 Shemtov MM, Cheng DL, Kong L, Shu WP, Sassaroli M, Droller MJ, Liu BC. LAK cell mediated apoptosis of human bladder cancer
cells involves a pH-dependent endonuclease system in the cancer cell: possible mechanism of BCG therapy. J Urol, 1995;154:269-274
作者: 铜雀    时间: 2012-1-28 14:40

再用加入人IgG包被的培养板是为了进一步提纯DC。前期培养不需用这种包被的培养板；是的，它会吸附FcR的细胞。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:41

我想把培养的细胞消化后用于流式的测定，结果不知是消化时间有些长，还是PBS出了问题，细胞第一次离心粘乎乎的，第二次干脆就没有了，镜下也看不到了，不知哪位遇到过这种情况或者知道怎么会事，敬请赐教。

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这种情况是有的，可能是哪种缓冲液PH不对，造成细胞损坏。即使没有损毁，离心时细胞也会有丢失，所以细胞的量要充分。同时离心时注意操作。有人建议用适量的BSA可以减少细胞的丢失。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:41

各位大虾：
这里却是很棒哟，初来乍到，请多关照。
我才开始做实验，准备用流式检测乳腺组织的ER PR,关于组织单细胞悬液制备中乳腺中难免有脂肪组织，如何有效去除呢？有人说用胰酶消化，但是机械法本来就容易产生碎片，加上酶可能细胞更容易破坏，所以请教这个火候如何控制呢（加多大量，时间多长）。
另外对于固定细胞悬液，实验室里以前有人用0.25%多聚甲醛室温避光60min后PBS洗涤1次，再用70%冰乙醇（-20度）悬浮，还有一种PBS洗涤后用80%乙醇固定（-20度），到底哪种好呢？
请各位留心我的笨笨问题，感激涕零。

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各种组织的消化方法类似，但是具体的消化时间是不同的，应该根据具体的条件加以优化。我建议你用胶原酶和胰酶联合消化。脂肪组织我的印象会漂浮在液面上，应该好去除。
由于你检测的是ER PR是位于细胞核内所以固定穿孔细胞是必须的。我最常采用的是多聚甲醛和皂素同时固定穿孔。70％的乙醇或80％的乙醇可以采用，可能其对蛋白的变性太强，所以有时影响抗原抗体的结合。所以用的少些。
具体的方法我建议你采用这篇文献的方法：
1: Breast Cancer Res Treat. 2003 Jul;80(1):1-13. Related Articles, Links

Quantitative fluorescence cytometric measurement of estrogen and progesterone receptors: correlation with the hormone binding assay.

Gritzapis AD, Baxevanis CN, Missitzis I, Katsanou ES, Alexis MN, Yotis J, Papamichail M.

Department of Immunology, Saint Savas Cancer Hospital, Athens, Greece. cacenter@otenet.gr

We describe, here, a rapid flow cytometry technique for the detection and quantification of estrogen (ER) and progesterone (PgR) receptors in several human cell lines and in clinical samples obtained from breast cancer tumors. ER and PgR quantitation can be very useful in patients with breast cancer as their role in diagnosis and prognosis is well established. However ligand binding assays and immunohistochemical assays are difficult to measure heterogeneity in individual cells. On the other hand, flow cytometry is a convenient tool for quantification in individual cells. Flow cytometric results with breast cancer cell lines and clinical samples were compared to those obtained by quantitative biochemical ER and PgR performed by the standard dextran-coated charcoal biochemical assay. The latter assay is affected by the level of endogenous steroids. This is also the case in the routine measurement of ER/PgR in patient's tumor cells whereby estradiol molecules in patient's serum produced negative or low values in the biochemical assay. The mAbs used in our flow cytometric method bind to their specific ER or PgR independently of whether they are preoccupied by their ligands and they produce reliable results. With the use of beads calibrated in MESF (Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome) units, the ER and PgR can be measured on a per cell basis. The flow cytometric method showed a strong correlation with biochemical receptor assessments of either ER alpha (ER alphaDCC, r = 0.918, p = 0.073) or PgR (PgRDCC, r = 0.75, p = 0.001). This study demonstrates that ER alpha and PgR can be detected by flow cytometry on a per cell basis in intact cells, and can be quantitated reliably in terms of MESF without the limitations of competition with serum's estradiol molecules
作者: lixi559    时间: 2012-1-28 14:45

请各位高人指点：
我测培养的人视网膜色素上皮细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、CD54的表达，现出现两个问题请高人指点
1、我用同一方案测量同一样品时，先走同型对照后单标HLA-DR有50%以上的阳性率，波峰在设门偏右，然后测三标时HLA-DR只有0.5%的阳性率，这是为何？如何调节仪器或样品处理？
2、我同一样品用0.02%的多聚甲醛（终浓度）固定，第一天测时HLA-ABC有70%以上的阳性率，荧光强度比较强，HLA-DR有50%以上阳性率，CD54有50%阳性率，而第二天测时则HLA-ABC、HLA-DR全阴性，CD54%有98%阳性率，这是为何？是否细胞未固定自溶？
作者: lixi559    时间: 2012-1-28 14:45

请各位高人指点：
测细胞表面抗原时，固定选用什么固定剂较好，固定浓度及时间多少？
作者: lixi559    时间: 2012-1-28 14:46

荧光光谱

图片附件: 43356205.snap.jpg (2012-1-28 14:46, 56.42 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10314

作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:46

请各位高人指点：
我测培养的人视网膜色素上皮细胞表面HLA-ABC（FITC标）、HLA-DR（PCy5标）、CD54（PE标）的表达，现出现两个问题请高人指点
1、我用同一方案测量同一样品时，先走同型对照后单标HLA-DR有50%以上的阳性率，波峰在设门偏右，然后测三标时HLA-DR只有0.5%的阳性率，这是为何？如何调节仪器或样品处理？
2、我同一样品用0.02%的多聚甲醛（终浓度）固定，第一天测时HLA-ABC有70%以上的阳性率，荧光强度比较强，HLA-DR有50%以上阳性率，CD54有50%阳性率，而第二天测时则HLA-ABC、HLA-DR全阴性，CD54%有98%阳性率，这是为何？是否细胞未固定自溶？

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仪器的补偿应该由流式的操作人员进行荧光补偿的调节。如果你按照原则进行了单双标的阳性对照设计应该可以得到较好的效果。
细胞的固定绝对不回出现像你描述的那样，第一天和第二天差异那么大。所以一定是你的细胞没有固定好，或者没有妥善处理。
你测这些指标难道是想检测上皮细胞的免疫功能（抗原提呈）？你用的是原代还是细胞株？我的印象上皮细胞的ICAM-1应该阳性，但是DR阳性有50％，我觉得似乎不对。正常情况下，不应该这麽高。
作者: lixi559    时间: 2012-1-28 14:47

其中提的细胞固定用多聚甲醛溶液浓度为1-4%，不知是终浓度还是储存液浓度？
作者: lixi559    时间: 2012-1-28 14:48

1、我测的培养的人视网膜色素上皮细胞（第二代），目的是了解其免疫状态，为其移植免疫提供资料（也包括其在抗原呈递中的作用）。体内由于眼部的免疫赫免该细胞ICAM-1及DR弱表达甚至不表达。测量的单标图上也表明DR的荧光强度不高。有人告诉我可能其表达量不高，同时加入三种标记的抗体时抗HLA-ABC、抗CD54的抗体-抗原复合物量较大而影响抗HLA-DR与HLA-DR的结合，因而提出先单标DR,20min后再加入抗HLA-ABC、抗CD54的抗体，是否可行？
2、细胞固定参考书上给出的多聚甲醛溶液为终浓度0.2-0.5%，30min ，我细胞固定时在2%多聚甲醛溶液300ul中加入3ml的细胞悬液，边加边摇动。不知操作正确与否？测细胞表面抗原时，固定选用什么固定剂较好，固定液终浓度多少？固定时间多久？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:49     标题: 回复 #619 lixi559 的帖子

有没有结合的相互影响，我不能确定。但是先加DR后加ABC和CD54这样操作应该没有问题，你试一下吧。结果会自然分晓。
我最常用的就是1-4%的多聚甲醛。通常是按照你所述“我细胞固定时在2%多聚甲醛溶液300ul中加入3ml的细胞悬液，边加边摇动"。只不过体积没有你那么大而已。固定后细胞可以一直放在固定液中，直至检测。我一直用的很好，没有什么问题。我想你这样作是没有问题的。
不过既然你用的是原代细胞，你怎样保证你分离的上皮细胞的纯度？这可能也是影响你实验的一个原因，既然是上皮细胞，你应该作相应的鉴定，保证你的细胞足够纯才可以进行流式检测。
作者: lixi559    时间: 2012-1-28 14:49


我采用眼杯消化法获取视网膜色素上皮细胞。将眼球眼前节、玻璃体及神经视网膜弃除后PBS冲洗干净，这时眼杯内最内层为视网膜色素上皮细胞层，加入胰酶直接消化视网膜色素上皮细胞而获取细胞。消化细胞培养后做角蛋白免疫组织细胞化学鉴定阳性率100%。这样细胞应该是比较纯的细胞。
作者: dragonkilly    时间: 2012-1-28 14:50


我想比较成纤维细胞和骨髓基质干细胞两者之间的ASMA表达量是不是一样多，或相差多少。
已经做了MSC的流式，结果如下：
Marker % Gated mean asma
------------------------------------------
All 100.00 33.66
positive 92.36 36.00

Marker % Gated mean control
-------------------------------------------
All 100.00 6.82
positive 4.32 72.82

文献中报道，可以采用Mean fluorescence intensity ratio(MFIR) Defined as mean fluorescence intensity of the studied antibodies divided by mean fluorescence intensity of corresponding isotype controls.
请问 ，根据我得结果，应该如何处理，得到MFIR，谢谢！！！
作者: vvmmoy    时间: 2012-1-28 14:50

确实如您所说，脂肪组织确实是浮在单细胞悬液表面的，至于胶原酶和胰酶的具体用法，我在摸索，以后再请教。您对乳腺组织常用多聚甲醛和皂素固定，皂素这里实验室好像很少有用，那么它具体的浓度和使用，可否告知呢？
再次打扰，不胜感激。·
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:52

我想比较成纤维细胞和骨髓基质干细胞两者之间的ASMA表达量是不是一样多，或相差多少。
已经做了MSC的流式，结果如下：
Marker % Gated mean asma
------------------------------------------
All 100.00 33.66
positive 92.36 36.00

Marker % Gated mean control
-------------------------------------------
All 100.00 6.82
positive 4.32 72.82

文献中报道，可以采用Mean fluorescence intensity ratio(MFIR) Defined as mean fluorescence intensity of the studied antibodies divided by mean fluorescence intensity of corresponding isotype controls.
请问 ，根据我得结果，应该如何处理，得到MFIR，谢谢！！！

比较检测细胞的平均荧光强度与同型对照的比值大小即可。即33.66/6.82。
令一种细胞也作同样的比较，最后比较两者比值的大小，可确定荧光的相对强弱。
另外，如果可能我建议你用荧光显微镜（或激光共聚焦）照相，有了形态学的佐证更能说明问题。
作者: lixi559    时间: 2012-1-28 14:52


请问我测人培养细胞表面抗原时（直接标记法，抗体为小鼠来源）封闭非特异性结合是用人AB型血清较好还是鼠血清较好？一般使用浓度多少？封闭多久？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:53

确实如您所说，脂肪组织确实是浮在单细胞悬液表面的，至于胶原酶和胰酶的具体用法，我在摸索，以后再请教。您对乳腺组织常用多聚甲醛和皂素固定，皂素这里实验室好像很少有用，那么它具体的浓度和使用，可否告知呢？
再次打扰，不胜感激。·

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细胞内蛋白染色步骤：
请想做者可以参照本文：Cells from Within:
Intracellular Proteins
Although many applications of ¯ow cytometry involve the staining of
cells for proteins expressed on the outer membrane, cells also have
many proteins that are not displayed on their surface. With appropriate
procedures, ¯ow cytometry can provide a means to analyze
these intracellular proteins. The outer cell membrane is impermeable
to large molcules like antibodies; however, if we intentionally ®x cells
to stabilize proteins and then disrupt the outer membrane, the cells
can be stained with ¯uorochrome-conjugated monoclonal antibodies
against intracellular proteins. After time to allow the antibodies to
pass through the now-permeabilized membrane, the cells are washed
to remove loosely bound antibodies and then are run through the
¯ow cytometer to measure their ¯uorescence intensity.
This intensity should, under good conditions, be related to the
amount of the intracellular protein present. However, in describing
our ability to stain cells for surface proteins, we mentioned that it is
best to stain viable cells. Dead cells have leaky outer membranes;
they often show high nonspeci®c staining because antibodies get
through the disrupted membrane and become trapped in the intracellular
spaces. Therein lies a con¯ict in our ability to stain cells for
intracellular proteins. Because antibodies of all types are easily
trapped in the cytoplasm, there is greater potential for nonspeci®c
staining of permeabilized cells than intact cells. The very procedure
that we carry out to give access of the staining antibody to its target
(intracellular) antigen actually increases the access of all antibodies
to nonspeci®c targets. To lower this nonspeci®c background, antibody
titers are critical and washing steps are important. Unfortunately,
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:53

115
Flow Cytometry: First Principles, Second Edition. Alice Longobardi Givan
Copyright  2001 by Wiley-Liss, Inc.
ISBNs 0-471-38224-8 (Paper); 0-471-22394-8 (Electronic)
even with low antibody concentrations and careful washing, background
¯uorescence from isotype-control antibodies is often considerably
higher on permeabilized than on intact cells.
There is, in addition, a second problem. The procedures used for
®xing and permeabilizing cellsÐto give the staining antibodies access
to intracellular proteinsÐcan modify or solubilize some antigens,
thus destroying the stainability of the very proteins that are being
assayed. To make matters worse, the protocol that works best for one
antigen may entirely destroy a di¨erent antigen. This should not be
surprising after consideration that ``intracellular'' includes proteins of
many types and in many di¨erent environments. Some intracellular
proteins are soluble, some are bound to organelle membranes, and
some are in the nucleus. Therefore, methods for staining cells for
intracellular proteins cannot be as standard or as dependable as the
methods for staining surface proteins. They have to be individually
optimized for the cells and the proteins in question.
METHODS FOR PERMEABILIZING CELLS
While not attempting to describe possible methods in detail, I feel it is
important here to point out the issues involved in intracellular staining
because they highlight some general issues that a¨ect all of ¯ow
cytometric analysis. Methods for permeabilizing and ®xing cells are
various and must be optimized for the particular intracellular antigens
being detected because some antigens are more robust than others in
the face of di¨erent agents. Figure 7.1 gives an example comparing
®xation/permeabilization e¨ects on two di¨erent intracellular antigens:
Five di¨erent ®xation/permeabilization protocols have been
used, and their e¨ects on staining PCNA (proliferating cell nuclear
antigen) and p105 (a mitosis-associated protein) have been compared.
The good news is that you can stain for intracellular antigens. The
bad news is that it may be di½cult to stain cells optimally for
two di¨erent antigens at the same time (and the relative intensity of
staining for two di¨erent antigens may tell you little about the actual
relative proportions of these proteins in the cell).
The general protocol for intracellular staining involves, ®rst,
staining the cells for any surface (outer membrane) antigens, as described
in the previous chapter. Then the surface proteins with their
Flow Cytometry 116
bound antibodies, as well as the intracellular proteins, are ®xed gently
to stabilize them. The purpose of the ®xation is to cross-link the
proteins well enough that they are not removed or washed out of the
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:57

cells after the cells are permeabilized, but not so well that the intracellular
antibody binding sites are masked or destroyed. Although
ethanol and methanol can be used for ®xation (by themselves or
following another ®xative), the most common ®xative used prior to
intracellular staining is formaldehyde. Formaldehyde is generally
used at lower concentration and/or for a shorter period of time than
for routine ®xation of surface-stained cells (where ®xation overnight
in 1% formaldehyde is the [optional] last step of the procedure before
¯ow cytometric analysis). Formaldehyde (at 0.5±1.0%) for 10 min is
a good suggested concentration and time for cell ®xation, but lower
or higher concentrations, for shorter or longer periods of time, might
be required.
Fig. 7.1. The e¨ects of di¨erent ®xation protocols on the relative amounts detected
of two di¨erent intracellular proteins. Modi®ed from A McNally and KD Bauer as
published in Bauer and Jacobberger (1994).
Intracellular Proteins 117
This formaldehyde ®xation does permeabilize the cytoplasmic
membrane a bit (formaldehyde-®xed cells are permeable to small
molecules), but proteins are often cross-linked too tightly for staining
of intracellular proteins with antibodies. Therefore the ®xation step
is followed by a permeabilization step. Permeabilizing agents are
usually detergents, such as Triton X-100, digitonin, NP40, or saponin,
at concentrations of about 0.1%. Combined ®xation/permeabilization
reagents are also available as proprietary commercial reagents. With
luck, the detergent will open up the cell enough so that the now-®xed
proteins are accessible to the antibodies used for staining.
What are the criteria by which we can determine whether a ®xation/
permeabilization procedure has been optimized for an antigen in
question? This optimization is, in essence, no di¨erent from optimization
of a protocol for surface staining of cells. It is ®rst necessary
to maximize the ¯uorescence intensity of cells that are known to possess
the intracellular antigen (the positive control); ®xation time and
concentration need to be altered in combination with di¨erent detergent
concentrations to increase the positive staining. It is then necessary
to decrease the background staining (using cells stained with
isotype-control antibodies) as much as possible; this is done by trying
increasing detergent concentrations and washing the cells thoroughly
in bu¨er that contains the detergent. In other words, the goal is to
increase the signal-to-noise ratio. Because antibody concentration,
®xative agent, ®xative concentration, ®xation time, choice of permeabilization
agent, and concentration of that permeabilizing agent
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:57

are all variables in this protocol (and the optimal characteristics of
each may be di¨erent for di¨erent antigens), staining for intracellular
antigens requires some persistence on the part of the investigator. The
following examples (in this chapter and in the following chapter on
DNA) will demonstrate, however, that it is certainly possible.
EXAMPLES OF INTRACELLULAR STAINING
From the point of view of a ¯ow cytometer, surface, cytoplasmic, and
nuclear proteins are similar. The ¯ow cytometer cannot ascertain the
location of the source of ¯uorescence. In addition, the nuclear membrane
has large enough pores that it provides little or no obstacle to
staining once the outer, cytoplasmic membrane has been breached.
Flow Cytometry 118
Cells have been stained successfully for nuclear proteins related to
proliferation (for example, PCNA, Ki-67, and various cyclins, which
will be discussed in the chapter on DNA) and to tumor suppression
(for example, p53, c-myc, and the retinoblastoma gene product).
They have also been stained for proteins bound to interior membrane
surfaces (e.g., Bcl-2, multidrug resistance protein [MDR], and P-glycoprotein),
and many strictly cytosolic proteins have been analyzed
(like tubulin, hemoglobin, surface proteins that exist intracellularly at
various stages of di¨erentiation, and many cytokines).
As an example of one of the more complex biological situations,
we can use the staining of cytokines as an illustration. Cytokines are
a diverse class of proteins that, in response to cell stimulation, are
synthesized and then secreted by leukocytes. For example, when T
lymphocytes are stimulated, either nonspeci®cally or by immunological
triggers, they begin to synthesize interferon-g in their endoplasmic
reticulum, send the proteins to the Golgi apparatus, and then
secrete the molecules into the environment for stimulation of neighboring
cells. To stain for intracellular interferon-g, the usual technique
is to stimulate cells with a biological trigger and then to incubate them
with an inhibitor (brefeldin A or monensin) for several hours. These
inhibitors block the normal secretion of proteins from the Golgi
apparatus and thus allow the cytokine concentration to build up in
the cell to levels that are detectable. After the incubation period, the
cells are stained for any surface antigens of interest, ®xed brie¯y in
formaldehyde, permeabilized with saponin, and, ®nally, stained with
a monoclonal antibody against interferon-g.
Figure 7.2 shows an example of the way in which cells can be
stained for a phenotypic surface marker (CD8) as well as the intracellular
cytokine, interferon-g. The ¯ow data indicate that interferong
is associated, after PMA-ionomycin stimulation, primarily with
CD8-negative cells. More of the CD8-negative than the CD8-positive
cells have intracellular interferon-g, and those that have that cytokine
have more of it per cell. The tricks in the procedure for staining intracellular
cytokines are as much biological as chemical (because the
stain is for the end result of a functional process). In addition to a
knowledge of how to ®x and permeabilize a cell and how to avoid
nonspeci®c staining, we require knowledge of how to trigger the
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:57

cytokine production, knowledge of the time course of cytokine synthesis
after stimulation, and knowledge of how long cells can survive
Intracellular Proteins 119
Fig. 7.2. Dot plots showing the staining of lymphocytes for intracellular interferon-g
in conjunction with an outer membrane stain (against CD8) to phenotype the cytokine-
producing cells. Cells were stained for CD8 and then ®xed with formaldehyde
and permeabilized with saponin. The stimulus was PMA-ionomycin. Data courtesy
of Paul Wallace.
with brefeldin A or monensin inhibition so that they build up large
amounts of easily detectable cytokines but do not burst from this dire
treatment.
As another example of intracellular staining, we can look at data
from the staining of human breast tumor cells for cytokeratin and for
the estrogen receptor (both intracellular proteins). Tumor cells were
obtained following mastectomy by mincing and sieving the tissue to
form a single-cell suspension. The suspension was then treated with
saponin to permeabilize the cells. After staining for both cytokeratin
and the estrogen receptor, cytokeratin-positivity selects the cells in
the mixture that are of epithelial tumor origin (excluding stromal
or in®ltrating in¯ammatory cells). The two-color plot in Figure 7.3
indicates that the cytokeratin-positive (but not the cytokeratinnegative)
cells express the estrogen receptor strongly (estrogen receptor
positivity is associated with superior prognosis and a greater
responsiveness to endocrine therapy). Gating on the cytokeratinpositive
cells permits the analysis of tumor cells by themselves for the
estrogen receptor without concern about the variable contamination
of tumor cells by stromal cells in di¨erent samples.
Fig. 7.3. A dot plot (on the left) showing the staining of cells from a human breast
tumor for two intracellular proteins. Cytokeratin-positivity marks tumor cells in the
suspension, and estrogen receptor positivity on these cells indicates superior prognosis.
The plot on the right shows a correlation (in 27 breast tumors) between the
intensity of estrogen receptor staining by ¯ow cytometry and the level of estrogen
receptor binding (by radioligand binding assay). Modi®ed from Ian Brotherick et al.
(1995).
Intracellular Proteins 121
Having discussed the staining of cells for both extracellular and
intracellular proteins, and, in the process, learned something about
general ¯ow cytometric methodologies for analysis of data, we are
now ready, in the next chapter, to apply some of these general
methods to cellular components that are not proteins at all.
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:58

请问我测人培养细胞表面抗原时（直接标记法，抗体为小鼠来源）封闭非特异性结合是用人AB型血清较好还是鼠血清较好？一般使用浓度多少？封闭多久？

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好的抗体即使不封闭也能去的好的结果，不好的抗体怎样封闭，都很难取得好的结果。
如果有非特异性标记才需要封闭。封闭的方法很多，你所选择的都可以。关键看结果。如果能封住，就无所谓了。浓度你可以从1%开始，和抗体一起孵育。效果不好时可以增加浓度。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:59

我今天把流式讨论区的帖子全部阅读一遍觉得受益菲浅。其中提的细胞固定用多聚甲醛溶液浓度为1-4%，不知是终浓度还是储存液浓度？

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终浓度。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 14:59

从图形分析补偿确实不太好。用DR单表时，应该其它两种荧光也调在10以下，目前你的偏低，你可以适当增加电压。但这不是主要问题，我觉得FITC和PE之间的补偿已经很好。从你的三标图上我觉得CD54和ABC都阳性。DR我还不能完全确定。但我觉得你应该相信单标的结果（最好能重复一下），因为单标不会收到补偿的影响。
另外我发现你的细胞很少，可能跟你的取材困难有关。而且两次的细胞形态看起来不玩全一致。注意每次的细胞消化等处理尽可能一致，这也是保证实验结果的一个重要方面。
作者: lixi559    时间: 2012-1-28 15:00

我过几天再养一批细胞再按你 的指点重做一遍。今天是我先染DR，25min后再染ABC、CD54后DR才有8%的阳性率。
作者: pengke1983    时间: 2012-1-28 15:00


请问同时检测HLA-ABC、HLA-DR时两个抗原结合位点是否会互相干扰。试剂为Coulter公司，抗HLA—ABC特异性为b2微球蛋白，抗HLA—DR特异性为HLA-DR单态性。
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-28 15:02


骨髓基质干细胞的ASMA表达为胞浆内抗原。

已经做了MSC的流式
我用的是TRITON打孔，流程比较复杂
1 甲醛固定40分，pbs重悬
2 0.2％TRITON 5%血清 冰上孵育 10分钟 重悬
3 一抗 饱和剂量 冰上放置40分钟
4 二抗
5 多聚甲醛重悬
6 检测
结果是有的，但消耗细胞量大。

而文献上仅用乙醇固定30分钟后（作者用permeabilized with ethanol for 30 minutes and incubated with monoclonal antibody)就用一抗孵育。
请问各位前辈，
这有什么不同吗？或者那一个更好？最好后者可用，因为感觉简单。
谢谢！
作者: milkdog    时间: 2012-1-28 15:02

如果按照标准的要求你所提到的事情可都要照办。
1 鞘液，自配的PBS溶液经0.22um膜过滤处理可以替代BD的成品，让BD的东西见鬼去吧，不就是个PBS还要收我们这么多钱，老美可真有钱。
2 PI 溶液，自配的效果可以替代BD产品。
3 如果是细胞粘连很多，可以用滤膜过滤，细胞的大小为数十um，只要孔径比细胞略大让细胞通过就可以了。
4 次氯酸钠用10%就可以。市售的次氯酸钠原液杂质多，可以稀释后过滤去除杂质，或者更换好的试剂。
但事实上，我们没有严格按照BD 的要求进行。
鞘液我都是用的3蒸水替代。实验是没有问题的（分选除外）。
作PI染色检测细胞周期，我过滤过几次，但是后来嫌繁，就再也没有过滤过。到现在没有堵住过机器，我的经验是有时会有大的细胞团会堵住机器，马上用Prime进行反冲，可以将细胞团块反冲回来，然后继续检测。
如果你万一堵住了，还是让工程师来吧，BD以售后服务好著称。

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几点补充和不同的看法：
1.建议上机前用300-400目尼龙滤网过一下标本，对防止堵管大有好处。测完后立刻冲机器，基本上不会发生堵管现象。
2.市售的次氯酸钠原液可用双层滤纸过滤去除杂质。
作者: milkdog    时间: 2012-1-28 15:03

我仔细阅读了贴主的英文原著部分内容，还是没有明确答案，请有经验的同道指点，不胜感激！

原贴如下：
骨髓基质干细胞的ASMA表达为胞浆内抗原。

已经做了MSC的流式
我用的是TRITON打孔，流程比较复杂
1 甲醛固定40分，pbs重悬
2 0.2％TRITON 5%血清 冰上孵育 10分钟 重悬
3 一抗 饱和剂量 冰上放置40分钟
4 二抗
5 多聚甲醛重悬
6 检测
结果是有的，但消耗细胞量大。

而文献上仅用乙醇固定30分钟后（作者用permeabilized with ethanol for 30 minutes and incubated with monoclonal antibody)就用一抗孵育。
请问各位前辈，
这有什么不同吗？或者那一个更好？最好后者可用，因为感觉简单。
作者: duoduo    时间: 2012-1-28 15:06


我在文献上看到只说需要BD公司的FITC-IgG1 同型对照，可是我去公司问，他们说有 IgG1 kappa的同型对照，kappa是什么意思啊？能用吗？请学长们指教。谢谢。
作者: duoduo    时间: 2012-1-28 15:09     标题: 回复 #641 duoduo 的帖子

你的抗体是什么样的类型，同型对照就要选相同的类型。
kappa（κ）就是其中的一个亚类。
作者: 穿越时空    时间: 2012-1-28 15:11


我也要做流式了，懂得还不多，请各位指教：
用流式细胞仪检测巨噬细胞的细胞周期和其表面的受体CD36，该受体用WESTERN 检测与流式检测各自的优缺点在哪里呢？谢谢
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:12

我也要做流式了，懂得还不多，请各位指教：
用流式细胞仪检测巨噬细胞的细胞周期和其表面的受体CD36，该受体用WESTERN 检测与流式检测各自的优缺点在哪里呢？谢谢

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我觉得流式的相对定量效果要远远好于western。western定量受很多因素的影响。首先你要裂解细胞，提纯蛋白，经过转膜等多个步骤。还要进行内参，最终还是个相对定量。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:12


流式细胞术实验手册
英文
cuturl('http://www.prettybio.com/pub/Flow') cytometry First Principles.rar
作者: qqq111    时间: 2012-1-28 15:13


请教！！！如何减轻流式过程中的细胞粘连问题？？？
作者: caihong    时间: 2012-1-28 15:14

我觉得检测贴壁细胞的凋亡时,还是用胰酶消化比较好,因为机械处理得到的细胞通常粘连很严重,不利于染色,我们通常用1X的胰酶消化5～10分钟即可,如果是贴壁不太牢固的,用EDTA也可以
作者: yhz1973    时间: 2012-1-28 15:14


请教！！！如何减轻流式过程中的细胞粘连问题？？？
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-28 15:15

由于CD36很好检测，而且可以用多色荧光精确定位巨噬细胞（除非你是用的细胞系），采用荧光标记的单抗可以较快的完成。

我用的恰恰是巨噬细胞系RAW264.7 和脂肪细胞系3T3L1,这会有什么麻烦呢？多色荧光具体用什么染料比较适宜呢?

还有两个问题，
一是检测以上两种细胞的PPARr的表达及活性，是不是只能用WESTERN方法；流式技术效率怎么样；

二是检测以上两种细胞里的PPARr与PPRE的结合活性，除了EMSA方法，流式技术有没有进展？EMSA方法，是不是毒性太大了，身边的人没几个愿意作，

还请各位指教，谢谢
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:16

请教！！！如何减轻流式过程中的细胞粘连问题？？？

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可以试一下加一点胰酶。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:16

有谁有用ANNEXIN-V/PI KIT做贴壁或组织块细胞凋亡的经验？
怎样处理这种细胞才能比较好的避免人为造成的细胞膜破坏？是单用机械处理还是单用酶消化亦或两者结合更好？若要使用酶，胰酶浓度多少？一般作用多长时间？
万分感谢！

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不同的细胞的黏附能力并不相同，因此你很难给出一个万全的方案。像神经元这种细胞你一碰它就会损毁。几乎就不可能处理好。293细胞帖壁不牢，轻轻吹几下就可以了。如果是组织块，我建议你不要做了。我这里还没有做过好的结果。帖壁细胞一般采用胰酶或联合EDTA可以得到较好的结果。但是要想完全去除对胞膜的影响是不可能的。我的通常做法是通常尽量的避免消化过渡。通常来说凋亡的细胞annexin－v的结合能力要强于胰酶的损伤造成的结合。因此只要能去分出凋亡和非凋亡的相对荧光强度就可以了。但是即使是这样，也不一定能得到理想的结果。所以帖壁细胞的凋亡最好能两个分析凋亡的方法同时应用。如分析caspase、tunel等。毕竟现在主流的观点认为检测凋亡要多种方法。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:17

由于CD36很好检测，而且可以用多色荧光精确定位巨噬细胞（除非你是用的细胞系），采用荧光标记的单抗可以较快的完成。
我用的恰恰是巨噬细胞系RAW264.7 和脂肪细胞系3T3L1,这会有什么麻烦呢？多色荧光具体用什么染料比较适宜呢?还请指教，谢谢

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如果是细胞系就没有问题了，只要你所用的细胞系有CD36有表达就是。采用单色荧光方便，省力。
多色染色的目的主要是区分这些细胞。假如说你想观察硬化斑块组织中的巨噬细胞的CD36的表达，自然可以采用CD14来区分巨噬细胞。同时观察cd36的表达水平。
作者: loli    时间: 2012-1-28 15:17

目的基因对细胞增殖的影响常用的就是流式细胞仪检测细胞的周期。常采用的染色步骤如下：
1 收集>10的6次方个细胞。以-20℃预冷的75%乙醇固定6h。
2 加入PI和RNAase（终浓度均为50ug/ml）染色30min以上。
3上机检测。
由于转基因有一定的效率，所以需要以GFP阳性的细胞设门区分转基因细胞和未转基因细胞。分析GFP阳性的细胞周期。如果你分析的细胞是经过克隆挑选过的稳定细胞株则不存在这个问题，直接分析细胞周期就可以了。
为了观察转基因本身对细胞增殖的影响（基因转染试剂往往会有一定的细胞毒性），所以需要设立转空载体的对照。
由于很多实验用的GFP是位于细胞质内，是可溶性的，在乙醇固定后往往会从细胞内溢出，导致GFP阳性率下降。所以如果你的转染效率不高，则要特别当心这个问题，采用膜定位表达的GFP可以更好的解决这个问题，但是由于你是融合蛋白，GFP的表达定位取决于你的目的基因。如果转基因效率高则可高枕无忧了。所以如果GFP阳性率不高，建议提高转染率，同时可以适当减少乙醇的固定时间，我尝试过1h，即可以达到固定的效果，有可以减少GFP的丢失。
希望对你的实验有用，如果取的了好的效果，别忘了来此详细介绍一下你的实验体会，以利后来者（先谢谢了！）。

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请问，在加入70％酒精之前和之后是不是都要用PBS冲洗几遍？
作者: guagua    时间: 2012-1-28 15:20


请教老师：我作细胞活化后的胞内因子染色，细胞的位置老是移动变化，无法根据对照设门，怎么处理？
作者: +小生怕怕+    时间: 2012-1-28 15:20

紧急请教各位老师:
能否用BD公司的ProCOUNT Progenitor Cell Enumeration Kit （货号340498）绝对计数大鼠外周血的CD34阳性细胞？（我只知道它可以绝对计数人的CD34细胞）如果不行，怎样才能准确计数大鼠外周血的CD34阳性细胞呢？希望能得到高人指点。
谢谢！
祝各位新年快乐，实验顺利！
作者: HP007    时间: 2012-1-28 15:23

我的问题是这样的，我就是用胰酶消化的啊，可能是没吹好，细胞成团吧，可是我照丁香园上面的方法用7号针头抽吸过两次了，还不能成为单细胞悬液么？而且存在一个问题，我的细胞有时候数量很少，就减少了重悬浮次数，就是说在洗的时候，我有时候没有重悬浮，直接加的洗液，是不是由于这个原因，导致了细胞粘连严重？师兄，虽然这是个小问题，可是直接影响了我的图的漂亮程度，请给点意见吧！！！谢谢！！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:24

请问，在加入70％酒精之前和之后是不是都要用PBS冲洗几遍？
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一般pbs洗一遍就可以了。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:24

请教老师：我作细胞活化后的胞内因子染色，细胞的位置老是移动变化，无法根据对照设门，怎么处理？
====================================================================
对照也应该按照染色的进行同样的处理，这样位置会一样。否则，只能单独设门分析了。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:24

紧急请教各位老师:
能否用BD公司的ProCOUNT Progenitor Cell Enumeration Kit （货号340498）绝对计数大鼠外周血的CD34阳性细胞？（我只知道它可以绝对计数人的CD34细胞）如果不行，怎样才能准确计数大鼠外周血的CD34阳性细胞呢？希望能得到高人指点。
========================================================================
老鼠的CD34我没有试过，但是我估计不会通用。
按照原理应用CD45和CD34进行双标可以进行检测。你只要定相应的鼠的单抗就可以了。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:26

我的问题是这样的，我就是用胰酶消化的啊，可能是没吹好，细胞成团吧，可是我照丁香园上面的方法用7号针头抽吸过两次了，还不能成为单细胞悬液么？而且存在一个问题，我的细胞有时候数量很少，就减少了重悬浮次数，就是说在洗的时候，我有时候没有重悬浮，直接加的洗液，是不是由于这个原因，导致了细胞粘连严重？师兄，虽然这是个小问题，可是直接影响了我的图的漂亮程度，请给点意见吧！！！谢谢！！
================================================
可能啊。
最好是细胞多一些。即使粘连也可以有足够的细胞数。
作者: ha111    时间: 2012-1-28 15:27

我的问题是这样的，我就是用胰酶消化的啊，可能是没吹好，细胞成团吧，可是我照丁香园上面的方法用7号针头抽吸过两次了，还不能成为单细胞悬液么？而且存在一个问题，我的细胞有时候数量很少，就减少了重悬浮次数，就是说在洗的时候，我有时候没有重悬浮，直接加的洗液，是不是由于这个原因，导致了细胞粘连严重？师兄，虽然这是个小问题，可是直接影响了我的图的漂亮程度，请给点意见吧！！！谢谢！！
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我也遇到跟你一样的困境，我用胰酶消化细胞，后来上流式时细胞粘连成团，打不散，老师说我是细胞消化过度，细胞DNA如絮状释出，粘连在一块了，可是我吹打时很费劲，细胞很难吹下来，收的细胞很少，到底细胞粘连是消化不完全还是消化不足呢？细胞粘连时，得出的凋亡图确实很难看，毛刺毛刺的，干扰很大！同病相怜啊！你要是有什么好方法可以减少流式过程中的细胞粘连问题，发封e-mail给我吧，不胜感激！
作者: 麦丽素1986    时间: 2012-1-28 15:28

我是一个新手，目前在准备开始实验，我在考虑能不能把流式细胞技术应用到果蝇细胞特性的分析中，但我现在对这方面技术还是一窍不通，不知道流式细胞术合不合适应用在果蝇细胞的分析中，希望各位有经验的高手能给我一点指点。
作者: eric930    时间: 2012-1-28 15:30


本人也是初次接触流式，此专区对本人真是受益菲浅。目前有些具体问题需要Schoman, Kassen,TCR等高人指点，先谢了！

1，本人将EGFP融合目的基因转入细胞内（该目的基因表达细胞核中），观察目的基因对细胞周期的影响。以GFP阳性细胞设门，检测该群细胞的DNA含量。看到该专区有些关于GFP设门的贴子，但具体如何设？请各位大侠能否解答的具体些。
2，我用了三个Control, 未转质粒也未染PI（Control 1），未转质粒染PI（Control 2），转质粒未染PI（Control 3），是否就是用Control 1调电压，而用Control 2和Control 3调节补偿？Control 1调到左下象限，Control 2在左上象限，Control 3则在右下象限，我觉得Control 3应该有两个细胞群（不可能有100%的转染效率），GFP阴性和阳性细胞群，但我的实验只有一个细胞群（荧光显微镜观察转染效率还是比较高的）。通过以上设置后检测我的样本，几乎100%细胞在右上象限（双阳性区），结果难以相信。
3，如果检测GFP阳性细胞的DNA含量是否就是指右上象限内的细胞的DNA含量？
4，GFP和PI分别用哪个通量，我们实验室是BD机子？

盼早日答复！
作者: bongte    时间: 2012-1-28 15:32

我是一个新手,现上传两张图片，请大家帮助分析分析，谢谢

图片附件: 44794880.jpg (2012-1-28 15:32, 37.64 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10315

作者: bongte    时间: 2012-1-28 15:33

我是一个新手,现上传两张图片，请大家帮助分析分析，谢谢


图片附件: 51908931.jpg (2012-1-28 15:33, 38.21 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10316

作者: tangxin_80    时间: 2012-1-28 15:38

各位大虾，求救了。

请允许我问一个外行问题，我的实验预备用流式检测乳腺癌ER、PR。我准备二抗用FITC标记的二抗。最近要定购一抗，实验室老师说抗体说明书最好表明流式的方法。可是我向很多试剂公司询问，很少有表明作流式的ER和PR的单克隆抗体，且价格十分贵，本人经费十分有限，想知道，没有特别标明流式方法的一抗，可不可以作呢？效果如何呢？
万分感激。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:39

本人也是初次接触流式，此专区对本人真是受益菲浅。目前有些具体问题需要Schoman, Kassen,TCR等高人指点，先谢了！

1，本人将EGFP融合目的基因转入细胞内（该目的基因表达细胞核中），观察目的基因对细胞周期的影响。以GFP阳性细胞设门，检测该群细胞的DNA含量。看到该专区有些关于GFP设门的贴子，但具体如何设？请各位大侠能否解答的具体些。
2，我用了三个Control, 未转质粒也未染PI（Control 1），未转质粒染PI（Control 2），转质粒未染PI（Control 3），是否就是用Control 1调电压，而用Control 2和Control 3调节补偿？Control 1调到左下象限，Control 2在左上象限，Control 3则在右下象限，我觉得Control 3应该有两个细胞群（不可能有100%的转染效率），GFP阴性和阳性细胞群，但我的实验只有一个细胞群（荧光显微镜观察转染效率还是比较高的）。通过以上设置后检测我的样本，几乎100%细胞在右上象限（双阳性区），结果难以相信。
3，如果检测GFP阳性细胞的DNA含量是否就是指右上象限内的细胞的DNA含量？
4，GFP和PI分别用哪个通量，我们实验室是BD机子？
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GFP用FL1，PI用FL2。
转基因阳性率高，所以你的细胞都在双阳性区是对的。
你应该分析转基因前和后的细胞周期的变化；以及转空载体（或者单纯GFP）的周期。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:39

各位大虾，求救了。

请允许我问一个外行问题，我的实验预备用流式检测乳腺癌ER、PR。我准备二抗用FITC标记的二抗。最近要定购一抗，实验室老师说抗体说明书最好表明流式的方法。可是我向很多试剂公司询问，很少有表明作流式的ER和PR的单克隆抗体，且价格十分贵，本人经费十分有限，想知道，没有特别标明流式方法的一抗，可不可以作呢？效果如何呢？
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绝大多数是可以用的。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:39

我是一个新手,现上传两张图片，请大家帮助分析分析，谢谢
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第一张流式电压调节错误。应该减到和第二张类似的数值。
第二张应该没有问题。死亡和凋亡的不少。
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-28 15:40

我想请教用罗丹明123染色的一个问题：
我做的是贴壁细胞，是消化之前染色好呢，还是消化之后染色好，
如果是在消化之前染色，那染多长时间比较合适呢？
作者: zhezhe    时间: 2012-1-28 15:44


请教:如何判断细胞周期发生阻滞及完全阻滞, 有什么指标吗?
作者: 泡泡    时间: 2012-1-28 15:45

sos 我是绝对的新手

老板要我用cfse染色，观察T细胞的增殖周期，并检测在增殖过程的细胞因子的分泌。预实验做了几次，也不知道做的结果是好是坏
楼主能不能帮我找点好的流式图片给我看看？？
现在的问题是，我不知道在用第二荧光CD4PE时，如何调整cfse的补偿值，到底该把它的荧光调整到什么程度？
另外，我还想做一下凋亡过程中的细胞因子，楼主有什么好的建议？？
作者: 泡泡    时间: 2012-1-28 15:45

请教:如何判断细胞周期发生阻滞及完全阻滞, 有什么指标吗?

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我想你可以试试活细胞燃料cfse，它在细胞增殖的过程中，荧光强度递减，利用流式细胞仪分析细胞增殖的技术已经应用的相当广泛，我现在就在做这方面的工作，只是我也是个新手，所以不能给你更多的信息了
作者: 社会主义好    时间: 2012-1-28 15:46


我用胰酶消化细胞，后来上流式时细胞粘连成团，打不散，老师说我是细胞消化过度，细胞DNA如絮状释出，粘连在一块了，可是我吹打时很费劲，细胞很难吹下来，收的细胞很少，到底细胞粘连是消化不完全还是消化不足呢？细胞粘连时，得出的凋亡图确实很难看，毛刺毛刺的，干扰很大！有什么好方法可以减少流式过程中的细胞粘连问题吗？帮帮我吧！我得的细胞现在是没办法过机，检测不出来，现在正怀疑老师给我的建议是否是正确的，如果是消化过度，不可能收细胞这么费劲的，我的细胞是否是消化不够，吹打时用吸管的尖部把细胞刮下来，导致细胞成片
作者: sunnyB    时间: 2012-1-28 15:51

我做了一个预实验，让一瓶细胞消化过度，一瓶消化不足，做流式时，果然消化不足的细胞粘连了，所以我觉得流式中细胞粘连的问题可能还是消化不足，然后吹打时太用力不小心把细胞刮了下来，成片的粘连。其实可能过分的消化过度也会造成粘连，可是本人还是感觉胰酶没那么大的功效把细胞膜消化破，可能会损伤膜功能而已，但不至于膜破让DNA释放，造成粘连。
作者: whitesheep    时间: 2012-1-28 15:51


我也是完全的新手，连流式细胞仪都没有摸过，过完年打算用流式来检查一下药物引起的细胞周期阻滞，还有检查凋亡细胞的含量。
细胞周期阻滞我想就是处理好细胞以后，上流式检查DNA含量，用直方图比较各期的细胞数。对于检查凋亡细胞含量，我看书上说是由于凋亡细胞的DNA漏出，在G1/G0期前有凋亡峰。我现在有点糊涂这两者的关系，都是以DNA含量为参数，这两者的区别在哪里？是不是检测时流式细胞仪的参数选择不同？
不好意思，问这么菜的问题。麻烦知道的人给我解释一下。谢谢。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:55

我也是完全的新手，连流式细胞仪都没有摸过，过完年打算用流式来检查一下药物引起的细胞周期阻滞，还有检查凋亡细胞的含量。
细胞周期阻滞我想就是处理好细胞以后，上流式检查DNA含量，用直方图比较各期的细胞数。对于检查凋亡细胞含量，我看书上说是由于凋亡细胞的DNA漏出，在G1/G0期前有凋亡峰。我现在有点糊涂这两者的关系，都是以DNA含量为参数，这两者的区别在哪里？是不是检测时流式细胞仪的参数选择不同？
不好意思，问这么菜的问题。麻烦知道的人给我解释一下。谢谢。
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正常细胞含有DNA，凋亡细胞也含有，只是含量下降，所以位于正常细胞的G0G1前，但是，假如说是G2M期的细胞凋亡，那可能也会位于G0G1之前。检测是采用的单参数分析。
作者: 大白菜    时间: 2012-1-28 15:55

我用BD的流式细胞仪检测细胞marker，对于同一条件处理巨噬细胞，我分别联合检测PAR2-FITC和CD14-PE，以及CD68-FITC和CD14-PE，按理2种组合的CD14-PE阳性率和荧光强度应该是基本相同的，可是我的结果确相差非常大，和PAR2-FITC结合的阳性率只有1％，强度(All, median,in Histogram)小于10，可是和CD68-FITC联合的结果却分别是90％和50以上。我想这肯定有问题，重复多次都如此。
不知为何，也不知那个组合里的CD14结果是对的？

先谢谢了
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 15:56

我用BD的流式细胞仪检测细胞marker，对于同一条件处理巨噬细胞，我分别联合检测PAR2-FITC和CD14-PE，以及CD68-FITC和CD14-PE，按理2种组合的CD14-PE阳性率和荧光强度应该是基本相同的，可是我的结果确相差非常大，和PAR2-FITC结合的阳性率只有1％，强度(All, median,in Histogram)小于10，可是和CD68-FITC联合的结果却分别是90％和50以上。我想这肯定有问题，重复多次都如此。
不知为何，也不知那个组合里的CD14结果是对的？
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正常分化的巨噬细胞应该是CD14阳性。所以我觉得第二种情况对。
作者: 气泡    时间: 2012-1-28 15:58

正常分化的巨噬细胞应该是CD14阳性。所以我觉得第二种情况对。

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谢谢，我的情况是来自同一个患者的同一份标本，分2种组合测，结果不同，所以我认为有一种结果不对
作者: 一叶    时间: 2012-1-28 15:58

老板要我用cfse染色，观察T细胞的增殖周期，并检测在增殖过程的细胞因子的分泌。预实验做了几次，也不知道做的结果是好是坏
楼主能不能帮我找点好的流式图片给我看看？？
现在的问题是，我不知道在用第二荧光CD4PE时，如何调整cfse的补偿值，到底该把它的荧光调整到什么程度？
另外，我还想做一下凋亡过程中的细胞因子，楼主有什么好的建议？？

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下面是我做的图你可以看一下，补偿我想调到这种程度就可以了。
你检测增殖过程中的细胞因子是用细胞内细胞因子染色法吧？那至少需要三种荧光了。

如果想检测凋亡中细胞因子分泌，选择恰当的检测凋亡方法可能很重要，因为与抗细胞因子的抗体荧光要分得开，单是PI就已经占据了FL-2和FL-3两个荧光通道，如果再配合Annexin V，细胞因子只能用FL-4了。而且细胞内细胞因子染色通常还要另加刺激剂和阻断剂，何时加，阻断多久？可能还有好多条件需要摸索。

图片附件: 35022398.snap.jpg (2012-1-28 15:58, 32.78 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10317

作者: 一叶    时间: 2012-1-28 15:59

本人也是初次接触流式，此专区对本人真是受益菲浅。目前有些具体问题需要Schoman, Kassen,TCR等高人指点，先谢了！

1，本人将EGFP融合目的基因转入细胞内（该目的基因表达细胞核中），观察目的基因对细胞周期的影响。以GFP阳性细胞设门，检测该群细胞的DNA含量。看到该专区有些关于GFP设门的贴子，但具体如何设？请各位大侠能否解答的具体些。
2，我用了三个Control, 未转质粒也未染PI（Control 1），未转质粒染PI（Control 2），转质粒未染PI（Control 3），是否就是用Control 1调电压，而用Control 2和Control 3调节补偿？Control 1调到左下象限，Control 2在左上象限，Control 3则在右下象限，我觉得Control 3应该有两个细胞群（不可能有100%的转染效率），GFP阴性和阳性细胞群，但我的实验只有一个细胞群（荧光显微镜观察转染效率还是比较高的）。通过以上设置后检测我的样本，几乎100%细胞在右上象限（双阳性区），结果难以相信。
3，如果检测GFP阳性细胞的DNA含量是否就是指右上象限内的细胞的DNA含量？
4，GFP和PI分别用哪个通量，我们实验室是BD机子？

盼早日答复！

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（1）BD的机子GFP用FL1通道，PI用FL-2通道检测。

（2）用Control 1和Control 3在FL-1 vs SSC散点图上分析GFP阳性细胞百分率，我想这应该是你观察目的基因对细胞周期影响之前首先应该做的事。

此时FL-2电压设在最低，以Control 1为阴性对照调节FL-1电压，分析Control 3中GFP阳性百分率，也就是转染效率。不知你用何种转染方法，转染都会对细胞造成损伤，尤其是电穿孔法，因此通常检测转染率前先用PI染一下死细胞，在FL2 vs FL-3上划除双阳性的死细胞，即不将死细胞计算在内。EGFP融合目的基因的转染效率一般不会超过40%。
注意：这个PI染色与染细胞周期时不同，是活细胞取出后不固定，直接加PI（配于PBS，不含任何其它添加物），5分钟后即可上机检测。

（3）调节FL1与FL-2的补偿。
FL1可以用（2）中的电压，FL-2的电压通过Control 1和Control 2来确定，并用Control 2和Control 3来调补偿，Control 2在左上象限，Control 3跨左下和右下两个象限其补偿程度可以参考（2）中图形，GFP阳性和阴性的两群细胞分开。

（4）比较转染EGFP融合目的基因组和转染EGFP空载体组细胞的DNA含量变化。
既转染又染PI的细胞应跨左上和右上两个象限，以右上象限（转染阳性细胞群）设门进一步在FL-2A vs FL-2W上设门，最后在FL-2A 直方图上分析DNA含量变化，并进行比较。此外EGFP空载体组还可对左上象限与右上象限两个细胞群进行比较，观察空载体阳性和阴性细胞群的DNA含量变化。
作者: 一叶    时间: 2012-1-28 16:01

我是一个新手，目前在准备开始实验，我在考虑能不能把流式细胞技术应用到果蝇细胞特性的分析中，但我现在对这方面技术还是一窍不通，不知道流式细胞术合不合适应用在果蝇细胞的分析中，希望各位有经验的高手能给我一点指点。

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流式细胞术只是一种方法，它的特点是在单细胞水平进行高通量、多参数的检测，可重复性好。这种方法本身对细胞类型是没有限制的，但对细胞数量要求较高，一般都要达到10^5水平。再就是流式细胞术与抗体是密不可分，而抗体有种属特异性，我想果蝇种属特异性的抗体是很难找到的，当然某些物质相当保守，在不同种属间有很大的同源性，也可以利用。你可以用一些通用细胞染料对细胞增殖、凋亡、分化、膜电势变化、pH值变化等等做一些研究。

为了拓展流式细胞术的应用，目前已经可以对可溶性的物质进行检测，如细胞因子，只要有抗体就可以将各种beads与可溶性物质连接，像细胞一样接受激光信号。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-28 16:01


请问我想用流式细胞仪检测两个受体，能同时标记送流式检测吗？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 16:02     标题: 回复 #690 黄花菜 的帖子

理论上是可以的，具体情况需要你详细介绍、具体实验才能决定能否成功。
作者: 阿敏    时间: 2012-1-28 16:02

我也是新手，看英文文献太费劲，想看看流式中文方面的专著，请问一下有没有这方面的书籍？如何能得到？ 另外不知各位有没有英文书籍的电子版，如Wiley出版的Current protocols in cytometer?书太贵，买不起。老板又没有，郁闷。
作者: 爱老虎游tt    时间: 2012-1-28 16:03


关于目前研究新基因功能的方法，很多实验室采用与GFP共转染的方法看新分子对细胞周期的影响，不得其法，在此简评之：由于人为转染造成的外加基因表达过度造成的影响太大，因此此法目前得到的结果多为假阳性，因此研究蛋白质功能的生化专家对此极为不屑，目前多主张做RNA干扰的方法来解决一些问题，当然也不是最完美的。关于GFP共转染后乙醇固定检测细胞周期遇到的问题主要是乙醇的固定影响GFP的结构从而使之荧光丧失。解决方式为更换膜穿透性染料如hochest等，当然激发光要用紫外。另外的方法就是将共转染的细胞分选出来再做分析，当然目前流式分选成本太高，如有朋友有兴趣，我可以提供一种GFP磁性分选方案，可能比较适合目前实验室的此类研究。
再回答楼上的一个问题，所有用到抗体的检测方法基本是可以相互补充的，关键是抗体的选择，因为流失检测抗体识别的多为蛋白的立体表位，而很多western抗体均为用多肽打的线性表位多抗或单抗，这类抗体有时不能识别蛋白三级结构，那就不能用来做流式，如果这个抗体刚好也能识别天然构象，理论上就可以用，当然信号分子的表达丰度也要考虑。操作时只要将膜脂溶掉即可，酒精或其他去垢剂均可尝试。但考虑到目前荧光和化学发光的敏感度，还是western更敏感些。最好多种方法相互印证。
本人从事细胞免疫学研究，欢迎讨论。
作者: 爱老虎游tt    时间: 2012-1-28 16:04


楼上的流式图做的不错，CSFE就是这样，有些文献上的图是处理过的，还有些更漂亮的是诌的。
作者: 爱老虎游tt    时间: 2012-1-28 16:04

我是一个新手,现上传两张图片，请大家帮助分析分析，谢谢
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新手请不要用自动软件分析，这种东西是给傻瓜用的。流式是分析仪器而不是自动傻瓜机。用检测DNA含量的方法测定凋亡很难判断真假阳性。建议用R123和PI双标记，或annexin和PI双标记。
作者: 了了    时间: 2012-1-28 16:04


关于细胞调亡的研究，记得看过一篇中文文献，研究其端粒，用的是荧光原位杂交的方法；不过我认为反映细胞调亡的生理生化特征很多，可以从这方面入手，如线粒体膜电位的变化等
作者: xevin    时间: 2012-1-28 16:05

我想把带有GFP基因的载体导入细胞后，让GFP表达。通过流式细胞仪筛选出表达阳性的细胞，将这些细胞用于再培养。请问：
1、筛选出来的细胞还能保持无菌用于细胞培养吗？
2、用GFP作为筛选标记，其技术是否成熟？
作者: one    时间: 2012-1-28 16:05


用GFP作为流式的筛选标记已经非常成熟了,国外的流式细胞仪基本每天都要做这方面的工作.

另筛选时保持无菌很简单,筛选完也可进一步培养.
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-28 16:06

请问各位高手，我的流式结果有时试验组比isotype还低是什么原因？

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您好：您用的抗体和阴性对照是同一个公司产品吗？最好能告诉我稍详细点的试剂信息。以便我们可以商讨一下。（抗体和阴性对照的亚型和标记应完全一样，且用量也应完全一致！）
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-28 16:06

Calbiochem 407952-1MG Ionomycin, Calcium Salt, Streptomyces conglobatus 我们用过这个做这方面研究，结果不错，不妨您也用这个吧。其实：Calbiochem 524400-1MG Phorbol-12-myristate-13-acetate Calbiochem 407952-1MG Ionomycin, Calcium Salt, Streptomyces conglobatus Calbiochem 203729-1MG (+)-Brefeldin A, Eupencillium brefeldianum 这三个东西是一齐用的，南京鼓楼医院就用过这三个东西做人的Th1/Th2检测。结果不错的啊。可以从联科公司购买：8008571184。
作者: hyuu    时间: 2012-1-28 16:07

我尝试用PI＋AnnexinⅤ作细胞凋亡，AnnexinⅤ用FL1，PI用FL2，结果如图。
三次结果都类似，左上象限的是代表什么呀，问了很多人都不知道。到底问题出在哪里呢。图一为对照，未加PI和AnnexinⅤ，图二、三均为药物作用组。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10318

作者: hyuu    时间: 2012-1-28 16:08

流式细胞仪当然可以检测细胞内蛋白，这一点，并不是很难，当然要比检测细胞表面抗原复杂些，好在都已经有现成的方法，不成问题。
不过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、免疫组化没有本质差别，但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用western（尤其是化学发光底物更佳）和免疫组化更好。当然，流式最大的一个特点就是，可以定量（百分比），如果是高表达的用流式细胞仪非常有优势。
流式检测时要求有抗体，可以是直接标记或简介标记的荧光抗体。细胞需要预先固定处理，常用的是多聚甲醛、TritoonX－100、75％乙醇等，具体步骤可参考相关文献，都有详细说明。

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您好！我有两点想法仅供参考：
（1）免疫组化、WB、FCM在检测蛋白方面有以下区别：流式细胞术是检测天然抗原（多数情况下），它报告样本抗原表达的百分比及强度；WB主要用于定性，可确定抗原的有无，用于鉴定。
（2）用流式细胞术检测胞浆内抗原，建议使用商品化的破膜剂，这样可以为研究带来更好可靠性和可重复性，有文献推荐Caltag公司Fix&Perm。
作者: hyuu    时间: 2012-1-28 16:09

我尝试用PI＋AnnexinⅤ作细胞凋亡，AnnexinⅤ用FL1，PI用FL2，结果如图。
三次结果都类似，左上象限的是代表什么呀，问了很多人都不知道。到底问题出在哪里呢。图一为对照，未加PI和AnnexinⅤ，图二、三均为药物作用组。

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您好！您用的是BDr的流式细胞仪吧，您的补偿调节了吗？是如何调的？这个实验的补偿调节很重要，不然会出不了结果。如果您的实验数据还在的话，基本上我可以帮您整理一下数据，因为我们有脱机补偿的软件可以试一下的。
作者: baidukk    时间: 2012-1-28 16:09

您好！您用的是BDr的流式细胞仪吧，您的补偿调节了吗？是如何调的？这个实验的补偿调节很重要，不然会出不了结果。如果您的实验数据还在的话，基本上我可以帮您整理一下数据，因为我们有脱机补偿的软件可以试一下的。
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我用的的确是BDr的流式细胞仪，因为我不会操作仪器，而实验员也是新手，我感觉是仪器操作出了问题，但不知具体是什么，太谢谢您了。
您说的实验数据，扫描的结果可以吗？实验员小妹妹说，流式的结果只能打印不能提供电子版本？！虽然觉得不太可能，但因为是苹果机，对他的程序实在是不熟悉……

[ 本帖最后由 baidukk 于 2012-1-28 16:10 编辑 ]

图片附件: 42952397.snap.jpg (2012-1-28 16:10, 96.04 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10319

作者: eric930    时间: 2012-1-28 16:11


请教各位老师，我对流式一知半解，今日老板提问：做流式为何需要阴性同型对照，如果不用会对结果有什么影响。临时抱佛脚，盼指导。
还有，各位老师提供的流式ppt好像下载不了啊？哪位能给发一个？不胜感激！
作者: tieshazhang    时间: 2012-1-28 16:11


请教各位流式高手：我要检测病人骨髓细胞某种基因的表达，一直以来我都是取了标本直接送给作流式的老师，由他进行处理和上机。送了大概有20个标本了，但仅有1、2个标本检测到有微弱表达，和文献报道相差甚远（30～50％）。我的抗体应该不会有问题，是新买的国外直接标有PE的一抗。现在我找不到阳性细胞作为对照，不知是哪里出了问题。眼看珍贵的骨髓标本就这样浪费，十分心焦！现在我想自己处理标本，固定后那给试验老师上机。我的一抗说明书上是这样写的，很简单：
取100ul全血或5×105细胞
1.每100ul标本加20ul一抗，于室温孵育15分钟
2 加3mlPBS/BSA/NAN3, 1200转离心5分钟，弃上清
3 裂解红细胞并固定白细胞
我有几个问题想请教：
1 100ul的标本（全骨髓）够了吗？直接在全骨髓中加一抗？
2 固定的和未固定的标本分别能存放多久？因为试验老师比较忙，他经常把我送的标本（含肝素）放在室温下，1天多后才检测，这样会对结果有影响吗？固定好的标本应如何存放？
3一抗的量很重要吗，应该自己摸索吗？
4第2步中的PBS/BSA/NAN3是都加，还是加其中1种？如只加1种，那种较好？
5裂解红细胞并固定白细胞这一步，加什么试剂，加多少？作用多长时间？
以上都是我迫切相知道的问题，我搜索了帖子，没看见关于标本处理的具体解释，请各位高手帮帮我！还有，我在图书馆没见专门介绍流式技术的书，应该在那一类书中有该技术的介绍？谢谢！救我！
作者: skytree    时间: 2012-1-28 16:13

各位老师：
请问我作的流式结果显示凋亡率有百分之十几，但在图上又见不到明显的凋亡峰，这是为何？急盼回复！谢谢！
作者: TAT    时间: 2012-1-28 16:15

流式细胞术只是一种方法，它的特点是在单细胞水平进行高通量、多参数的检测，可重复性好。这种方法本身对细胞类型是没有限制的，但对细胞数量要求较高，一般都要达到10^5水平。再就是流式细胞术与抗体是密不可分，而抗体有种属特异性，我想果蝇种属特异性的抗体是很难找到的，当然某些物质相当保守，在不同种属间有很大的同源性，也可以利用。你可以用一些通用细胞染料对细胞增殖、凋亡、分化、膜电势变化、pH值变化等等做一些研究。

为了拓展流式细胞术的应用，目前已经可以对可溶性的物质进行检测，如细胞因子，只要有抗体就可以将各种beads与可溶性物质连接，像细胞一样接受激光信号。

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你做的图真是太好了，我很快就会出染色结果，希望会和你的差不多，现在我还有一个问题：cfse染色后阴性同型对照该怎么办？ 有专门的IG 抗体吗？？ 谢谢
作者: TAT    时间: 2012-1-28 16:19

哪位学长可以提供流式细胞仪的上机操作流程？具体是染色并固定好的淋巴细胞检测亚群，多谢.

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我想我可以帮帮你，
具体的操作流程你看一下的文档，单就全血法检测淋巴细胞亚群，我的操作过程是：
1 .全血抗凝 50um
2.加入荧光抗体，常温下，避光25分钟
3.加入溶血剂，常温，避光10分钟（不能过长）
4。离心，弃上清，SB洗 2次。
5. 2% PFA 固定
6. 上机检测，用专门的检测软件，自动就可以检测。或者用cell quest 软件自己做
7.有关流式的开关机程序和操作原理，BD 公司的操作手册还是有参考价值的。
作者: TAT    时间: 2012-1-28 16:19

我用的的确是BDr的流式细胞仪，因为我不会操作仪器，而实验员也是新手，我感觉是仪器操作出了问题，但不知具体是什么，太谢谢您了。
您说的实验数据，扫描的结果可以吗？实验员小妹妹说，流式的结果只能打印不能提供电子版本？！虽然觉得不太可能，但因为是苹果机，对他的程序实在是不熟悉……

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她是骗你的啦，在苹果机上，直接就可以把cell quest文件转换成word文档，或者还可以把cellquese 文件直接copy下来，放到u盘就可以拉，然后用专门在pc机上分析cellquest的软件就可以分析了。可惜那个软件很贵啊，盗版的也找不到~~~。要是谁个有，能不能借我用一次啊。万分感激了！！！！！（用一个免费的软件也可以分析，不过效果不好）
注意：u盘的接口在键盘上~~ 就在你左手的键盘侧面~~~~
作者: 中国特色    时间: 2012-1-28 16:20


请问那位大侠有测过人类淋巴细胞表面HLA-DR的表达，表达率一般为多少，荧光强度多少？
作者: 一叶    时间: 2012-1-28 16:25

你做的图真是太好了，我很快就会出染色结果，希望会和你的差不多，现在我还有一个问题：cfse染色后阴性同型对照该怎么办？ 有专门的IG 抗体吗？？ 谢谢

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CFSE染色是不需要同型对照的，因为这只是细胞染料，不是抗体，所有的活细胞都应该是阳性的，只是随着分裂代数的增加，荧光强度倍减。
同理，PI进行细胞周期染色时，所有有核细胞都是阳性，只是荧光强度不同，不需要同型对照。

补充一点，在调整FL-1电压时，将原代细胞（可用未给予任何刺激的对照组调）荧光强度调整在10^3～10^4之间，也就是尽量高些。
作者: caihong    时间: 2012-1-28 16:26


问题； cfse染料开封后，能够用多长时间？？我这次染色的时候，就发现cfse的荧光强度好象不太对劲了，可能是量少的原因吧。

图片附件: 41055135.gif (2012-1-28 16:26, 8.68 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10320

作者: duoduo    时间: 2012-1-28 16:26

请教一个比较菜的问题：

流式细胞仪可以定量分析细胞内目的（音：木地）mRNA的表达吗？

是否需要借助于原位杂交？

如果可以，是否可以替代半定量RT－PCR分析方法？

谢谢！呵呵
作者: windy+++    时间: 2012-1-28 16:27

请教：有哪位仁兄做过用流式检测淋巴细胞上的受体的有关实验？
作者: windy+++    时间: 2012-1-28 16:28


哪位仁兄做过用流式检测淋巴细胞表面受体？请指教。
作者: windy+++    时间: 2012-1-28 16:28

我是要检测淋巴细胞上的LDL受体，用DiI标记的LDL做配体，和LDL受体结合后用流式检测。

请教：有谁做过吗？需要注意什么问题？做了几次，重复性不太好，在细胞孵育处理和洗涤时需要注意什么？洗涤会使细胞减少，怎么解决？。。。
作者: loli    时间: 2012-1-28 16:29

我想请教大家两个问题：
1. 在用PI染色进行细胞周期分析前，用75%的乙醇固定细胞。这个75%不是最终浓度吗？因为我看到上面也有protocol说是加2倍体积的预冷的75%乙醇。
2.其中需要用到的乙醇用分析纯可以吗？因为记得以前看到的一份材料，要求用细胞专用的乙醇，不知有没有这个必要。
暂时这两个问题，谢谢。
作者: 生物迷    时间: 2012-1-28 16:30

这里真是太好了！请教：哪里有关于如何分析流式的结果的材料？例如：直方图，点图，统计数据 ，多谢！
作者: 911    时间: 2012-1-28 16:31


流式细胞术如何来测细胞染色体数目的？
作者: qqq111    时间: 2012-1-28 16:32

我想请教大家两个问题：
1. 在用PI染色进行细胞周期分析前，用75%的乙醇固定细胞。这个75%不是最终浓度吗？因为我看到上面也有protocol说是加2倍体积的预冷的75%乙醇。
2.其中需要用到的乙醇用分析纯可以吗？因为记得以前看到的一份材料，要求用细胞专用的乙醇，不知有没有这个必要。
暂时这两个问题，谢谢。
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答：1 这个实验的要求是最终乙醇固定浓度为50-75%（所以用无水乙醇较好，因为要求是冷无水醇，从-20%取出，为满足这个要求，75%的乙醇就不如无水乙醇好了）。至于2倍或其他数字，取决于你用的乙醇浓度，以及终浓度决定。
2 分析纯可以。
作者: 克隆鱼    时间: 2012-1-28 16:32

近来需用流式测大鼠心肌细胞胞浆钙浓度，有没有人测过，请指教！
作者: utt0989    时间: 2012-1-28 16:33


各位高手：
我有转染（某个基因，这个基因产物对周期有影响）前的细胞和转染后的细胞现在想测测加药以后周期的变化情况。加药前须不需要同步化，怎么同步化，急切等待回答，谢谢
作者: 白白的    时间: 2012-1-28 16:39


细胞长至70-80％融合，吸去培养基，加无血清（或1%血清）培养基静止24小时使其同步化（如严格要求，可摸静止时间，使其最终都处于G0期）。换常规培养基，加药作用到实验时间，收集细胞检测
作者: ha111    时间: 2012-1-28 16:40


我养的一种肝脏细胞，用流式测细胞周期，发现S期细胞高达60％！
据检测者讲还没见过这么高的增殖率。
哪位高人知道一般体外培养细胞的增殖率是多少?敬请告知，多谢！
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-28 16:50


本人用FACSVantageSE分析细胞后得到的数据是CellQuest的FACS Files，而我想将数据转移到PC机上安装的ORIGIN pro7.0进行曲线拟合分析。其实我知道只要得到每一个荧光强度（X轴）下的细胞个数（Y轴）就可以在ORIGIN上分析，但是不知道如何操作？或者是有否可能得到这样的数据？
作者: 小糖块    时间: 2012-1-28 16:51

初步打算用流氏，但有几个低级问题想请教：
1。pEGFP－N1为载体转染细胞1，细胞2表面使用单抗染色，流氏是否可以分辨二者融合细胞的双荧光信号，并将之分离？
2。未融合的单荧光信号细胞可否分别分离，此过程可否与上面的操作同时进行？
3。分离所得的细胞是否影响活性，我想知道流氏对细胞有多大的损伤，因为想用分离的细胞做进一步的功能检测。
4。流氏的费用问题，听说主要是试剂贵？经费有限，不得不考虑……
作者: glass    时间: 2012-1-28 16:52

请教各位大侠，若是血常规中显示两组病人的淋巴细胞计数有差异，那么这会对外周血淋巴细胞CD3，CD4，CD8流式结果有影响吗？
作者: baidukk    时间: 2012-1-28 16:53


想请教各位大侠：我们实验室的流式细胞仪是FACScalibur,BD公司的，样品流速最低为15μl/min,但我测的样品流速要求为<或=0.4μl/min，不知哪种型号的流式细胞仪能达到这个要求?
作者: guagua    时间: 2012-1-28 16:53


我知道流式细胞仪具有算阳性率和平均荧光强度的功能，

可是我的实验设计要求我得到每个细胞的荧光强度

比如我以细胞大小设门后框出来3000个细胞

这3000个细胞每个细胞对应的荧光强度，我能得到一组数据文件吗？

而且得到以后，能否进行数据导出到文本或者WORD文件吗？

非常感谢！
作者: rxcc33    时间: 2012-1-28 16:53


我作外周血流式,抽血后用EDTA或肝素抗凝,加入红细胞裂解液5--10分钟,1500转离心5分钟,血样分层,下层为纤维蛋白样物质,底部细胞量很少。不知为什么？判大虾指点！谢谢先！
我试过多种裂解液，都是如此！
作者: zhezhe    时间: 2012-1-28 16:54

为什么我的293T细胞老是饿不了，我血清饥饿后24h并没效果，48，72h以后还是没效果，以前作的时候G1还能达到60%左右，现在怎么也重复不了，急死了。
另外我的流式测293T的细胞周期峰形老是扁扁的，图形一点都不典型，是细胞状态不好还是其他的原因呢，请高手帮我分析分析了。
谢谢
作者: 缘yuan    时间: 2012-1-28 16:55


请教一个低级的问题：我刚开始做流式，关于HLA－B27的阳性判断的问题。有人说80％以上表达，荧光强度>8可以判断为阳性。但是，如果在界值上时应如何判断？请各位指点迷津。谢谢！
作者: 彼岸花opp    时间: 2012-1-28 16:56

回复：
我近期也要做流式细胞仪，但是同实验室没有人做过，所以这方面的经验比较少，看了这里发的帖子以后明白了许多，请问细胞固定后怎么保存呢？可以保存多少天呢？因为做time course的时候不能同时收集那么多的samples，而且要排队才能做上.

       一般来讲，实验是观察不同时间点对细胞的影响，我的建议是先作时间最长的点，依次递减。譬如：观察药物作用12h、8h、4h、2h对靶细胞的影响。可以同时培养细胞，12h的药物先加入培养细胞中，过4个小时后，加入药物预定观察8h的细胞，再过4h加入到预定观察4h的细胞中，再过2小时，加入药物到2h组。这样，可以同时收集各个时间点的细胞，同时处理上机检测，避免了细胞固定或者多次检测 的麻烦。
一般来讲，固定的细胞或多或少对检测有一定影响，我比较推崇采用新鲜细胞进行检测。所以我建议还是采用上述方法，同时检测，这样的结果会更好。
在我们实验室，我曾经多次回答类似的问题，希望其它想进行不同时间检测的同道采用这种方法。

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但是细胞不是同一状态，虽然不同时间是麻烦一点，但最起码细胞是同一情况下加药的，这样更可心信
作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-28 16:57


我想用流式来检测c-myc, c-jun,c-fos,p53等癌基因的表达，哪位有详细的操作步骤或者文献？最好是推荐一下具体用那家的试剂比较。我用的是BD公司的流式细胞仪。
作者: windy+++    时间: 2012-1-28 17:01


1。只要两种荧光信号发射波长能按流式的要求错开就可以，可以让试剂公司帮助你选择合适荧光标记的单抗；
2。可以分离，可以同时做；
3。活性是肯定会有影响的，具体损伤有多大不好用数据来显示，但可以肯定的是已有不少人用流式分选细胞后再培养来继续实验应该是不成问题的；
4。流式确实存在试剂贵，分选时要找那种有分选性能较好的机器的地方来做，也要收费的
最后，祝你实验顺利！

谢谢，去临近的一台流氏所在地问过了，据说是台式机不能做分选，而且他们刚进的机子，操作员不熟，但许诺可免费使用。
不知流氏荧光标记单抗那家的比较好，跟机带进的BD产品目录上动辄几百美金，可有的生物制品公司只有2000元左右。还有就是有没有普通荧光显微镜用的荧光标记单抗，搜索得不得要领，请指教。
再，呵呵，偶说话有点罗嗦，转染了带有红荧光光蛋白基因（Red Fluorescent Protein (DsRed2) gene ）质粒（如pIRES2-DsRed2）的细胞理论上应该能够同转染了pEGFP N2的细胞分开吧，绿荧光信号如果同红荧光信号重叠可得到黄色荧光，那如果将这两种细胞融合所得的荧光是否为黄色呢？
还望不吝赐教……
作者: greenbee    时间: 2012-1-28 17:02

可以检测胞内蛋白，但需要有破膜过程
作者: greenbee    时间: 2012-1-28 17:02

我们也一直用的bd产品，但同时用达科为的作过对照，结果也很好，也便宜多了。我们已经准备找达科为有选择性地定一些抗体了。
作者: 麦丽素1986    时间: 2012-1-28 17:03

想请教各位大侠：我们实验室的流式细胞仪是FACScalibur,BD公司的，样品流速最低为15μl/min,但我测的样品流速要求为<或=0.4μl/min，不知哪种型号的流式细胞仪能达到这个要求?
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你要求上样慢些应该可以通过调整细胞浓度，使其细胞浓度低些应该可以达到同样的效果.一般流式都不可能有流速<或=0.4μl/min的
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但我查的文献的确是样品流速<或=0.4μl/min。那篇文献的作者在进样孔上接了一段毛细管以控制流速，并自称是超敏感的流式细胞仪（ultrasensitive flow cytometer）。看来国内是没人做这个了：（
作者: hyuu    时间: 2012-1-28 17:04

请教一个问题：我想用秋水仙素或者其他的同步化试剂做细胞的同步化，抑制在G2/M,S期都可以！但不知道加药量、作用时间、具体操作方法1是怎样的！请哪位大侠帮帮忙！万分感谢！
作者: 中国特色    时间: 2012-1-28 17:05

我是个实验新手，想问一下流式可否检测脂质体表面标记的抗体，并进行计数呢，是不是应用相应的荧光标记的抗原就行了呢？另外，是不是有仪器能够直接计数细胞的数目以及大小？
作者: 分子式    时间: 2012-1-28 17:06

真是有意思，没有见过
有人用流式做过活细胞分选吗？
作者: BUK    时间: 2012-1-28 17:06


请问：PE和R－PE是否同一标记物？在流式细胞仪上是否占同一道吗？
作者: 969    时间: 2012-1-28 17:08

溶血效果不好时可以试试使用细胞分离液，分离白细胞后再做，一般流式要求106左右的细胞，但少些入105左右同样可做，并且经常细胞少到离心后管底看不到仍旧可做
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同意楼上的说法，，外周血的我也做过。一般来说，正常人3ML的全血处理后，在管底仅有很少的细胞，通常为淡黄色，，加PBS处理后，，一般可以到10 6，正常上机是没有问题的。
如果细胞数少的话，，先用细胞计数仪，，测一下WBC的数目。这样可以排除是否是操作上的原因。
作者: flower-201    时间: 2012-1-28 17:08

请教：
对于核因子-KB的检测，有什么高招？
流式细胞仪对其检测有何特殊点？
作者: flower-201    时间: 2012-1-28 17:09

请教贵人帮助：
流式细胞仪对于核受体的检测有什么特殊的吗？
核受体（NF-k的检测还有什么方法吗？
作者: one    时间: 2012-1-28 17:11


我做细胞生长曲线显示我的药物从24小时起就有细胞生长抑制作用,但FACS怎么也测不出药物处理后,相对CONTROL有任何G1,S 或G2/M的分布变化.我试了很多时间点,2h, 4h, 6h,8h,12h,24h,48h,72h.这是怎么回事呀? 谢谢.
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-28 17:11

菜鸟请教：
流式细胞仪检测 外周血中树突状细胞所用单抗如下：CD14-PC5;
CD16-Cy-chrome;
CD33-FITC,
HLA-DR-PE。
单抗后的PC5；Cy-chrome;还有HLA-DR-PE是何物？
价格如何？有无国内供应商？
作者: 薄荷侠    时间: 2012-1-28 17:13

急问各位高手:
1.流式的结果还需不需要进行统计学分析?
2.流式测凋亡,显示有8%的凋亡率,但图上未见明显的凋亡峰,如何解释?
作者: eric930    时间: 2012-1-28 17:13

联科网上有在线的操作手册http:\\gotofcm.com
《流式细胞术与生物医学》 左连富 辽宁科学技术出版社
作者: fei1226com    时间: 2012-1-28 17:13

请教各位高手,我将肠黏膜干细胞分离后将其做成单细胞悬液比较困难,细胞与细胞间的粘连相当严重,按照文献说明使用组织分散液处理效果不明显,在过流式前使用400目筛网过滤后进行HOCHEST33342和PI双染进行分选时HOCHEST的波峰始终不稳定,请各位指教有何高招?急!!!
作者: fei1226com    时间: 2012-1-28 17:14

能否做脂质体，要看你的脂质体的大小了，一般情况下，流式要求所测颗粒要达到的um级或以上的大小，如果大小合适又相应荧光标记就当然可以用流式测定并计数了。
流式可以直接计数细胞的数目以及大小，但一般都是得到相对值，需要加标准已知颗粒数的参照就可以得到绝对的结果。
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还请问kent做流式的同时，可否对标记上的表面抗体的量进行定量呢？
作者: DNA    时间: 2012-1-28 17:15

请教：用流式检测培养的心肌细胞胞浆钙离子浓度方法及注意要点！
作者: yysr238    时间: 2012-1-28 17:16

有个小问题，你说是在血清饥饿情况后，换成常规培养基，可是有很多文献上都是直接在无血清培养基同步化之后，又换成加了药的无血清培养基啊，这有什么影响么？虽然问题小，可是很重要啊，盼答！
作者: yysr238    时间: 2012-1-28 17:16

各位高手：做DNA倍体时，鸡红细胞用什么抗凝？与抗凝剂的比例是多少？怎样固定鸡红细胞？比例？可保存多少时间？做内参时用稀释吗？
作者: yysr238    时间: 2012-1-28 17:17

各位高手，我刚接触流式，所以问题很多，谢谢大家给我帮助。
1.我在医院做临床工作，请问检测针洗液或腹水中细胞的DNA倍体时，有时细胞不多，上机只能检测到1500个细胞左右，这样结果是否可靠？是不是必须10000个以上？
2.能不固定直接用DNA－Prep试剂盒(CoulterCo.)检测吗？因试剂内有打孔剂。如需固定，要固定多少时间？
作者: 911    时间: 2012-1-28 17:17


请教各位：
我想研究不同细胞周期时相的基因表达差异，用流式细胞仪分选好，还是用密度梯度离心好？如果将培养的细胞经密度梯度离心分离，得到不同期相的细胞可能吗？有经验的板主请指教！
作者: 社会主义好    时间: 2012-1-28 17:18


请问何处可以下载分析流式测量数据的软件？
作者: 了了    时间: 2012-1-28 17:21


流式可以用来检测胞浆中表达的蛋白，方法是用破膜剂在细胞膜表面打孔并固定，再用荧光抗体结合，敏感性还是不错的，但破膜剂一定要好，这个很重要，否则出来的图很不清楚，效果就不好
作者: ha111    时间: 2012-1-28 17:22

应该是不可能的，因为不同时相的细胞密度才差多少，根本不可能据此区分开的。可以考虑细胞周期时相和你的基因表达同时上流是检测就不用分选了，如果你要测的是某种基因表达的蛋白知要找到相应荧光标记的抗体就可以了，如果是要测的基因本身的表达可以试试看能否找到相应的荧光标记的探针即在细胞的基础上做fish。实在不行，估计还是要做流式分选。

我想如果做流式分选时不同细胞周期时相的细胞分别分选后再做基因表达或蛋白质表达,并进行差异分析.但请教不同细胞时相的特异性标记抗体如何去获得?我查过,但没有发现,请指教!
作者: 社会主义好    时间: 2012-1-28 17:22

再请教一个问题：如何将两个同一方案所测的直方图同时打开在同一坐标上以进行比较？再次表示衷心的感谢！
作者: misswu61    时间: 2012-1-28 17:23


各位高手：请问用流式检测vcam-1时，上机前固定细胞的具体步骤?用多聚甲醛固定后是否适合长途运输？谢谢！
作者: whitesheep    时间: 2012-1-28 17:23

我们研究室由各种病毒抗体很多株，我本人十分相开展这一方面的工作，但是不知道是不是比较难做。流式细胞技术在病毒检验中的应用是不是较难达到满意效果？另外国内做得到底怎么样了。
万望大虾们不吝指教！！
作者: yychen    时间: 2012-1-28 17:24


流式检测贴壁细胞和悬浮细胞调亡有区别?
作者: toy    时间: 2012-1-28 17:24

你能告诉我你的“含有50μg/ml的PI（碘化吡啶）和100μg/ml的无DNA酶污染的RNA酶（RNase A）PBS染色液”具体配方是什么？我原来一直用BD公司的试剂盒做的x细胞周期，但价钱太昂贵，负担不起？准备用你说的方法进行！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-28 17:25

你能告诉我你的“含有50μg/ml的PI（碘化吡啶）和100μg/ml的无DNA酶污染的RNA酶（RNase A）PBS染色液”具体配方是什么？我原来一直用BD公司的试剂盒做的x细胞周期，但价钱太昂贵，负担不起？准备用你说的方法进行！

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我是用粉剂PI＋PBS直接稀释的。
作者: 小鱼鱼    时间: 2012-1-28 17:26


请教：
我最近在用Annexin-v/PI法检测细胞凋亡，遗憾的是测了N次均为见到明显凋亡细胞。但是用Hochest33342荧光染色却发现了许多凋亡细胞，不知哪位高手能够解释一下？
作者: qqq111    时间: 2012-1-28 17:26


请问：做小鼠脾CD8+树突状细胞的分选。不知是用磁珠系统还是用流式更好，我需要从经济和效果等方面综合考虑。
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-28 17:27

我还想问你的是，染色液中除了PI、RNase A以及溶剂PBS外还需其它试剂吗？
谢谢！
作者: 大白菜    时间: 2012-1-28 17:27

这是我用Hochest33342染的细胞

图片附件: 84325468.jpg (2012-1-28 17:27, 59.58 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10321

作者: 大白菜    时间: 2012-1-28 17:28

为什么Annexin-V/PI确检测不到呢？
是不是这个方法本身就不可靠？
请高手指点迷津！
谢谢！
作者: 社会主义好    时间: 2012-1-28 17:28


请问用Wi***I Version 2.8分析流式数据时如何将两个同一方案所测的直方图同时打开在同一坐标上以进行比较？
作者: 社会主义好    时间: 2012-1-28 17:28


请问分析流式数据时如何将两个同一方案所测的直方图同时打开在同一坐标上以进行比较？用什么软件，何处可以下载？谢谢！
作者: 羊咩咩    时间: 2012-1-28 17:29

本人用FACSVantageSE分析细胞后得到的数据是CellQuest的FACS Files，而我想将数据转移到PC机上安装的ORIGIN pro7.0进行曲线拟合分析。其实我知道只要得到每一个荧光强度（X轴）下的细胞个数（Y轴）就可以在ORIGIN上分析，但是不知道如何操作？或者是有否可能得到这样的数据？



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你可以将文件 转化成word文当，在进行分析就可以了。
作者: 二丫头466    时间: 2012-1-28 17:29

问一个弱弱的问题：CYC标记与CY5 标记有何区别？台式机FCM可用CYC为染料吗？谢谢！
作者: 大尾巴    时间: 2012-1-28 17:32

不知道你用Hochest33342染的细胞上图中那些是凋亡细胞？Hochest33342应该死活细胞都染的，我是看不出来你的图中怎样把凋亡和活细胞区分开的，麻烦请教？
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我也不清楚Hochest33342单染如何区分活细胞、凋亡及坏死细胞。但书上说活细胞能够将染料排出，所以我想图中呈现淡蓝色的是活细胞，而形状规则，染色较深的则是凋亡细胞。不知仁兄以为然否？
作者: yychen    时间: 2012-1-28 17:33

还有一个问题，请不吝赐教。用流式细胞仪检测淋巴细胞分泌的细胞因子时，需要有刺激物活化淋巴细胞。我知道的有用PMA和离子霉素（Ionomycin），在订试剂时，公司告诉我Ionomycin有含钙盐和不含钙盐两种。我不知道究竟应该选择哪种。理论上将Ionomycin作为钙离子导入剂应该选用含钙盐的吧！但我吃不准，还请仁兄帮我拿拿主意！
作者: sunnyB    时间: 2012-1-28 17:34

你好。
我最近在用库尔特的流式细胞仪测定肿瘤细胞表面分子时，出现肿瘤细胞自发荧光非常强的异常现象。
我培养的细胞是ATCC建株的非小细胞肺癌H1299,我用姜黄素诱导其凋亡，细胞按用药剂量分为四组：0(0ug/ul);1(12.5ug/ul)；2（25ug/ul)；3（50ug/ul)。每个培养瓶加入9毫升1640培养基和1毫升小牛血清培养。加药24h后，用0.25％胰酶消化（具体过程：1.将瓶中培养基倒入10ml塑料离心管中,尔后往瓶中加入0.25%胰酶1ml消化，抽吸吹打，待消化完全后与离心管中原培养基混合，重新倒回离心管。2.以1000rpm离心5分钟，加PBS洗两遍后上机检测）。
在我没有加荧光单抗的情况下，将细胞上机检测，细胞在520nm下，60%至70%的细胞发出极强的绿色荧光，操作师说若消除本底，则单抗标记的细胞上机根本无法检测荧光变化，如果一定要测，只能测细胞的荧光。我同意测荧光，最终测了5个指标：Fas ,FasL,CD80,CD86,HLA-DR。FasL为PE标记，其余单抗都是FITC标记，上机结果大致如下：0组mn为20左右，1组mn为200左右，2组mn为400左右，3组mn为800左右，每组测定5000个细胞。五个指标的情况大致差不多都是这样，一个下午测了20个样,花了1200RMB,钱如流水已够痛惜，痛心的是试验失败找不到原因。这已是测h1299细胞时第二次发生自发荧光异常的事故，第一次失败后，操作师当场取了3份临床送检血样上机排查，并未发现自发荧光，机器正常，其后我归结为自己操作出错而有可能荧光污染，所以事隔半月第二次上机检测前，我一切实验用品都是全新物件，但结果仍然匪夷所思，痛定思痛，仍然找不到原因。
期望你能有所释疑。
作者: xevin    时间: 2012-1-28 17:35

我利用流式细胞做风湿病人血小板活化的课题。做了二十个病人，但结果不是很令人满意。我用的是较传统的方法即富含血小板血浆法：先用荧光抗体标记，而后多聚甲醛固定，再进行检测。虽然报道流式检测血小板活化有灵敏特异等优点，但我感觉血小板在体外非常容易发生活化，或者发生聚集后使结果很不可靠，且标本处理要求即时，严格讲应半小时之内，但实际临床实施有一定难度，质量控制有很多问题。
目前我的检测结果是有高有低，还没有一个趋势。我的心里没底，是操作的问题还是血小板在体外发生了变化没能控制好，
有哪位对此方面有经验能否介绍一下。
流式做血小板活化国内是否已很成熟？目前国外对其真实的评价如何？
作者: caihong    时间: 2012-1-28 17:35

请教一下
你有用FITC标记的二抗与抗鼠单克隆抗体IgG作用后,用流式细胞测定细胞内目的蛋白的表达量,有啥方法?如用抗P53单克隆抗体和其用FITC标记的二抗如何检测肿瘤细胞内的表达量,有具体的实施步骤吗?
作者: one    时间: 2012-1-28 17:37

请教：我要用流式检测宫颈癌组织HLA-I表达情况，具体应如何获得单细胞悬液？（好像各个文献都有不同的方法）
作者: 大尾巴    时间: 2012-1-28 17:38

这个我真不清楚，希望有经验的同志们给点建议？
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这是我的几组照片，不知道能否看出区别来？
真的希望有经验的朋友（不是同志，呵呵）给点建议。

图片附件: 64575820.jpg (2012-1-28 17:38, 47.72 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10322

作者: 大尾巴    时间: 2012-1-28 17:38

最后一张，给点建议！

图片附件: 52542200.jpg (2012-1-28 17:38, 40.94 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10323

作者: ffooll    时间: 2012-1-28 17:38

各位同仁，你们好！我做流式也有一段时间，但仅做淋巴细胞比例和绝对技术。目前，我遇到一个问题：FACSComp 条件优化操作中没有出现第四荧光图，但是在CELLQUEST软件中可以检测到第四荧光，能告诉我你们的经验，怎么解决吗？
作者: tieshazhang    时间: 2012-1-28 17:39

谁有《practical flow cytometry》这本书？能否传给我一份
跪求！我想详细了解关于荧光物质的发光原理、它与生物素连接等方面的东西。
先谢了！
作者: 831226    时间: 2012-1-28 17:40

我刚开始做实验，所以问个菜鸟级的问题：
我要用的细胞是U937，利用其表面的sTNFRI和我特异及非特异的肽分别结合，再加上抗TNF的抗体，最后是加有荧光标记的抗TNF抗体的抗体。通过流式来判断。
高手能详细给解释解释步骤，用量，时间和注意事项吗？
谢谢了！
作者: ha111    时间: 2012-1-28 17:40


Hi, 各位高手: 我们实验室新进的BDAria带分选功能的流式仪,我想进行活细胞的细胞周期分选,请教如何去做?有特别的试剂吗? 我是新手,一无所知,还望大家多多指点!
作者: nn255    时间: 2012-1-28 17:41

我现在用流式细胞术（FACS）检测鼠淋巴细胞IL-4，用的是胞内染色法。老是染不上。具体是用下面的方法：
1。分出淋巴细胞，PMA+meno+ion刺激4小时
2。封闭，外标。
3。1%多聚甲醛固定30‘
4 穿膜液20’，再加内标抗体，30‘或者过夜
5 穿膜液洗涤重悬检测
穿膜液和内标抗体加入后过夜也不行。我做了IFN-GAMMA和IL-4，IFN-GAMMA能标上些，IL-4一点没有。因为我用的细胞样品在鼠活体时已经受药物刺激，分泌应该很高，ELISA结果也显示很高，为何内标检测不到呢。不知是抗体原因还是方法不够好。各位有做过类似的吗，能否传授经验一二
作者: moonlight45    时间: 2012-1-28 17:41


我是想用流式测细胞周期，我想问细胞酒精固定最长能放多久，染色！谢谢！
作者: lixi559    时间: 2012-1-28 17:41

70%的无水乙醇固定一般来说最长可以保存三周。不能超过这个时间，最好固定24小时后立即上机测试。
作者: dragonkilly    时间: 2012-1-28 17:42


小弟从没有作过流式，实在是门外汉一个，最近想做流式，有几个菜鸟级问题向学长请教。我所参考的文献中老外用EDTA抗凝外周血，EDTA是不是枸橼酸钠？
文献中提到Leukocytes (5 × 105) obtained after erythrocyte lysis or MRC-5 fibroblasts were fixed and permeabilized by two technical procedures run in parallel. paraformaldehyde-Tween method和In the paraformaldehyde-methanol method 。是不是两种方法都可以，可以仍选其一？裂解红细胞以及给白细胞固定和通透，一般是用试剂盒好，还是自己配制试剂好？裂解红细胞后调整白细胞的密度时，一定要用培养基吗，老外没有说清楚用什么试剂调节白细胞的密度。
我已经将所参考的文献发到兄长的搜狐信箱了，请兄长帮我看看。
多谢。

Tween可以穿孔白细胞吗
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-28 17:43

各位大哥
我用的是BD公司的FACSACalibur型号流式细胞仪，最近觉得好像感染了病毒
请问用什么杀毒软件？
计算机自带有杀毒软件吗？ 怎么使用？ 谢谢
作者: 吴才子    时间: 2012-1-28 17:43


我想请教这个配方应该怎么配，10%SDS-5%异丁醇-0.012mol/lHCL(w/v/v)，是不是说SDS占总质量的10%，但是后面又是体积比，HCL怎么样计算体积比呢？望指教！
作者: duoduo    时间: 2012-1-28 17:43

我想用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞（MSCs）表面标记物（CD系列），因为我用的是兔子的干细胞，很难买到相应的抗体，能否用抗人的抗体代替？效果怎样？因为抗体都很贵，不敢贸然去购买，所以先请教一下专家！
作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-28 17:44

请教：我用机械法获得宫颈组织单细胞悬液，流式直接法测其表面HLA-I分子表达水平，但阳性细胞百分数很低，与文献相差甚远。可否帮忙分析一下。
用什么方法获得单细胞悬液较好？
我用的是BIOSCIENCE的FITC标记的单抗，哪位高手作过相关实验，可否推荐用的较好的公司？PE标记的是否比FITC标记的好得多？
作者: tianmei001    时间: 2012-1-28 17:44


最近要做神经干细胞的流式测定，但查了一些公司都没有相关的流式抗体，不知各位大侠知不知道哪各公司有相关的产品，多谢了！
作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-28 17:45

1. check protein expression level, please use SDS-PAGE combine with weston blot. no need use flow cytometry
2. it is impossible to detect the proteins expressed in cytosolic by means of FCM if the no tag on the proteins(such as GFP or EGFP)
作者: ha111    时间: 2012-1-28 17:46

这么先进的仪器：）
简单的可以试试heochest33342染料，不知你的机器有没有紫外激发光？机器的激光器是怎么配置的？
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kent仁兄, 我们的BDAria 流式仪听工程师说未配紫外激光发光管,只配了两根激光管波长为488nm和633nm.请问如进行细胞分选,是否可以保存细胞活性再培养?如何准备样品?
谢谢!
作者: dotaaa    时间: 2012-1-28 17:46

请问在作流式时找不到荧光直接标记的流式一抗。可否用用于免疫组化或是免疫荧光的一抗再加上用于流式的二抗的组合代替。这样做的话对结果会有很大的影响吗？谢谢！
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-28 17:47


可以，但二抗必须是抗一抗抗体单型的抗体，而且需要测定其滴度。
作者: 蒲公英    时间: 2012-1-28 17:47

大家好！
我的实验是想要用流式检测混合培养的细胞中的神经元和胶质细胞含量，想用双标。（FITC&PE）请问再设置阴性对照时，是否应将两种不同的同型对照（分别为神经元和胶质细胞特异性抗体的同型对照）同时加入，即只设一个阴性对照组用两种同型对照，而不用采用两个阴性对照组进行。我的问题好像有些绕口，谢谢！
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-1-28 17:48


大虾：
我要用流式分选细胞，此种细胞数量极少，不知是否有可行性，分选出的细胞应装在怎么处理过的管里才能避免尽量少丢失
作者: 西子    时间: 2012-1-28 17:48


刚刚开始做实验，正好又要用到流式细胞技术，所以急需这方面的资料，谢谢高手提供的宝贵资料，但是14个压缩文件下载后，用RAR解不开，请教高手帮忙出谋划策。
作者: duoduo    时间: 2012-1-28 17:49

请教高手，
我想用用流式细胞仪间接2步法检测细胞膜表面趋化分子的表达，我买的一抗是小鼠单抗，有专业手册上说为了减少非特异染色，二抗最好用同种亚型的单克隆二抗或抗F(ab')2二抗，我现在只有羊抗鼠多克隆二抗，不知道是否可用？
作者: dog002    时间: 2012-1-28 17:49


版主，你好，老板叫我做Tunel试剂盒采用流式检测，我的Tunel试剂盒是PROMEGA的。我看了一下，需要的细胞数还挺大的，而且只有悬浮细胞的介绍，不知道贴壁细胞能不能做。我还想问Tunel试剂盒采用流式检测好不好做，结果容易出吗以及理不理想？因为要答辩了，急得不得了，谢谢，请尽快回复！
作者: yhz1973    时间: 2012-1-28 17:49


请教高手：
做细胞内标志物（如ALB等）的FACS，需要先破膜。请问，FACS分选后的目的细胞仍有活力吗？若要使其仍保持活力，应如何操作？
作者: HP007    时间: 2012-1-28 17:50


请问乙肝表面抗原能否用流式测定？如何测定？
作者: guagua    时间: 2012-1-28 17:50

请教很CAI的问题：
如何用流式检测细胞表面CD31分子表达情况？需要详尽的实验步骤！
我使用的是FITC标记CD31单抗，自己培养的内皮细胞。
是不是也需要固定呢？
作者: DNA    时间: 2012-1-29 08:27

你好，我是流式细胞的新手， 我想请教你关于流式细胞分析细胞周期的方法，如果实验没有达到统计要求的样本量， 只能根据图像分析的话， 应该如何分析。
我的实验是关于药物对细胞增殖周期的影响，分不同时间和不同浓度进行干预，最后上机检测，可是现在结果出来了，就是有了一组祖 图像， 但是我不太了解如何才能分析的比较到位，那里可以找到类似的分析说明。或者您是否可以给我一些建议，谢谢！
作者: dragonkilly    时间: 2012-1-29 08:32

做的课题是环境污染物的细胞毒性，主要检测染毒前后细胞功能学方面的改变及细胞中一些因子的表达改变。请问，我除了测凋亡率及细胞周期的改变外，还可以检测哪些指标？从论坛上看好象可以替代WESTERN BLOT 检测细胞因子蛋白质水平的表达，但我们实验室没有做过，请指点。
作者: 中国特色    时间: 2012-1-29 08:34

请教 EXPO™32打开*.lmd文件后其功能键“overlay histogram"是灰色的，如何操作才能让它可同时打开两个直方图进行重叠比较？
EXPO™32 如何打开*.hst的文件？
EXPO™32 能否将*.lmd文件转成*.hst文件？
作者: lixi559    时间: 2012-1-29 08:35

有实验恳请各位帮忙，急着毕业，能不能给予优先解答呢？！
我用PI＋AnnexinⅤ作细胞凋亡，AnnexinⅤ用FL1，PI用FL2，结果如图：但是我总觉得给药的图片有些不太正常，感觉像整个细胞团发生了偏移，并不像是产生了凋亡！因为在用FSC-SSC采集细胞的时候，整个细胞团由于药物作用物理性质发生了变化，因为我看到门里的细胞也不少就没有把细胞全部都调到门里面去，我不知道会不会因为这个原因导致我的实验结果看起来怪怪的！！由于是第一次进行这个实验，实在是不知道该怎样确认实验结果，还请各位帮忙！因为要使这个实验结果没有弄准确的话，之后的实验就会出现大麻烦！
另外对于这种给药细胞的物理状态改变很大的情况，是否是应该调节电压将细胞调到门里呢？还是只要检测得到就可以不用调了啊？

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作者: lixi559    时间: 2012-1-29 08:36


这是control组的FSC-SSC图片

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作者: lixi559    时间: 2012-1-29 08:36


这是control组的各象限比例

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作者: lixi559    时间: 2012-1-29 08:36


这是给药组的图片

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作者: lixi559    时间: 2012-1-29 08:37


上图所示的给药细胞的双染结果

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作者: lixi559    时间: 2012-1-29 08:37


上图的实验数据


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作者: lixi559    时间: 2012-1-29 08:38

在做PI染色时，细胞必须固定。因为活细胞对于PI拒染，只有细胞在固定后，细胞膜通透性增加，PI染料才可以进入细胞内与DNA嵌入式的结合。
就是利用这点，在测细胞调亡时，才用PI 将死亡细胞与凋亡细胞区分开。因为，死亡细胞的膜通透性很高，PI可以染进，而细胞凋亡早期的膜是完好的，不会被染上PI。

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我觉得也不是啊！我现在做的实验就是向PI(PBS液）中加入一定量的TRITON然后做活染检测！我觉得效果很好，而且相比固定后的有很多优势：细胞数目可以明显减少、不会堵仪器、对于作用很强的药物作用后的细胞仍然可检测得到----我觉得活染的方式要好于固定，推荐大家都试一试！
也希望有经验的人能否说说的看法，活染到底为什么一直没有被推广呢？
作者: lixi559    时间: 2012-1-29 08:38

你的门选的不好，因此导致调亡图看起来怪怪的。在选门时最好用不规则线条画，这样比较准确。

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你是说FSC-SSC的门吗？还是说FITC-PI的门？那应该怎样画才对呢？！能不能具体说一下啊！
另外，图形的确是怪的，但试验结果是不是准确的阿、或者是说有没有凋亡的出现呢？？
作者: lixi559    时间: 2012-1-29 08:38

请教各位大虾：
我现在做药物对细胞周期影响的实验，我查文献上有的是在加入药物之前，先将细胞静止24小时，有的没有静止。我问老师，意见也不统一，还请各位给予指导，是否应该先静止，再加药检测周期变化呢，原因是什么？谢谢

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我觉得应该先静止再加药，对于贴壁细胞更为重要，贴壁细胞进行贴壁是需要一定时间的，并且在为贴壁之前状态多不是很稳定的，如果没有静止就直接加药的话，会对细胞的一些生理现象产生影响，因此建议还是静止一段时间，让细胞的状态恢复到正常后，再作处理较好。
作者: lixi559    时间: 2012-1-29 08:39

在做Annexin-V.FITC/PI双染检测细胞调亡时，首先需要先用正常对照的细胞（不要双染）把活细胞选出来，在分别做两管实验组细胞的Annexin-V.FITC和PI单染，调好仪器的设置（在刚开始做时，因为不知道细胞调亡确切的量以及时间，实验组两管单染的细胞最好用刺激时间最长，药物作用浓度最大的来调仪器），另外还需要做对照组个个时间段的Annexin-V.FITC/PI双染，看看有没有自发性调亡。
你的流式图拿出去肯定不行，因为一个门没选好，另外仪器也没调好。从你的图看，我建议把FL1-FL2和FL2-FL1分别调大，把正常的细胞压到左下象限。再把P1电压调大，把正常细胞向右推，因为从图上看，细胞碎片和正常细胞没有分开。祝你好运！

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非常感谢你的建议！调仪器的是流式的工程师，在做未标记的和单标PI的时候都很正常、把细胞调到了应该在的象限，FITC单染的时候是用的-80度的冻存细胞进行的，也是按照规定将细胞调好了！她调过之后就说补偿就不要动了，不同细胞改变一下门就好了。
我在进行实验的时候，未标记的细胞以及单标记PI的细胞也都在相应象限里，并没有进入其它象限啊，这样的话应该怎么调补偿啊？！加了药之后的细胞形态发生了改变，是不是因为我的FSC,SSC电压未再次调整，导致图形不好呢？！
非常感谢！
作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-29 08:40


我想要PI染色检测细胞周期的详细步骤,另外还有一个问题是:用75%酒精固定能在细胞膜上打洞,但是能不能在核膜上打动呢?是不是固定后加PI即可染到核内的DNA?小弟是菜鸟,还请各位大哥赐教,谢谢!
作者: hyuu    时间: 2012-1-29 08:44


欲用流式检测一胞浆内表达的蛋白，该如何固定、标记和检测？真诚请教在座各位老师，不胜感激！
作者: glass    时间: 2012-1-29 08:47

各位好！
我现在有个问题想请教各位
我已经购买了一抗（单抗）准备用于流式细胞仪，但是它们没有荧光标记，所以需要购买二抗，我联系了一家外国公司，但该公司的二抗都是多克隆的，对二抗来说：多抗和单抗哪个效果要好些？应该怎样去选择合适的二抗呢？我的实验有单色标记，也有双色标记，。
谢谢
作者: 911    时间: 2012-1-29 08:47

欲用流式检测一胞浆内表达的蛋白，该如何固定、标记和检测？真诚请教在座各位老师，不胜感激！
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我本人也开始做类似的东东，下面方法可以参考以下。
胞浆内的蛋白检测，细胞可以用75%或是80%冰乙醇固定，-20度冰箱悬浮，一抗标记之前，需要破膜，可以用0.25%的Trion-X100，一抗孵育过夜后，用FITC标记的二抗标记，然后检测即可，注意做同型对照。
祝你好运！
作者: 911    时间: 2012-1-29 08:48

我想应该可以吧，毕竟膜的性质是差不多的，另外，核膜同质膜比较，好像本来就有孔的。另外，我提供一份程序，供参考！

溶液：
1）10-30% Triton，100×: PBS配，工作浓度为0.1-0.3％

2）10mg/ml RNAase（10×）：
RNAse 25mg
1M Tris(pH7.5): 25ul
2.5M NaCl: 15ul
H2O: 2460ul
100℃加热5min，缓慢冷却，1ml分装，-20℃保存。

3）0.5mg/ml PI溶液（进口：10×；国产：50×）
PI： 10mg
二水合柠檬酸三钠：0.224g
dH2O: 20ml
1ml分装，-20℃保存。

实验流程：
1）  消化细胞，取约105个细胞，1000rpm×5min×1次，倒去PBS，－20℃预冷75％乙醇固定, 4℃保存。注意：缓慢加入乙醇，同时小心晃动或者吹打。保存时间从一周到十天，最长是三周。根据具体情况而定。最短时间大概是30min，请查文献确定。
2）  1000rpm×5min离心去除乙醇，PBS重悬洗涤，1000rpm×5min离心
3）  用200ul PBS重悬细胞，加入下面几种物质：
1）  1％～0.3％ Triton： 20ul
2）  RNAase，10ul
3）  PI：10ul（进口）
4）  混合均匀，37℃ 避光孵育30min。
5）  300目细胞筛过虑。
6）  加入PBS调整浓度为1×106/ml
7）  流式检测细胞周期。

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我想要PI染色检测细胞周期的详细步骤,另外还有一个问题是:用75%酒精固定能在细胞膜上打洞,但是能不能在核膜上打动呢?是不是固定后加PI即可染到核内的DNA?小弟是菜鸟,还请各位大哥赐教,谢谢!
作者: 911    时间: 2012-1-29 08:48

我觉得还是需要酒精固定后才好。因为我们单位没有，所以得到别人哪里测定。每次经过酒精固定的样本就是比当天收集的细胞作出的细胞周期漂亮。我不知道你的triton浓度是多少？

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我觉得也不是啊！我现在做的实验就是向PI(PBS液）中加入一定量的TRITON然后做活染检测！我觉得效果很好，而且相比固定后的有很多优势：细胞数目可以明显减少、不会堵仪器、对于作用很强的药物作用后的细胞仍然可检测得到----我觉得活染的方式要好于固定，推荐大家都试一试！
也希望有经验的人能否说说的看法，活染到底为什么一直没有被推广呢？
作者: 911    时间: 2012-1-29 08:48


EDTA是金属离子的螯合剂，大概主要螯和二价金属。枸橼酸钠是柠檬酸钠！

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小弟从没有作过流式，实在是门外汉一个，最近想做流式，有几个菜鸟级问题向学长请教。我所参考的文献中老外用EDTA抗凝外周血，EDTA是不是枸橼酸钠？
文献中提到Leukocytes (5 × 105) obtained after erythrocyte lysis or MRC-5 fibroblasts were fixed and permeabilized by two technical procedures run in parallel. paraformaldehyde-Tween method和In the paraformaldehyde-methanol method 。是不是两种方法都可以，可以仍选其一？裂解红细胞以及给白细胞固定和通透，一般是用试剂盒好，还是自己配制试剂好？裂解红细胞后调整白细胞的密度时，一定要用培养基吗，老外没有说清楚用什么试剂调节白细胞的密度。
我已经将所参考的文献发到兄长的搜狐信箱了，请兄长帮我看看。
多谢。

Tween可以穿孔白细胞吗
作者: flower-201    时间: 2012-1-29 08:49

请教！
我使用annexin v 和 pi 双标测定法测定缺氧诱导视网膜色素上皮细胞的调亡。视网膜色素上皮来自ATCC，呈贴壁生长，37度胰酶消化2分钟，吹打后细胞极易呈团，很少能看见单个细胞。按照试剂盒（BD）的说明操作上机检测，每次死亡的细胞比例均超过20％，所以我的实验无法进行。恳请高手能指点如何准备细胞。万分感激！
作者: 铜雀    时间: 2012-1-29 08:50



QUOTE:
原帖由 flower-201 于 2012-1-29 08:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教！
我使用annexin v 和 pi 双标测定法测定缺氧诱导视网膜色素上皮细胞的调亡。视网膜色素上皮来自ATCC，呈贴壁生长，37度胰酶消化2分钟，吹打后细胞极易呈团，很少能看见单个细胞。按照试剂盒（BD）的说明操作上机检测，每次死亡 ...

在胰酶中加些EDTA可能会有所改善
作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-29 08:50

我觉得还是需要酒精固定后才好。因为我们单位没有，所以得到别人哪里测定。每次经过酒精固定的样本就是比当天收集的细胞作出的细胞周期漂亮。我不知道你的triton浓度是多少？

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1%的TRITON!你所说的当天收集的细胞是经过酒精固定后的吗？！酒精固定后放在4度里必须要过夜才行，即便是-20度也要等一段时间，我想你说的图不漂亮是不是因为没有完全固定好呢？
作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-29 08:50

我觉得还是需要酒精固定后才好。因为我们单位没有，所以得到别人哪里测定。每次经过酒精固定的样本就是比当天收集的细胞作出的细胞周期漂亮。我不知道你的triton浓度是多少？

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0.1%的TRITON!你所说的当天收集的细胞是经过酒精固定后的吗？！酒精固定后放在4度里必须要过夜才行，即便是-20度也要等一段时间，我想你说的图不漂亮是不是因为没有完全固定好呢？
作者: 969    时间: 2012-1-29 08:52

流式细胞技术在细胞定量检测方面是最先进检测技术,流式细胞仪在临床和科研领域得到广泛运用。
分析细胞学是细胞定量分析的学科,流式细胞技术(ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ,ＦＣＭ)是分析细胞中的一个重要领域,该技术为细胞学研究手段之一,能够对细胞和细胞器及生物大分子进行高达每秒上万个染色体的分析,而且一个细胞多参数分析并可分选细胞。这种以流动的方式(相对静态方式)测量细胞与传统的用荧光镜检测细胞比较,具有速度快,精度高,准确性好的特点,可以说ＦＣＭ是目前最先进的细胞定量分析技术。该仪器在医学和基础生命科学中得到广泛应用。也就是说流式细胞术已应用于免疫学,生物学等临床医学和基础医学研究领域。下面做一简单介绍。细胞凋亡是当前研究的热点之一,检测凋亡有多种方法,ＦＣＭ的优点是1)能快速客观高灵敏度地进行多参数地测定样本细胞中的生物学变化。(2)定量测定凋亡指数,可同时测定凋亡细胞与细胞周围的关系。(3)同时测定细胞增殖率与死亡率,从而可了解肿瘤的增长速度。(4)测定单细胞为基础的凋亡相关基因蛋白的变化以探讨凋亡分子机制与细胞周期的关系。(5)从治疗过程中肿瘤细胞死亡速率可早期了解药物的疗效。随着ＦＣＭ凋亡检测方法的敏感性和特异性不断的提高,有望做到更客观地反映凋亡这一复杂的现象。血液学研究的主要内容是血液和骨髓,而这两者均为天然的单细胞悬液,并且易于反复采集,这正符合ＦＣＭ的标本要求。细胞流式术在这里起的作用是1)对细胞内部参量的检测,利用细胞对光的散射,可获得有关细胞大小(与前向角散射有关)和粒度的信息(与侧向角散射有关)。(2)细胞外部参量的检测。待测细胞经荧光染成标记后,主要检测:ＤＮＡ含量,ＲＮＡ含量,总蛋白含量,细胞原构成,酶活性及定位小细胞钙离子,细胞内ｐＨ细胞膜定位,细胞膜流动性或微粘度等。(3)细胞分选内部参量或外部参量的不同。ＦＣＭ可将某一特定亚群从细胞总体分选出来,以待做进一步的研究,这一功能在克隆方面有重要的意义。细胞抗原表型分析,这是ＦＣＭ在血液病学中应用最广泛的领域。流式细胞术在该领域里显示出其快速大量检测细胞和多色标记的优点,使免疫表型分析更加快速、客观、准确。用ＦＣＭ技术分析和分选标本染色体是分子生物学,遗传学研究的一个非常有效的方法。采用双激光的方法,研究者可进行核型分析和鉴定,分离纯化某号染色体并构建染色体特异性ＤＮＡ文库。后者在遗传病基因定位、基因克隆方面发挥重要作用。其实流式细胞术在生物学中的发展,主要得益于克隆抗体技术的发展,这两者的发展是相辅相成的。流式细胞仪主要部件及其作用:光源:光源有相干光源和非相干光源。非相干光源一般来自灯和汞灯。此类弧光灯的发光是电流经过气体时,造成气体电离所产生的。它能提供最佳的激发波长。选择汞灯和灯的原则是能提供最大的荧光激光能量。但弧光灯在单一谱线上能量较弱且功率不稳,己逐步被激光光源代替。相干光源常用Ａｒ+激光,Ｈｅ—Ｎｅ及染料激光,其中氩离子激光器在紫外范围也可激发染料,适合ＤＮＡ分析和使用特殊荧光染料情况。因此成为流式细胞仪中使用最广泛的激光源。它在488ｎｍ时呈兰色激光。此光源能提供极高的照射光强,稳定性高,发射散角小,能聚焦到细胞大小的线度范围内。常用的还有Ｈｅ—Ｎｅ激光器(633ｎｍ),用于光散色的测量。由于染料激光器的波长能连续调6ＭｅｄｉｃａｌＥｑｕｉｐｍｅｎｔＶｏｌ 13,Ｎｏ 5
作者: 爱老虎游tt    时间: 2012-1-29 08:53

欲用流式检测一胞浆内表达的蛋白，该如何固定、标记和检测？真诚请教在座各位老师，不胜感激！

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不知道你要做什么细胞，什么细胞因子的检测？
我做的是人的pbmc的表染＋细胞内染色（检测TH1和TH2因子），我们这里关于细胞内染色做了很多的工作，可以给你一点建议
1.取出培养的细胞悬液50－80ul于流式管中
2.染色缓冲液洗＋离心 X1次
3.表染（冰浴25－30' ）
4.染色缓冲液洗＋离心 x2次
5.加入固定剂（冰浴30'）
6.染色缓冲液洗＋离心　x2次
7.加入透膜液（我们用的是0.1％saponine皂素）冰浴15’
8 离心弃上清，不要用染色缓冲液洗
9.加入抗胞内蛋白的抗体（冰浴25－30'）
10.透膜液洗＋离心 x1次
11.染色缓冲液洗＋离心 x1次
12.上机检测或者加入固定剂过几天再测
以上步骤可以概括为表染－固定－透膜－胞内染色－上机检测
注意：我做的是人的pbmc，检测的是TH1/TH2因子，在检测之前，细胞要加入刺激剂PMA＋ionomysin4小时，再加入monesin或者BFA阻断2小时后收集。而且还有一点要注意的是，刺激后的细胞，表面分子如CD4是一定下调很多的，所以要选择合适的刺激剂和阻断剂
你如果做的是其他细胞，最好先查看一下别人的文献。我这个方法，目前我只用在淋巴细胞上，效果不错。

总之，你要做的是胞内染色，就要弄明白几点
1。是否需要刺激剂 和阻断剂，如果需要，刺激的时间？阻断的时间？
2。如何做阴性对照和实验对照
3。选用什么样的固定剂，透膜剂，以及非常重要的透膜时间需要多长？
我也是实验新手，以上只是别人和我自己的一点经验，希望高手指正！！
作者: guagua    时间: 2012-1-29 08:54


FCM型号：EPICS XL

问题：本人觉得随机带的报告形式过于简单、且不规范。流式细胞仪报告单涉及的上下标的问题该如何解决？如：CD3+CD16+56 +在给临床的报告单中该如果表达？

请问各位老师：你们的流式细胞仪报告单用何管理软件？

软件要求：能解决上下标的问题，有简单的报表统计功能。
作者: 盼盼    时间: 2012-1-29 08:54


刚进了一台BD公司的流式细胞仪，今天刚培训完毕，所以我也加入这个大家庭啦。以后少不了请教大家。现就有一个问题哟：我要测外周血的DC细胞，请问应买那个公司的什么抗体？

[ 本帖最后由 盼盼 于 2012-1-29 09:00 编辑 ]
作者: tangxin_80    时间: 2012-1-29 08:55

我做的是淋巴细胞内搪皮质激素受体的检测。步骤如下：
1.细胞加入固定液（4%多聚甲醛）（冰浴20'）
2. 染色缓冲液洗＋离心 X1次
3. 加入透膜液（我用的是0.1％saponine皂素，含胞内抗体）冰浴20’
4. 透膜液洗＋离心 x2次
5. 将细胞悬浮在固定液中，上机
但目前结果不太理想，得出假阳性来。估计是破膜后，抗体洗不出来。是否有人可以指点一下，应该怎么改进？是否各种液体的PH值很重要？
谢谢！
作者: misswu61    时间: 2012-1-29 08:56


我是作分子生物方面的，细胞方面很匮乏，向各位请教：
需要用流式检测细胞的凋亡和细胞周期，用PI单染可否同时检测？对细胞的处理是否一致？
谢谢！
作者: pengke1983    时间: 2012-1-29 08:56


请问碘化丙啶那里能买到?
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 08:56

我要做大鼠脊髓损伤的实验,想用流式检测细胞的凋亡,查阅资料上面关于组织标本的制作,方法各异,讲的也不详细,请老师们帮帮忙介绍以下具体的步骤及注意事项,多谢多谢!
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 08:57

再附加几个：外周血不刺激能直接检测到DC吗？百分率是多少？应该如何检测啊？
作者: toy    时间: 2012-1-29 08:58


我做的药物对细胞生长曲线有影响，引起细胞的数量下降，但做Annexin V没什么凋亡，请问结果怎么解释？直接引起坏死吗？
作者: caihong    时间: 2012-1-29 08:58

哪位朋友有Fura_2或Fluo-3荧光染料，或测胞内pH值的染料，能否给我点，我刚准备做，做的不多，为完成研究生课题，请各位多帮忙！多谢多谢！

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我们前段时间买了个染料BCECF AM，可以用于检测细胞内的PH值，这方面的文献也不少。Fluo-3我们这也有人在作，主要是用于在激光共聚焦显微镜上检测钙离子变化，不知你想要什么资料
作者: caihong    时间: 2012-1-29 08:59

我做的药物对细胞生长曲线有影响，引起细胞的数量下降，但做Annexin V没什么凋亡，请问结果怎么解释？直接引起坏死吗？

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可以Annexin V和PI双染，这样是否直接引起坏死也一目了然
作者: 盼盼    时间: 2012-1-29 08:59

我想用流氏细胞仪测胞内钙离子浓度和胞内pH值,具体方法查了一些文献也略知一二.但问试剂公司,染料价格不菲,而我用的也不多,所以想向大家求助点.我用的东西你如需要,咱们可以互相交流.感谢不尽!
现将我需要的染料列出,如你能支援点就太好了.非常非常非常感谢!
Fura-2
Fluo-3
BCECF-AM
nigericin
我的Email是wj2502@vip.sina.com, wj2502cb6@hotmail.com
请和我联系!
作者: eric930    时间: 2012-1-29 09:00

我要检测小鼠巨噬细胞表面CD14,CD86,用直接荧光标记抗体，怎么根据细胞数决定抗体用量呢？请各位老大指导一下，谢谢！
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-29 09:00

请教大侠：

我要做Annexin V-FITC PI双标的流式细胞仪检测。但因为要做不同的时间点，请教诱导的凋亡细胞能否固定啊？多谢！
作者: hold住    时间: 2012-1-29 09:01

请问楼主:
做Annexin V PI 双标的细胞标本可以固定吗?(流式细胞议)
作者: baidukk    时间: 2012-1-29 09:02

请教高手：
流式与westen在检测蛋白表达方面各有什么优缺点？
流式可以检测在胞浆中表达的蛋白吗？敏感性怎么样？
操作上有什么特殊要求？

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回复：
我曾请教果生可科院专家，他们认为如果发文章的话
流式或免疫组化的方法肯定不如westen的好发，因为他们认为流式在收集样本的时候，肯定会有很多的杂质掺入其中，而这些杂质在流式的激发光源下是会发光的，因此会有很高的假阳性，而免疫组化的方法主观性太强，而且不宜定量，所以他们都倾向于westen
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-1-29 09:02

急切的请教各位流式高手：
1 我做的是色素上皮细胞的活细胞荧光染色，染色后直接制成悬液用流式测荧光强度，可是总是出现两个峰（十的三次方至二次方之间），好多次都是这样，我想有可能是染色不均，但想不出其他原因了。请帮助我好吗？
2 我的对照组未经染色，直接做流式，但峰的左半边总在零之外，呈现难看的右斜坡状，这是为甚末呢？跟我细胞内的少量色素有关系吗？
作者: idea2011    时间: 2012-1-29 09:03

可以用流式代替WESTERN啊！而且流使用于定量比WESTERN客观的多！你到bd公司的产品目录上去找一找，用途中为FCM的就表示可以用作流式检测的，很多蛋白都可以！你可以先看看相关的产品介绍。
作者: 彼岸花opp    时间: 2012-1-29 09:03


我是一名流式新手，今天在做射线诱导淋巴细胞调亡时，给4Gy照射，22小时后，调亡达77%，远远大于以前各家报道，是不是时间有误？请告之？
作者: skytree    时间: 2012-1-29 09:04


哪位高人可回答这个问题:10ug标记物可标记1000000个细胞,但我知道阳性细胞只占10%,是否可用1ug去标记,这样可省许多money.谢谢!
作者: loli    时间: 2012-1-29 09:05


昨天做流式,目的是比较单转PEGFPC1和转目的基因-PEGFPC1融合蛋白对细胞周期的影响,用已醇固定1h并希望将表达绿色荧光蛋白与不表达的细胞分开.转染后荧光显微镜下观察转染效率分别为40-50%与10-20%.但昨天上流式却发现为80%和70%不知为什么?哪位流式高手能否回答一下.
作者: skytree    时间: 2012-1-29 09:06

再附加几个：外周血不刺激能直接检测到DC吗？百分率是多少？应该如何检测啊？

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我用FCM测过大鼠外周血的DC，不到10%；你可根据不同的血液用不同的特异性抗体标记DC，sigm\BD等公司的资料上都有。
作者: skytree    时间: 2012-1-29 09:06

纠正一下，是不到分离的单核细胞的10%。
作者: TAT    时间: 2012-1-29 09:11


想买jc-1染料作线粒体分析，大家能不能推荐那个公司的经济可靠？？
谢谢
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-29 09:11

昨天做流式,目的是比较单转PEGFPC1和转目的基因-PEGFPC1融合蛋白对细胞周期的影响,并希望将表达绿色荧光蛋白与不表达的细胞分开.转染后荧光显微镜下观察转染效率分别为40-50%与10-20%.但昨天上流式却发现为80%和70%不知为什么?哪位流式高手能否回答一下.

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流式比荧光敏感，你的结果比较正常.

另：我最近作的正好和你的相反，荧光检测比流式的高，实在想不通，还以为流式坏了呢，但在别的单位重测， 结果差不多
作者: KGZ564    时间: 2012-1-29 09:12

我是一个流式新手。主要做淋巴细胞分群和细胞周期分析。看了不少相关资料，但是缺乏实际操作经验，我这里的实验室也没有别人做。希望能得到各位大虾的指点。
作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-29 09:12

请教高手
我想检测细胞的自我更新能力，请问需要检测那些指标？用流式细胞术检测细胞的周期，行吗？怎么检测？需要那些材料？具体程序如何？
作者: vvmmoy    时间: 2012-1-29 09:13

需求：
FITC conjugated anti-human CD1a and it's isotype
可购买也可交换，本人有以下抗体以供交换
ISOTyPe buffer
PE-CD 69 PE-IgG2a PBS
PE-CD-80 PE-IgG1 PBS
PE-CD-83 PE-IgG1 PBS
PE-CD-86 PE-IgG1 PBS
PE-anti-CD69
PE-anti-IFN-γ Mouse-IgG1 PBS

FITC-HLA-DR FITC -IgG2b PBS
FITC -CD-28 FITC -IgG1 PBS
FITC -CD11α FITC -IgG1 PBS
作者: HP007    时间: 2012-1-29 09:13

浏览了上面的帖子，发现有很多高人！
我目前的实验是要定量白细胞中一种内膜蛋白（P-糖蛋白，P-gp），标本（只能采血）要达到流式检测标本的要求就可以，因此我现在正在分离白细胞（理论上全血WBC4～10×106／ｍｌ？！），按照TCR的方法做了很多次仍然得不到很好的分离效果（我的操作：预热裂解液，1：5加入裂解液水浴6分钟，1500转离心5分钟，PBS洗3遍），非常苦恼！
请教各位老师：
1.FCW如果检测白细胞，WBC最少要达到多少数量（106　？！）。
2.其中WBC的阳性率应该在多大范围内（也就是WBC的比率至少应达到多少），就可以上机进行检测了呢，而且还能得到准确的检测结果呢？
另外再问一下：流式定量内膜蛋白时，要求其表达量最低应该为多少啊？
我是不是应该进行WBC的姬姆萨染色来确定它的数量呢（我已经分不出镜下的WBC和RBC了：—（）？！
急切盼望您的指导！万分感谢！
作者: c86v    时间: 2012-1-29 09:14

请教各位：
又来了一个新手，我想问一下有人用血浆做过流式么？想检测血浆中一种颗粒的细胞来源。不知哪位前辈做过？
作者: 生物迷    时间: 2012-1-29 09:15

请教大侠：

我要做Annexin V-FITC PI双标的流式细胞仪检测。但因为要做不同的时间点，请教诱导的凋亡细胞能否固定啊？多谢！

Annexin V-FITC PI双染细胞不能固定，染色后必须在1小时内上机检测；但如果是PI单染，细胞可以用70％冷乙醇固定，于－20度保存可以备用。

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刚刚开始学习用流式技术分析食品成分对于肿瘤细胞是否诱导细胞凋亡。
1。做了几次PI染色分析细胞周期，都不是很理想。发觉与对照组相比，处理组的亚二倍体的DNA含量在数字上几乎一致，但是仔细看，细胞周期的形态分布时发现，似乎有区别，在G2/M期的地方比对照组低一些，也就是感觉S期的细胞增多了，但是打印出来的图却不是很明显。现在考虑是否细胞就是停止在S期，但是查了一些文献，很少有凋亡细胞停止在S期的。
不知道该如何解释？

2。研究室里前辈配制的PI溶液用完，因为她已经毕业也不知道是用的什么溶剂，查了相关资料，但大多是kits，看到有用PBS的，就想用PBS试试。但是另一同志查到有水溶液的，就建议用水溶液。周五用水溶液配制的PI溶液染色细胞，不知道是否因为我一直在调整protocol导致染色后的细胞放置时间过长（研究室的前辈说必须染色后2小时内测定。其实也有过一次超过两小时测定的，感觉还行。）还是由于PI的水溶液的缘故，在染色2。5小时测定时发现无法测定了，细胞几乎都落在设定区外接近边缘线，细胞大量死亡了。
作者: gemei0115    时间: 2012-1-29 09:15


我是初学者，对这方面了解很少，查了不少资料，可还是搞得不太清楚，请高手多加指教．我主要是检测血小板经ADP激活后表面分子表达的．两份样本处理过程完全一样，而只是一管加入同型对照抗体，一份加入要检测的荧光抗体，上流式检测却发现，阴性对照管的表达比试验管的还要高．不知会是什么原因引起的？不知如果再加一管什么也不加的，这三个管子上流式后的图形会有怎样的差异？？
作者: gemei0115    时间: 2012-1-29 09:16

请教北京哪家单位有细胞流式仪？如果对外使用，如何收取费用？

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西苑中医院 20
作者: nn255    时间: 2012-1-29 09:16


各位大虾，我正在用流式检测乳腺癌临床标本的DNA直方图，问题是有很多时候，有异倍体表现，在分析数据时候，不知道如何分析SPF和DNA指数。
恳求各位，是否有人做过类似的东东。帮一下忙，此类文献也可以，谢谢！
另外，问一个愚蠢的问题，用来做免疫组化的抗体，可否用来做流式，我需要的抗体有一部分，向试剂公司咨询，都没有标明作流式这个方法。
再次谢谢了！
作者: zsxan1990    时间: 2012-1-29 09:17


请教：流式检测细胞增殖(FLOW Brdu Kit)有何经验？我的操作过程：养淋巴细胞三天后按照说明书操作染色固定等，之后立即上机没有细胞增殖的指标变化，但是标本放置24小时后再检测反而有了“指标的变化“。说明书虽然允许标本放置过夜，但检测结果在固定完成后应是不会变化的，该如何解释这一现象呢？
多谢！
作者: 831226    时间: 2012-1-29 09:17

我操作的是美国Becton Dickinson 公司的FACSACalibur型号流式，有2年；略有经验。
如果有问题，请跟帖子，除非特别忙，我会尽力应助。
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您好：
我的实验是体外检测枯否氏细胞的吞噬功能。大致过程为让枯否氏细胞吞噬带有荧光标记的乙肝病毒e抗原抗体复合物，在流式上我该检测什么些指标。我的实验在别人地方做，我想了解一下我该检测什么东西，不然我到那什么 都不懂，可能不太好，请指教一下，谢谢！！！
作者: star#room    时间: 2012-1-29 09:18


本人欲作CD34+白血病细胞的药敏试验，想了解细胞处于静止状态（G0期）是否会造成耐药，即了解细胞周期对于药物疗效的影响。请问如何运用流式细胞术加以检测？检测前是否要求细胞周期同步化？如何实现？另外，我以前知道，检测细胞增殖状况可通过MTT法、细胞集落形成试验、还有同位素掺入试验等。现发现流式细胞术好像也可以检测细胞增殖状况，不知如何检测（好像要加秋水仙胺），效果如何？恳请各位高手给与答复！本人急需！！（本人对流式细胞术仅为一知半解，请答复得越详细越好，再次感谢！！！）
作者: 831226    时间: 2012-1-29 09:18


大家好：我是新手。我想置备乙肝病毒e抗原抗体复合物，购买 CD68，CD11b抗体，请多多指教，谢谢。
我实验在上流式检测的，大致为用流式检测带荧光标记CD68，CD11b确定为巨噬细胞，且让巨噬细胞吞噬乙肝病毒e抗原抗体复合物也是带荧光标记的，来检测巨噬细胞 的吞噬功能。
作者: nn255    时间: 2012-1-29 09:19

本人是一个流式新手，现在正准备做小鼠淋巴细胞亚群分析。请教红细胞氯化铵裂解液的配方。使用时应该注意些什么呢？
作者: jujuba    时间: 2012-1-29 09:20

我打算用annexin V和PI双染法检测PMN的凋亡率，请问每份样本要分几管，怎么处理，处理的样本是不是要立刻上机，能固定吗？
作者: langlang    时间: 2012-1-29 09:20


我的步骤是这样的：
1.PBS洗三遍
2.加0.25胰酶1毫升
3.显微镜下看细胞变园，立即加入4毫升PBS,离心1200 10分钟

但离不下细胞 我不知怎么办了，请高手指正。最好能给我一个从收集细胞到固定的具体的步骤。
作者: bananapeople    时间: 2012-1-29 09:21

各位大虾，我正在用流式检测乳腺癌临床标本的DNA直方图，问题是有很多时候，有异倍体表现，在分析数据时候，不知道如何分析SPF和DNA指数。
恳求各位，是否有人做过类似的东东。帮一下忙，此类文献也可以，谢谢！
另外，问一个愚蠢的问题，用来做免疫组化的抗体，可否用来做流式，我需要的抗体有一部分，向试剂公司咨询，都没有标明作流式这个方法。
再次谢谢了！
作者: 8princess8    时间: 2012-1-29 09:21


我想问，我做出来的红细胞CD35值，做数据统计的时候，是看all mesn呢？还是要除到看单个红细胞的mean值？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 09:22

各位大虾，我正在用流式检测乳腺癌临床标本的DNA直方图，问题是有很多时候，有异倍体表现，在分析数据时候，不知道如何分析SPF和DNA指数。
恳求各位，是否有人做过类似的东东。帮一下忙，此类文献也可以，谢谢！
另外，问一个愚蠢的问题，用来做免疫组化的抗体，可否用来做流式，我需要的抗体有一部分，向试剂公司咨询，都没有标明作流式这个方法。
再次谢谢了！

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癌症的标本做DNA测定的时候，出现异倍体是正常的，因为它本身就是异常的增殖，表现为DNA含量的不成倍性。如果出现的很少，或者说含量较低的时候，你可以用分析软件去掉它。（不知你用的是Cellquest,还是Midfit？） 做组化用的抗体，，一般来说可以做流式，但结果可能不好，这方面试剂公司如果没明确表示的话，不建议用做流式。
作者: zzzz    时间: 2012-1-29 09:22

请哪为朋友告知下列仪器的厂家和价格：

厂家 价格（人民币）

流式细胞也仪
confocal 显微籍
中档水平的透射电镜
中档水平的扫描电镜
冰冻切片机
玻璃刀制刀机
CO2临界点干燥仪

急需！ 拜托！
作者: bananapeople    时间: 2012-1-29 09:25

各位大虾，我正在用流式检测乳腺癌临床标本的DNA直方图，问题是有很多时候，有异倍体表现，在分析数据时候，不知道如何分析SPF和DNA指数。
恳求各位，是否有人做过类似的东东。帮一下忙，此类文献也可以，谢谢！
另外，问一个愚蠢的问题，用来做免疫组化的抗体，可否用来做流式，我需要的抗体有一部分，向试剂公司咨询，都没有标明作流式这个方法。
再次谢谢了！

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癌症的标本做DNA测定的时候，出现异倍体是正常的，因为它本身就是异常的增殖，表现为DNA含量的不成倍性。如果出现的很少，或者说含量较低的时候，你可以用分析软件去掉它。（不知你用的是Cellquest,还是Midfit？） 做组化用的抗体，，一般来说可以做流式，但结果可能不好，这方面试剂公司如果没明确表示的话，不建议用做流式。

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非常感谢，我用的是Cellquest，可是有时候以异倍体表现为主，所以才困惑该如何分析SPF或是DNA指数，所以只有在问一下了，不好意思。
作者: rxcc33    时间: 2012-1-29 09:26


我也想问一个问题，方向和大家有一点不一样。
细胞仪在对白细胞分类时是用dot plot图分的，他图上面的各种细胞的分界线是怎么确定的。如：嗜酸细胞在图的右上方，我想知道体积和吸光度的值分别要是多少才能把他归为嗜酸细胞类。
终之我想知道各种白细胞的体积和吸光度(550nm左右波长)的具体的值是多少。
顺便说一下我用的是法国的ABX PENTRA 60流式细胞仪。

至少我想知道在哪里能找到这些资料。谢谢了
作者: rxcc33    时间: 2012-1-29 09:26


另外，问一个愚蠢的问题，用来做免疫组化的抗体，可否用来做流式，我需要的抗体有一部分，向试剂公司咨询，都没有标明作流式这个方法。
再次谢谢了！

做免疫组化的抗体可以用来做流式，不知你用哪一方面的抗体，我是用抗体标记后测定阳性细胞标记率。
作者: bananapeople    时间: 2012-1-29 09:27

另外，问一个愚蠢的问题，用来做免疫组化的抗体，可否用来做流式，我需要的抗体有一部分，向试剂公司咨询，都没有标明作流式这个方法。
再次谢谢了！

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做免疫组化的抗体可以用来做流式，不知你用哪一方面的抗体，我是用抗体标记后测定阳性细胞标记率。

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谢谢你关心，我检测乳腺癌的ER和PR，我用MCF作阳性对照，检测临床标本，谢谢你哟
作者: xueyouzhang    时间: 2012-1-29 09:27


各位老师，我想请教一个问题。现在我正在做免疫荧光抗体标记检测阳性细胞的细胞周期，不想实验当中遇到了大麻烦。当我用70%乙醇固定后，二抗标记的荧光根本不可见了，因此无法进行实验。我也使用了多聚甲醛固定，显微镜下可见荧光不受影响，但是流式上机后却无法测细胞周期，分布图很难看！因此，想请各位不吝赐教！！！有何合适的替代方法？还有乙醇固定对细胞有何影响呢？谢谢！
作者: 羊咩咩    时间: 2012-1-29 09:28


流式细胞检测蛋白较为简单、快速、方便、易定量分析，但是特异性较差。westen检测蛋白特异性高，但是过程烦琐。流式可检测胞浆蛋白，敏感性与膜蛋白相差无几，操作上就是要先固定，在用破膜剂处理。
作者: lagua123    时间: 2012-1-29 09:28


这是我用人的CD34做猪的外周血分析，请看结果，M1标的对吗？合适吗？
预期的结果CD34阳性应该30％左右。

图片附件: 20731232.snap.jpg (2012-1-29 09:28, 47.99 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10330

作者: lagua123    时间: 2012-1-29 09:29

这是我用人的CD34做猪的外周血分析，请看结果，M1标的对吗？合适吗？
预期的结果CD34阳性应该30％左右。


图片附件: 30584731.snap.jpg (2012-1-29 09:29, 47.99 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10331

作者: sunnyB    时间: 2012-1-29 09:29

那位仁兄帮小弟一个忙：我想知道用流式细胞仪能否把前列腺癌组织中的激素依赖性细胞和激素非依赖性细胞分别计数，如果可以的话用那种抗体染色标记。如果可以的话尽量介绍详细一点，我实在是对流式细胞仪大大地不了解，拜托！
作者: sunnyB    时间: 2012-1-29 09:30


关于肿瘤方面我只看到有用FCM做S、PI、DNA倍体方面的分析。目前前列腺癌组织中的激素依赖性和激素非依赖性细胞这方面的认识还相当模糊。我实在查不到有关它们的特异性单克隆抗体，可老板非让我查，急死我啦。有没有很熟悉这方面的专家，给我一个较明确的回答呀，拜托啦各位！
作者: 铜雀    时间: 2012-1-29 09:30

各位大侠好！
小弟刚接触FCM不久，从做FCM的老师那把原始结果拷回来后，但不知怎么打开，没有这种专门的软件，请问哪位有吗？

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用WINMIDI 软件，一个免费的软件，功能要比cellquest差很多，操作也复杂些，但是能用~~
作者: plaa    时间: 2012-1-29 09:30


请教，不知那位老师能给帮助，我刚刚接触流式，什么尚不清楚。下载前面的文件确不能打开，郁闷ing。我想做一下几个指标：绝对细胞计数，细胞周期参数，蛋白多糖测定，细胞凋亡的检测。我养的是兔子椎间盘细胞，类软骨细胞，细胞外基质表达不高，PI染色是否可以检测前两个指标？蛋白多糖的检测以及凋亡的检测还请各位老师给予指导。谢谢
作者: one    时间: 2012-1-29 09:33

请问那里有COULTER XL的流式细胞仪？
我是湖北一所学校的一个年轻教师。我们单位有一台此型号的仪器。我们主任要我自己联系单位进修，学习这种仪器的使用。如果有单位有这种型号的仪器，已经投入使用，且愿意接受进修人员请回贴，或与我联系。
作者: wmp1234    时间: 2012-1-29 10:19

求助：各位大哥,小弟正在做一药物诱导细胞凋亡,准备检测线粒体膜电压,急求教检测的方法,看过文献说用rhodamine123流式细胞仪检测,但不知详细方法,那位大哥作过,万望赐教,不胜感激!
作者: duoduo    时间: 2012-1-29 10:19

我最近打算用流式和DCFH来检测细胞内的ROS含量。可是，由于我是第一次用流式细胞仪，所以对里面的一些参数设置和操作流程不清楚。可不可以给我一个相关的操作流程。
谢谢！
作者: ffooll    时间: 2012-1-29 10:20     标题: 回复 #929 wmp1234 的帖子

我也想做的，但到现在一直都没去做。除了rhodamine123，好像用JC－1测的也不少
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-29 10:21


请教各位，用PMA刺激淋巴细胞CD40L表达，配成工作液4度储存，有时能用2周，有时才5天就失活了，很不稳定，应怎样保存结果更有可比性？？
作者: tieshazhang    时间: 2012-1-29 10:21

各位老师，我想请教一个问题。现在我正在做免疫荧光抗体标记检测阳性细胞的细胞周期，不想实验当中遇到了大麻烦。当我用70%乙醇固定后，二抗标记的荧光根本不可见了，因此无法进行实验。我也使用了多聚甲醛固定，显微镜下可见荧光不受影响，但是流式上机后却无法测细胞周期，分布图很难看！因此，想请各位不吝赐教！有何合适的替代方法？还有乙醇固定对细胞有何影响呢？谢谢！
作者: yueban-1147    时间: 2012-1-29 10:22     标题: 回复 #933 tieshazhang 的帖子

乙醇固定會使細胞變粘, 尤其免疫螢光抗体標記過程需要多次清洗, 最後大部分的細胞會都黏附在試管壁上, 所以對流式细胞术並不是一個好的固定方式.
提供你一個不錯的固定方式:
5% diethylene glycol, 1.5% formadehyde (in PBS) 固定15分鐘
可以配成10x 溶液長時間室溫保存, 固定效果是我使用過最好的.
(該配方源自BD公司處理血液的Lysing solution, 只是以PBS配製, 無lysing作用)
作者: wu11998866    时间: 2012-1-29 10:22

我尝试用PI＋AnnexinⅤ作细胞凋亡，AnnexinⅤ用FL1，PI用FL2，结果如图。
三次结果都类似，左上象限的是代表什么呀，问了很多人都不知道。到底问题出在哪里呢。图一为对照，未加PI和AnnexinⅤ，图二、三均为药物作用组。
左上象限：细胞碎片或杂质
左下象限：正常细胞
右上象限：死亡细胞或者调亡晚期细胞
右下象限：调亡早期细胞
作者: u234    时间: 2012-1-29 10:23


豚鼠的CD4、CD8及NK抗体那里有卖，有谁知道？
作者: gogo    时间: 2012-1-29 10:23

常用荧光燃料的发射光和激发光分布：

图片附件: 58317360.snap.jpg (2012-1-29 10:23, 116.48 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10332

作者: idea2011    时间: 2012-1-29 10:24


请教
各位大哥,做大鼠的大脑中动脉梗死后,检测凋亡细胞,能否采用Annexin/PI法?
取脑组织做单细胞悬液,能否用胰酶消化,还是单纯采用机械法?
我所做预实验时,二者的死亡细胞都很多,出来的图表效果不好
作者: dotaaa    时间: 2012-1-29 10:24


我是第一次做流式细胞仪检测小鼠TH1/TH2细胞，请问哪一家公司的
小鼠TH1/TH2流式细胞盒较好？晶美代理的小鼠TH1/TH2流式细胞盒
（eBioscience）可以吗？
请赐教！
作者: shenkunjie    时间: 2012-1-29 10:25

请教各位：
谁精通流式的染色体分选技术？？
望不吝赐教！
提供一些相应线索也好！！
作者: dotaaa    时间: 2012-1-29 10:26

我是第一次做流式细胞，想检测小鼠Th细胞亚群。通过一些资料（包括丁香园上的），打算按以下步骤进行，请各位帮忙看一下，有什么不对的地方。同时想请教
1，monensin使用时浓度为多少？
2，固定和破膜时间为多少？
抗体
细胞表面标记抗体: 抗小鼠 CD3-TC 抗小鼠CD4-FITC
细胞内因子抗体：抗鼠IL-4-PE, IFN-γ- PE。
RAT IgG1（对照）-PE
以上抗体均打算购自联科生物。
实验方法
1. 外周血单个核细胞的分离：取C57BL小鼠脾，制成脾细胞悬液。在试管内加入小鼠淋巴细胞分离液2ml。将脾细胞悬液4ml，轻轻加入淋巴细胞分离液上层。600g离心15min。取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞，加入Hanks液3ml，混匀后，300g离心5min，弃去上清。
2.细胞加入0.5ml 10%FCS-RPMI 1640培养基（含 100ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素，同时加入monensin）重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度。37 ℃ CO2孵箱刺激5h后，收集细胞，洗涤1次。
3. 将细胞分为3份，分为对照管（2管）和实验管（1管），各加入IL-4-PE 10µl和CD3-TC 10µl，混匀。室温放置20min。洗涤3次
4. 每管加入500ul固定液（4%多聚甲醛），室温放置20min，使细胞固定。洗涤2次。
5. 每管加入100ul破膜液（0.1%皂角），室温放置10min，洗涤2次。
6. 实验管分别加入IFN-γPE、IL-4 - PE各5ul，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30min。洗涤两次。
7．以300µl洗涤液（DPBS）重悬细胞。流式细胞仪检测。
作者: lagua123    时间: 2012-1-29 10:27

用流式细胞仪测定DC细胞表型时，具体步骤不清楚？在用PBS洗之前，细胞数量是够的，可是洗之后，竟然没有细胞，该怎么办呢？
作者: @STAR@    时间: 2012-1-29 10:27


做DC表型与做其它细胞表型实际上是一样的。将细胞收获、PBS洗涤、相应荧光抗体标记、再PBS洗涤即可。出现你这种情况可能是在离心时的转速不够所致。如你是用的EP管在小离心机上做时，可提高转速到6000RPM/MIN，5-10钟就行了。
作者: DDD    时间: 2012-1-29 10:28


求教各位高手；
我的实验分3组，对照：加培养基dmem，刺激组：再加生长因子，干预组：再加干预药物。想用流式细胞仪看各期细胞的%数。用6孔板做，行吗？每组1个孔，行吗？怎样统计分析啊？
辛苦各位
作者: ending    时间: 2012-1-29 10:28


各位前辈，有没有人做过舌苔脱落细胞的流式细胞仪实验？
作者: pengke1983    时间: 2012-1-29 10:28

第一次做流式,惨败,着急万分，真诚求救!
我用小鼠CD14标记小鼠脾细胞悬液中的单核巨噬细胞,想看看巨噬细胞表面CD86的表达.
1,用载玻片将脾脏磨成细胞悬液
2,淋巴细胞分离液分离单个核细胞
3,置24孔板,经药物培养刺激
4,重悬收集细胞,洗涤
5,调整细胞浓度10 6次方,每管加入细胞5*10 5次方
6,阳性管加入FITC-CD14和PE-CD86,阴性对照管加入FITC-CD14和PE ISOTYPE各5ul
7,避光20min,上机检测
本是想用CD14设门,看CD14阳性细胞中的CD86的表达率和平均荧光强度,
可是结果根本不能分出明显一群CD14阳性细胞,后面根本无从着手，请教各位老师、同仁，有没有做过类似的东西，CD14能不能作为巨噬细胞的特异标记，我该如何修改实验方法。谢谢!
作者: zhezhe    时间: 2012-1-29 10:30

请教各位高手：
本人打算做外周血单核细胞凋亡，特异性标记一直没见到相应文献，不知有没有那位高手了解相关知识。单个CD抗原可以吗？还是要多个组合？
作者: 一叶    时间: 2012-1-29 10:30

多聚甲醛的的固定相对温和，用1-4%左右的常用，一般固定至少10min，我有时用1%的多聚甲醛一直固定直到使用。
75%乙醇常用于细胞周期染色的固定，甲醇用的相对较少，我记得戊二醛也是固定剂，但详细的区别，我说不太清楚。
PI染色是用于细胞周期的分析，75%]的乙醇固定细胞后，通常置于4℃保存，固定的目的是在于细胞穿孔，PI进入细胞内对DNA进行染色，细胞周期的分析是根据各个期的细胞含DNA多少进行确定的。简单的说就是G2M期的DNA含量是G0G1期的两倍，而S期介于两者之间。由于RNA同样会被PI染色会干扰检测，所以要加入RNA酶以去除RNA。我认为不用复染是错误的 ，或者说是不准确的。
免疫荧光化学染色我两者都曾进行实验，感觉都可行，文献说soponin的固定穿孔作用相对温和，对抗原抗体的影响小，因而常用。

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一直固定到使用是指多长时间？
想请问我想做培养细胞内的HCV的FCM用如下方法是否可行？（参考自Endymion ）
弃去培养上清,1640 洗涤4～6次,0.25%胰蛋白酶消化部分细胞制成细胞悬液,以1000 离心5分钟, 细胞加入0.5ml 10%FCS-RPMI 1640培养基（含 100ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素，同时加入monensin）重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度。
将细胞分为3份，分为对照管（2管）和实验管（1管），
每管加入500ul固定液（4%多聚甲醛），室温放置20min，使细胞固定。洗涤2次；
每管加入100ul破膜液（0.1%皂角），室温放置10min，洗涤2次；
各加入HCV核心抗体10µl混匀。室温放置20min。洗涤3次；
实验管分别加入标记二抗5ul，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30min。洗涤两次。
以300µl洗涤液（DPBS）重悬细胞。流式细胞仪检测
作者: dotaaa    时间: 2012-1-29 10:31

再请问你指的冰浴，是不是在3，4，5步室温放置的时候冰浴？
作者: cj_mondy    时间: 2012-1-29 10:32


请教各位战友：我的下一步实验可能需要检测细胞周期，怕差异不明显，想做细胞同步化（膀胱肿瘤细胞）,可否介绍都有哪些同步化方法？
作者: owanaka    时间: 2012-1-29 10:32

各位大师：
最近我做了两次FCM检测细胞内抗原,但效果均不理想。想请教各位大侠，采用哪种操作程序较好?能否提供一种检测细胞内抗原十分有效的操作程序？检测的细胞为经过转基因的基质干细胞。谢谢。
作者: xingyi08    时间: 2012-1-29 10:33


我在对一种药物做实验分析，用记数法发现有抑制PBMC转化增殖的作用，我现在想用FACS做精确实验。我做的实验很简单，就是PBMC用PHA刺激后，加入药物会抑制转化增殖。我查了资料，BrdU和CFSE两种染色方法比较符合，请教两者分别如何做实验，还需要那些实验试剂，谢谢
作者: qhyu    时间: 2012-1-29 10:33


流式的结果除了百分比外，还有平均荧光强度，我看到的文献上一般都是用百分比进行比较的，有谁知道用平均荧光强度如何进行统计和比较吗？在一般的中文参考书上我都找不到。另外，如果样品与同型对照比百分比较高而平均荧光强度差不多的话，是否可以说是待检抗原在每个细胞上的表达强度较弱（deam）呢？
作者: yychen    时间: 2012-1-29 10:34

前两天我在做T细胞亚群的时候用FS V SS设门，淋巴细胞有两群CD3表达有两群，一群有6%左右、CD19有90%左右；另一群CD3表达有65%左右CD19有8%改用CD45VSS设门结果类似，血涂片淋巴细胞一群，偶见异淋，病人76岁，血Rt WBC：11.1*10^9/L，口腔科门诊就诊，余病史不详，各位能予以解释吗？谢谢!
作者: chuntian1983    时间: 2012-1-29 10:35

我下载了流式细胞术的PPT，但是解压不了。
另外，我在做造血干细胞的流式细胞检测，测CD34+细胞时，常规设门的数值是多少？
作者: whitesheep    时间: 2012-1-29 10:36

检测胞浆内的抗原，我是用的CALTAG 公司的FIX&PERM CELL PERMEABILIZATION KIT使用效果不错的。
作者: eric930    时间: 2012-1-29 10:36


请问高手，如果我查不到关于我所做的上皮细胞的某种膜蛋白作流式的相关文献（国内外均无），但可查到其它细胞上的此种膜蛋白作流式的相关文献，如内皮细胞上（是国外的一篇文献，且实验步骤不清楚），且此种膜蛋白在上皮细胞与内皮细胞上的表达均为强阳性，我是否能做关于上皮细胞的流式呢？是不是得要自己摸条件，制备细胞悬液？是不是会很麻烦？由于我是个新手，还要做细胞培养，搞的现在头很大，怕毕业课题拖的时间过长，毕不了业。
作者: zwsyrt    时间: 2012-1-29 10:36

各位老师，我想请教一个问题。现在我正在做免疫荧光抗体标记检测阳性细胞的细胞周期，不想实验当中遇到了大麻烦。当我用70%乙醇固定后，二抗标记的荧光根本不可见了，因此无法进行实验。我也使用了多聚甲醛固定，显微镜下可见荧光不受影响，但是流式上机后却无法测细胞周期，分布图很难看！因此，想请各位不吝赐教！！！有何合适的替代方法？还有乙醇固定对细胞有何影响呢？谢谢！
作者: 二子    时间: 2012-1-29 10:38


我的是GFP质粒，转染细胞后可能会致细胞凋亡，我也想用流式细胞仪测凋亡，但有个问题请教各位神仙级高手：
一、我选PI染色，但是GFP可能会有干扰；
二、请问各位神仙有什么好的方法？我要一定用流式的话，应该怎么搞
作者: langlang    时间: 2012-1-29 10:38


请问 质粒本身带有绿色荧光标签时，转染COS7细胞后是否可用流式细胞仪检测转染效率，我已经在镜下看到荧光，为什么流式检测转染效率只有0.27%.能否告知详细的实验步骤，流式检测胞内荧光是否有特殊的要求？
作者: 白白的    时间: 2012-1-29 10:39


请问贴壁细胞可以做流式细胞仪分析吗，怎么做，96孔板可以吗
作者: yysr238    时间: 2012-1-29 10:40


请求帮助！！
我做的是细胞凋亡的周期变化。
请问：以下各表示什么意思？
Mean G1 Mean G2
CV G1 CV G2
% G1 % G2
% TOt
Chi Sq

Mean
CV
%Tot
D.I
Chi Sq
cell No
以上符号有没有表示凋亡率的？图已发出，望大家帮忙分析，谢谢！

图片附件: 53477449.snap.jpg (2012-1-29 10:40, 26.48 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10333

作者: 生物迷    时间: 2012-1-29 10:42

各位高手：请教
本人想采用流式细胞仪检测精子的一些指标
参阅文献：使用Denovo software (DNS) 软件

计算每个精子的αt = 红荧光/ (红荧光+ 绿荧光) 即
每个精子发出的红荧光占总荧光的分数,结果以αt
分布的平均值(Xαt ) 和标准偏差(SDαt ) 表示,主群以
外的细胞百分数即变性精子的百分数用COMPαt 表
示。

原理没问题，但对仪器了解不多
请问一般流式细胞仪配备什么软件对实验结果进行处理
能否提供使用Denovo software (DNS) 软件的信息
感谢了
作者: lixi559    时间: 2012-1-29 10:42

小弟以前没有做过流式。想向各位高人指点一下这个方面。
现在我在做干细胞分化，分化过程要3个多星期，我想在细胞分化过程中，用荧光抗体标记检测一下，不要固定杀死细胞，只是用荧光显微镜观察，然后接着培养。我不知道能否象用细胞流失筛选。

另外一个问题，抗体能否加在media里面？
谢谢！
作者: fqswdzd    时间: 2012-1-29 10:43


我想检测活细胞内的DNA周期变化，我用Hochest33342染色，可是原来检测的流式细胞仪坏了，不能激发351－360nm的荧光，请问您知道还可以标记活细胞DNA的其他染料吗，另外，在北京那里的流式细胞仪可以352，488nm双激发？谢谢！
作者: tieshazhang    时间: 2012-1-29 10:43

有网友在用美国BIO-RAD公司的BRYTE HS型号的流式吗？
它可以收集细胞么？
它的一些配套设备在国内有代理么？
国内有公司在做这机子的技术支持么？
作者: BUK    时间: 2012-1-29 10:43

想好好学习一下流式分析的方法，以前总是将样品做好后就送去由实验员上机，对结果中出现的问题总是云里雾里，想弄个究竟却无处下手，问实验员也问不出个所以然。
终于在园子里看到可以免费使用WI***I来自己进行结果分析，兴奋不已，终于找到可以自己学习的机会了！
可是下载安装后还是觉得不知怎样使用？
能否请前辈们指点一下？有没有WI***I的使用教程，要是高手能费神做个有图解的教程就更好了（这个要求有点过分了）！
相信需要这个教程的不止我一个，请各位帮帮我们这些渴望学习的人吧！

先谢谢各位了！
作者: BUK    时间: 2012-1-29 10:44


还有问题要请教一下：
我在chujun_hust兄提供的（多谢了！）cellquest使用说明上看到在调节FSC/SSC电压及FSC阈值时，有下面几个图：
1。FSC放大增益不足

图片附件: 67370558.jpg (2012-1-29 10:44, 40.21 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10334

作者: BUK    时间: 2012-1-29 10:44


2。FSC增益太高

图片附件: 26874215.jpg (2012-1-29 10:44, 41.74 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10335

作者: BUK    时间: 2012-1-29 10:45

3。SSC电压太低

图片附件: 75188051.jpg (2012-1-29 10:45, 43.47 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10336

作者: BUK    时间: 2012-1-29 10:45


4。理想

图片附件: 32608983.jpg (2012-1-29 10:45, 42.86 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10337

作者: BUK    时间: 2012-1-29 10:46


我不太明白如何来判断是否理想，应以什么标准来判断呢？
是不是要让细胞群尽量散开，而有不会象图2那样飘离出去呢？

外行人说外行话，各位不要见笑！
作者: TAT    时间: 2012-1-29 10:46


求教：请问有人做过放血法造模的血虚症或贫血模型，然后去骨髓检测CD34？我的结果为什么CD34阳性率非常低零点几？
作者: mickeylin    时间: 2012-1-29 10:47

各位：我准备测小鼠血中的T细胞亚群，看了不少文献，还是没多少概念！（这方面接触太少），究竟要买单标或双标或三标的抗体？用量要多少？看文献好多公司都有抗体出售，究竟哪些公司的便宜点？（自己的口袋不涨，郁闷！），国产的有吗？
作者: redbutterfly    时间: 2012-1-29 10:48


目前需要用流式细胞仪检测小鼠外周血中的嗜酸性粒细胞，如何操作，可否给予指点？
作者: 101010    时间: 2012-1-29 10:48

近一个月来我用FITC-AnnexinⅤ以及PI进行培养的细胞（胰岛细胞瘤细胞系，RIN-m）凋亡检查。但做了7、8个六孔板的标本，始终都有结果不稳定的问题。孔与孔之间细胞生长情况基本相同，同样的处理条件，同批检测，但凋亡率变化很大。以下我给出某次标本的FITC-AnnexinⅤ以及PI的检测结果：

标本号   1   2   3   4   5   6
FITC-Annexin 1.6/5.5 5.0/14.0  3.3/15.1  3.9/21.0  3.9/23.3  7.2/15.0
PI   1.1   12.3   24.3  16.3   16.1   12.3
*FITC结果以 坏死/凋亡 表示；其中3与4号、5与6号的处理因素相同，但凋亡率结果相差很大。

请指点造成这种差异的原因以及减少差异的方法。谢谢！
作者: qumm1985    时间: 2012-1-29 10:49

请教老师，流式细胞仪检测人外周血CD3、CD4、CD8计数，并检测CD4、CD8各自的凋亡比例（老板说最好是TUNEL法），该选择哪些标记抗体比较理想？因涉及四种荧光的选择，比较困惑，急用，多谢。
作者: 04906    时间: 2012-1-29 10:49

我是一个新手，目前正准备做有关流式检测细胞凋亡的方法——亚“G1”峰检测法。请问具体的步骤是怎样的？
作者: 了了    时间: 2012-1-29 10:50

请问哪位同仁用流氏细胞术测定细胞内钙离子？实验过程中应注意什么问题？另外，实验因素作用于细胞的时间应该是多长？
作者: vera+    时间: 2012-1-29 10:50

请问哪位同仁用流氏细胞术测定细胞内钙离子？实验过程中应注意什么问题？另外，实验因素作用于细胞的时间应该是多长？
作者: glass    时间: 2012-1-29 10:51

我最近要做 ICAM-1 的表达，使用的是PE抗-CD54作标记。我想请问一下，对于膜表面表达的分子进行流式细胞仪检测时，如果标本不能马上送检，细胞是否需要固定，如何固定，是在标记前固定还是标记后固定（我查资料：一般仅提到对于细胞内物质的检测必须在标记前先固定，而膜表面分子的检测其细胞标记到底是在固定前还是固定后则很少提到）。
作者: kewanqi2011    时间: 2012-1-29 10:51


我们实验室最近要购进一台流式细胞仪，希望各位大侠给点建议！那个公司的比较好用，型号，配置以及价格。先谢谢各位了！对了，我们实验室主要做分化与凋亡。
作者: jujuba    时间: 2012-1-29 10:52

你好，我买了Annexin-V试剂盒检测中性粒细胞的凋亡，说明书上说在标记后1小时内上机，由于我检测的时间点较多，有的时间点不方便上机，我想知道能不能把标本固定一段时间,如果能，请问怎么固定？
还有我要检细胞CD11b的表达，也是买的上流式的试剂盒，请问在一个小时内上机还有没有必要用1％的多聚甲醛固定呢？
上面两个问题请尽快给我解答，急！谢谢！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 10:52

Basic Protocol: Use of Indo-1 and Flow Cytometry to Measure Cellular Calcium Concentration

In this protocol, intracellular ionized calcium concentration ([Ca2+]i) is measured using indo-1 dye and ratiometric analysis. Most commercially available flow cytometers can be used to perform this assay, provided the instrument is capable of UV illumination; however, note that the Becton Dickinson FACScan and Coulter Profile and XL cannot be used. In addition, on many instruments, cells may be electronically sorted based on a particular calcium response; the sorted cells can be cultured for later analysis. The protocol can be divided into three stages: preparation of cells to be analyzed, setup of the flow cytometer, and data analysis and display (UNITS 10.3–10.6). The protocol requires expertise in basic flow cytometric techniques.

Materials

Murine splenic lymphocytes or human peripheral blood lymphocytes (UNIT 5.1)

Cell loading medium (see recipe)

100 mM probenecid (see recipe)

2 mg/ml indo-1 pentaacetoxymethyl ester (indo-1; see recipe)

1 mg/ml ionomycin (see recipe)

Dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma) or 10% (v/v) bleach in water

Saline (0.85% [(w/v)] NaCl) or PBS (APPENDIX 2A)

12 × 75–mm polypropylene tubes (Falcon)

Beckman TJ-6 rotor (or equivalent)

30° or 37°C water bath

Flow cytometer with UV light source and heated sample chamber (e.g., Becton Dickinson, Coulter, or Ortho), and software for kinetic and ratiometric analysis (Phoenix Flow Systems)

Load cells with indo-1
1. Collect lymphocytes in 12 × 75–mm polypropylene tubes and centrifuge 6 min at 180 × g (950 rpm in Beckman TJ-6), room temperature. Resuspend pellet in cell loading medium at 106 to 107 cells/ml.

Use murine splenic lymphocytes or human peripheral blood lymphocytes in initial experiments because they are easily and reliably loaded. Later, when the other aspects of the technique have been validated on the flow cytometer, both adherent and nonadherent cells can be analyzed.

Use polypropylene tubes to minimize loss of cells.

2. Optional: Add 100 mM probenecid (4 mM final).

Probenecid may improve cellular loading by minimizing leakage of indo-1 and cell-to-cell variation in dye content; sulfinpyrazone will also work (see Critical Parameters and Troubleshooting section on cellular response).

3. Add 2 mg/ml indo-1 to 2 µg/ml final. Incubate 30 min at 30° or 37°C.

The cells are loaded with the membrane-permeant form (pentaacetoxymethyl ester) of indo-1 (indo-1). Cellular esterases cleave the AM moiety, resulting in the trapping of the highly charged indo-1 in the cells. Typically, ~20% of the dye becomes trapped and concentrated within the cell.

Optimal conditions for loading must be empirically determined for each cell type. Rates of loading of indo-1 vary between cell types, especially as a consequence of variations in intracellular esterase activity. More rapid loading rates are seen in platelets and monocytes than in lymphocytes, and in growing cell lines rather than resting cells. More uniform loading is often observed if pluronic F-127 is included together with indo-1 (see Alternate Protocol 3). In addition, incubation at 30°C can aid loading of cells that tend to compartmentalize the dye.

An optional step is to stain an aliquot of indo-1-loaded cells for simultaneous immunofluorescence analysis (UNIT 6.2). This is done by treating the cells with saturating amounts of azide-free FITC- or phycoerythrin (PE)-conjugated antibody—as determined by titration experiments (UNIT 4.1) or by manufacturer's recommendations—and incubating 20 min at 22°C. Incubation may be done at 4°C to minimize antigen modulation, but after chilling, cells may require an extended equilibration time at 37°C to return to physiologic functioning for the calcium assay. In cases where antigen modulation is a problem, PE-conjugated antibodies are preferred, because unlike FITC, PE can still be detected after cellular internalization.

4. Centrifuge cells 6 min at 180 × g, room temperature. Gently resuspend (do not vortex) cells in cell loading medium at the desired cell concentration (~3 × 106 cells/ml). Store cells at room temperature and protect from light until analysis.

Leakage and compartmentalization of indo-1 is accelerated if cells are stored at 37°C.

It is often preferable to let cells rest for ~15 min before starting analysis. This presumably allows complete conversion of the calcium-insensitive form of indo-1 ester into the calcium-sensitive (charged) form of indo-1 and enhances cell uptake of additional equilibrating calcium to compensate for indo-1-bound calcium.


Set up the flow cytometer
5. Set up and adjust flow cytometer. Use a violet bandpass filter centered at 395 ± 10 nm and a blue bandpass filter centered at 500 ± 15 nm or a green bandpass filter centered at 525 ± 15 nm (see Critical Parameters and Troubleshooting).
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 10:53

6. Set light scatter gates and optimize photomultiplier tube gain settings by placing the mean blue fluorescence in the upper half of the histogram channels and the violet fluorescence in the lower half of the histogram channels. Use linear rather than logarithmic amplification, and gate out dead cells with light scatter and violet fluorescence windows (see Critical Parameters and Troubleshooting).

For kinetic experiments such as this, the cytometer should be able to display time as a parameter. Violet and blue fluorescence can be plotted versus time; however, the violet/blue indo-1 ratio is optimally observed by allowing the cytometer to calculate this ratio, which can then be plotted as a function of time (see Anticipated Results and Figure 9.8.2).

Figure 9.8.2 Effects of T cell receptor stimulation on CD4 cell ionized calcium concentration ([Ca2+]i). Peripheral blood lymphocytes were loaded with indo-1 AM and stained with PE-anti-CD8. The cells were maintained at 37°C; after obtaining a baseline for ~1 min, anti-CD3 MAb was added during the gap in analysis. (A) The indo-1 ratio of 395 nm/500 nm fluorescence emission was calculated and the value for each cell displayed on the y axis versus time on the x axis. The results are displayed as a dot plot on a 100 × 100 pixel grid, where the number of cells per pixel is represented by increasing shades of gray. Changes in [Ca2+]i in the CD4 subset of T cells are depicted by setting electronic gates on the indo-1 fluorescence derived from the PE-negative cells. ( The mean response of the data from panel A plotted versus time.
[Full View]


7. Check instrument setup and cellular loading by treating ~1 × 105 cells (in cell loading medium) with 1 mg/ml ionomycin at 1 to 2 µg/ml final. An immediate response in 100% of cells should occur. Carefully remove any ionomycin that may adhere to the tubing by flushing the lines 1 min with DMSO or 10% bleach, then 1 min with cell loading medium.

It is critical that each experiment include a determination of R, the ratio of violet/blue fluorescence of resting cells, and Rmax, the ratio of violet/blue fluorescence of cells after stimulation by the calcium-ionophore ionomycin. If the instrument is properly aligned and the cells loaded adequately, the ratio of Rmax to R is 6:9 and >99% of the cells respond (see Critical Parameters and Troubleshooting). Use fluorescence microscopy to verify quality of indo-1 loading; compartmentalization of indo-1 is indicated by the presence of punctate dots of fluorescence.

8. To calibrate the indo-1 fluorescence ratio to the concentration of ionized calcium ([Ca2+]i), suspend cells in a series of calcium/EGTA buffers and ionomycin (see Support Protocol for details).



Analyze indo-1-loaded cells
9. Warm an aliquot of indo-1-loaded cells 5 to 10 min at 37°C before analysis. Use ~5 × 105 cells per 10-min assay.


10. Analyze cells at 37°C in cell loading medium. Use saline or PBS for the sheath fluid.

The rate of cell analysis can vary. Commonly, cells are analyzed at 200 to 300 cells/sec. A higher flow rate may be required when sorting cells or when analyzing a rare event, such as a calcium signal in a small subset of cells identified by monoclonal antibody staining (see Critical Parameters and Troubleshooting).

11. Optional (for instruments with dual-beam illumination): Set regions for simultaneous immunofluorescence analysis.

Combining the use of FITC and PE with indo-1 analysis allows determination of [Ca2+]i in complex immunophenotypic subsets. Limiting the analysis of indo-1 fluorescence to windows of FITC versus PE fluorescence allows information relating to each identifiable cellular subset to be derived from a single sample. On instruments without provision for analysis of four separate fluorescence wavelengths, both the FITC signal and the signal from calcium-free indo-1 can be detected with the same filter element. Note that the FITC signal must be delayed from the long-wavelength indo-1 signal derived from the UV laser.

12. If desired, sort cells on the basis of [Ca2+]i responses.

Sorting on the basis of indo-1 fluorescence can be an important tool for selection and identification of genetic variants in biochemical pathways leading to Ca2+ mobilization and cell growth and differentiation (see Background Information).

copied from CP.if any additional needs arise please let me know and i'll try my best
作者: bohe221    时间: 2012-1-29 10:54


请教高手：
1、流式细胞仪如何确定某种蛋白在细胞膜表面表达？
2、 流式细胞仪如何检测单抗？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 10:54

here is a basic protocol for determination of membrane antigenic protein,hope it do some good for you purpose.

Basic Protocol: Quantitative Determination of Cell Surface Antigens by Indirect Immunofluorescence Assay Using Qifikit Calibrator Beads

In this procedure, the cell specimen is labeled with a saturating concentration of either a primary mouse monoclonal antibody (MAb) directed against the antigen of interest or an irrelevant mouse monoclonal antibody (control). Saturation conditions are determined through titration experiments for each MAb investigated, using a fluorescein-conjugated anti-mouse secondary antibody. The primary antibody may be of any mouse IgG isotype. Under these conditions, the number of bound primary antibody molecules corresponds to the number of antigenic sites present on the cell surface.

Next, the cell specimen and the setup and calibration beads of the kit are labeled in parallel with a fluorescein-conjugated anti-mouse secondary antibody. The secondary antibody is also used at saturating concentrations. Consequently, fluorescence is correlated with the number of bound primary antibody molecules on the cells and/or the beads. Finally, thanks to the saturating conditions of both primary and secondary antibodies, the amount of fluorescence obtained directly correlates to the number of antigenic sites present on the cell surface. In other words, the cell specimen is analyzed on the flow cytometer and the ABC calculated by interpolation of the calibration curve.

Two types of beads are used in this protocol. Setup beads are a mixture of blank and high-level fluorescence beads. Autofluorescence of the beads may be different from that of the cells under analysis; therefore, it might be necessary to adjust the voltage of the fluorescence detector (PMT) to assure that both negative cells and the two populations of beads are displayed simultaneously on the fluorescence scale. Thus, the setup beads are used to establish the fluorescence windows of analysis of the flow cytometer.

Calibration beads are a mixture of different beads with well known numbers of antibody-binding sites per bead; fluorescence data corresponding to each of the five bead peaks are used for construction of the calibration curve of mean fluorescence intensity (MFI) against antibody-binding capacity (ABC).

Materials

Cell suspension: whole blood, cell lines, or isolated cells

Unconjugated primary antibody: mouse monoclonal IgG antibody specific for the cell surface antigen under evaluation

Unconjugated negative control antibody: irrelevant mouse monoclonal antibody of the same isotype as the unconjugated primary antibody

PBS/BSA/azide: PBS (APPENDIX 2A) with 0.5% (w/v) BSA and 0.1% (w/v) NaN3

QIFIKIT (Dako):

Setup beads

Calibration beads

F(ab¢ 2 fragment of FITC-conjugated goat anti-mouse (GAM) IgG
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 10:55

PBS/BSA: 1× PBS with 0.5% BSA

1× ammonium chloride lysing solution (APPENDIX 2A) or equivalent (for whole blood only)

1% paraformaldehyde in 1× PBS

PBS/azide: 1× PBS with 0.1% (w/v) NaN3

Computer with spreadsheet software (e.g., MS Excel)

TallyCAL software for Windows: dedicated software for automatic calculation of antigen density (optional)

Label cells with primary antibody
1. For each antigen to be tested, prepare two 12 × 75–mm test tubes labeled MAb Specificity and Isotype, respectively. Add 100 µl cell suspension to each tube.

If more than one cell surface antigen is to be determined using MAb of the same isotype and concentration, only a single isotype control tube will be necessary.

2. Add 10 µl unconjugated primary antibody to the sample in the MAb Specificity tube.


3. Add 10 µl unconjugated negative control antibody, adjusted to the same concentration as the primary antibody, to the sample in the Isotype (control) tube.


4. Incubate 30 to 60 min at 4°C.

Incubation time and temperature may depend upon the titration conditions used for staining with the specific monoclonal antibody reagent.

5. Add 3 ml PBS/BSA/azide to each tube. Vortex gently to mix.


6. Centrifuge 5 min at 300 × g, room temperature. Remove supernatant, leaving ~50 µl fluid in each tube.


7. Repeat steps 5 and 6.



Label QIFIKIT beads
8. Prepare two test tubes labeled Setup and Cal.


9. Add 100 µl of a homogeneous suspension of setup beads to the Setup tube.

Setup beads are a mixture of two different populations of beads: blank beads and beads with high numbers of monoclonal antibody molecules attached to each bead.

10. Add 100 µl of a homogeneous suspension of calibration beads to the Cal tube.

Calibration beads are a mixture of five different populations of beads, each population bearing different numbers of monoclonal antibody molecules. Lot-specific information for each population on the exact mean number of monoclonal antibody molecules attached per bead is included with each kit.

11. Add 3 ml PBS/BSA to each tube. Vortex gently to mix.


12. Centrifuge 5 min at 300 × g, room temperature. Remove supernatant, leaving ~50 µl fluid in each tube.

From this point on, the same procedure should be followed for both beads and cells.


Stain with secondary antibody to detect antibody binding
13. Dilute an appropriate volume of FITC-conjugated of F(ab¢ 2 fragment goat anti-mouse (GAM) IgG (secondary antibody) 1:50 in 1× PBS. Vortex gently to mix.

Each tube to be analyzed will require 100 µl secondary antibody.

14. To each tube, add 100 µl diluted FITC-conjugated secondary antibody.
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 10:55

15. Incubate 45 min at 4°C in the dark.


16. If the sample is whole blood, lyse erythrocytes by adding 1× ammonium chloride lysing solution to the tube. Incubate 10 min in the dark at room temperature.

Alternatively, reagents are commercially available for manual erythrocyte lysis. Follow instructions provided with the reagents.

17. Centrifuge 5 min at 300 × g, room temperature. Remove supernatant, leaving ~50 µl fluid in each tube.



If fixation is not required
18a. Add 3 ml PBS/BSA/azide to each tube. Vortex gently to mix.


19a. Centrifuge 5 min at 300 × g, room temperature.


20a. Remove supernatant, leaving ~50 µl fluid in each tube.


21a. Repeat steps 18a to 20a.


22a. Resuspend the pellet in 500 µl PBS/BSA/azide.


23a. Store tubes in the dark at 4°C no more than 2 hr before analyzing on a flow cytometer.



If fixation is required
18b. Add 3 ml PBS-azide to each tube. Vortex gently to mix.


19b. Centrifuge 5 min at 300 × g, room temperature. Remove supernatant, leaving ~50 µl fluid in each tube.


20b. Repeat steps 18b and 19b.


21b. Resuspend pellet in 500 µl of 1% paraformaldehyde in 1× PBS and incubate 2 hr at room temperature or overnight at 4°C. Add 3 ml PBS/azide to each tube and vortex gently to mix.


22b. Centrifuge 5 min at 300 × g, room temperature. Remove supernatant, leaving ~50 µl fluid in each tube. Resuspend the pellet in 500 µl PBS/azide.


23b. Store tubes up to 5 days in the dark at 4°C until analyzed on a flow cytometer.

It is recommended to check the stability of each of the studied parameters after storage.


Acquire flow cytometry data
24. Create an acquisition document containing one bivariate histogram of forward scatter (FS) versus side scatter (SS) in linear mode and one FITC fluorescence histogram in log mode.


25. Position FS and SS windows of analysis according to standard procedures, allowing a clear gating of the population of bead singlets.


26. Run the Setup tube and gate on the population of bead singlets on the FS/SS plot, collecting at least 10,000 total events or at least 5,000 gated events (Fig. 6.12.1A).

Figure 6.12.1 (A) Gate around the singlet population of setup beads. ( Corresponding FITC-associated histogram showing both lower- and higher-intensity populations simultaneously. (C) Gate around the singlet population of the calibration beads. (D) Corresponding FITC-associated fluorescence histogram showing the five bead populations. Note that histogram statistics, including geometric means, are displayed. (E) Gate around the cell population of interest. (F) Corresponding histogram plot of FITC-associated fluorescence. Histogram statistics are again displayed.
[Full View]
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 10:55

27. Use a histogram plot to show the FITC-associated fluorescence of the population of bead singlets gated from the FS versus SS dot plot (Fig. 6.12.1.


28. Adjust the voltage of the FITC fluorescence detector to assure that both negative cells and the higher- and lower-intensity populations of setup beads are all displayed simultaneously on the FITC-associated histogram (Fig. 6.12.1. Keep instrument settings constant for subsequent measurements of calibrator beads and cells.


29. Run the Cal tube and gate on the population of bead singlets on the FS/SS plot, collecting at least 10,000 total events or at least 5,000 gated events (Fig. 6.12.1C).


30. Analyze FITC-associated fluorescence for the population of singlet beads using a histogram plot. Adjust markers around the five bead peaks (Fig. 6.12.1D). Show histogram statistics, making sure that geometric means are displayed.


31. Analyze MAb Specificity and Isotype tubes containing the cells. For cell acquisition, adjust FS and SS windows to clearly display the cells of interest (Fig. 6.12.1E).


32. Analyze the FITC fluorescence for the cell population of interest using a histogram plot. Adjust markers around the positive and/or the negative cell population peaks (Fig. 6.12.1F). Show histogram statistics, making sure that geometric means are displayed.



Construct the calibration curve
33. View the histogram statistics of the Cal tube.

Either MFI arbitrary units or channel numbers are useful.

34. On a computer with spreadsheet software, enter either the MFI or the channel numbers as the dependent variable y.


35. Enter the lot-specific values for the ABC molecules for each of the five bead peaks as the independent variable x.


36. If MFI is used, calculate log10 for the FITC-associated MFI values and log10 for the ABC levels per bead.


37. Calculate and plot the linear regression line of log10 ABC per bead against log10 MFI or against channel numbers, using the equation y = mx + c, where y equals log10 MFI or channel numbers and x equals log10 ABC per bead.



Calculate the ABC of the cell population under analysis
38. To determine an unknown ABC for a given cell population, introduce the log10 FITC MFI or channel number obtained for those specific cells as y in the linear regression equation and derive the log ABC value. Calculate the anti-log of the value obtained to get the ABC value.
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 10:56

39. Optional. If necessary, correct the ABC of the cell population under analysis for the ABC obtained with the isotype control on the blank bead tube by subtracting the ABC of the Isotype from that of the MAb Specificity tube.

The ABC of the Isotype is generally negligible, but in case of low antigen densities it might be significant and therefore should be subtracted from the ABC value obtained for the MAb Specificity tube.

ABC values rather than raw values are subtracted because log-transformed data cannot be subtracted directly.
作者: utt0989    时间: 2012-1-29 10:56


用于检测细胞凋亡的流式:用RNA酶还是用RNA酶A?
作者: utt0989    时间: 2012-1-29 10:57


请教用于检测细胞凋亡的流式:
1. 用RNA酶还是用RNA酶A ?
2.用70%的酒精固定,是放在-20°C 还是放在4°C 里,时间是多长?
2.用1ml的DNA抽提液,室温静置多长时间? 5分钟还是20分钟?
作者: Ao7    时间: 2012-1-29 10:57


向各位高手请教：
用PI染色时，活细胞也着色了，取的新鲜的脾脏细胞，终浓度是10微克/毫升，还是细胞只能固定后才能用PI染色？
非常感谢！
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-29 10:58


Annexin-V试剂盒有没有便宜点的，我想用Annexin-V和PI染色后流式分析

有老师知道好的技术请指点

多谢拉!
作者: duoduo    时间: 2012-1-29 10:59

我想可能就是让所有的信号都出来吧，前两个图的信号没有完全出现。
作者: yes4    时间: 2012-1-29 10:59

我不太明白如何来判断是否理想，应以什么标准来判断呢？
是不是要让细胞群尽量散开，而有不会象图2那样飘离出去呢？

外行人说外行话，各位不要见笑！

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我不太明白医学上的一些东西
我做的是流式应用于微生物的一些东西
结果理想可能有一下条件（只是我的经验）：1、目标细胞群应在图中，这一点是肯定的；2、让个细胞类群尽量分离开来，至少要让你的目标细胞群与别的细胞群分离开来；3、目标细胞群最好聚成一团。其实大多数流式因为零分辨率仪器，作出来的图形需要根据经验来判断，得出来的数据需要获得别人的认同才行，所以最好在调节是在图形底部留一点噪音。

^_^ 以上是个人见解。
作者: is2011    时间: 2012-1-29 11:00

我想作流式检测肿瘤细胞凋亡率及周期分布，想请教一下选择哪种类型凋亡试剂盒效果比较好？选择双染还是单染？检测早期凋亡还是晚期凋亡？我知道BD的流式试剂盒很有名（好多种，不知从何选择），还有其他的吗？没做过流式，新手上路，请多指教：
作者: 兔唇    时间: 2012-1-29 11:01

我想用流式细胞术检测凋亡基因的表达，有哪位大虾告诉我详细的操作步骤，谢谢！
作者: 2541    时间: 2012-1-29 11:02



1.流式检测蛋白表达方面出结果的时间大大加快......
2.流式可以检测在胞浆中表达的蛋白，试剂选择正确--如型号、种属等；机器设置好，设好合理的代偿；敏感性较好。
3.注意
温度对融血效果有影响，减少反复冻融。
试剂平时保存在4度
某些单克隆抗体会与红细胞反应 -凝集
固定方法各有不同，直接影响效果。
也可归纳为4个方面：project (如结果的鉴定--阳性细胞)
sample fresh
mAB storage(避光)
FACS maintain
更深入探讨或求教 美国BD-PharMingen公司陈璋教授--世界著名流式专家
北京：010-65520121；65520084
上海：020-64664434；64158521
作者: 831226    时间: 2012-1-29 11:02

我对流式刚开始认识，以前的感觉是它在细胞调亡的检测方面很方便，不知道它在细胞表面受体的表达以及配体和受体的结合率方面的检测是不是也很方便，是否需要特殊的试剂或者说有一定的条件，请高手指点！多谢！我的问题也许很外行，见谅！
作者: dotaaa    时间: 2012-1-29 11:03


求助：流式细胞术检测小鼠Th细胞亚群
我第一次做流式，结果不好，请高手指点！多谢！
取脾细胞的单个核细胞数量可（大于10的6次方），细胞外染色也可（T细胞的量有70%）。但是细胞内染色较差。抗鼠IL-4-FITC, IFN-γ- FITC染色后，细胞数量较少，抗鼠IL-4-FITC染色细胞约0.2-0.7%，而抗鼠IFN-γ- FITC染色细胞约0.6-1.9%。怀疑是刺激不足，故昨日用2只脾细胞悬液混匀后，分离单个核细胞，分为 3组。
1）10%1640（含 25ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素，同时加入monensin）
2）10%1640（含 100ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素，同时加入 monensin）
3）10%1640（含 500ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素，同时加入monensin）
加入6孔细胞培养板，37 ℃ CO2孵箱刺激12h后，后操作如下。
结果：
1）抗鼠IL-4-FITC染色细胞：0.5%
抗鼠IFN-γ- FITC染色细胞：0.8%
2）抗鼠IL-4-FITC染色细胞：0.7%
抗鼠IFN-γ- FITC染色细胞：1.1%
3）抗鼠IL-4-FITC染色细胞：1.4%
抗鼠IFN-γ- FITC染色细胞：1.9%
材料与方法
试剂
1.抗体
细胞表面标记抗体: 抗小鼠 CD3-TC 抗小鼠CD8-PE
细胞内因子抗体：抗鼠IL-4-FITC , IFN-γ-FITC 。
以上抗体购自EB。
PMA（ALEKS）
Ionomycin（ALEKS）
Monensin(E:用时1000倍稀释。
实验方法
1. 单个核细胞的分离：取1只C57BL小鼠脾，制成脾细胞悬液。在试管内加入小鼠淋巴细胞分离液2ml。将脾细胞悬液4ml，轻轻加入淋巴细胞分离液上层。600g离心15min。取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞，加入Hanks液3ml，混匀后，300g离心5min。弃去上清，
2.细胞加入3ml 10%FCS-RPMI 1640培养基（含 100ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素，同时加入monensin）重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度。37 ℃ CO2孵箱刺激12h后，收集细胞，洗涤1次。
3. 加入CD8-PE 10µl和CD3-TC 10µl(1µg)，混匀。室温放置20min。洗涤1次
4. 加入500ul固定液（2%多聚甲醛），室温放置30min，使细胞固定。洗涤2次。
5. 每管加入100ul破膜液（1%皂角），室温放置15min，洗涤1次。
6. 将细胞分为3份，分为对照管（2管）和实验管（1管)。实验管分别加入IFN-γ-FITC、IL-4 - FITC各20ul（0.5µg），对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30min。洗涤1次。
7．以500µl洗涤液（PBS）重悬细胞。流式细胞仪检测。
作者: redbutterfly    时间: 2012-1-29 11:05


本人妇产科医生，用本院FACSort机型分选孕妇外周血中的胎儿细胞，回收到细胞极少，不知如何改进。请高人指点，急，谢谢！
作者: redbutterfly    时间: 2012-1-29 11:06     标题: 回复 #1006 kent 的帖子

我们的流式平时做HLA-B27,工作状态挺稳定。不知ACCUDROP是什么
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 11:11

pi是针对核酸的染料。只有胞膜破损的细胞才有可能染色。pi对活细胞拒染。我只听说过固定后染pi！！

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补充一点的就是：PI是对固定后染色取决于你所想要的信息。如果你想对未固定的细胞进行死活鉴别，可用PI标记死细胞，而用FDA等标记活细胞；如果你只是想对细胞进行计数，可固定后加PI，此外你不妨看看一种较新的染料SYBYGreen－1的相关介绍。
作者: join    时间: 2012-1-29 11:12


请问各位大虾和同门兄弟：
配置好的PI染液在避光4度下可以保存多久？愚兄先谢了！
作者: 四福晋    时间: 2012-1-29 11:12

请问做intracellular cytokine staining 时 ，Isotype control 的阳性率一般在多少比较合适^_^ ^_^， 先谢谢了。
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-1-29 11:15


真的有人用这台机器做分选啊！
这台机器的分选速度是300个/sec,最新的机器好象是20000个/sec，你要是做分选还是找台大机器吧，如果是做无菌的大概也就一个地方可以去了，问BD公司的人。
作者: plaa    时间: 2012-1-29 11:30


间接法测某膜表面分子,加一抗二抗,上流式前,不用甲醛固定行吗?
标的上吗?
作者: yhz1973    时间: 2012-1-29 11:31


我要检测病人外周血淋巴细胞的CD4CD25 和CD3CD8，是不是要用同型阴性对照呢，那么我是每个病人都加对照，还是一批只要一对照设门就可呢，谢谢。还有假如我先把细胞液氮冻，复苏后再检测会有影响吗？
作者: yhz1973    时间: 2012-1-29 11:31

我想用流式做Ｃa离子，请教高手方法学．

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用流式做ca离子，我们实验室做过，是用对钙离子敏感的荧光探针（试剂公司有售)标记后，上流式检测就行啦！
作者: 薄荷侠    时间: 2012-1-29 11:33

向各位高手请教：
我分离人中性粒细胞，培养8小时后提取，然后4%多聚甲醛固定，PBS洗涤两次（1000r/min，离心10min）,为什么细胞会减少？然后我用0.1%的皂角素作用1min,离心细胞明显减少，结果上机检测不到细胞，怎么办呀，是否我配的固定液有问题，0.1%的皂角素作用时间够短了，怎么细胞还破呀！每次都要抽血，我着急不知怎么办，各位老师有何高见？
作者: jkobn    时间: 2012-1-29 11:33


用流式做ca离子,可以买荧光探针，现在比较多的是FLUO-3，不过这些燃料容易造成管道里的残留，污染机器
作者: jkobn    时间: 2012-1-29 11:34

实验样品制备操作手法也需注意，我经常见人离心后把细胞一起倒掉
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 11:34

向各位高手请教：
我分离人中性粒细胞，培养8小时后提取，然后4%多聚甲醛固定，PBS洗涤两次（1000r/min，离心10min）,为什么细胞会减少？然后我用0.1%的皂角素作用1min,离心细胞明显减少，结果上机检测不到细胞，怎么办呀，是否我配的固定液有问题，0.1%的皂角素作用时间够短了，怎么细胞还破呀！每次都要抽血，我着急不知怎么办，各位老师有何高见？

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呵呵，你查一查多聚甲醛的固定原理。在我理解中，多聚甲醛固定应该在医学上面应用很少，而且多聚甲醛固定本身就会造成细胞膜破损。为什么要固定后才离心呢，不可以先离心处理在固定吗？
作者: dog002    时间: 2012-1-29 11:35


请教各位大侠:
哪里有有关流式细胞仪的应用软件？可下载吗？
本人需要学习流式细胞仪的使用，但是科里的机器不可能让我随便试用。有关预值设置，门设置等均无法实际操作。加之操作系统和软件都是英文版本。痛苦之极。望各位大侠指条生路！最好可以安装到自己的电脑上，实际操作操作，有助于进步。
谢谢了。
附：科室为BD公司 BD FACSCalibur 流式细胞仪
作者: dotaaa    时间: 2012-1-29 11:35


我在一篇文献上看到，作者用PKH26（一种膜染料，好象和PE是同一个通道）对细胞进行染色后，再用PI染色，以区别死细胞，然后进行流式检测，测定PKH26阳性活细胞的百分比。

我不太明白，PKH26和PI不都是红荧光吗？流式怎么能把二者区别开呢？
作者: dotaaa    时间: 2012-1-29 11:35

向各位高手请教：
我分离人中性粒细胞，培养8小时后提取，然后4%多聚甲醛固定，PBS洗涤两次（1000r/min，离心10min）,为什么细胞会减少？然后我用0.1%的皂角素作用1min,离心细胞明显减少，结果上机检测不到细胞，怎么办呀，是否我配的固定液有问题，0.1%的皂角素作用时间够短了，怎么细胞还破呀！每次都要抽血，我着急不知怎么办，各位老师有何高见？

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就个人经验而言，经过固定和皂素处理后，细胞体积会明显增大，密度减轻，因此这时应适当增加离心的转速，才能减少细胞的丢失。
作者: fei1226com    时间: 2012-1-29 11:36


我是一个新手，准备用流式检测细胞的周期。直接检测和用brdu有什么不同。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 11:37

我在一篇文献上看到，作者用PKH26（一种膜染料，好象和PE是同一个通道）对细胞进行染色后，再用PI染色，以区别死细胞，然后进行流式检测，测定PKH26阳性活细胞的百分比。

我不太明白，PKH26和PI不都是红荧光吗？流式怎么能把二者区别开呢？

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没看过PKH26的具体资料，其实即使PKH26和PI都是红色荧光，但是红色荧光包含的是一个波长范围内的光，只要两种染料的荧光发射光谱重叠不是很厉害，从理论上说，是可以通过透镜的设置来实现。你可以看看这两种荧光染料的发射光谱。
作者: dotaaa    时间: 2012-1-29 11:37

PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm;
PKH26激发波长551nm,发射波长567nm.

二者的发射光谱好象还是有一定重叠的，不知透镜该如何设置？

图片附件: 34969195.jpg (2012-1-29 11:37, 30.67 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10338

作者: dotaaa    时间: 2012-1-29 11:40

我看到现在用于测定细胞活力的常用染料还有7-AAD，但我还没有用过，也没查到它的发射波长，不知有没有战友用过？能否简单介绍一下？先谢了！

用它与PKH26配合是否更好一点？
作者: 生物迷    时间: 2012-1-29 11:40

7-AAD可用FL1,同FITC
作者: 生物迷    时间: 2012-1-29 11:40

我看到现在用于测定细胞活力的常用染料还有7-AAD，但我还没有用过，也没查到它的发射波长，不知有没有战友用过？能否简单介绍一下？先谢了！

用它与PKH26配合是否更好一点？

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没用过，但是有这方的protocol。7-AAD可用488激发，发射为大于650nm。7－AAD的原理和PI相同，同为膜完整性探针。具有完整细胞膜的细胞（如活细胞、休眠细胞）能将染料排出所以不会染上色而不具有完整细胞膜的细胞（如死细胞）会染上色。PI染色后的细胞发亮红色（发射波长>590nm），很容易区分开死活细胞。但是7-AAD的荧光虽然不如PI亮，但是也容易区分死活细胞。而且与PI相比，发射波长更长（>650nm），因此可以和PE(~585nm)、FITC（～530nm）协同使用。
作者: 生物迷    时间: 2012-1-29 11:41

PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm;
PKH26激发波长551nm,发射波长567nm.

二者的发射光谱好象还是有一定重叠的，不知透镜该如何设置？

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呵呵，PI可以很容易利用488nm氩离子激光激发，激发波长覆盖很大的一个范围。可用检测PE（～585nm）或更长的波长（大于650）的PMT来检测。看了PKH26的光谱图，感觉利用488激光激发有点困难。你再仔细看看那篇文献，不知道他是单激光激发还是双激光激发。另外，你仔细对照一下PI和PKH26的荧光图，如果两者发射波长覆盖得很厉害，那就很难解决，如果不是很厉害，则可利用二向色镜和补偿设置搞定。呵呵，我这边一时找不到PI的荧光图。以上所说只是我的个人见解，不一定对。如果你要是有时间，可以多看看一些相关文献。
作者: dotaaa    时间: 2012-1-29 11:42

呵呵，PI可以很容易利用488nm氩离子激光激发，激发波长覆盖很大的一个范围。可用检测PE（～585nm）或更长的波长（大于650）的PMT来检测。看了PKH26的光谱图，感觉利用488激光激发有点困难。你再仔细看看那篇文献，不知道他是单激光激发还是双激光激发。另外，你仔细对照一下PI和PKH26的荧光图，如果两者发射波长覆盖得很厉害，那就很难解决，如果不是很厉害，则可利用二向色镜和补偿设置搞定。呵呵，我这边一时找不到PI的荧光图。以上所说只是我的个人见解，不一定对。如果你要是有时间，可以多看看一些相关文献。

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我仔细看了那篇文献，他对流式的检测说的很简略，没有说明是单激光激发还是双激光激发。顺便请教一下，我不太明白双激光激发是怎样的？是用两种波长的激发光同时激发吗？还是先后？一般的流式仪都能做吗？这方面很是外行，若问题太蠢，多担待！
只找到这样的一张图，看来PI和PKH26的发射波长确实重叠不少，这样是不是难以解决？

图片附件: 67752476.jpg (2012-1-29 11:42, 36.2 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10339

作者: dotaaa    时间: 2012-1-29 11:42

没用过，但是有这方的protocol。7-AAD可用488激发，发射为大于650nm。7－AAD的原理和PI相同，同为膜完整性探针。具有完整细胞膜的细胞（如活细胞、休眠细胞）能将染料排出所以不会染上色而不具有完整细胞膜的细胞（如死细胞）会染上色。PI染色后的细胞发亮红色（发射波长>590nm），很容易区分开死活细胞。但是7-AAD的荧光虽然不如PI亮，但是也容易区分死活细胞。而且与PI相比，发射波长更长（>650nm），因此可以和PE(~585nm)、FITC（～530nm）协同使用。

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从资料看来7-AAD与PKH26配合似乎是要理想一些。
大家的看法呢？
作者: dotaaa    时间: 2012-1-29 11:42

7-AAD可用FL1,同FITC

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你应该是用过7-AAD吧？不知是哪个公司的？价格如何？国内有没有哪家公司有现货？
作者: DNA    时间: 2012-1-29 11:46


我最近在做核内蛋白的FITC，4％甲醛室温30min后，Triton X100（0。5％）on ice for 5 min，离心后NP 40（0。5％） on ice for 5 min，总觉多一个步骤会使得细胞损失，不知道哪位可以告知有什么样的固定通透方式对核内的东西比较适用呢？先说声谢谢了！
作者: 吴才子    时间: 2012-1-29 11:48


我想观察一种ＦＣ受体阻断剂对ＩＧＧ和ＦＣ相互作用的阻断，可否用流式细胞术做？谢谢！１
作者: 大尾巴    时间: 2012-1-29 11:50     标题: 回复 #1037 吴才子 的帖子

可以.
1.用ＦＣ受体阻断剂和含ＦＣ受体的细胞孵育一定时间后与荧光标记的ＩＧＧ再孵育一定时间
2.直接拿含ＦＣ受体的细胞与荧光标记的ＩＧＧ孵育一定时间
然后上流式检测,比较上诉两种处理处理样本就可得出FC受体阻断剂的作用
作者: 大尾巴    时间: 2012-1-29 11:50

应该是用过7-AAD吧？不知是哪个公司的？价格如何？国内有没有哪家公司有现货？

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非也,7-AAD 488激发,在coulter机器上通常用FL-4接收发射光,再facscalibur上通常用FL-3通道接收.我只用过BD公司的.
作者: tianmei001    时间: 2012-1-29 11:51

有哪位前辈能贴张同步化的图，生长刺激的图，生长抑制的图
作者: star#room    时间: 2012-1-29 11:52


有谁用流式细胞术检测过小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞，介绍一个既省钱又简便的方法。并介绍一下该方法需要注意的问题。
作者: yhz1973    时间: 2012-1-29 11:52


我现在做FITC和PE标记的CD4CD25的T细胞亚群分析，可是荧光补偿值做了三次都不一样，影响数据，CD4－PE的荧光补偿值FL1-FL2分别为1.2%,1.7%,2.4%,不知那位高手能预帮助,荧光补偿值到底是多少?谢谢!盼复!
作者: daod    时间: 2012-1-29 11:53

请问用流式细胞仪如何才能检测细胞内的钙离子

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一般流式都可以用flur-3这种染料来测细胞内的钙离子,可以上网查一下具体的实验方案,测定几个参数后应该是有个公式可以计算你的样本细胞内钙离子浓度的.
作者: daod    时间: 2012-1-29 11:53

我现在做FITC和PE标记的CD4CD25的T细胞亚群分析，可是荧光补偿值做了三次都不一样，影响数据，CD4－PE的荧光补偿值FL1-FL2分别为1.2%,1.7%,2.4%,不知那位高手能预帮助,荧光补偿值到底是多少?谢谢!盼复!

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你所提供的这些补偿数值应该都还可以没有太异常,不过每个样本的所有采样条件可能会不完全一样,包括电压补偿的数值,因为这些跟你当时的样本处理条件机器状态,及不同样本的细胞表面所结合的抗体的多少都是有关系,只要符合流式调节条件的基本要求去做应该都是正确.不过,当然一般情况下统一类型的样本采样条件差异是比较小的.
作者: daod    时间: 2012-1-29 11:54

我最近在做核内蛋白的FITC，4％甲醛室温30min后，Triton X100（0。5％）on ice for 5 min，离心后NP 40（0。5％） on ice for 5 min，总觉多一个步骤会使得细胞损失，不知道哪位可以告知有什么样的固定通透方式对核内的东西比较适用呢？先说声谢谢了！

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是的,多些处理步骤一方面细胞会有损失,另外破膜过度的话还可能会有胞内蛋白泄漏出去.所以如果你的细胞很珍贵结果要求很精确,我建议还是使用商品话的一些破膜剂吧,它们一般是经过实验验证和严格质控要求的.
作者: 伊莎贝拉    时间: 2012-1-29 11:54

各位师兄你们好！
本人采用流式细胞术来分析细胞周期。我想看一看受试物作用细胞后到底有没有周期阻滞。可是上完流式以后结果出来了，却不会分析。知道各位师兄对这一块比较熟悉，所以我请教帮我分析一下结果。
作者: toy    时间: 2012-1-29 11:55     标题: 回复 #1046 伊莎贝拉 的帖子

你的图不是我分析的，只能就你现在图给出的信息帮你解释一下，希望对你有帮助。
2185：G0/G1期占 78% S期占 21.6% G2/M期 0% 此周期占 53.4%
凋亡 46.6% DI=0.631
5-24H: G0/G1期占 36.1% S期占 53.3% G2/M期 10.5% 此周期占 98.5%
凋亡 1.5% DI= 0.385
2.24H: G0/G1期占 40.5% S期占 53.1% G2/M期 1.8%

以上是你的结果给出的信息，我一般不是这样分析的，另外你做的是什么标本，是组织？
还有你这样的结果拿出来说服力不强的，一方面结果本身不算太好，另一方面你缺乏对照。
作者: toy    时间: 2012-1-29 11:56

我现在做FITC和PE标记的CD4CD25的T细胞亚群分析，可是荧光补偿值做了三次都不一样，影响数据，CD4－PE的荧光补偿值FL1-FL2分别为1.2%,1.7%,2.4%,不知那位高手能预帮助,荧光补偿值到底是多少?谢谢!盼复!

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荧光补偿值不应该是一个确定的数值，和机器及试剂都有关系，另外看补偿的是否合适，一般用双色标记的ＣＤ４/ＣＤ８来调节补偿比较好，补偿的好指１，３象限Ｘ－mean值及３，４象限Ｙ－mean值相差小于０.１，且尽可能接近。
作者: ha111    时间: 2012-1-29 11:56

我仔细看了那篇文献，他对流式的检测说的很简略，没有说明是单激光激发还是双激光激发。顺便请教一下，我不太明白双激光激发是怎样的？是用两种波长的激发光同时激发吗？还是先后？一般的流式仪都能做吗？这方面很是外行，若问题太蠢，多担待！
只找到这样的一张图，看来PI和PKH26的发射波长确实重叠不少，这样是不是难以解决？

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首先回答说一下,回答你问题的是这里的新手.一般来说BD公司的流式细胞仪在FCASClibur以后的型号都有双激光,一根是氩离子激光管,另一根为氦氖激光管,前者的发射光波长为488,后者为633.他们是先后激发的.至于库尔特公司的好像只有新型的一款有双激光.
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-29 11:57

请问高手：我用PercP，PE ，APC,FITC四色检测基因，APC的荧光检测不到是怎么回事？还有想请教一下四色荧光的补偿怎么调。我院的流式仪也是BD公司的FACSACalibur型号流式。谢谢！
作者: 蒲公英    时间: 2012-1-29 11:57

我想请教您一些有关流式实验的问题。我的实验是要测定正常人浆细胞中一种基因的表达情况。我用PercP，PE ，APC,FITC四色检测基因，其中FITC是被检基因的荧光，其他三种荧光标记的抗体是用来标记被检细胞的，我做了预实验，可是CD19-APC的荧光检测不到，不知是什么原因？还有就是四色补偿要怎么调？我院的流式仪也是BD公司的FACSACalibur型号流式。谢谢！
作者: 大尾巴    时间: 2012-1-29 11:58

请问高手：我用PercP，PE ，APC,FITC四色检测基因，APC的荧光检测不到是怎么回事？还有想请教一下四色荧光的补偿怎么调。我院的流式仪也是BD公司的FACSACalibur型号流式。谢谢！

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我想APC测不到有两个方面的原因：1，机器的第二根激光器或检测系统没有调整好；2，你的样本处理步骤或试剂有问题。如何去验证：1，可以先用通常调机器用的APC beads去上机，看看FL4通道信号正常否，或者看你所用的机器这里平时用不用第四通到若一直在用否，如正常说明机器本身没问题，如果不正常就要找BD工程师去调机器了；2，机器没问题的前提下可以先试试单独标记APC做做看，因为这样相对简单干扰因素更少。
补偿的调节类似两色的，就是都使用单标的样本管来调节两两相邻通道之间的补偿。
作者: 2541    时间: 2012-1-29 12:00

Annexin V FITC 和 PI 双染时 H1 区多达15%是不是不正常？
作者: milkdog    时间: 2012-1-29 12:01


谢谢大老!但是对于流式的补偿概念我还是很模糊,不知道该怎样调,也不知道怎样调才叫理想?做出的结果比较好?能不能再具体点,劳驾举个例?拜托了!(我很笨的)Zyang.另外我测的是浆细胞,正常人骨髓中的浆细胞只有0-2%,是不是APC荧光测不到也与浆细胞太少有关呢?
作者: greenbee    时间: 2012-1-29 12:02


今天做的PI和Annexin V测细胞凋亡，但本人经验不足，希望大家提点意见。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10340

作者: greenbee    时间: 2012-1-29 12:02


第2张

图片附件: 86584741.jpg (2012-1-29 12:02, 52.27 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10341

作者: greenbee    时间: 2012-1-29 12:03


这张是结果，但不知道应该怎么样判断结果是否理想，采集时各项参数是否调节合适，希望各位高手指点。另外能否请版主给新人加1分，谢谢！
作者: greenbee    时间: 2012-1-29 12:03


对不起，这张是结果，刚才没发上去。

图片附件: 34566939.jpg (2012-1-29 12:03, 48.55 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10342

作者: greenbee    时间: 2012-1-29 12:04

请问各位大虾和同门兄弟：
配置好的PI染液在避光4度下可以保存多久？愚兄先谢了！！

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一般情况下，配置好的PI染液在避光良好的4度冰箱里，保存半年应该没问题。如果发现上机结果不理想，可以用滤器过滤一下继续使用。但我见过做流式用的PI，都不知是何年何月制的了，结果仍然不错。所以，我个人认为，PI应该是比较容易保存的。
作者: greenbee    时间: 2012-1-29 12:04

请教各位大侠:
哪里有有关流式细胞仪的应用软件？可下载吗？
本人需要学习流式细胞仪的使用，但是科里的机器不可能让我随便试用。有关预值设置，门设置等均无法实际操作。加之操作系统和软件都是英文版本。痛苦之极。望各位大侠指条生路！最好可以安装到自己的电脑上，实际操作操作，有助于进步。
谢谢了。
附：科室为BD公司 BD FACSCalibur 流式细胞仪

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流式细胞仪的主机都是Apple机，不知道你的是PC还是Apple机。
不过我想你应该是PC机吧，这里有一个可供PC机分析流式结果的软件，
我将网址提供给大家分享：
cuturl('http://facs.scripps.edu/software.html#winapps')
上面有不少流式可以用到的分析软件，你可以下载试用一下。
作者: +小生怕怕+    时间: 2012-1-29 12:05

大家好!

我有一个紧急的问题要求助大家,我测的是正常人骨髓中的浆细胞,我是用CD19-APC和CD56-PE两种抗体标记的,但是CD19-APC阳性测不出,我又测了CD19-APC的单标,有荧光,但很弱,请问大家有什么办法解决吗?麻烦大家帮我想想办法!摆脱了!谢谢!我院的流式仪也是BD公司的FACSACalibur型号流式。
作者: +小生怕怕+    时间: 2012-1-29 12:06

因为我做的是多发性骨髓瘤相关基因的研究,我查资料骨髓瘤细胞表达是CD38++,CD19-,而正常浆细胞表达为CD19+, CD56-所以我用CD19,但也有文献报道正常浆细胞抗原表达为CD38+, CD19+ 我不知道单一的CD38能区别两者吗? 另外骨髓中浆细胞为0-2%, 检不出是不是也与数量少有关呢?
作者: loli    时间: 2012-1-29 12:06

各位大虾，我正在用流式检测乳腺癌临床标本的DNA直方图，问题是有很多时候，有异倍体表现，在分析数据时候，不知道如何分析SPF和DNA指数。
恳求各位，是否有人做过类似的东东。帮一下忙，此类文献也可以，谢谢！
另外，问一个愚蠢的问题，用来做免疫组化的抗体，可否用来做流式，我需要的抗体有一部分，向试剂公司咨询，都没有标明作流式这个方法。
再次谢谢了！

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我试着回答你的问题：
你做的是流式检测肿瘤标本，肿瘤标本在细胞周期上体现为不规则增殖，就是会出现异倍体，这是正常的现象。
SPF=S%/G0G1%+S%+G2M%×100％
DNA指数DI=G0G1道数/G2M道数　　
正常细胞DI＝2.00　　表明是一个规则增殖，而肿瘤细胞则不等于2
这也是肿瘤细胞与正常细胞的一个主要区别。
免疫组化用的抗体，不一定适合做流式。
如果公司不明确说可以做流式的话，多数原因是用做流式得不到理想的结果。所以不建议使用！
作者: moonlight45    时间: 2012-1-29 12:07


请问如何制备脑细胞悬液,具体步骤? 我做了很久都没成功,急死了
作者: 00无名指00    时间: 2012-1-29 12:08

请问各位战友,间接FITC标记测膜表面分子,得到的结果图峰形为双峰,请问是抗体特异性的问题吗?为什么?
作者: windy+++    时间: 2012-1-29 12:08

本人在做课题中遇到一个问题，请教schoman老师：本人的课题需要进行四色标记，而且只能用来自不同公司的产品，更要命的是要间标直标一块标，结果发现其中三色成功标上，但最关键的第四色（间标）总是表达水平非常低，请教schoman老师理论上能间标，直标同时标记么，出现上述问题的可能原因您觉的可能是什么，谢谢！
作者: plaa    时间: 2012-1-29 12:09


我在做新鲜血管组织流式细胞仪细胞周期动力学检测，但跑出来的数据和别人不一样。我用的是剪刀剪组织取的匀浆。做出来g0g1期多占95％以上，而s期和g2期基本没有。为什么？
作者: hyuu    时间: 2012-1-29 12:09


用抗鼠红细胞抗原TER119抗体（生物素标记）标记小鼠胚肝细胞，PE为二抗（均为EBIOSCIENCE公司产品），与阴性对照相比，表达的细胞表面的荧光高的出奇，而同样的二抗做CD45却没有这样，请问大虾们，这一般是什么原因，一抗量大了还是抗体本身的问题？
多谢！
作者: yysr238    时间: 2012-1-29 12:09

请问两个问题：
我分析脐带血中的单个核细胞，想了解是否红系比例，有人建议用三管
（1）同型对照
（2）CD34（FITC）、CD33(CY5)、CD71(PE)
（3）CD71(PE)、CD36(FITC)
我做出来的结果，同型对照（IgG1PE/IgG1FITC，IgG1CY5/IgG1FITC）都是左下角疑团细胞，然后指向右上角，好像两团细胞（左下（大）和中间（小）），究竟什么原因呢？

还有在FSC/SCC图上，如何Region红系细胞团？

我是第一次做流式，真郁闷啊！
作者: qqq111    时间: 2012-1-29 12:10

各位仁兄，我想用流式测细胞周期，我定了PI，结果是SIGMA公司中国公司分装的，又没有说明书，我浏览了很多文章和流式精华版，也没找到PI液的配置，那位仁兄帮助一下。真的很感激！！
作者: cj_mondy    时间: 2012-1-29 12:10

您的實驗沒有作螢光補償
compensation....所以會有這種狀況
如果是依照您的狀況

我會分別單染來作螢光補償

1 unstain
2 Isotype IgG1-FITC
3.Isotype IgG1-PE
4.Isotype IgG1-Cy5
5.CD34-FITC
6.CD71-PE
7.CD33-Cy5
8.CD36-FITC
9.CD34（FITC）、CD33(CY5)、CD71(PE)
10.CD71(PE)、CD36(FITC)

其中以5 6 7 管來調整9的compensation
7 8兩管來調整10的compensation
希望對你有幫助
作者: cj_mondy    时间: 2012-1-29 12:11

Reagents
Cold absolute ethanol.
0.5 M Na citrate stock (filtered), 50mM diluted stock.
10 mg/ml RNase A (Boil 10 mins, cool, filter and store at -20°C).
4 mg/ml Propidium iodide (PI) (filter and store in dark at -20°C).

Protocol
Spin down 107 cells from an exponentially growing culture - 2000 rpm for 5 mins. Pour off supernatant.

Vortex tube while adding 1.0 ml cold 70% EtOH.
Store at 4 °C (cells keep ~indefinitely).

When you want to process the cells, take 0.3 ml (this will be 2-3 x 106 cells, assuming a little loss in the washing) and add to 3 ml 50 mM Na citrate in a 5ml Falcon tube. Mix and spin 2000 rpm for 5 mins.

Discard supernatant and resuspend pellet in 0.5 ml 50mM Na citrate containing 0.1 mg/ml RNase A. Leave in 5 ml Falcon tube and put in 37 °C room for 2 h.

For staining:

Propidium Iodide
Add 0.5 ml 50 mM Na citrate containing 8 µg/ml PI, so that final concentration in the sample is 4 µg/ml. There can be non-specific staining of yeast (pombe) ends at higher concentrations if cells are starved, or spores. Cells can be processed immediately or conveniently stored overnight at 4°C in the dark before processing the next day. If necessary cells can be stored at this stage for a maximum of a week (4°C in the dark). Check them under the fluoresence microscope (red channel) to verify staining.

(Optional) Just before processing the cells, sonicate for 45 s again leaving cells in the 5 ml Falcon tubes. Sonication prevents doublets of cells which give spurious peaks and is particularly useful if your cells have varying DNA contents and will clean up spores or wee mutants.

Approximate settings on the FACScan for Propidium Iodide
Detector FSC E00 Gain:3
Detector FL2-A Voltage:890 Gain:2

希望對你有幫助
作者: 麦丽素1986    时间: 2012-1-29 12:11

请教您几个有关流式分选细胞的问题：
1.流式分选过程很麻烦吗？
2.是否很易污染？
3.如果我要从PBMC中分选CD8+CD25+细胞，是不是要分成两步做：第一步从PBMC中分选CD8+细胞；第二步则从分选得到的CD8+细胞中再分选CD25+细胞。这样时间是否过长？对细胞影响大不大？是否可以先逻辑设门CD8+CD25+细胞，再直接分选得到双阳性的细胞？
4.为什么我看到的文献主要还是以磁珠分选多？
感谢您不吝指教！
作者: cj_mondy    时间: 2012-1-29 12:11


1.會不會很麻煩要看你的機器我是用FACS Aria大概要四五個小時
2.我目前作過還沒有污染的現象
3.不需要,你把細胞雙染 並且各作一個單染的陽性對照組
把compensation調整好就可以做分選
只要先圈出CD8+作為gate 1 然後在Gate1 中看CD25+的細胞
設為gate2 然後分選出gate2 的就是你要的CD8+CD25+的細胞

4.因為磁珠的價錢比較低....例如Dynal的一組kit大概一兩萬(台幣)
但是FACS Aria 一台要1300萬(台幣)
不過利用磁珠分選的純度比較低(FACS Aria >95%)
我之前用磁珠大概70~80%的純度
而且利用磁珠會有磁珠殘留的現象
但是磁珠所花的時間比機器來的短~大約2小時左右
作者: jujuba    时间: 2012-1-29 12:12

最近在写课题的过程中遇到一些难题，是关于细胞分选的问题，希望能得到专家指点。我的问题可能有点业余，但确实令我这样的新手很是困惑，先谢谢了。
问题一：我想从组织中分离出不同属性的血管内皮细胞并争取作原代培养，当然已有相关的标记，您认为用哪种方法更好些？流式细胞分选or磁珠分离or其他更好的方法？
问题二、用流式细胞分选出来的细胞还能进行接下来的试验吗？如分子生物学检测、继续培养传代，进行其它的体外试验等等。
作者: abc816    时间: 2012-1-29 12:12

用FACSVANTAGE 分选,细胞可以做接下来的实验
可以继续培养
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-29 12:13

我感觉蒸馏水混有细胞似的。请检查蒸馏水是否干净！
对于这种火箭状的图形，今天BD会议上我问了他们的技术支持，如果在其它条件没有问题时，主要可能还是细胞活力差及染料差引起。

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高手帮我看看怎么回事

我只用蒸馏水的FL1-FL2图，如火箭
我是新手，郁闷到极点

还有同型对照的图（接着）
作者: junhun    时间: 2012-1-29 12:13

我们原来实验室的师兄和师姐都没有做过流式，我第一次做用来测定细胞的凋亡。因为初次接触，有好多问题想请教您。我们培养鼠胸主动脉内皮细胞,一般到第三代才能用于实验,也就是经过20多天才可做.上次好不容易做了,但是存在一些问题.在塑料培养瓶里的细胞有很多,经过处理后,消化用的是0.25% 胰酶,离心后也看见有很多细胞,但是在固定后就损失了好多.我们固定是直接用70%的乙醇混悬细胞的,然后放于-20度保存.第二天离心后消化的RNA酶浓度是400微克/毫升。请问我们所用的胰酶消化细胞对细胞损害大么？固定一步有什么问题？RNA酶浓度多大最合适？希望得到您的答复。谢谢！
作者: 中国特色    时间: 2012-1-29 12:14


请问各位高手：我现在用流式测ＰＩ染色的ＰＢＭＣ（主要是淋巴细胞）的ＤＮＡ，以观察淋巴细胞增殖．操作时的ＧＡＴＥ怎么选择？如果有图就更好了！我发现细胞岁片很多，导致可记数的细胞少，怎么办呢？有什么地方需要注意的，谢谢了
作者: abc816    时间: 2012-1-29 12:16

我不是高手，但我还是要回答一下，呵呵。
如果碎片多，那么可以尝试选取更高一点的threshold，排除这些碎片。但是又不能设得太高，否则可能会把部分淋巴细胞排除掉。
另外，在计数时可以选取淋巴细胞那一群，使门内的细胞收集到10000个。
这样就可以保证有足够的细胞用来分析。

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请问各位高手：我现在用流式测ＰＩ染色的ＰＢＭＣ（主要是淋巴细胞）的ＤＮＡ，以观察淋巴细胞增殖．操作时的ＧＡＴＥ怎么选择？如果有图就更好了！我发现细胞岁片很多，导致可记数的细胞少，怎么办呢？有什么地方需要注意的，谢谢了
作者: 911    时间: 2012-1-29 12:16

请教:哪里有丰富的流式细胞术的图片呢?(特别是关于细胞凋亡的图片)?
作者: 西子    时间: 2012-1-29 12:17

我做流式用FITC标记的荧光抗体测细胞内基因蛋白表达,但对流式的直方图不知道如何分析,而关于直方图的分析方面的书好少,请大家赐教!如果能举例说明就最好不过了,谢谢
作者: c86v    时间: 2012-1-29 12:17


我急着找流式的分析软件，尤其是能具体分析细胞各周期占有率的soft，有哪位大侠能帮帮忙啊??
作者: abc816    时间: 2012-1-29 12:18

苹果机上是用modfit，不过它也有windows版本的，你可以去下载一个，但是有些数据分析起来可不是非常简单的事情哦。

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我急着找流式的分析软件，尤其是能具体分析细胞各周期占有率的soft，有哪位大侠能帮帮忙啊??
作者: fei1226com    时间: 2012-1-29 12:18

我觉得检测贴壁细胞的凋亡时,还是用胰酶消化比较好,因为机械处理得到的细胞通常粘连很严重,不利于染色,我们通常用1X的胰酶消化5～10分钟即可,如果是贴壁不太牢固的,用EDTA也可以

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请问1X的胰酶的具体浓度是多少？消化温度多少为宜？多谢！
作者: fei1226com    时间: 2012-1-29 12:19

上机之前要过滤的，如果是未消化完全的细胞这时就可以过滤除掉的，如果刚过滤后没有大团块，而时间长点后才产生的则是可能消化过度产生的了。
另外，可以试试看我上面一个贴子中的消化方法,胰酶/EDTA。

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请问具体的胰酶和EDTA的浓度及比例是多少？多谢！
作者: fei1226com    时间: 2012-1-29 12:19

请教：我用机械法获得宫颈组织单细胞悬液，流式直接法测其表面HLA-I分子表达水平，但阳性细胞百分数很低，与文献相差甚远。可否帮忙分析一下。

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请问，你的机械法获得单细胞悬液具体是如何操作的？我是做口腔黏膜的，想交流一下。我用的是酶消化法，但总是细胞不分群，老师说是细胞碎片多。我同学有用机械研磨法制备脾单细胞悬液的，效果不错，但上皮组织不容易研磨啊。
作者: fei1226com    时间: 2012-1-29 12:20

请教：
我准备用Dispase酶消化来进行粘膜上皮细胞的培养，查阅中文文献后见都未有细胞纯度的说明，因为我的实验后续研究需要有较高的细胞纯度。Dispase酶消化后是否能达到100％的纯度？如果不能，上流式检测细胞纯度（类似磁珠分选后的纯度检测）有无意义？
万分感谢！

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我想请教下，你最终制备出的满意的黏膜上皮单细胞悬液的具体操作过程？谢谢拉
作者: 缘yuan    时间: 2012-1-29 12:20


各位前辈，我正在做EPC的流式分析，我先后用过0.25%胰酶和1mMEDTA消化细胞后荧光染色，但流式结果实在是很低（CD31,KDR），这可能是消化过程中引起的细胞损伤，请教各位有啥办法可减少消化过程中的细胞损伤？还有EDTA消化后的细胞一定要用hanks液洗涤吗？如用PBS洗涤可以吗？小弟已经被流式弄的头昏脑胀，请各位高人多多帮忙，谢谢！
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-29 12:21

请问各位战友,间接FITC标记测膜表面分子,得到的结果图峰形为双峰,请问是抗体特异性的问题吗?为什么?

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你用的FITC 标记的是什么标志物，同时还标记了别的指标没有，提前做同型对照没有啊？还有就是电压和补偿做的如何啊，因为我先前做流式的时候，因为电压和补偿没有调节好的时候也遇到过这种问题，必要的话你可以把图发上来看看
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-29 12:21

请教
我的试验中需要用流式细胞pi染色检测组织块中细胞周期的变化,由于试验周期较长,不能一次取得标本,我想收集够标本后一次送检,请教标本如何保存,可以保存多长时间,保存是否会影响检测的结果.
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 12:22     标题: 回复 #1092 ladyhuahua 的帖子

组织块经酶解成单细胞悬液后，每锥底离心管放入1-2x10^6个细胞，500g离心5分钟收集细胞，再用PBS洗一次（500g离心5分钟），弃去PBS，留0.1毫升左右的PBS将细胞团震荡重新悬浮，置于冰上。70%乙醇先预冻至-20度，然后边震荡细胞团边逐滴加入8-10ml冰乙醇，最后放入-20度冰箱保存。有文献说保存可达2周，但我保存的许多不同细胞的样品放上3-6月也未见明显变化。
作者: 了了    时间: 2012-1-29 12:23

请教各位高手：
我第一次做流式用来测定细胞的凋亡。我们培养鼠胸主动脉内皮细胞,一般到第三代才能用于实验,也就是经过20多天才可做.上次好不容易做了,但是存在一些问题.在塑料培养瓶里的细胞有很多,经过处理后,消化用的是0.25% 胰酶,离心后看见有很多细胞,但是在固定后就损失了好多.我们固定是直接用70%的乙醇混悬细胞的,然后放于-20度保存.第二天离心后消化的RNA酶终浓度是400微克/毫升。请问我们所用的胰酶消化细胞对细胞损害大么？固定一步有什么问题？RNA酶浓度多大最合适？希望得到您的答复。谢谢！
作者: baidukk    时间: 2012-1-29 12:24

我想观察一下药物对内皮细胞表面P-selectin表达的影响，是用ELISA还是流式好？哪一个更经济？如果做流式，买抗体大概要多少钱？
先谢谢各位！
作者: 白白的    时间: 2012-1-29 12:24


我想用细胞分选仪分选含GFP的COS-1细胞，并定量这些细胞的数量，再按相同的数量传代培养。可是我们的仪器没人用过，请问高手怎么处理仪器和样品啊？有那些注意事项呢？
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-29 12:24

我想用细胞分选仪分选含GFP的COS-1细胞，并定量这些细胞的数量，再按相同的数量传代培养。可是我们的仪器没人用过，请问高手怎么处理仪器和样品啊？有那些注意事项呢？

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请问你们的仪器是什么型号的?
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-29 12:25

组织块经酶解成单细胞悬液后，每锥底离心管放入1-2x10^6个细胞，500g离心5分钟收集细胞，再用PBS洗一次（500g离心5分钟），弃去PBS，留0.1毫升左右的PBS将细胞团震荡重新悬浮，置于冰上。70%乙醇先预冻至-20度，然后边震荡细胞团边逐滴加入8-10ml冰乙醇，最后放入-20度冰箱保存。有文献说保存可达2周，但我保存的许多不同细胞的样品放上3-6月也未见明显变化。

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如短时间保存,操作可以简单一点,制成细胞悬液后用PBS洗2次,再用80%乙醇固定,我们一般保存一周左右
作者: dragonkilly    时间: 2012-1-29 12:25


我想用Annexin V-FITC和PI双染来检测化疗药物作用贴壁肿瘤细胞后的凋亡率，买的是生物晶美公司的，说明书中说将Annexin V和PI同时加入反应15分钟即进行检测，不知这两种试剂能同时加么？还有反应时对避光的要求高么？细胞的数量如何影响结果？
不好意思问了这么多问题，上星期作了一次，好像染色效果极差，不知什么原因，极度郁闷中！谢谢了！
作者: 爱老虎游tt    时间: 2012-1-29 12:26     标题: 回复 #1099 dragonkilly 的帖子

我试着回答：
1、一般是先加FITC，因为FITC对PH比较敏感，加入PI后可能改变液体的PH，影响FITC活性。一般加入PI后10分钟左右上机即可。
2、反应对避光的要求不十分严格，不用强光照射，一般不会影响结果。
3、细胞浓度应在5×10的5次方——1×10的6次方个／ml为好。
别外，细胞凋亡是一个动态过程，反应1小时后荧光强度会明显衰退。
作者: 爱老虎游tt    时间: 2012-1-29 12:26

苹果机上是用modfit，不过它也有windows版本的，你可以去下载一个，但是有些数据分析起来可不是非常简单的事情哦。

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提供一个流式分析软件下载站，希望对大家有所帮助。
cuturl('http://facs.scripps.edu/software.html#winapps')
上面的软件大家可以试下，本人没用过。
作者: bongte    时间: 2012-1-29 12:27


请各位高手帮帮忙：我要检测骨髓瘤细胞株加药前后细胞表面抗原CD38,CD56,CD54,IL-6,VEGFR表达的情况，我设立了三个浓度，一个对照，相应抗体全部购买的是PE标记的，另外，对照组是不是也加相同的抗体就可以了？徐不需要封闭？我需要做细胞表面抗原的定量，不知该选用什么样的抗体。
请各位高手指教，谢谢！
作者: TNT    时间: 2012-1-29 12:27

我现在要用两种单抗分选绒毛组织中的两种细胞,一抗和流式二抗我都有了,我把组织消化成单细胞悬液后要进行怎样处理,即一抗和二抗的处理,才能上机检测和分选.我以前用磁分选失败了,所以很着急,我想要详细操作,请高手指点,不胜感激!
作者: whitesheep    时间: 2012-1-29 12:27


您好：流式新手遇到问题照不到解答特向您请教。
我买的SIGMA的莫能，包装是1G的，用20ml的乙醇稀释作为储存浓度。用时1：50稀释。但是我们把莫能加到细胞培养液就立马出现大量的可见沉淀。
我也查到有用SIGMA的，用法同我上面所述。是我们用的稀释液体不对还是用量太大？我也查到有的用的液体包装的，人家用的是2UM数量级的。就是我现在用量的1/720。
请高手指点。试验进展中，急切盼望回复。谢谢！谢谢！
作者: cocacola    时间: 2012-1-29 12:28

本科委托 安易电脑会计公司 设计的流式细胞仪报告单管理软件能有效解决"+、－"等上下标问题。使临床报告单的管理更简单、检索更合理，样式更规范。
CD3+CD4+
CD3+CD8+
作者: flower-201    时间: 2012-1-29 12:28


你好,有没有用过Biolegend公司的流式抗体的战友呢,你们认为怎样?我最近购买了Biolegend公司的流式抗体,感觉非常差,细胞的荧光标记分散,CD25好象都要快没有了,和BD公司有很大差距.不知你们的怎样呢?
作者: utt0989    时间: 2012-1-29 12:29


各位做流式的战友，谁能指导一下，是怎么样把流式结果转到PC机上的？
尽量具体些好吗？
作者: HPLC使者    时间: 2012-1-29 12:29


请教各位高手:
我想用全血培养T细胞5小时,然后用流式测细胞内的细胞因子,不知道对所用的1640培养液有什么特殊要求(我看到有材料说不能含谷氨酰胺)?
另外,培养时需加刺激剂,能不能只加一种(如PMA)?
哪里有便宜的流式试剂.
非常感谢
作者: abc816    时间: 2012-1-29 12:30

在PC机上也有好多读取流式结果的软件，比如win MDI、FCS express等软件。网上均有下载。

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各位做流式的战友，谁能指导一下，是怎么样把流式结果转到PC机上的？
尽量具体些好吗？
作者: abc816    时间: 2012-1-29 12:30

位做流式的战友，谁能指导一下，是怎么样把流式结果转到PC机上的？
尽量具体些好吗？

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我们目前比较常用的分析软件是Modfit和Cellquest，这种文件只在Apple机上可以通过这两种分析软件打开。我操作流式细胞仪两年，都是在以上两种分析软件上分析出数据，之后Copy再粘到Word空白文档上，并保存。Mac和PC上的Word文件是可以互相打开的，这样就可以把分析结果转到PC机上了。不知我说明白了没有？
作者: yapuyapu    时间: 2012-1-29 12:31

各位做流式的战友，谁能指导一下，是怎么样把流式结果转到PC机上的？
尽量具体些好吗？

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我们实验室可以用下列方法把apple机上的图片报告转到PC机上:
1. 将苹果机上的图片报告复制到photoshop上,转换成jpg格式
2.将其转到PC机上,点右键,选择"打开方式",选择"IE"
3.点右键,"图片另存为",选择地址即可.
作者: yapuyapu    时间: 2012-1-29 12:31

我想用全血培养T细胞5小时,然后用流式测细胞内的细胞因子,不知道对所用的1640培养液有什么特殊要求(我看到有材料说不能含谷氨酰胺)?
另外,培养时需加刺激剂,能不能只加一种(如PMA)?
哪里有便宜的流式试剂.
非常感谢

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1640培养液应该没有要求,可能需要含小牛血清.
加刺激剂时,若检测细胞内细胞因子只加PMA肯定是不行的,还需要加一种钙离子载体(Ionomycin或A23187)和蛋白转运抑制剂(Monensin或BFA).

晶美生物公司有卖流式抗体,比国外同类产品要便宜.
作者: 社会主义好    时间: 2012-1-29 12:32

我计划用流式检测癌细胞的凋亡细胞数,凋亡率,蛋白表达水平,我有几个问题向你请教,凋亡数和凋亡率的检测需要准备那些材料?我的检测细胞里GFP,抗体采用什么东西标记好?标记的抗体可用来做WESTERN BLOT吗?
作者: qhyu    时间: 2012-1-29 12:32

请教：我想检测药物对肿瘤细胞周期的影响(PI染色)，但是我每次检测时都由于细胞聚集在一起不能检测。先以为消化时间短，可是延长时间后却发现DNA都漏出来了。后来我减少待测细胞的浓度，同时减少消化的时间，消化后镜下保证基本上是单个细胞的悬液，乙醇固定后也是。但加了PI染色液后，细胞又聚集在一起了。如果才能解决这个问题呢？事关毕业，急!!!!谢谢!
作者: abc816    时间: 2012-1-29 12:33

请教：我想检测药物对肿瘤细胞周期的影响(PI染色)，但是我每次检测时都由于细胞聚集在一起不能检测。先以为消化时间短，可是延长时间后却发现DNA都漏出来了。后来我减少待测细胞的浓度，同时减少消化的时间，消化后镜下保证基本上是单个细胞的悬液，乙醇固定后也是。但加了PI染色液后，细胞又聚集在一起了。如果才能解决这个问题呢？事关毕业，急！谢谢!

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你所检测的细胞应该是来自体外培养的吧？消化时间过长，会引起死亡细胞过多，细胞内DNA在固定之前外漏，从而出现细胞严重粘附的现象。至于加入PI之后，细胞再次聚集在一起，建议先充分混匀，再用滤网过滤后上机。如果以上方法还不能解决的话，希望你能把自己的操作步骤发到上面，请各位高手帮忙解决，祝好运！
作者: skytree    时间: 2012-1-29 12:33

我的做法大概是：
CNE-2细胞株。
1、分瓶后培养一天加处理因素，再一天后用吸出培养液至离心管中(为了收集凋亡的细胞)，2、再胰酶+EDTA的消化液来消化。3、五分钟后加培养液中止。吹打细胞，转至上面有原培养液的离心管中。4、 离心：1000rpm 5min, 倒去上清，留下0.5ml将细胞吹匀，逐滴加入70%乙醇，边加边用振荡器混匀。至2ML左右。5、4度存放一夜，第二天离心弃上清，6、加入预制的PI染色液(PI+RNase(煮沸过))。37度半小时送检。
我在2,3步后细胞都还比较均匀。4步后，细胞大多破裂了。是固定的效果吗？但肉眼还见不到颗粒。直到第6步后，就见到细胞聚集了。
是不是：固定时用振荡器振荡太过剧烈？或是细胞本身就容易粘在一起？
作者: chuntian1983    时间: 2012-1-29 12:33

我想用流式检测胃癌细胞表面的几种marker,不知道用胶原酶和透明质酸酶一起在恒温震荡水浴箱中来消化新鲜手术切除的胃癌组织可以得到足量的单细胞悬液吗？如何能从组织中提取出瘤细胞来让我很头疼。谢谢！
作者: abc816    时间: 2012-1-29 12:34

我的做法大概是：
CNE-2细胞株。
1、分瓶后培养一天加处理因素，再一天后用吸出培养液至离心管中(为了收集凋亡的细胞)，2、再胰酶+EDTA的消化液来消化。3、五分钟后加培养液中止。吹打细胞，转至上面有原培养液的离心管中。4、 离心：1000rpm 5min, 倒去上清，留下0.5ml将细胞吹匀，逐滴加入70%乙醇，边加边用振荡器混匀。至2ML左右。5、4度存放一夜，第二天离心弃上清，6、加入预制的PI染色液(PI+RNase(煮沸过))。37度半小时送检。
我在2,3步后细胞都还比较均匀。4步后，细胞大多破裂了。是固定的效果吗？但肉眼还见不到颗粒。直到第6步后，就见到细胞聚集了。
是不是：固定时用振荡器振荡太过剧烈？或是细胞本身就容易粘在一起？

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不用客气，我个人认为：你对细胞加处理因素，消化，离心这三步是比较容易使细胞破坏的。
1、建议在处理细胞时，同时做一管不加处理因素的对照，这样可以判断是否是由加处理因素引起的。
2、对于不同的细胞来说，消化的时间也有所不同。消化时间过长，也可能使细胞碎片过多。
3、你的离心是1000rpm，建议改用300xg离心力。不知道你用的是什么样的离心机，如果你用的转子半径很大的话，1000rpm很可能会使细胞破坏。
固定时太剧烈振荡，也可能出现这种现象。
作者: 四福晋    时间: 2012-1-29 12:35

我的上机前操作过程，请大家指正：

1、倒掉培养液，冷PBS3ml洗2次
2、胰酶消化，加培养液终止反应，吹打成单个细胞（1－5×106），1000r 8min
3、冷PBS重悬，1000r 8min
4、重复步骤3
5、加1ml预冷70％乙醇固定细胞，边摇动指管边加入，用力吹打成单细胞悬液，-20℃12h
6、吹打细胞，1000r 8min
7、PBS重悬，1000r 8min
8、适量PBS重悬，分别加入RNase，PI各10ul，其终浓度分别为100ug/ml，5ug/ml。 （二者配方见下面），避光37℃30min
9、过筛，调整密度1×106/ml，上机

10mg/ml RNase: RNase 25mg
1M Tris(PH7.5) 25ul
2.5M NaCL 15ul
H2O 2460ul
100℃ 5min,缓慢冷却，1ml分装，－20℃保存

0.5mg/ml PI: PI 10mg
二水和柠檬酸三钠 0.224g
H2O 20ml
1ml分装，－20℃保存
作者: 四福晋    时间: 2012-1-29 12:35

各位仁兄，我想用流式测细胞周期，我定了PI，结果是SIGMA公司中国公司分装的，又没有说明书，我浏览了很多文章和流式精华版，也没找到PI液的配置，那位仁兄帮助一下。真的很感激！！

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400ug/ml PI(Sigma)，溶于水，4度避光保存。
正常可以使用半年以上。
对于国产PI：PI 5mg，Rnase 2mg，Triton-100 1ml，枸橼酸Na 100mg，溶于65ml生理盐水中，加水至100ml。
作者: hyuu    时间: 2012-1-29 12:35


我用流式检测单标PE标记胞膜抗体，阳性占0.1-2%,请问要做同型对照吗？您那能做分选吗？无菌的
作者: abc816    时间: 2012-1-29 12:36

用wi***i和mfi分析数据是二个概念，mfi是专门用来分析细胞周期的软件，且只能在MAC上使用的软件。你只要手里有当时做流式的数据文件，可以用所用的流式分析软件做结果的处理。不过，目前只有wi***i等几个小软件可以在PC机上使用，绝大多数功能强大的分析软件都是仪器公司提供的。像你这种情况，建议回到原来做实验的地方，请他们帮忙分析。
此外，我再提供你一个流式分析软件的下载站点，你可以试用一下这些软件。祝你好运！
作者: 小野花    时间: 2012-1-29 12:36


哪位老师能指点一下怎样用流式测心肌细胞肥大？我只听说过用它来测凋亡。这可行吗？
作者: 气泡    时间: 2012-1-29 12:37

應該是看FSC的大小有沒有變化就可以了吧
作者: 小野花    时间: 2012-1-29 12:37     标题: 回复 #1124 气泡 的帖子

有的文献上是测FSC-SSC大小.
你曾经用流式做过测肥大吗?好象很少人用,如果做的话结论会不会不够有说服力呢?
作者: rxcc33    时间: 2012-1-29 12:38


请问用流式细胞仪能检测神经元内细胞色素C的释放吗？我做的是动物实验，如何取材以及注意事项？
作者: wmp1234    时间: 2012-1-29 12:38


现在也正在研究关于细胞流动仪的论文。由于语言上的差异。有很多东西不懂。希望大家能共同帮忙。
作者: abc816    时间: 2012-1-29 12:39     标题: 回复 #1127 wmp1234 的帖子

不知你英文怎么样？我可以给你提供一本我的收藏：《Flow Cytometry First Principles Second Edition》。文件比较大，无法用附件的形式上传，想要的话可以和我PM联系，或留下你的E-mail。希望这本书对你有所帮助！其他想要的朋友也可以向我索取资料。
作者: ending    时间: 2012-1-29 12:40

我用Pharmingen的PE标记的大鼠抗小鼠的CD25单抗检测小鼠脾细胞的CD25+细胞的表达情况，重复多次都没有检测到，老板怀疑试剂有问题。Pharmingen的产品质量应该是可信的，可是就是检测不到表达。不知问题出在哪里，难道真是试剂质量有问题？请高手指点。谢谢
作者: abc816    时间: 2012-1-29 12:40


【资源】分享流式细胞术的资料
我的公用信箱：1234567890123@163.com
密码：521ladeng
主要有以下资源：
FlowCytometryFirstPrinciplesSecondEdition.rar
FACSAria.pdf
AnnexinV.pdf
流式细胞仪补偿设置.pdf
FACSCalibur.pdf
BD产品目录.pdf
流式细胞术的原理和应用.pdf
CD34+细胞计数.pdf (940k)
流式细胞仪的使用程序.pdf (89k)
细胞凋亡检测技术与方法-凋亡现象的分析.pdf (1746k)
细胞功能的流式细胞仪检测.pdf (51k)
DNA含量分析的一般方法.pdf (799k)
这是我从事流式细胞术两年的收藏，希望对从事流式细胞术研究的战友们有所帮助，也希望大家不要改密码！！
各位战友，密码被人改了。此信箱已被冻结，如果各位战友对以上资料感兴趣的话，可以PM和我联系。
我一定尽力满足大家的需求。
作者: yes4    时间: 2012-1-29 12:40

我用Pharmingen的PE标记的大鼠抗小鼠的CD25单抗检测小鼠脾细胞的CD25+细胞的表达情况，重复多次都没有检测到，老板怀疑试剂有问题。Pharmingen的产品质量应该是可信的，可是就是检测不到表达。不知问题出在哪里，难道真是试剂质量有问题？请高手指点。谢谢

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CD25是IL-2受体，在激活的T、B淋巴细胞上表达，所以要想得到阳性结果，你需要在染色前先激活淋巴细胞。pharmingen的抗体是不错的：－）
作者: summerxx    时间: 2012-1-29 12:41

我是一个新手，要使用PI测定药物处理的白血病细胞周期变化，但是我不晓得要购买些啥试剂？试剂如何配制？具体的试验步骤？能否给我些资料？谢谢？
作者: tangxin_80    时间: 2012-1-29 12:41

各位高手大哥，小弟刚接触流式，机型是BD FACSCalibur四色流式细胞仪。我现在正做白血病免疫分型，可到底选用哪种标准，我一筹莫展。一个是1995年EGIL的四色21分型，一个是1985年的国际MIC分型，还有北美流式分型，这几个分型，各有千秋，让我难以选择，请有经验的老师不吝赐教！

再有，哪位老师能有1995年EGIL的分型全文，我们的数据库只能从1996开始检索，可怜那是1995！帮帮小弟吧！
作者: toy    时间: 2012-1-29 12:42

各位老师：你们好。现在做的课题是用流式细胞仪检测外周血中性粒细胞凋亡的情况。想在全血中加Annexin－V和PI，然后裂解红细胞。看到国外有文献报道，且做CD11时全血中加入CD11单抗，然后破红细胞检测，结果还可以。且分离之后凋亡率就比较高，可能是分离本身对细胞有损伤，现在不知道应该怎么办了，请各位老师帮忙指点一下。多谢！
作者: duoduo    时间: 2012-1-29 12:42

这里我想请教一下，对流式真的没有放大效应吗？我觉得基本点既然是抗原抗体反应，就肯定会有放大作用的，特别是采用间接法时。另外，我认为流式与Wb、IHC等技术是的一个关键注意点是抗原的状态，用流式时是天然的，而Wb、IHC是变性的，结果能否相符主要看抗原处理后的位点变化了。

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流式细胞仪当然可以检测细胞内蛋白，这一点，并不是很难，当然要比检测细胞表面抗原复杂些，好在都已经有现成的方法，不成问题。
不过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、免疫组化没有本质差别，但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用western（尤其是化学发光底物更佳）和免疫组化更好。当然，流式最大的一个特点就是，可以定量（百分比），如果是高表达的用流式细胞仪非常有优势。
流式检测时要求有抗体，可以是直接标记或简介标记的荧光抗体。细胞需要预先固定处理，常用的是多聚甲醛、TritoonX－100、75％乙醇等，具体步骤可参考相关文献，都有详细说明。
作者: 兔唇    时间: 2012-1-29 12:43


不知道有没哪位做过BD流式CBA系统测定细胞因子，BD公司这次在FIMSA上做了专题讲座，听了觉得还不错，哪位做过的可否给些指导！
作者: 大尾巴    时间: 2012-1-29 12:44     标题: 回复 #1136 兔唇 的帖子

我有用过BD CBA kit感觉还可以，确实比ELISA方法方便多了，但还没用过最新的可以灵活组合的CBA Flex Set及phospho的东东，有可能的话可以试试去，挺棒的思路！不知道你要要什么指导，具体的protocol 什么的BD的网站上都有，你也可以联系BD公司的人要相应的文献什么的。
作者: 大尾巴    时间: 2012-1-29 12:44

用wi***i和mfi分析数据是二个概念，mfi是专门用来分析细胞周期的软件，且只能在MAC上使用的软件。你只要手里有当时做流式的数据文件，可以用所用的流式分析软件做结果的处理。不过，目前只有wi***i等几个小软件可以在PC机上使用，绝大多数功能强大的分析软件都是仪器公司提供的。像你这种情况，建议回到原来做实验的地方，请他们帮忙分析。
此外，我再提供你一个流式分析软件的下载站点，你可以试用一下这些软件。祝你好运！！！
cuturl('http://facs.scripps.edu/software.html#winapps')

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错耶！！MODFIT软件也有PC版本可以用在PC机上，建议不清楚时不要误导大家。
作者: 大尾巴    时间: 2012-1-29 12:45

能不能回答上面我的问题，我最近比较急！谢谢！谢谢！
我是一个新手，要使用PI测定药物处理的白血病细胞周期变化，但是我不晓得要购买些啥试剂？试剂如何配制？具体的试验步骤？能否给我些资料？谢谢？

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http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3101793&sty=3
另外，我已向您的信箱中发送了一份详细，专业的实验方法，PDF格式，请注意查收，祝好运！
作者: 大尾巴    时间: 2012-1-29 12:45

各位老师：你们好。现在做的课题是用流式细胞仪检测外周血中性粒细胞凋亡的情况。想在全血中加Annexin－V和PI，然后裂解红细胞。看到国外有文献报道，且做CD11时全血中加入CD11单抗，然后破红细胞检测，结果还可以。且分离之后凋亡率就比较高，可能是分离本身对细胞有损伤，现在不知道应该怎么办了，请各位老师帮忙指点一下。多谢！！！

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一般的试剂盒，对Annexin－V和PI染色后的上机时间要求都比较严格，有人认为加入PI　5分钟后，溶液的PH会有所变化，从而抑制Annexin－V　FITC的活性，从而影响结果。我不知道你为什么要染色后裂解RBC，建议先把全血中的中性粒Cell提出来再染色。
作者: 兔唇    时间: 2012-1-29 12:46


大家好，
我想检测脾淋巴细胞的表面抗原，请教大家：
1、因为不能同时取材，不知脾淋巴细胞如何保存，是保存组织好，还是保存单个细胞悬液比较好，不会破坏细胞的表面抗原？
2、细胞是否需要固定？如果需要固定，怎样固定最合适呢？我看到有些文献上说抗体染色后用1％的多聚甲醛固定，然后上机检测。有些人又说不能固定，固定后会破坏表面抗原。
多谢各位指教！

另：这个专题讨论区太长了，我没能看完，希望我的问题不会和前面重复，如果有重复请哪位好心人告诉我具体的位置，谢谢！
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-29 12:46


各位大虾好：我是新手，刚接触流式，想请教大家一些简单问题，
我从外周血中分离单核细胞，需要用流式细胞技术对分离的单核细胞进行鉴定：
1、单核细胞密度多少？
2、细胞如何固定？
3、需要设同型对照吗？
4、能否告之详细的实验步骤？
万分感谢
作者: fklo83    时间: 2012-1-29 12:46

大家好
我这里的机器是BD公司的FACSVantageSE,和CALIBUR
CALIBUR是新买的,VANTAGE用了几年了,特别是机器校准很熟悉
我比较忙,来这里的时间不是很多
大家有什么问题可以交流一下

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PS:我现在有个calcium calibration的盒子,有谁想检测可以过来联系一下
如果效果很好可以开展项目如果效果不好就FREE
作者: fklo83    时间: 2012-1-29 12:47

大家好，
我想检测脾淋巴细胞的表面抗原，请教大家：
1、因为不能同时取材，不知脾淋巴细胞如何保存，是保存组织好，还是保存单个细胞悬液比较好，不会破坏细胞的表面抗原？
2、细胞是否需要固定？如果需要固定，怎样固定最合适呢？我看到有些文献上说抗体染色后用1％的多聚甲醛固定，然后上机检测。有些人又说不能固定，固定后会破坏表面抗原。

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固定应会破坏表面抗原,
1％的多聚甲醛固定应该是在做完标记以后
如果是新鲜组织或细胞检测,那就应该取材后立刻标记
否则保存组织或细胞悬液效果都不好
作者: mickeylin    时间: 2012-1-29 12:47


我有一问题想向你请教。前些日子，我用流式做细胞凋亡这方面，流式细胞仪是BD公司的，方法采用Annexin v-FITC，做凋亡分析时需要用门选细胞，是不是？我当场记下的结果和我后来整体去拷结果有一些出入，是不是因为门发生了改变？望你给予指点。
作者: 131415    时间: 2012-1-29 12:48


请教RD1是否就是PE，PC5是否是PE－cy5，如果不是的话，它们的荧光强度有何差别？
作者: wsll    时间: 2012-1-29 12:50

请教各位老师：
我准备用流式测腹膜间皮细胞上的葡萄糖转运蛋白，查到SANTA CRUTZ 公司有一种抗体Glut1 (H-43): sc-7903 ,其说明为推荐可用WB IP IF测小鼠大鼠及人的Glut1，不知道是否可用于流式，IF的含义是什么，谢谢了！
cuturl('http://www.scbt.com/catalog/detail.lasso?-Search=Action&-Table=web_detail&-Database=catalog&-token.order_id=3990153&-KeyValue=40667&-OperatorLogical=or')
作者: wsll    时间: 2012-1-29 12:50

可用于免疫荧光（IF)的这种抗体能否作流式，谢谢
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-29 12:52

流式细胞仪在血栓与止血方面的应用主要有些什么？我所知道的主要应用于检测血小板表面膜糖蛋白，血小板相关抗体，血小板功能检测等。我想问一下还在血栓与止血方面，流式细胞仪还能检测一些什么项目？
作者: 阿敏    时间: 2012-1-29 12:52

我这里有个小小的问题想要请教：对于检测肿瘤细胞内钙离子的浓度的话，流式细胞仪和激光共聚焦那个更有优势些呢？激光共聚焦可以观测动态的钙变化，而流式只能观测细胞某一时段的钙变化，比若24和48小时后的变化，如何来取舍这两个检测手段呢？先谢谢了！
作者: summerxx    时间: 2012-1-29 12:54

请问做细胞分选时,上样细胞数为多少?另,细胞和抗体比是多少?
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 12:54


一. 流式细胞术概述
流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标
1．流式细胞仪的分析速度：
一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。
三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统
流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 12:55

流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。

图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide)
四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488ηm,此外可配备氦氖离子气体激光管（波长633ηm）和/或紫外激光管。
流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关，激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照，正是能达到这一要求的理想的激发光光源。
在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μm×66μm)，在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。
五. 流式细胞仪主要构造和工作原理 光学系统
流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为2片透镜、1个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰；流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类：长通滤片（LP）--只允许特定波长以上的光线通过，短通滤片(SP)-- 只允许特定波长以下的光线通过，带通滤片(BP)-- 只允许特定波长的光线通过，不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT),如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525, 接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575, 接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。见图12.2光学系统和信号检测系统示意图。
六. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号检测系统
当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射（Forward Scatter, FS）和侧向角散射或900散射（Side Scatter, SS）,散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备（如染色）无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。
前向角散射（FS）反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号；侧向角散射或900散射（SS）反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。
流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm）。488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是：
激发光波长（ηm） 发射光峰值（ηm）
FITC 488 525（绿）
PE 488 575（橙红）
PI 488 630（橙红）
ECD 488 610（红）
CY5 488 675（深红）
PreCP 488 675（深红）
各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内.见图12.2光学系统和信号检测系统示意图。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 12:55

七. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号存储、显示、分析系统
(一) 信号存储
存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode(列表排队)方式存入的,采用List mode方式有两大优点:①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析。
（二）信号显示和分析
由于List mode方式数据缺乏直观性，数据的显示和分析一般采用一维直
方图(图12.3)、二维点阵图(图12.4,12.5)、等高线图(图12.8)和密度图(图12.7)。
1．单参数数据显示和分析 细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显 示，图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，其单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的；纵坐标表示细胞数。见图12.3一维直方图，图中横坐标是FITC荧光信号相对强度值（对数），纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的“门”（直线门），仪器的计算机就会给出测定值（包括阳性细胞%和平均荧光强度）。
2.双参数数据显示和分析 细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。如图12.4二维点阵图，是正常人外周血白细胞的前向散射光（FS）和侧向散射光（SS）组成的点阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中淋巴细胞、单核细胞、粒细胞很明显地分为3群，可以很容易地圈“门”（ Bitmap，无定型门），分析各亚群细胞的数据;图12.6假三维地形图(X轴: SSC ,Y轴:FSC Z轴:细胞数)更清楚地表明这一点。图12.5二维点阵图是细胞的两种荧光（FITC和RD1）双参数数据显示，横坐标和纵坐标均是对数的，横坐标代表FITC，纵坐标代表PE，图中已设定适当的“门”（十字门），十字门的D1、D2、D3、D4门分别代表PE单阳性细胞、PE和FITC双阳性细胞 、阴性细胞、FITC单阳性细胞。仪器的计算机就会给出两种荧光测定值（包括阴性细胞%、两种荧光各自的阳性细胞%、两种荧光的双阳性细胞%、各群细胞的平均荧光强度）。 图12.7和图12.8分别是测定细胞的两种荧光双参数数据的密度图和等高线图，横坐标和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定十字门就可得到两种荧光的各种测定值，密度图和等高线图较点阵图更直观。
3．三参数数据显示和分析 细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据）用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。三个荧光数据关系用分光图（prism）表示，分光图可直接给出8个数据（如用ABC代表3种荧光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。见图12.9 prism，图12.9为人外周血淋巴细胞亚群测定结果的分光图，图中给出CD3、CD4、CD8组合的各种结果，如T辅助细胞（CD3+CD4+CD8-）为42.0%,如T抑制细胞（CD3+CD4+CD8-）为17.4%。
图12.5两种荧光的二维点阵图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.7. 双参数数据的密度图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.6假三维地形图和二维点阵图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.8双参数数据的等高线图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.9 分光图（prism）
八. 流式细胞仪主要构造和工作原理 细胞分选系统
如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室高频震动,使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴, 每秒钟形成液滴上万个。每个液滴中包含着一个样品细胞,液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中,不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而实现了分选。分选的详细原理和操作请有兴趣者参考有关文献。
九. 流式细胞术在血液学中的应用 DNA倍体分析及细胞周期分析
在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化,正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go), G1期细胞虽有DNA合成，但DNA含量仍为2N，为二倍体细胞,;处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA含量为2N-4N;正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的DNA(4N)。细胞经固定后用PI(Propidium Iodine 碘化丙啶)等荧光染料染色即可上机测定。但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰。FCM可在测量大量细胞(数分钟可测定105个细胞)后给出DNA分布直方图,见图12.10.正常人外周血DNA示意图，图中第一个峰(G1)是DNA含量为2N 的细胞峰, 第二个峰是DNA含量为4N 的细胞峰,两峰之间是DNA含量为2N-4N的处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞。用厂家提供的Multicycle软件，计算机可自动计算出G1%、S+G2M%;如用DNA/RNA双参数分析,可得到G0:G1%,G0/G1期DNA指数, 如标本中有凋亡细胞,在G1峰前会出现一个亚G1期峰,软件可自动计算出凋亡细胞的%。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 12:55

图12.10.正常人外周血DNA示意图(采自Coulter Training Guide)
DNA倍体分析的临床有价值的指标是DNA非整倍体和/或超二倍体%和四倍体%增高。这些改变是肿瘤细胞的特异性改变,和实体瘤相比,急性白血病非整倍体发生率较低,约30～40%。
十. 流式细胞术在血液学中的应用 淋巴细胞亚群测定
淋巴细胞担负着免疫的主要功能。淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。临床经常测定的淋巴细胞亚群包括T淋巴细胞 (CD3+), T 辅助细胞 (CD3+CD4+), T 抑制细胞(CD3+CD8+), B 淋巴细胞（CD19+或CD20+），NK 细胞 (CD3-CD56+)等。
常用来测定淋巴细胞亚群的单克隆抗体(Monoclonal Antibody McAb)都是小鼠抗人Ig,有精制抗体,有直标荧光抗体,现在一些国外公司有双色和三色McAb出售,如CD4-FITC/CD8-RD1、CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等,此时应根据这些双色或三色McAb的Ig性质选择相应的阴性对照,如MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC等。上机测定时应先测定阴性对照管,阴性对照的阳性细胞应＜2.0%。
三色测定可给出更为准确的各亚群的情况:如真正的T 辅助细胞应是 CD3+CD4+CD8-, 真正的T 抑制细胞应是 CD3+CD4-CD8+,单标CD8+细胞中不仅有T 抑制细胞,还含有30%左右的NK细胞;而CD3+CD4-CD8-细胞群是γδT细胞,此类细胞与感染有关, CD3+CD4+CD8-细胞+CD3+CD4-CD8+细胞+CD3+CD4-CD8-细胞+CD3+CD4+CD8+细胞=CD3+细胞。如单标记CD56不能准确测定NK 细胞,NK 细胞应是 (CD3-CD56+),因为CD56+细胞中包含着非HLA束缚细胞毒T 细胞(CD3+CD56+)。双色组合还能测定B 淋巴细胞（CD3-CD19+或CD20+）、激活的T 细胞(CD3+CD69+或CD3+25+)等。
应用适当的双色组合如CD4与CD29,CD4与CD45RA,可以测定T辅助细胞的的亚群。如CD4+2H4(CD45RA)+细胞是Ts的诱导细胞;CD4+4B4(CD29)+细胞Th的诱导细胞。同理,利用CD8+CD45RA和CD8+CD29+S6F1可测定T抑制细胞的亚群。
T辅助细胞还可分成Th1、Th2两个亚群，同时标记细胞内细胞因子IFN-γ和IL-4，可区分Th1细胞（CD4+/ IFN-γ+）和Th2细胞（CD4+/ IL-4+）。
利用CD25、CD69等McAb和其他淋巴细胞标记双色或三色标记还可测定淋巴细胞亚群的功能状态，如活化T8、活化B细胞等。
以下给出常用细胞亚群的正常范围供参考,请注意同一CD中有多种克隆的McAb, 同一CD中不同McAb所测出的数值不同,每个实验室应测定自己实验室的正常数值。
CD3+ 70.0±12.0% +4B4+ 23.0±7.0%
CD3+CD4+CD8- 40.0±9.0% CD4+2H4+ 19.0±6.0%
CD3+CD4-CD8+ 30.0±8.0%
CD3-CD56+(NK) 12.0±8.0%
十一. 流式细胞术在血液学中的应用 白血病免疫分型原理
白血病免疫学分型是利用单克隆抗体(McAb)检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。对白血病细胞抗原的分析研究有助于对白血病分型,为诊断和治疗提供依据。白血病免疫分型是形态学分型的重要补充和进一步深化，国际MIC分型协作组认为每一例急性白血病的免疫分型都是必不可少的。白血病免疫分型对鉴别急淋和急非淋有决定作用，对鉴别急非淋的某些亚型如M7、M3也有决定作用，对于一些用形态学、细胞组织化学不能诊断的急性白血病，急性未分化白血病，混杂性白血病等有重要意义。自从单克隆抗体问世以来,最成功的应用就是研究造血系统各类细胞表面抗原与细胞增殖、分化及恶变的关系。研究发现细胞表面抗原有重要功能,一些抗原分子作为细胞生长因子的受体而影响细胞的增殖分化;一些抗原分子作为细胞间相互识别的物质基础而参与细胞间相互作用;一些抗原分子则是细胞特异功能的物质基础。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 12:56

从多能造血干细胞(PHSC)分化成熟为功能细胞过程中, 细胞表面和细胞浆内抗原随着分化成熟过程不断发生改变, 这些抗原称为造血细胞分化抗原。造血细胞分化抗原是造血细胞分化过程中由细胞核内染色体上的基因编码的镶嵌蛋白, 其出现、增多、减少或消失与造血细胞分化密切相而表现出与细胞系列及分化程度相关的特异性。这些抗原可作为鉴别和分类造血细胞的标记。如髓系细胞的MPO、CD33、CD13、CD14、CD15等抗原;巨核系的CD41、CD41、CD61抗原; T淋巴细胞的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等抗原;B淋巴细胞的CD19、CD20、CD22等抗原。至今尚未发现白血病细胞特异性抗原，而白血病细胞是造血细胞在某一分化阶段的大量积累,表达与之相应的造血细胞分化抗原，因此可用造血细胞分化抗原类标记检测白血病细胞; 但白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表达与正常造血细胞并不完全相同。常有丢失某一分化发育阶段正常应有的抗原,或表达某一分化发育阶段正常不应有的抗原，或表达其他系列抗原，部分丧失了系列专一性和分化的严格性。
用FCM检测白血病免疫分型具有快速、简便、重复性好等优点。由于FCM可根据FSCνSSC直方图区分细胞并可圈定检测细胞范围(Bitmap，无定型门),或用SSC(线性或对数)和CD45直方图圈定检测细胞范围(Bitmap，无定型门)，排除其他细胞干扰，因此较光学显微镜免疫荧光法或免疫组化法结果更准确。
十二. 流式细胞术在血液学中的应用 白血病免疫分型其临床意义
目前公认的系列特异性指标是:T淋巴细胞系--胞浆CD3（cCD3）,B淋巴细胞系-- cCD22或cCD79，髓系---MPO 或cCD13,一般可先用他们区分细胞系列后再进一步分析某一系列亚型和分化阶段。
1. ALL的免疫学分型
1986年前分为普通型ALL（cALL）、未分化细胞ALL （Null-ALL）、T细胞ALL（ T-ALL） 、前B细胞ALL （PreB-ALL）、B细胞ALL （B-ALL）五型;1986-1994年分为两大类九型(非T-ALL六型,T-ALL三型),九十年代后期有人按临床实用性一般分为B祖细胞ALL、前B细胞ALL、B细胞ALL、T细胞ALL四型。表12.1-表12.4列出ALL的五型、九型（ B细胞系列六型、T细胞系列三型）、四型分类法。

B-祖细胞 ALL :B-祖细胞ALL 占儿童ALL的65%-70%,青少年ALL的55%-60%,成人ALL的50%,儿童ALL >90%病例 CD10+，而婴儿CD10+病例<50%。FAB分类为L1、L2，白血病细胞的FS和SS都很低;一般TdT、HLA-DR、CD19阳性，大多数病例CD24、CD34阳性，本型细胞膜免疫球蛋白(Ig)阴性。此型有CD10+、CD10-两个亚型，CD10+型预后较CD10-型好。
前B 细胞ALL ：前B 细胞ALL在发育阶段上较B祖细胞 ALL晚，占儿童ALL的25%，在成人ALL占的比例还不清楚。一般CD24、HLA-DR、CD19、 CD10、cCD22阳性，CD34阴性,鉴别特点时有胞浆重链μ。此型预后较B祖细胞ALL差，可能与t(1;19)有关，t(1;19)占前B 细胞ALL的25%，此型CD34-，而B系列ALL中CD34-是独立的预后不良标记。
B细胞ALL ：B细胞ALL 占所有ALL 的2%-5%；B细胞ALL更为成熟，白血病细胞的FS和SS较B-祖细胞 ALL明显增加，在FSνSS直方图或SS(线性或对数)νCD45直方图中处于淋巴细胞和单核细胞区域。典型标记是细胞膜免疫球蛋白（sIg）阳性,表型一般为CD19、CD20、CD22、CD24阳性,多数病例CD10+，但sIg和成熟抗原出现可区别于更早的B系ALL。此型FAB分类一般为 L3,罕见病例有B细胞ALL标记而FAB分类一般为 L1，这些病人多有t(1;19)和t(14;18)。
T细胞ALL ：T细胞ALL占儿童ALL的15%,成人ALL的25%。多数表型为胸腺细胞型，最常见的是晚期胸腺皮质细胞亚型，CD1+、CD2+、CD5+、CD7+,CD4+CD8+，CD3表达较少，TdT常阳性；另一常见亚型是早期胸腺皮质细胞亚型，CD2+、CD5+、CD7+、TdT+。髓质期亚型较少见，CD2+、CD5+、CD7+，CD3+CD4+或CD3+CD8+，TdT表达较少。前T细胞亚型，仅有CD7和cCD3而无其他T系抗原表达，预后较差。T系肿瘤性疾病多有特异性正常抗原表达的下调或表达该分化阶段正常不应出现的抗原。成人T细胞ALL预后较好，而儿童T细胞ALL较儿童B-祖细胞 ALL和前B细胞 ALL预后差，虽然各亚类预后仍不甚明确，但CD10阴性者预后不良。
ALL 的免疫学分型经过1986年前分为五型，1986-1994年分为两大类九型,九十年代后期(1997)分为四型的过程。1986年前的五型，是当时单克隆抗体和检测手段的反映；随着新的单克隆抗体（主要是T、B淋巴细胞亚群的McAb）的发现和临床大量病例的检测，不仅弄清了T、B淋巴细胞的来源、分化发育过程，而且使免疫分型更加细致，因而出现了1986-1994年分为两大类九型；但按照细胞的分化发育阶段分型的两大类九型分型法对临床略显繁琐，指导治疗、判断预后临床实用性也不够强，因此又出现了以上简单的四型分类法。经过对比不难看出，四型分类法的B-祖细胞ALL型实际上包含了两大类九型分类法的非T-ALL的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3个亚型，而Ⅴ型即是前B 细胞ALL型，Ⅵ型是B 细胞ALL型；而T细胞ALL型是两大类九型中T-ALL的三型合并为一型。两大类九型分类法的非T-ALL的Ⅰ型分类为急性未分化白血病（见后）。
ALL也可按DNA含量分类，用流式细胞仪很容易测定DNA含量，DNA含量分为两个亚类：超二倍体和亚二倍体，前者预后好，后者预后差。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 12:57

2.急性髓细胞白血病(AML)攪
目前所有粒、单核系的单克隆抗体基本无分化发育阶段特异性,因此AML的免疫学分型FAB-M0、M1、M2界限不十分明显;但M3多不表达HLA-DR和CD34，常表达CD13、CD33、CD9、CD38；GPA在鉴别红白血病(M6)时可提供帮助;巨核细胞白血病(M7)则有CD41、CD42、CD61为系列特异标记,为确诊的重要指标。由于白血病的异质性,同一FAB分类的白血病抗原表达并不完全相同。AML的免疫表型见表12.5。

M0：M0白血病细胞的FS和SS都很低，在SSνCD45直方图中处于原始淋巴细胞区域。M0的白血病细胞至少表达一个髓系特异性标记如MPO、CD13、CD116，MPO较CD13、CD116更敏感；一般淋巴系标记是阴性的，但可能表达CD7或CD4；一般CD34、HLA-DR阳性。有研究显示AML复合表达CD7和CD34预后不良。
M1：M1的白血病细胞抗原表达类似于M0并与M0不好区分，M1一般表达CD13，CD33和HLA-DR，CD34表达较M0少，部分可能表达CD15，较少病人可能表达CD4。
M2：M2与M1的主要区别是分化成熟增加，原始细胞减少；CD34表达较M1少，CD15表达较M1增加，大部分病例HLA-DR阳性，CD13表达强于CD33；部分M2表达CD19和CD56伴有t(8;21)，罕见的伴有t(8;21)的M2不表达CD13，CD33和CD14但MPO阳性。
M3：M3白血病细胞由于它的高颗粒性而SS增大；M3的白血病细胞一般表达CD13，CD33，部分病人可能表达CD2，但HLA-DR阴性，CD34一般为阴性，复发病人阳性；部分病人可能表达CD56，表达CD56者应作基因检查(APL/RARα)以排外髓/NK细胞急性白血病(详见后)。
M4、M5：M4、M5的免疫表型相似，重要表型特点是表达CD13、CD33、CD14、CD15和HLA-DR，部分病人表达CD4、CD7,部分病人可能表达CD56，表达CD2多为M4E0，常伴有16号染色体异常，预后好。
M6：M6较少见，一般表达HLA-DR、CD34、CD13、CD33，GPA对确定红系有用。
M7：M7占成人ANLL的1%、儿童的4%。成人M7多见于二次性白血病,即CML.BC或MDS-RAEB或MF白血病变。而儿童M7多为原发。M7免疫学表型一般为:CD41+,CD42+,CD61+,CD33+/-,CD13+/-,CD34+,DR+/-,CD10-。特异性标记CD41、CD42、CD61阳性可确诊M7，但要注意排外血小板粘附于细胞上的假阳性结果。
3．急性未分化白血病 用流式细胞仪分析仅有大约1%的急性白血病不能分类，典型急性未分化白血病仅有HLA-DR和CD34表达而无系列特异性抗原表达。
4．杂合型白血病 真正的双系列表型白血病是伴有t(9;22)或有11q23 MLL（myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia髓/淋系或混合性白血病）基因重排的病人，以往报道的许多杂合型白血病多是由于方法学问题不能排除非白血病细胞的干扰，或将非特异弱表达当作特异表达，如前所述白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表达与正常造血细胞并不完全相同，部分丧失了系列专一性和分化的严格性，因此不要轻易定型杂合型白血病，国际上杂合型白血病尚无统一诊断标准。
5．慢性粒细胞白血病急性变(CML BC) 慢性粒细胞白血病(慢粒 CML)是一种多能造血干细胞疾病,其转归多为急性变。慢粒急变(CML BC)涉及所有造血细胞系列,往往不易从形态学上确定急变类型, 50%-60%为AML变,30%左右为ALL变。AML变可表达AML的所有表型，大多数ALL变为B细胞来源,其中cALL及前B-ALL多见,罕见T-ALL变。
6．B 淋巴系细胞增殖性疾病 B 淋巴系细胞增殖性疾病的免疫学分型见表12.6。
采自C.D Jennings and K A.Foon略加改变. MCL: mantle cell 淋巴瘤; FCCL:Follicular center cell lymphoma---泸泡中心细胞淋巴瘤; MZL: Marginal zone lymphoma—边缘区淋巴瘤; SLL:small cell lymphocyte lymphoma--小细胞淋巴细胞淋巴瘤
B 淋巴系细胞增殖性疾病中包括B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B幼淋细胞白血病（B-PLL）、毛细胞白血病（HCL）和多发性骨髓瘤（MM）/浆细胞白血病和部分淋巴瘤，淋巴瘤免疫分型将在不同章节中描述。
B-CLL：B-CLL的白血病细胞一般表达CD19、CD20、CD43和CD79a，CD5与以上抗原复合表达，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表达但表达较弱，CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 12:58

B-PLL ：流式细胞仪在区分B-PLL和B-CLL中十分有用, B-PLL通常sIg表达强, CD5阴性而CD22阳性,困难的是原发B-PLL和由B-CLL转化为B-PLL的区分, 由B-CLL转化来的B-PLL CD5阳性而CD22表达弱,类似于B-CLL。
HCL：HCL 一般表达成熟B细胞标记:CD20、CD22、CD19、CD79、sIg，CD11c、CD22高表达，CD25中等度以上表达，一般CD21-，典型病例CD5-、CD10-、CD23-，但有少数病例可阳性。CD103是HCL最可信的标记，可用来与其它B细胞白血病鉴别。
浆细胞瘤：由于大多数多发性骨髓瘤病人骨髓标本中含骨髓瘤细胞少及瘤细胞丧失了大多数B细胞系特异性标记，用流式细胞仪分析多发性骨髓瘤（MM）/浆细胞白血病较为困难，典型的浆细胞CD38强表达而CD45弱表达。一般浆细胞sIg弱表达,cIg阳性。
7．T淋巴系细胞增殖性疾病 T淋巴系细胞增殖性疾病的免疫学分型见表12.7。
T淋巴系细胞增殖性疾病中包括T幼淋细胞白血病（T -PLL）、NK细胞白血病（T-LGL、NK-LGL）和成人T淋巴细胞白血病（ATL）、T慢性淋巴细胞白血病(T-CLL)。
T-PLL ：T-PLL的白血病细胞一般表达CD2、CD3、CD5和CD7，大多数病人CD4+ CD8-,但偶有CD4+ CD8+,单独表达CD8者少见, 本病常伴有14q11和14q32改变, 有CD4+ CD8-表型者预后较好,本病较B-PLL恶性度高。
NK 细胞白血病 ：NK系列白血病最早描述的是大颗粒淋巴细胞白血病（LGL）, LGL有两种类型：T-LGL和NK-LGL，T-LGL表达CD3、CD8、CD2、CD16、CD11b、CD57、而CD56、CD5、CD7、CD4和CD25多阴性，有TCR基因重排。NK-LGL表达CD2、CD16和CD56，而CD3、CD4多阴性，CD8、和CD57弱表达或阴性，无TCRα-β基因重排。最近NK系列白血病又有新的亚型发现，如急性前髓系/NK 细胞白血病、急性髓系/NK 细胞白血病、原始NK 细胞白血病、NK样T细胞白血病。急性前髓系/NK 细胞白血病是一种最近认识的不同类型的白血病, 其特点是有明显髓外涉及,不成熟的原始淋巴细胞样形态,伴MPO--、CD7+、 CD33+/CD13+、sCD3-、cCD3-、CD56+,预后不良。急性髓系/NK 细胞白血病，形态学和免疫表型类似于M3,但无RARα基因重排，一般HLA-DR-、CD33+、CD13+、CD56+，多见于老年病人，对维甲酸无反应。原始NK 细胞白血病，无髓系和淋巴系抗原，CD56+、cCD3+/-、CD2+/-、CD4+/-、CD7+/-，少数有TCRβ基因重排，而无TCRγ-δ基因重排。NK细胞系列白血病的新亚型是近10年才较多注意到的白血病,其临床特点,免疫表型,染色体及基因改变需进一步积累病例研究才能彻底明了。大约10%-20%左右的急性白血病表达CD56，除了原始NK 细胞白血病、NK样T细胞白血病、急性髓系/NK 细胞白血病、急性前髓系/NK 细胞白血病外，大部分表达CD56的急性白血病是FAB分类的M2、M3、M4、M5型，这类病人究竟是急性髓系/NK 细胞白血病还是急性髓系细胞白血病伴NK抗原表达有待进一步研究，鉴于急性白血病部分丧失了系列专一性和分化的严格性，可能称为急性髓系细胞白血病伴NK细胞抗原表达较为合适。
成人T淋巴细胞白血病(ATL)：大多数ATL细胞表达激活T细胞表型：CD3、CD4、CD5、CD25、HLA-DR、TCR，一般CD7-和CD8-,常有粘附分子L-选择素的异常表达； 伴有p53异常者预后不良。
T-CLL：T-CLL少于CLL总数的1%，细胞形态学类似与一般CLL，但临床发展较快，但多数病人表达CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、少数病人表达CD8。
十三.流式细胞术在血液学中的应用 淋巴瘤免疫分型
目前淋巴瘤的分类方法已从LSG的形态学分类逐渐转变为REAL分类法, REAL分类法是以肿瘤发生源为基础的分类方法,在原来的形态学基础上加上免疫学分型后再加以分类,这种分类方法不仅能够推断肿瘤的发生源,对治疗也有指导意义。因此淋巴瘤的免疫分型越来越重要。如同白血病免疫分型一样，淋巴瘤的免疫分型也是利用单克隆抗体检测淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测淋巴瘤细胞所属细胞系列及其分化程度。流式细胞仪能对多数的淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原迅速客观地做出检测，在淋巴瘤的免疫分型中起着不可替代的作用。
临床淋巴瘤的免疫分型的检测标本一般是淋巴结、脾脏、胸水、腹水等。在临床淋巴瘤的免疫分型工作中常可遇到以下四种情况：①B细胞系淋巴瘤②T/NK细胞系淋巴瘤③淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤④造血细胞以外的肿瘤。
REAL分类淋巴瘤的免疫表型见表12.8。

*：弱表达或阴性。
BLBL :前B原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病; BSLL: B-小淋巴细胞淋巴瘤; LPL:淋巴浆细胞样淋巴瘤; MCL: 斗篷细胞淋巴瘤; FCL:滤泡中心淋巴瘤; MZL: 边缘带B细胞淋巴瘤; SMZL :脾MZL ;HCL:毛细胞白血病; PC:浆细胞瘤;DLBL: B-弥漫性大细胞淋巴瘤; BL: Burkitts淋巴瘤; HBLB:高度B细胞淋巴瘤, Burkitts样; TLB L: 前T原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病; TPLL: T幼淋细胞白血病; LGLT:大颗粒淋巴细胞白血病, T细胞型; LGLNK: 大颗粒淋巴细胞白血病, NK细胞型; MF:覃样真菌病; PTL:外周T细胞淋巴瘤,非特异;AILD:血管免疫T细胞淋巴瘤;ACL:血管中心性淋巴瘤; ITCL:肠T细胞淋巴瘤; ATL:成人T细胞淋巴瘤/白血病; LCL:大细胞淋巴瘤; LCLH: 大细胞淋巴瘤,何杰金氏样;
1． B细胞系淋巴瘤 大多数情况下, B细胞系淋巴瘤CD19、CD20阳性，分化早期CD20阴性，CD10、CD34阳性；分化晚期CD5、CD23阳性，成熟为浆细胞后以上标记均阴性。利用单克隆抗体κ、λ（正常时κ：λ=2：1）可检测免疫球蛋白轻链的偏移，推断是否克隆性增殖免疫球蛋白。表12.6. 列出了外周B 淋巴系淋巴瘤的4种类型的免疫分型。
SLL(small cell lymphocyte lymphoma)--小细胞淋巴细胞淋巴瘤: 小细胞淋巴细胞淋巴瘤细胞一般表达CD19、CD20、CD43和CD79，CD5与以上抗原复合表达，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表达但表达较弱，CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。
MCL（mantle cell lymphoma）--斗篷细胞淋巴瘤：MCL包括以前分类为中等淋巴细胞淋巴瘤（ILL）、中度分化淋巴细胞淋巴瘤(IDL)、中心细胞淋巴瘤和套区细胞淋巴瘤（MZL）,占淋巴瘤的2%-8%，λ型较κ型常见， sIgM中度表达,IgD弱或阴性，表达CD19、CD20、CD22、CD43，但多数病例CD5阳性CD23阴性，CD10一般阴性，CD5阳性CD23阴性和Ig类型可帮助鉴别MCL和FCL。
FCL（Follicular center cell lymphoma）---泸泡中心细胞淋巴瘤：FCL占淋巴瘤的45%，表达CD19、CD20、CD22， sIg强表达,但多数病例CD10和CD23阳性，典型FCCL CD5、CD43和CD11c阴性。CD10阳性、CD11c阴性和sIg强表达利于与MZL鉴别。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 12:58

MZL（Marginal zone lymphoma）--边缘带淋巴瘤和相关B 细胞淋巴瘤：典型免疫表型: CD19、CD20、CD22、HLA-DR阳性，sIg中度表达，CD5、CD10、CD23、CD25阴性，CD21、CD24多数情况下阴性，多数表达CD11c。CD5、CD10、CD23、CD25阴性，CD21、CD24多数情况下阴性，利于与CLL/SLL、FCCL、MZL鉴别。
2． T/NK细胞系淋巴瘤 早期T细胞一般CD2、CD5、CD7、cCD3阳性。T/NK细胞系淋巴瘤的详细分类及表型参见表12.8。细胞膜CD3阳性可确认为外周T细胞肿瘤, 外周T细胞肿瘤的特征是CD3与CD4或CD8复合表达，并常有克隆性T细胞受体，或α-β型或γ-δ型；
MF（mycosis fungoides）--蕈样真菌病和sezary综合症:占皮肤淋巴瘤的绝大多数，CD4阳性，同时表达CD2、CD3、CD5，有时CD7阴性，CD8阳性病例极少见但已有报道，有无TCRβ基因重排对鉴别淋巴瘤和炎性反应有帮助。
LCL（large cell lymphoma）--大细胞淋巴瘤: 大细胞淋巴瘤（LCL）占成人淋巴瘤的40%，儿童的1/3，成人80%是B细胞型的，儿童B细胞型和T细胞型各占一半。
3． 淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤 急性髓系细胞白血病（特别是M4、M5）淋巴结转移时有发生，如T、B淋巴细胞标记低表达应怀疑并按白血病免疫分型处理。
4． 造血细胞以外的肿瘤 检测淋巴结、胸腹水标本时如遇CD45阴性情况应考虑非造血系统肿瘤淋巴结、胸膜、腹膜转移。
十四. 流式细胞术在血液学中的应用 红细胞疾病诊断
（一）网织红细胞测定
计数外周血中网织红细胞数量,对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要意义。有核红细胞在成熟过程中,脱去细胞核后仍有少量RNA残留在细胞浆内,再经过约一天时间残留RNA完全消失,成为成熟红细胞。这种细胞浆内有残留RNA的红细胞称作网织红细胞。正常情况下有一定量的网织红细胞出现在外周血中,正常值为1.0～1.5%,上限3.0%,但当红细胞数异常时会出现错误结果。因此用网织红细胞绝对值表示,正常值5～15×1010/L。由于常规方法测定须先在体外经活体染色(最常用亚甲兰),然后在显微镜下计数,计数细胞数有限。用流式细胞仪测定网织红细胞具有以下优点:①可避免由于细胞核的碎片或铁幼粒细胞的颗粒的存在而出现假性网织红细胞升高②可避免人为误差③因为可在短时间内测量上万个细胞,结果较常规方法准确、可靠,④同时可给出网织红细胞年龄结构。
流式细胞仪测定网织红细胞方法简单,只须将红细胞洗净后用荧光染料染色后即可上机检测。常用的荧光染料有焦宁Y(Pyronin Y) 丫啶橙(Acridine OrangeAO) 碘化丙啶(崐Propidium Iodine PI) 花青( Cyanine dye)等。
（二）PNH诊断
阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）因血细胞膜上锚固蛋白-糖磷酸肌醇（GPI）减少或缺乏而导致与GPI有关的补体激活抑制因子如CD55、CD59减少或缺乏，因而红细胞对补体异常敏感发生溶血。流式细胞仪检查CD55、CD59十分敏感，正常人CD55、CD59双阳性细胞>95%，PNH病人CD55、CD59明显减少，这种减少不仅表现在红细胞上，粒细胞、淋巴细胞也有减少。已发现CD55c可能对GPI减少或缺乏较CD59更敏感。
十五. 流式细胞术在血液学中应用 血小板功能分析和血小板病诊断
（一） 血小板功能分析
血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期血小板的膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同，用不同的抗血小板单克隆抗体可测定和分析血小板功能状态。血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、CD41b (GPIIb)、血小板颗粒膜糖蛋白CD62p、CD63的测定可供分析血小板功能状态，如CD62p、CD63正常血小板不表达，当血小板活化时表达明显增加，可用来测定活化血小板。
（二）血小板病诊断攪
1．血小板相关抗体测定 血小板相关抗体可因不同机制产生。抗血小板自身抗体(包括原发性、药物诱导产生、合并其它自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮)能引起严重的血小板减少。大多数原发性(免疫性)血小板减少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相关抗体PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相关抗体的抗原仍不十分清楚,可能有多种,如GPⅠb、GPⅡb 、GPⅢa、Pa、或HLA抗原。抗血小板自身抗体也可能发生于多次输血后或怀孕期间,这些自身抗体多为针对HLA-Ⅰ类抗原决定簇的抗体,一般是IgG,它们可迅速破坏和清除随机供血者的血小板。因此能迅速测定这些抗体存在与否的方法是必需的。许多不同的利用放免、荧光、酶、SPA等的测定血小板抗体的方法已建立,但这些方法都很复杂、费时;同时给出的结果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗体来表示。近年来发展起来的用FCM测定血小板抗体的方法具有快速、简便的优点,同时可测定血小板上和血清中的抗体;测定中FCM分析每一个血小板表面有无抗体,能给出血小板群体中有多少血小板表面有抗体(以%表示);同时能给出血小板相关抗体量与血小板数的直方图,使我们了解血小板相关抗体在血小板群体中的分布情况。
FCM测定血小板抗体原理:分别用标有荧光的抗人IgG、IgA、IgM或用抗血小板GPⅠb、Ⅱb、Ⅱb/Ⅲa的抗体与分离洗净的病人的血小板和在病人血清中孵育过的正常O型血小板作用后用FCM测定,前者测定的是病人血小板上的抗体后者测定的是病人血清中的抗体。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 12:59

2．血小板无力症 血小板无力症时血小板膜GPIIb/IIIa明显减少，用血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41、CD61和流式细胞仪测定不仅可测出GPIIb/IIIa减少，CD42a、CD42b基本正常或偏高，还可测出GPIIb/IIIa减少程度，分类血小板无力症。
3.巨大血小板综合征（BSS）:血小板巨大, CD42a减少，CD42b减少，CD61 增加。
十六. 流式细胞术在血液学中的应用微小残留白血病检测
微小残留白血病(Minimal Residual Leukemia MRL)是指白血病经治疗后获得完全缓解(Complete Remisson CR)后体内残留少量白血病细胞的状态。微小残留白血病与明显白血病(Overt leukemia)无明确界限,仅是白血病细胞负荷数量不同,一般成人明显白血病时白血病细胞可达1012,经治疗获CR后≤1010,因此MRL状态白血病细胞数可能是100-10攪。MRL是白血病复发的根源,因此检测MRL有十分重要的意义: ①指导临床治疗②预测白血病复发③评价自体骨髓移植的净化效果。应用FCM检测MRL的优点在于可在短时间内分析大量标本,具有快速的特点。
由于白血病细胞缺乏特异性标记,FCM检测MRL的效果尚不理想,敏感性尚不够高，一般仅有1/103-104。目前主要有两类检测方法: ①用FCM分析CR期骨髓细胞核酸量或染色体,可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性仅1-5%。②免疫表型分析,由于尚无白血病特异的标记,只能通过与正常细胞比较某些抗原量的差别及分布部位的不同作为检测依据;如利用TdT和CD10双标记检测MRL,但敏感性亦不高,约0.1-1%。
假阴性结果可能由于: ①标本中的白血病细胞＜10-4攪或＜10-5;②所取标本不能代表全身骨髓情况; ③病人白血病细胞表型转换。
十七. 流式细胞术在血液学中的应用白细胞吞噬功能测定
粒、单核-巨噬细胞是机体免疫反应和免疫调节细胞中的重要成员。它们不仅具有吞噬功能,吞噬外来的微生物、肿瘤细胞等,同时又分泌多种生物因子参于免疫反应,此外单核-巨噬细胞对抗原物质的摄取、修饰、递呈等作用,是淋巴细胞的免疫功能必不可少的。因此检测白细胞吞噬功能对了解机体免疫状况有重要意义。以下简要介绍FCM测定白细胞吞噬功能的概况。
应用光学显微镜、荧光显微镜测定白细胞吞噬功能时须分离粒、单核细胞, 并尽可能地保持细胞活性。用FCM检测时不须分离细胞,应用全血即可, 因此可在自然状态下测定,结果准确可靠。
目标粒子一般以酵母、细菌等能激发自然吞噬作用或予先以抗体调理化的人造粒子为好;并标以荧光,常用者为FITC(异硫氰酸荧光素)或RA(罗达明).
以肝素或拘橼酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200μl全血与目标粒子200μl(目标粒子浓度4×107/ml)置37°C温育,温育结束后立即置冰水中, 以同样标本不在37°C温育而置于冰水中者作为对照。目标粒子不同温育时间不一,FITC标记的金黄色葡萄球菌25分钟,FITC标记的粒子15分钟即可达到吞噬饱和;此外,粒子与白细胞的比例也很重要,一般为10:1。温育结束后以溶血剂溶去红细胞即可上机检测。
应用FCM全血法测定白细胞吞噬功能,对白细胞的丢失、损伤最小;此外用本法可测定血清中的调理素(Opsonine)水平及血清中有无吞噬作用抑制因子。如果用FITC标记的单克隆抗体 CD13、CD14、CD15标记粒、单核细胞,用红荧光标记目标粒子,即可测定吞噬功能与细胞表面标记的关系,对白细胞吞噬功能作进一步的研究。
十八. 流式细胞术在血液学中的应用NK和LAK细胞活性测定
NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标。人NK细胞一般表达CD56、CD16、CD57部分表达CD2、CD8、CD11而不表达CD3。
LAK(Lymphokine Activated Killer cells)细胞主要存在于LGL的高密度群体中,LAK前体细胞表达NK细胞标志CD16而不表达T细胞标志如CD3、CD4、CD5等;它们不需要抗原刺激就能杀伤NK细胞不能杀伤的肿瘤细胞,并且无MHC限制性;从表型上看大多数LAK细胞来自NK细胞,但严格讲LAK细胞对K562细胞的杀伤活性不能称作LAK活性,测定LAK活性的靶细胞应为NK抵抗的实体瘤细胞,如HL-60细胞、HeLa细胞等。
常用的测定NK和LAK细胞活性的方法较多,如攩51Cr释放法、[3H]TdR参入法或释放法、LDH释放法、ATP发光法等;应用放射性同位素对人体和环境不利,利用FCM测定NK和LAK细胞活性从1986年就开始摸索,方法已趋于成熟,以下介绍其中一种:
肝素抗凝取外周血后分离PBMC后洗净,调整细胞浓度为106/ml,为效应细胞;靶细胞分别为K562和HL-60或HeLa细胞,在对数生长期受集细胞,调整浓度为106。用3mMDiO(3,3-Diacradecyloxacarbocyanine Perchlorate)标记靶细胞,效应细胞:靶细胞(E:T)为40:1、20:1、10:1和5:1,孵育后加入PI(10μg/ml)染死细胞,洗净后即可上机检测。DiO发绿荧光,PI发红荧光,利用双参数(FL1vFL2)直方图可清楚地了解靶细胞中的死亡细胞,计算出靶细胞%溶解率。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 12:59

十九．流式细胞术在血液学中的 应用造血干/祖细胞测定
造血干/祖细胞移植已广泛应用于血液肿瘤、实体瘤、某些遗传性疾病、免疫缺陷病等，因此检测造血干/祖细胞已成为临床必不可少的手段。应用流式细胞仪多色技术测定外周血造血干/祖细胞，具有快速、准确的优点，不仅能确定造血细胞数量，而且能对造血干祖细胞的质量进行评价，为临床干细胞移植治疗提供重要数据。目前多色组合一般包括CD34、CD38、HLA-DR等McAb。
CD34抗原是一种分子量约11万的糖蛋白，选择性地表达于早期造血干/祖细胞、小血管内皮细胞和胚胎纤维母细胞表面。该抗原在原始造血细胞上表达，以后随细胞分化、成熟逐渐减少直至消失，因此一直作为造血干/祖细胞表面的一种特征性标志而广泛应用于造血干细胞基础研究和临床。CD34+细胞是一群不均一的群体，依其是否表达CD38、HLA-DR、CD33、c-kit等分出的亚群表现出了不同的造血性能。最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,有人经实验研究提出CD34的表达与造血干细胞的细胞动力学相关,细胞激活时CD34+,细胞处于稳定状态时CD34-;也有人提出CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早。我们认为：成人体内可能仍保留着一小部分原始间充质细胞，他们仍保留着多向分化能力，也能向造血干细胞分化，因此体内有CD34-造血干细胞和CD34+造血干细胞是正常的，CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早、更具造血潜能；但目前的用CD34+细胞代表造血干细胞的检查方法已足以满足临床需要，因为临床实践已证明这一点。理论研究往往能推动学术发展，开发新技术，我们期待着造血理论的不断发展给临床带来新技术，不断提高临床疗效。
我们用CD34、CD38、HLA-DR三色组合测定了151份外周血经动员后标本，CD34+细胞占单个核细胞（MNC）的（0.954±0.466）%，含量为（3.55±2.41）×109/L；其中CD34+CD38-亚群含量为（0.253±0.24）×109/L，占CD34+细胞的7.13%；CD34+HLA-DR-亚群含量为（0.273±0.310）×109/L，占CD34+细胞的7.61%；随着采集次数的增加，CD34+细胞及其亚群数量逐渐减少（P＜0.05）；随着供者年龄增加，其外周血CD34+细胞数逐渐减少，在≥40岁供者CD34+细胞百分比和含量比＜20岁供者分别降低了47%和50%；动员后外周血CD34+细胞数存在性别差异，男性供者外周血CD34+细胞数较女性高23%。
应用流式细胞仪测定造血干细胞虽具有快速、准确的特点，目前被广泛采用。但应用中要特别重视质量控制，要建立一套完整质控方法以确保检测的准确性。
二十. 流式细胞术在血液学中的应用 细胞凋亡研究
细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。
1. 细胞形态变化：通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察细胞凋亡。在细胞凋亡早期，细胞前向角光散射的能力显著降低，90°角光散射的能力增加；在细胞凋亡晚期，前向角和90°角光散射的信号均降低。此方法特异性不强，目前使用较少。
2 细胞膜功能改变：
（1） 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine PS）异位：正常情况下，PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。PS与Annexin Ⅴ（一种具有强力抗凝作用的血管蛋白）具有高度亲和力。应用流式细胞仪采用FITC- Annexin Ⅴ/PI双染法进行细胞凋亡检测，可同时描述三群不同状态细胞：FITC- Annexin Ⅴ-/PI-细胞，即正常活力细胞；FITC- Annexin Ⅴ+/PI-细胞，即凋亡细胞；FITC- Annexin Ⅴ+/PI+细胞，即已死亡细胞。此种方法操作过程简单，指标敏感，应用者越来越多。
（2） PI/Hoechst33342双染法：Hoechst33342（HO）是一种DNA的特异性荧光染料，可通过完整细胞膜，应用PI/Hoechst33342可将细胞分为三群：正常活细胞（HO强/ PI-），凋亡细胞（HO弱/ PI-），（由于凋亡细胞发生DNA降解和丢失，导致HO荧光减弱），死亡细胞（HO弱/ PI+）。此种方法再结合凋亡细胞前向角光散射能力降低的特点，能更好地鉴定凋亡细胞，但HO须紫外光激发，由于很多流式细胞仪不配有紫外激光，故此法应用受限。
（3） 吖啶橙(AO)/溴化乙啶(E双染法: AO是一种异染性荧光染料,可通过完整的质膜,它与核酸的结合主要是嵌入DNA双链的碱基之间，其发射峰为530nm，呈绿色荧光。EB的理化特性与PI相似，不能通过完整质膜。应用AO/EB双染法也可以将细胞分成三群：正常活细胞（AO强/ EB -），凋亡细胞（AO弱/ EB -），死亡细胞（AO弱/ EB +），原理与PI/Hoechst33342双染法相似，不同的是AO/EB双染法所的激发光是被广泛使用的氩激光（488nm），而不须紫外光，其缺点是染色过程较复杂，且AO易污染设备管道，因此使用此法者较少。
（4） 放线菌素D(7-AAD)染色法：7-AAD是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，最后通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：7-AAD强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。此法具有染色快速、简便、价格便宜等优点。另外，由于此法不破坏细胞膜，故还可联合使用FITC、PE标记的膜蛋白,对特殊细胞群及亚群进行多色荧光分析(虽然AO/EB双染法也不破坏被检细胞膜,但由于AO及EB的发射光波谱分别与FITC和PE的发射光波谱相似，故AO/EB法不能与FITC和或PE联合使用)。此法是应用核酸染料测定细胞凋亡的流式细胞仪法中十分实用的方法。
3. 细胞器改变： 线粒体膜APO2.7蛋白表达：早期凋亡细胞的线粒体膜出现APO2.7蛋白表达，利用荧光标记的单克隆抗体，运用流式细胞术可以检测早期凋亡细胞。
4 .DNA含量变化：
主要是PI染色法，由于凋亡细胞DNA发生有序降解，被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方图中G1峰前可出现亚二倍体峰，即所谓凋亡峰。通过测定凋亡峰百分含量，便可知凋亡细胞比例。此法简便、快速，是目前常用的、经典的测量凋亡细胞的方法。此法存在问题：少量的正常的低DNA含量细胞、由于机械损伤产生DNA含量减低的坏死细胞、染色体丢失的分裂相细胞以及细胞碎片和微核等都可能出现在亚二倍体峰内。因此，此法的特异性较低。
5. DNA断裂点标记：细胞凋亡时发生DNA断裂,利用末端转移酶(TdT)可以将dUTP标记到断裂点上,称作原位缺口末端标记（TUNEL）技术。此法有直接标记和间接标记两种，前者的标记物是FITC-dUTP，后者的标记物是生物素(biotin)标记的dUTP,需要再用FITC标记的亲和素(avidin)与生物素标记的dUTP结合，使标记反应倍增，故间接标记法灵敏度高，但操作较复杂。TUNEL还可以配合其它单抗同时进行细胞表型分析，或与DNA含量同时分析。TUNEL法因其灵敏度高而被广泛采用。
6 细胞凋亡相关基因产物检测：细胞凋亡是一个多种基因参与的复杂过程,目前已知与bcl-2基因、c-myc基因、P53基因等有关，这些基因都有相关产物，目前针对这些相关产物已有单克隆抗体生产，应用这些单抗，通过流式细胞仪可检测造血细胞凋亡相关基因蛋白表达水平，相互关系。
流式细胞仪测定细胞凋亡方法、层次众多，且具有快速、准确特点，应用十分广泛。在实际应用中应注意采用多种方法结合使用，使结果更加可靠准确。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 13:00

二十一. 流式细胞术在血液学中的应用 细胞分选
流式细胞仪能够分选某一亚群细胞,分选纯度＞95%。目前细胞分选主要用于研究，临床应用较少。血液学应用最多的是造血干细胞的研究，最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,这些实验研究所用的CD34- 和CD34+细胞就是通过细胞分选获得的。小鼠造血干细胞分选一般按lin-c-Kit+CD34+/ lin-c-Kit+CD34-分选,人造血干细胞分选一般按lin-CD34+/ lin-CD34-分选。
为避免某些遗传性血液病如海洋性贫血、异常血红蛋白病的纯合子出生，产前诊断非常重要，这些疾病的主要靶细胞是红细胞，而孕妇血循环中存在着胎儿有核红细胞，只是数量非常少，利用流式细胞仪可从孕妇血液中分选出胎儿有核红细胞（分选条件：CD45-GPA+）进行基因分析，作出产前诊断。
利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。总之，流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞，只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记，流式细胞仪的分选功能将得到越来越多的科学研究和临床应用。
二十二. 流式细胞术在血液学中的应用 其他
流式细胞仪可能在两方面对骨髓增生异常综合症（MDS）有用，一是测定CD34阳性细胞数，以监测病情，二是测定核蛋白增殖因子（PCNA）,有报告PCNA再在生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症、白血病三种疾病中表达有明显差异，可辅助鉴别诊断。
此外流式细胞仪也可检耐药蛋白,如肺耐药相关蛋白（LRP）、多药耐药蛋白（MRP）、 P170等。
流式细胞仪也可检测细胞因子，细胞内细胞因子如白介素系列（IL-1—IL-14）,肿瘤坏死因子(TNF),干扰素(IFN)等,只要用适当的打孔剂即可用抗上述细胞因子单克隆抗体标记后用流式细胞仪测定。
参考文献
1.Coulter Education Center: Training Guide (Epics Elite Flow Cytometer),1994,USA.
2．Coulter Corporation: Operater,s Guide (Epics Elite Flow Cytometer),1993,USA.
3．Gray.J.W.Cell cycle analysis using flow cytometry. Int.J.Radiat.Biol.1986;49(2):237.
4.Catovsky.D.et al. A Classification of acute leukemia for 1990s. Ann Hematol1991;62:16.
5.Bemard.A.The limitations in utilizing phenotypic markers to detect minimalresidual diseases i n acute leukemia(AL).Pathol.Biol 1988;36:17.
6.Rosenfeld.C.S. Flow cytometric measurement of anti-platelet anibodies. AM.JClin.Pathol.1987;87(4):518.
7.Rothe.G.&Valet.G.Phagocytosis、intracellular PH and cell volume in the multifuctional analysis of granulocytes by flow cytometry. Cytometry 1988; 9:316.
8.Chang L et al.Rapid flow cytometric assay for assessment of natural killer activity. Immun
Methods 1993;166:45.
9.Foon.K.A.& Todd.R.F.Immunoligic classification of leukemia and lymphoma. Blood.1986;68(1):1～31.
10.陈璋等.200例急性淋巴细胞白血病免疫学表型特点.中华血液学杂志.1991;12(7):356.
11．C.Darreli Jennings and Kenneth A.Foon:Recent Advance in Flow Cytometry: Application to the Diagnosis of Hematologic Malignancy Blood 1997;90:2863-2892.
12．Yoshiaki SONDA,Takafumi KIMURA. Quantitative and qualitative of peripheral blood stem cells. Journal of Clinical and Experimental Medicine, 1996,176:561-565.
13..Chin-Yee I, Anderson L, Keeney M, et al .Quality Assurance of Stem Cell Enumeration by Flow Cytomeyry. Cytometry, 1997,30:296-303.
14.Thomas P.Loughran Jr:CD56+ hematologic malignancies. Leukemia Res. 1999;23(7):675.
15. Takashi Sato,Makio Ogawa:CD34 expression reflects kinetic action of murine hematopooietic stem cells. International J Hematol 1999;69(suppl 1):48。
作者: whitesheep    时间: 2012-1-29 13:00

本人打算做肝组织肝细胞的凋亡情况，实验步骤如下：
1. 收集细胞：①取材组织用冷PBS漂洗干净后，浸泡在含冷PBS的瓶皿中。②用眼科剪将组织剪碎。③2块载玻片的毛玻璃端互相交错将小组织块磨碎，④用装上4号针头的注射器吸出，快速反复抽吸几次。⑤200目筛网过滤一次。⑥收集网下的液体，离心，1000R/min，6～8分钟（洗3次）。
2.加入冰预冷的70%的乙醇固定，注意：缓慢加入乙醇，同时小心晃动或者吹打，4℃，1过夜。
3. 离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。
4. 400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。
5. 用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。
6. 上机检测

===============================================================================================================

疑问：
1、此实验步骤是否妥当，应做何部修改？
2、第一步中，细胞的计数、调整浓度在哪部进行？如何调整？
3、400目的筛网过滤应该在PI染色前还是染色后？
4、实验步骤说到洗是如何洗？是不是离心后加入PBS，振荡后再离心？洗的时候加入的PBS应该是多少毫升？一般用多大的离心管呢？
5、  加入冰乙醇固定的时候该加多少呢？
6、  离心弃去PBS后染色，是不是就是离心完后，在离心管内直接加1ml的PI染液？
7、实验过程是否要求无菌操作？如果是，该如何进行？
作者: zhezhe    时间: 2012-1-29 13:01


IP 和Hoehest双染色用流试细胞仪来检测细胞凋亡时Hoehest的通道应该是哪个啊？请问做过这方面的高手赐教哈！
作者: 小糖块    时间: 2012-1-29 13:01

我实验中碰到一个问题，细胞是转染pEGFP重组载体的细胞，我想用annexinV和PI检测凋亡，FITC标记的annexin肯定不能用， PE标记的annexin V与PI一个荧光通道，我应该选择何种荧光标记的annexin呢？希望得到大家的帮助！
作者: any333    时间: 2012-1-29 13:02

大家好，我是皮肤病医院的，我们单位刚买了流式细胞仪，急于开展项目，想请教大家，除了基本的细胞免疫功能和淋巴细胞绝对技术外，还可以开展什么临床项目？谢谢！
作者: gogo    时间: 2012-1-29 13:02

请教各位老师：我的流式细胞仪的检测池被PI黏附了，我看到书上有说用contrad 70来洗的，可是这种试剂还分了酸碱性，我不知用那一种？不知道那位老师用过，可以帮我选一下。
谢谢！！
流式专家，一定帮帮忙！
作者: idea2011    时间: 2012-1-29 13:03


请教高手:我用细胞分离机系统制备心肌细胞悬浮液,要么细胞数不够,要么悬浮时细胞粘集,是什么原因呢?有谁有这方面的成功经验,可以介绍吗?急!!
作者: zsxan1990    时间: 2012-1-29 13:03

样本的阴性阳性峰不能分开，到底是什么原因呢
作者: 薄荷侠    时间: 2012-1-29 13:04

请问哪里可以买到TMAC杂交缓冲液，MES，EDC等试剂？谢谢！
作者: star#room    时间: 2012-1-29 13:04

你好,请问做细胞分选时,上样细胞数为多少?另,细胞和抗体比是多少?

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至少1X10的6次方
细胞和抗体比根据你的抗体来定
作者: bamboo16    时间: 2012-1-29 13:04

战友们，帮帮忙，虽然问题很简单很基础，希望你们帮帮我拉，小弟在这先谢了。
本人打算做肝组织肝细胞的凋亡情况，实验步骤如下：
1. 收集细胞：①取材组织用冷PBS漂洗干净后，浸泡在含冷PBS的瓶皿中。②用眼科剪将组织剪碎。③2块载玻片的毛玻璃端互相交错将小组织块磨碎，④用装上4号针头的注射器吸出，快速反复抽吸几次。⑤200目筛网过滤一次。⑥收集网下的液体，离心，1000R/min，6～8分钟（洗3次）。
2.加入冰预冷的70%的乙醇固定，注意：缓慢加入乙醇，同时小心晃动或者吹打，4℃，1过夜。
3. 离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。
4. 400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。
5. 用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。
6. 上机检测

疑问：
1、此实验步骤是否妥当，应做何部修改？
2、第一步中，细胞的计数、调整浓度在哪部进行？如何调整？
3、400目的筛网过滤应该在PI染色前还是染色后？
4、实验步骤说到洗是如何洗？是不是离心后加入PBS，振荡后再离心？洗的时候加入的PBS应该是多少毫升？一般用多大的离心管呢？
5、 加入冰乙醇固定的时候该加多少呢？
6、 离心弃去PBS后染色，是不是就是离心完后，在离心管内直接加1ml的PI染液？
7、实验过程是否要求无菌操作？如果是，该如何进行？
作者: ha111    时间: 2012-1-29 13:05     标题: 回复 #1172 bamboo16 的帖子

1.细胞计数的目的是有足够的PI染细胞，并足够上机。因此，你对操作中的细胞损失要心里有数，这样就可以根据最后上机至少保证1×10－5次方个细胞来看你前期需要准备多少细胞了！
2.最后染PI！
3.PBS洗涤就如你所说，1～2.5ml就行了.选择相应的离心管。
4.如果你固定一管细胞只作为一只上样管的样本，那么2ml足够。
5."离心弃去PBS后染色"就是离心弃去PBS后，加入rna酶和pi染色。根据你定的试剂的说明操作！我们实验室是自己配的pi，故不用加1ml。
6.要固定的，何必“无菌”？？^_^
7.前期组织处理无经验，sorry！！

好运！
作者: tianmei001    时间: 2012-1-29 13:05


各位高手，帮我看看我的实验步骤有没有什么问题，，小弟在这先谢了。

本人打算做单核细胞的CD49d和CD29表达情况，实验步骤如下：

1. 收集细胞。以PBS洗涤细胞，调整细胞浓度至２×１０的7次方 。

2. 做５管，１：光是细胞，２：Rat IgG isotype. 3: Mouse IgG isotype. 4: CD49d. 5: CD29

3. 在第５管加入一抗 Mouse-anti-human CD29, 5μl。

4. 在每一试管中加入５０μl细胞溶液（约含１×１０的6次方）。第５管振荡混匀，在４℃下，避光，作用３０分钟。。

5. 在第５管中加入３ml 0.1% BSA/PBS, 振荡混匀。

6. 第５管离心，２００g, ５分钟。吸除上清，留５０μl.

7.在第２管中加入 Rat IgG isotype 0.5 μg; 在第3管中加入 Mouse IgG isotype 20 μl; 在第４管中加入 PE-Mouse-anti-Human CD49d 20 μl; 在第5管中加入 FITC-Rat-anti-Mouse CD 29 0.5 μg. 4℃，避光，作用３０分钟。

8. 在每管中加入３ml 0.1% BSA/PBS, 振荡混匀。

9. 每管离心，２００g, ５分钟。吸除上清，留５０μl.

10. 在每管中加入0.5ml 1% paraformaldehyde/PBS, 避光, ２４小时内上机检测.

疑问：

1.此实验步骤是否妥当，应做何修改？

2. 本实验需要重复多少次才有统计学意义？才能说明问题？

新手上路，请各位老师多多指教，先谢谢了！
作者: mamamiya    时间: 2012-1-29 13:06

我想用流式检测细胞凋亡率,目前构建了相应的GFP, RFP, Flag, Myc等载体质粒, 我的问题是, 用那种方法检测单转我的目的基因后对细胞凋亡率的测定比较好,同时我的目的基因和另外一个基因共转后对凋亡的影响如何用流式检测! 请楼主给我回复一下,不甚感激!
作者: yysr238    时间: 2012-1-29 13:06


我现在有人的CD40,CD1a,和CD83的流式单克隆抗体，BD公司产品。当时自己买不到小剂量的，只好买了50T,现在试验已经做完了，但是还有很多剩余，如有需要，可以优惠的提供给需要的同学。
作者: yysr238    时间: 2012-1-29 13:07

问题
1. 收集细胞。以PBS洗涤细胞，调整细胞浓度至２×１０的7次方 。
通常我会选择1～2×10E6，加入的细胞量为100微升，是不是你的说明书要求你要这么多细胞？？
流式需要合适的细胞和抗体比例，这一步我觉得可能是你问题的关键，如果不行不妨把你的问题说的更清楚一些。
作者: yysr238    时间: 2012-1-29 13:07

各位高手，帮我看看我的实验步骤有没有什么问题，，小弟在这先谢了。

本人打算做单核细胞的CD49d和CD29表达情况，实验步骤如下：

1. 收集细胞。以PBS洗涤细胞，调整细胞浓度至２×１０的7次方 。

2. 做５管，１：光是细胞，２：Rat IgG isotype. 3: Mouse IgG isotype. 4: CD49d. 5: CD29

3. 在第５管加入一抗 Mouse-anti-human CD29, 5μl。

4. 在每一试管中加入５０μl细胞溶液（约含１×１０的6次方）。第５管振荡混匀，在４℃下，避光，作用３０分钟。。

5. 在第５管中加入３ml 0.1% BSA/PBS, 振荡混匀。

6. 第５管离心，２００g, ５分钟。吸除上清，留５０μl.

7.在第２管中加入 Rat IgG isotype 0.5 μg; 在第3管中加入 Mouse IgG isotype 20 μl; 在第４管中加入 PE-Mouse-anti-Human CD49d 20 μl; 在第5管中加入 FITC-Rat-anti-Mouse CD 29 0.5 μg. 4℃，避光，作用３０分钟。

8. 在每管中加入３ml 0.1% BSA/PBS, 振荡混匀。

9. 每管离心，２００g, ５分钟。吸除上清，留５０μl.

10. 在每管中加入0.5ml 1% paraformaldehyde/PBS, 避光, ２４小时内上机检测.

疑问：

1.此实验步骤是否妥当，应做何修改？

2. 本实验需要重复多少次才有统计学意义？才能说明问题？

新手上路，请各位老师多多指教，先谢谢了！

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我们是在每管中加入1mlPBS, 振荡混匀， 不用0.1%的BSA。其实用不用意义不大
作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-29 13:08

问题
1. 收集细胞。以PBS洗涤细胞，调整细胞浓度至２×１０的7次方 。
通常我会选择1～2×10E6，加入的细胞量为100微升，是不是你的说明书要求你要这么多细胞？？
流式需要合适的细胞和抗体比例，这一步我觉得可能是你问题的关键，如果不行不妨把你的问题说的更清楚一些。

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是BD的protocol要求的。Resuspend cells in cold wash buffer (PBS with 0.1% NaN3 and 1.0% fetal bovine serum, pH 7.2 - 7.4) at a concentration of 2 × 107 cells/ml. Aliquot
0.05 ml of cell suspension (106 cells) into tubes or microwell plates for staining.
在处理标本时常取100,000-1,000,000个细胞/test。试剂厂家提供的滴度也常以此为样本的基础，然后所加的抗体应该都是过饱和的（常为1ug/test左右)，这样你所要得到的细胞抗原的含量才不会受所加细胞多少或抗体多少的少许变化的影响。所以我认为10E5,10E6都可以，这不是问题的关键。
作者: newway    时间: 2012-1-29 13:08


[求助]请问专家们有没有Wistar大鼠CD4，CD8的正常值，望回复，谢谢！
作者: newway    时间: 2012-1-29 13:08


请问：活化的T淋巴细胞的凋亡检测方法！谢谢
作者: 盼盼    时间: 2012-1-29 13:09

各位高手，帮我看看我的实验步骤有没有什么问题，，小弟在这先谢了。

本人打算做单核细胞的CD49d和CD29表达情况，实验步骤如下：

1. 收集细胞。以PBS洗涤细胞，调整细胞浓度至２×１０的7次方 。

2. 做５管，１：光是细胞，２：Rat IgG isotype. 3: Mouse IgG isotype. 4: CD49d. 5: CD29

3. 在第５管加入一抗 Mouse-anti-human CD29, 5μl。

4. 在每一试管中加入５０μl细胞溶液（约含１×１０的6次方）。第５管振荡混匀，在４℃下，避光，作用３０分钟。。

5. 在第５管中加入３ml 0.1% BSA/PBS, 振荡混匀。

6. 第５管离心，２００g, ５分钟。吸除上清，留５０μl.

7.在第２管中加入 Rat IgG isotype 0.5 μg; 在第3管中加入 Mouse IgG isotype 20 μl; 在第４管中加入 PE-Mouse-anti-Human CD49d 20 μl; 在第5管中加入 FITC-Rat-anti-Mouse CD 29 0.5 μg. 4℃，避光，作用３０分钟。

8. 在每管中加入３ml 0.1% BSA/PBS, 振荡混匀。

9. 每管离心，２００g, ５分钟。吸除上清，留５０μl.

10. 在每管中加入0.5ml 1% paraformaldehyde/PBS, 避光, ２４小时内上机检测.

疑问：

1.此实验步骤是否妥当，应做何修改？

2. 本实验需要重复多少次才有统计学意义？才能说明问题？

新手上路，请各位老师多多指教，先谢谢了！

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回复：我说的重一点，你的实验设计得比较乱，而且你前后说的不一致，CD29抗体到底是Mouse anti-human的还是Rat anti-mouse的，二者相差很远，直接关系到你用的细胞是人的外周血还是小鼠的细胞。所以事先一定要搞清楚这一点。
作者: 小鱼鱼    时间: 2012-1-29 13:09

本人欲用流式细胞术做单核细胞鉴定，因所订的CD14抗体要3周后才到，不知哪位战友有富余的FITC-或PE标记的抗人CD14抗体能转让于我？？急需！！谢谢！！
作者: BOSS2011    时间: 2012-1-29 13:10

IP 和Hoehest双染色用流试细胞仪来检测细胞凋亡时Hoehest的通道应该是哪个啊？请问做过这方面的高手赐教哈！

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IP还是PI
Hoehest是紫外光激发的
作者: ROSE李    时间: 2012-1-29 13:10

课题思路探讨:
我用疫苗联合佐剂免疫小鼠,检测免疫前后DCs细胞的活化情况,CTL细胞的活化情况,Th细胞的分化情况.请问应分别选择哪些细胞因子做为特异性检测指标,目前哪些公司有相应的Kit销售.
谢谢!
作者: 分子式    时间: 2012-1-29 13:10


请问各位大侠，
最近我去做流式，利用FITC标记的抗体检测某蛋白的表达，操作的老师从实验结果的波形图上能够知道细胞的形态，请问是什么原理。请大侠指导一下，怎样从实验结果看出细胞不同的形态。谢谢！
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-1-29 13:11


【紧急求助】流失细胞仪检测中------细胞不见了

今天作流式细胞仪测定胞核P53表达量，前面按照常规1%多聚甲醛固定15min，0.25%TritoonX－100打孔15min，细胞数量明显减少，离心后几乎看不到了。接着加封闭血清、一抗、二抗（FITC）后，细胞直接看不到了，滴了一滴，在荧光显微镜下观察，细胞罕见。

请问各位：
1、是不是TritoonX－100打孔把细胞都破坏了？
2、有没有流式细胞仪检测核抗原比较好的protocol?
谢谢！
作者: abc816    时间: 2012-1-29 13:11

请问各位大侠，
最近我去做流式，利用FITC标记的抗体检测某蛋白的表达，操作的老师从实验结果的波形图上能够知道细胞的形态，请问是什么原理。请大侠指导一下，怎样从实验结果看出细胞不同的形态。谢谢！

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在流式上可以分辨出不同的细胞，主要有以下两个物理参数。
即前向角散射FSC,Forward Scatter和侧向角散射SSC,Side Scatter。
前向角散射与被测细胞的大小有关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。
通过以上两个参数，就可以找出自己需要的细胞群，进行采集和分析了。
作者: abc816    时间: 2012-1-29 13:12

我们举例来说：
下面是一幅体外培养的肿瘤细胞图形，中间细胞数最多的一群是想检测的细胞。靠近纵轴一群多是死细胞、细胞碎片。
采集时，可以通过调整阈值和划门，把死细胞排除。
如果标本是WBC，一般可以分出三群细胞，即中性粒、单核、淋巴细胞。


图片附件: 21257839.jpg (2012-1-29 13:12, 25.54 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10343

作者: one    时间: 2012-1-29 13:12

今天找到一本不错的书，《实用流式细胞术彩色图谱》，王书奎＼周振英主编，第二军医大学出版社出版，２００４年４月第一版，除了大量的彩色图谱外，还详细介绍了流式原理和应用范围，比较好懂，有兴趣的可以看看哦，希望能对大家有所帮助．就是价格有点小贵，２００RMB.
作者: 北风那个吹    时间: 2012-1-29 13:13

位老师，实验中碰到同样的问题：细胞是转染pEGFP重组载体的细胞，我想用annexinV和PI检测凋亡，FITC标记的annexin肯定不能用， PE标记的annexin V与PI一个荧光通道，我应该选择何种荧光标记的annexin呢？希望得到老师们的帮助！
作者: abc816    时间: 2012-1-29 14:13

这个问题不难回答，您选择的两种染料只要不在同一通道就行了。
如果你说不能用FITC和PI的话，你可以考虑用罗丹明和PI。
FITC在流式上是Fl1通道，PI和PE都是FL2通道，而你不想用FITC的话，你可以在FL1,FL3,Fl4上找可以标记annexinV的试剂，目前针对流式的染料种类还是挺多的，你可以灵活选择，祝你好运。
作者: ffooll    时间: 2012-1-29 14:13


我的facs抗体是间接荧光标记的，不知道在处理上有什么特殊的，是不是加入一抗后还要加封闭血清，然后才能加二抗？如果要封闭，是要买特殊的血清，还是就用FCS就可以了，谢谢。
作者: BUK    时间: 2012-1-29 14:14

我是新手，刚接触流式。有几个很弱的问题请教各位高手，请不吝赐教。
我在做关于细胞多药耐药(MDR)的实验，想用Rh123来检测依赖ATP 的ABC转运子外排泵的功能，有几个问题请教：
1、Rh123该用什么溶剂溶解？如何保存？
2、细胞与Rh123共同孵育时应在1640培养液里还是PBS里就可？（文献里有的用前者有的用后者），有资料提示应在富含ATP的培养基里孵育，（因ABC转运子是依靠水解ATP提供能量），何为富含ATP的培养基？有资料是加入葡萄糖，是这样的吗 ？
麻烦在做相关实验的高手给点提示？
不胜感激！
作者: yes4    时间: 2012-1-29 14:14

本人用美国BD流式细胞仪检测C57BL/6小鼠脾细胞内TH1，TH2亚群表达情况，应用4色标记法（CD3,CD8.IFN-R,IL-4)，结果发现胞内细胞因子IFN-R和IL-4表达非常少，有些为零，不知是没有标记上去还是其他的问题，请教有没有人做过此类实验，并求结果较好的流式图参考一下，谢谢！
作者: 克隆鱼    时间: 2012-1-29 14:15


我也在做流式，但出现了一个问题，我用的是CML患者的骨髓中分离的CD34阳性细胞，刚纯化出来（我用的是Dynal 公司的磁珠）的时候其比例有70%~80%，但培养两天后再次复查则降为20%~30%，我想细胞分化不至于这么快吧！会不会是流式检测方面出了问题？或者说细胞培养后表面抗原发生了改变？请各位高手指点！急！
作者: ha111    时间: 2012-1-29 14:15

看了这么多文章，由于自己太菜鸟，还是云山雾罩。

我现在遇到的问题就是如何设置好参数和补偿，什么是好的结果图形？

不知道问题是不是很菜，如果过于简单，请高手们推荐一下学习材料，越实用越好，最好是电子版的，我都快被流式细胞仪折磨疯了。
作者: 一叶    时间: 2012-1-29 14:16

各位老师，实验中碰到同样的问题：细胞是转染pEGFP重组载体的细胞，我想用annexinV和PI检测凋亡，FITC标记的annexin肯定不能用， PE标记的annexin V与PI一个荧光通道，我应该选择何种荧光标记的annexin呢？希望得到老师们的帮助！

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pEGFP占FL1， PI同时占FL2和FL3，如果是四荧光通道流式细胞仪，你只能选择FL-4通道——AnnexinV-APC。
作者: 小螺号    时间: 2012-1-29 14:18

请教：
如果要把流式细胞仪（苹果机）作出来的结果考到其他普通电脑上（微软机），可以用什么程序打开?
作者: zhezhe    时间: 2012-1-29 14:18


我从苹果机上考结果都只是将分析好的数据图考到word文档上，然后考到普通电脑上就能打开了，不需要考一个数据文件的，这些文件一般是LMD文件，没有相应的分析软件，怎能打开？
作者: 生物迷    时间: 2012-1-29 14:19


请教各位高手：
我想用流式细胞仪检测肝癌细胞表面某膜蛋白经药物刺激一定时间后表达量的变化。一抗用的是Santa Cruz公司的多抗（说明书上说适用western blor和免疫组化），二抗用的是FITC标记的。做了两次了，第一次的结果表明加药刺激后提高了100多倍，但是在加药刺激后一个峰左边有一个小肩峰；于是又做了一次，这次的结果竟然表明抗体都没有标记上！（加一抗与不加一抗的MnX值查不多）更别说峰的位移了。我两次操作基本完全相同，只是在铺板的时候第二次细胞略少一点而已。
麻烦大家帮我看看我的操作存在哪些问题：
1、细胞用胰酶消化下来后用PBS漂洗一次，4%多聚甲醛4度固定约16h（固定这么长时间是为了赶人家开机的时间）
2、PBS洗一次后，用含5%FBS的PBS重悬细胞，4度放置10min;
3、PBS洗一次后，把细胞均分为两份，一份不加一抗作为阴性对照，一份加一抗，一抗按照1：50稀释；4度放置40min；
4、PBS洗两次，加二抗，二抗按照1：100稀释，4度放置40min；
5、PBS洗一次，加0.5mlPBS，过滤网上机。

两次都是这么做的，但结果为什么相差这么大啊，恳请高手指点，不胜感激！
作者: bohe221    时间: 2012-1-29 14:19

该洗还是不该洗？

我现在在检测HLAB27/B7的表达，这是流式细胞术在临床的比较常规的应用了。没有很大的问题，只是发现给予抗体孵育后，洗与不洗的结果相差较大。
我以前作实验时，应用的间接荧光法，给一抗与荧光标记二抗的那种，都是要洗涤的以去除非特异性荧光。现在在临床上检测，用的是Beckman公司的荧光标记一抗，直接法。培训时老师的做法是直接标记后，不用再洗了的直接上机检测（是否就是no-wash）。抗体说明书上说，如果洗一次可得到更佳结果，试了一下，发现洗与不洗的结果相差较大。
过程如下：
1 取全血100微升
2 加入荧光标记一抗10微升
3 充分混匀室温避光孵育10分钟
4 加入溶血素500微升
6 充分混匀室温避光孵育10分钟
5 加入等渗PH7.2 PBS或流式细胞仪用鞘液500微升
7 充分混匀室温避光孵育10分钟
8 上机检测。
以一次结果为例，以上步骤得到以下结果：
HLA-B27 单阳性率 96.4%
HLA-B7 单阳性率 83.8%
HLA-B27阳性/HLA-B7阴性 15.34%
HLA-B27阳性/HLA-B7荧光强度 7.6
如果在上机前洗一次同一管结果变为：
HLA-B27 单阳性率 98.0%
HLA-B7 单阳性率 37.3%
HLA-B27阳性/HLA-B7阴性 60.77%
HLA-B27阳性/HLA-B7荧光强度 7.1
可见洗后可能洗去了HLA-B7的非特异性荧光，使HLA-B7 单阳性率变低了，导致HLA-B27阳性/HLA-B7阴性率的升高，HLA-B27 单阳性率与HLA-B27阳性/HLA-B7荧光强度倒没有什变化。作了好几次其他样本，结果都是这样变化。HLA-B27阳性/HLA-B7阴性率如果高于90%，HLA-B27阳性/HLA-B7荧光强度高于8.0，就判断为HLAB27阳性，直接影响临床诊断。如果洗前结果小于90%，洗后去除HLA-B7的非特异性荧光，使得HLA-B27阳性/HLA-B7阴性率升高则可能高于90%，出现这样的情况，该如何判断呢？

该洗还是不该洗？
有经验的高手们，提个建议吧！
作者: BUK    时间: 2012-1-29 14:20

本人用美国BD流式细胞仪检测C57BL/6小鼠脾细胞内TH1，TH2亚群表达情况，应用4色标记法（CD3,CD8.IFN-R,IL-4)，结果发现胞内细胞因子IFN-R和IL-4表达非常少，有些为零，不知是没有标记上去还是其他的问题，请教有没有人做过此类实验，并求结果较好的流式图参考一下，谢谢！！！

Re：CD3和CD8 是细胞表面抗原，可以直接染色；而IFN-g和IL-4是细胞内细胞因子，要想得到阳性结果需要刺激小鼠脾细胞使其产生细胞因子，然后再进行胞内染色才行。
作者: toy    时间: 2012-1-29 14:21


请教2个问题：
1, 做流式样本细胞数最少可以是多少？
2，做双标时，作同型对照的是否也需要两种不同标记？
谢谢。
作者: 了了    时间: 2012-1-29 14:22

我的课题的核心是流式，但对流式技术不太懂，调查得到的一些关于流式技术的资料很让我失望。在这里我想请教您：利用流式进行细胞分选真的效率低，结果不理想而且试剂价格贵吗？如果可行，我该如何操作？（我的细胞从外周血中分选后还要培养）。万分感激！
作者: Ao7    时间: 2012-1-29 14:24


刚结束试验，所用部分抗体有较多剩余。包括AnnexinV－FITC，PI，CD14－TC，CD25-PE，IFN-G-FITC，及同型对照抗体。有需要的朋友，可PM我（限南京）。
作者: qumm1985    时间: 2012-1-29 14:24

我也在做流式，但出现了一个问题，我用的是CML患者的骨髓中分离的CD34阳性细胞，刚纯化出来（我用的是Dynal 公司的磁珠）的时候其比例有70%~80%，但培养两天后再次复查则降为20%~30%，我想细胞分化不至于这么快吧！会不会是流式检测方面出了问题？或者说细胞培养后表面抗原发生了改变？请各位高手指点！急！！！

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是培养后表面抗原的变化，不是检测的问题。的确下降得很快！不过，你分得纯度70%~80%，实在是不纯。但这不是你的技术问题，而是磁珠的分离技术问题。磁珠分选的纯度比不过流式。流式一般都在９９％左右。我没用过Dynal的，但用过Miltenyi和StemCell的。前者的纯度一般在９５％以上。我用StemCell的去系阳性细胞后，再标CD34+CD38-，用流式分选CD34+CD38-Lin-，纯度都在９７－１００％之间。
作者: qumm1985    时间: 2012-1-29 14:24

请教2个问题：
1, 做流式样本细胞数最少可以是多少？
2，做双标时，作同型对照是否也需要两种不同标记？
谢谢。

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１细胞数最少可到数百个。我用流式分选后，再让它分选数百个到另一管中，分析纯度。
２需要两种同型对照。尤其是在第一次，需要调整补偿。此时最好做三管同型对照，即一管标IgG1FITC，一管标IgG1PE，一管标IgG1FITC＋IgG1PE。第一次做完后，要save settings，以后可以只做IgG1FITC＋IgG1PE。
作者: qumm1985    时间: 2012-1-29 14:25

请教：
如果要把流式细胞仪（苹果机）作出来的结果考到其他普通电脑上（微软机），可以用什么程序打开?

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你可以用PC下运行的Wi***I打开、分析、作图。Wi***I是免费的，搜索一下，下载安装后就可以用了。这个软件功能挺强，做出的图挺漂亮，可以把不同的histogram放在一张图上，可以做3D图。
如果是用苹果机分析，FlowJo最流行。免费用３０天。３０天后，得买个号或一个象USB样的dongle，巨贵，一个$１０００。
作者: 铜雀    时间: 2012-1-29 14:25

怎么解压缩？
另外我是做树突状细胞的，想测表型，那些比较常用？那个公司的抗体效价高？是直标的还是间标的好呢，请指教！
作者: duoduo    时间: 2012-1-29 14:26


请教，能否用流式细胞仪直接 sorting CD4+CD25+ T CELLS ？
作者: pengke1983    时间: 2012-1-29 14:28

请问
1 .用流式细胞仪如何检测凋亡
2 .刚取下来的活体组织能否用来做流式检测

谢
作者: glass    时间: 2012-1-29 14:28


有很多方法，比如检测早早期的细胞凋亡可检测Caspase的表达。早期凋亡可用AnnexinV-FITC/PI法，检测凋亡时的PS外转，可鉴别凋亡，坏死与活细胞。此外还有，比如检测线粒体凋亡时的膜电位改变以及线粒体膜蛋白7A6的表达，或者可检测细胞氧化还原状态的改变，也就是检测GSH的水平降低；晚期可用PI单染DNA含量检测凋亡峰。此外还有，PI/Hochest33342法，也可以鉴别凋亡坏死与活细胞。
当然最常用的我想应该是PI单染DNA含量检测凋亡峰与AnnexinV-FITC/PI的方法。
文献上都有报道的。
你可以上联科公司的网站cuturl('www.gotofcm.com')，只要注册就能在里面看到关于流式检测细胞凋亡的PDF文章，还不错。
作者: glass    时间: 2012-1-29 14:30

请教各位大虾：

本人用Beckman-Coulter公司的Epics XL 流式检测网织红细胞，使用的里面的SystemII软件，是DOS，整个过程全自动。给出很多指标包括网织红百分比，网红成熟指数（RDI），未成熟网红细胞比值（IRF），网红分布指数（RDI）。网织红百分比不用说了。这些指标的临床意义，我也略知一二，还是很有用的。我想请教各位的是，其它三个指标的正常参考范围，希望知道的大虾们一定要知无不言，言无不尽，因为我上网找了好久都没有找到有关的参考范围。
拜托了！
作者: 羊咩咩    时间: 2012-1-29 14:32

初做流式细胞计数，请教各位大侠

1. 我准备检测活化的内皮细胞表面的CD40、CD154和CD62E，看文章发现有的用荧光抗体直接标记，上机检测。有的文章要先用一抗结合，洗脱后再用荧光标记抗体结合然后上机检测。请问这两种方法有何不同，各有什么适用范围？再请教一下具体标记步骤！

2. 流式细胞仪为BD公司的，但现在实验室的操作人员对于我的这些检测项目不太熟悉。请教需要用什么软件进行分析？我的这几个指标用什么指标来表示比较合适，是用平均荧光强度还是其他指标？

3. 这几个指标用双标或是三标能一次完成吗？

4. 直接检测法和间接检测法区别在哪里？（我对这两个词意思不解）

请各位高手出手相助，谢谢！！
作者: 101010    时间: 2012-1-29 14:32

请教一个问题：我用APC-CD14,PE-TLR4,FITC-CD80三色标记单核细胞表面抗原表达，所得流式结果是分别为以三种单抗为横坐标或纵坐标的单阳性、双阳性和双阴性百分数的二围图像，即APC-CD14,PE-TLR4或APC-CD14,FITC-CD80或PE-TLR4,FITC-CD80，但该图结果只能得到CD14阳性细胞中TLR4或CD80单阳性的百分数，怎样才能得到CD14阳性细胞中PE-TLR4,FITC-CD80双阳性的百分数？还有一个问题，图中的百分数是否应减去标记相应荧光的IgG对照的百分数？非常感谢！
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 14:32

流式细胞术分析血小板

作者：佚名 实验频道来源：生物谷 点击数：612 更新时间：2004-6-18

血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术，它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法，丰富了血小板功能评估指标。

流式细胞仪血小板分析应用范围

通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反应性
通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测，分析血小板止血功能的获得性和遗传性缺陷
结合血小板大小，检测血小板RNA含量，分析血小板成熟度，计数网织血小板
发现血小板抗体，做定性和定量分析
血小板分析的临床应用

血小板活化导致的血栓前综合症：如糖尿病、非免疫性血小板活化
血管缺陷导致的血小板活化：如动脉粥样硬化、急性心肌梗塞、血管成型术、心脏移植
血小板糖蛋白的基因缺失，或血小板存储缺陷导致的出血性疾病
骨髓异常增生或骨髓发育不良、肾衰末期、血小板输血或药物副作用引起的血小板止血功能障碍
血小板相关的抗凝治疗的诊断监测
由特发性血小板减少或药物引发的血小板减少、恶性肿瘤骨髓转移导致的血小板生成减少
免疫性血小板减少、先兆子痫或脓毒症造成的血小板生成增加；生长因子治疗的骨髓反应状况监测
自身免疫和同种免疫造成的血小板减少症
流式细胞仪检测全血中血小板功能状态

全血中血小板更接近生理状态
操作简便，减少由于操作造成的血小板状态改变(如血小板活化试验)
同时检测血小板的多个标志物，结合FSC和SSC，评估多个参数，进行定量分析
多采用血小板特异抗体CD41或CD61画门，找出血小板，避免杂质碎片的干扰
检测血小板亚群灵敏度高
用血量少
无放射性污染
全血样本的制备
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 14:33

1．抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程；做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化

2．Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置15分钟

3．1%多聚甲醛固定样本

4．上机检测

质控标本

阴性对照(Isotype Control)：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免补偿造成的误差
血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控；使用正常人未活化标本作为阴性质控
血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控；使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控
血小板表面抗原缺失：如巨血小板症血小板表面CD42a/CD42b缺失，血小板无力症血小板表面gpIIb/IIIa，即CD41/CD61缺失或异常。使用正常人标本做阳性对照，抗体的同型对照做阴性对照
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 14:34

流式细胞术的发展和临床应用
[日期：2003-5-5] 来源：中华检验医学杂志1999年 第22卷 第6期 Vol.22 No.6 1999 作者：孙芾　王厚芳 [字体：大 中 小]





　　流式细胞术(FCM)是70年代初发展起来的一项高新技术，80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。我国在80年代初引进了第一台流式细胞仪，到目前在医学院校、科研机构和医院已经有100多台。
　　FCM采用流式细胞仪对细胞悬液进行快速分析，通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。FCM综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和技术，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点，还有对所需细胞进行分选等特殊功能。随着该仪器性能的不断完善，操作简单的各新型流式细胞仪相继问世。新试剂的不断发现使试验费用日益降低，FCM也从研究室逐步进入临床实验室，成为常规实验诊断的重要手段，不仅为临床提供了重要的诊断依据，也使检验科室的诊断水平、实验技术提高到一个新的高度。
　　一、流式细胞仪工作原理
　　生产流式细胞仪的主要厂家是美国的BD公司和贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)两家公司，它们生产出一系列科研型和临床型的流式细胞仪，并研制生产了FCM所用的各种单克隆抗体和荧光试剂。科研型流式细胞仪(如FACStar, FACSort, EPICS-Elite等)功能齐全，分析灵活，但操作比较繁琐，必须由经过正规培训的专业技术人员进行操作。临床型的仪器(FACScan, Profile等)易于操作，稳定性好，分析速度快，适合在临床实验室中应用。
　　流式细胞仪的工作原理是将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱，后者与入射的激光束垂直相交，液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学系统(透镜、光阑、滤片和检测器等)收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号，计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号，对各种指标做出统计分析［1，2］。
　　科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来，以便对它们进行进一步的研究分析。其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动，流动室即随之振动，使液柱断列成一连串均匀的液滴，一部分液滴中包有细胞，而细胞性质是在进入液滴以前已经被测定了的，如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符，则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷，使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，按照所带电荷符号向左或向右偏转，落入指定的收集器内，完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其它处理，做更深的研究。
　　二、流式细胞术的临床应用
　　随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。
　　1.在肿瘤学中的应用：这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G1期，S期和G2期)，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。(1)发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断：人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。(2)在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用：FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。
　　FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。
　　此外FCM近几年还被应用于细胞凋亡和多药耐药基因的研究中［3，4］。医学工作者开始研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。多药耐药是肿瘤病人化疗失败的主要原因，FCM对多药耐药基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定，可为临床治疗效果分析提供有力依据。
　　2.在临床细胞免疫中的作用：FCM通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。有大量文章介绍了淋巴细胞亚群等在各种疾病中的变化。正常人群淋巴细胞T4/T8比值大约为2∶1，但在人体细胞免疫力低下时可出现比例倒置。用FCM还可以监测肾移植后病人的肾排斥反应，如果T4/T8比例倒置，病人预后良好，较少发生肾排异现象；反之排异危险性增加。同样此种测定技术也用于爱滋病的诊断和治疗中。还有作者报告了外周血淋巴细胞免疫表型的参考值，并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了探讨［5］。
　　目前FCM用的各种单克隆抗体试剂已经发展到了百余种，可以对各种血细胞和组织细胞的表型进行测定分析。
　　3.在血液病诊断和治疗中的应用：FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。(1)白血病的诊断和治疗：FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体，借助于各种荧光染料(异硫氰基荧光素FITC，藻红蛋白PE等)测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有决定性作用［6］。例如干细胞表达CD34，髓系表达CD13、CD14，B细胞系表达CD10、CD19、CD20等，T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7，利用FCM可以测定出血细胞表达各种抗原的水平，协助临床确诊。
　　同其它肿瘤的治疗一样，测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同，定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。
　　
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 14:34

目前临床除化疗药物治疗外还采用造血干细胞移植技术治疗急性白血病和一些疑难性疾病［7］。FCM通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植技术主要包括干细胞的鉴别、活性测定、干细胞动员和采集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列过程。FCM测定CD34、HLA-DR、CD33等细胞表面标志物，成为干细胞移植技术重要的监测手段。用FCM检测一系列指标观察病人的恢复状态，可以对预后做出早期的判断。(2)其它种类血液病的诊断和治疗监测：阵发性睡眠性血红蛋白尿症是一种造血干细胞克隆病，细胞CD55、CD59抗原表达减低是该病的一个特点。该抗原属于血细胞表面磷脂酰肌醇锚连蛋白家族，是重要的补体调节蛋白，它通过与补体C8、C9的结合以阻止补体膜攻击复合物的形成，从而抑制细胞被补体激活溶解。FCM采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞CD59的表达做定量分析，可以协助临床做出诊断并判断疾病的严重程度［8］。(3)网织红细胞的测定及临床应用：网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标，FCM通过某些荧光染料(吖啶橙、噻唑橙等)与红细胞中RNA结合，定量测定网织红细胞中RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。有作者报道FCM方法比目测法结果精确度更高［9］。此外FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度，对红细胞增殖能力的判断很有意义［10］。为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。
4.在血栓与出血性疾病中的应用：(1)血小板功能的测定：正常情况下血小板以分散状态在血管内运行，但当血管损伤、血流改变或受到化学物质刺激时血小板被活化而发生一系列改变。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，FCM测定血小板膜糖蛋白的表达情况成为检查血小板功能的一种新手段［11］。该方法灵敏、特异性高。如果采用全血法测定，只需微量标本，适合于儿童及血小板减少性疾病的患者［12］。
　　血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生显著改变，FCM可以通过单抗免疫荧光标记(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62，CD63等)监测血小板功能及活化情况，有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。
　　此外血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化，借助于钙离子敏感荧光探针的帮助，用FCM测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。(2)血小板相关抗体的测定：免疫性血小板减少性紫癜病人血浆中可产生血小板自身抗体，结合在血小板表面，称为血小板相关抗体，其分子可以是IgG、IgA或IgM，用羊抗人IgG、IgA、IgM荧光抗体标记被测血小板，FCM可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体，间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测，具有检测速度快、灵敏度高的优点。

作者单位：100016 北京和睦家医院

参考文献

　[1]　Grogan WM. Guide to flow cytometry methods. New York: Marcel Dekker Inc, 1990,1-20.
　[2]　丛玉隆，孙芾，陈宝梁，主编.当代血液分析技术与临床.北京：人民卫生出版社，1997，166-171.
　[3]　栾凤君，杨纯正，邵晓枫，等.100例急性白血病患者多药耐药性检测分析.中华肿瘤杂志，1994，16：360-363.
　[4]　宋玉琴，徐功立，张凌岩，等.Fas基因在rhG-CSF诱导白血病细胞凋亡过程中的作用.中华血液学杂志，1999，20：242-244.
　[5]　朱立华，王建中.中国人血液淋巴细胞免疫表型参考值调查.中华医学检验杂志，1998，21：210-213.
　[6]　肖志坚，郝玉书.免疫表型分析与急性白血病诊断.中华血液学杂志，1997，18：53-55.
　[7]　韩忠朝，冯四洲，韩明哲.造血干细胞移植技术及其应用.中华血液学杂志，1998，19：663-666.
　[8]　高珏华，谢毅.DC59单抗封闭红细胞与阵发性睡眠性血红蛋白尿症溶血试验的研究.中华血液学杂志，1999，20： 187-190.
　[9]　孙芾.流式细胞仪测定网织红细胞.陕西医学检验，1995，10：5-8.
　[10]　崔巍.网织红细胞成熟度临床应用的研究.中华医学检验杂志，1997，20：19-20.
　[11]　王建中，孙芾.流式细胞术检测活化血小板.中华医学检验杂志，1994，17：83-85.
　[12]　徐杰，阮长耿，王爱青，等.应用流式细胞仪检测血小板膜糖蛋白.中国小儿血液杂志，1997，20：216-219
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 14:34


流式细胞术在血液学中的应用

一、流式细胞术在基础血液学中的应用

（一）血细胞的计数和分类研究
1．红细胞的计数、分类及其功能的研究
（1）循环的红细胞总量的测定：
生物素—逆转抗生物素蛋白—FITC系统的特异性和流式细胞 仪（FCM）的敏感性结合起来，建立了FCM测定人红细胞总量的方法，此方法具有标本用量少，无放射性的优点，适用于儿童和孕妇测定循环红细胞总量。
（2）网织红细胞总数：
外周血网织红细胞计数（百分数和绝对值）是一反映骨髓红系增生活性的常用指标。许多学者先后提出应用FCM和不同的RNA特异性荧光染料自动计数网织红细胞的方法，如派若宁Y、AO、溴化乙啶、thiazole orange等。
目前最普遍应用的是 thiazoie　orange 染色法，这种特异性RNA 的激发波（488nm）测量的特点，与人工计数法相比，它不但能得到网织红细胞的百分数和绝对值，而且还能获得网织红细胞成熟指数（RMI）。RMI是一个检测骨髓功能的独立实验室指标，它与网织红细胞内RNA含量成正比，RMI可成功地用于评价骨髓移植的效果。
目前，FCM检测网织红细胞主要用于
1）预测骨髓移植的效果；
2）解释各种红系增长低下性贫血的发病原因;
3）评价某些新的重组生物制剂的治疗效果。
2．白细胞计数、分类及其功能的研究
（1）白细胞计数和分类
FCM方法避免常规染色过程中，由于细胞漂洗和分类溶解所致的人工假象，提供了可靠的评价血液状态的第一手资料，并进一步筛选细胞亚群、测定其他参数。LDS-751、CD45、thiazole orange
（2）中性粒细胞的功能
FCM可在单个细胞水平上定量测定中性粒细胞的功能变化，有助于了解白细胞在感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性疾病的作用和诊断意义。
（3）血小板功能的研究：
FCM可检测血小板膜抗原，如CD41a、CD42b、CD36、CD62p、CD63等。应用流式细胞术检测这些单克隆抗体的变化可用于：
a、评价血小板功能状态;
b、探测循环血液中激活的血小板;
c、探测血小板自身抗体。
如对原发性血小板减少性紫癜、慢粒急变和再障病人的血小板自身抗体的检测中发现，病人均可探测到IgM型自身抗体，有的病人可同时伴有IgM或IgA自身抗体，后者血小板减少更明显。因此，IgG血小板免疫荧光检查是检测自身免疫反应的敏感和特异指标，它可直接测定自身免疫性血小板减少病人的血小板表面免疫球蛋白，进行血小板交叉配型，以此为有自身免疫反应的病人选择合适的供血者。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 14:36

（二）正常骨髓各系血细胞特点的研究
1．造血干细胞的特点：
FCM多参数分析可以探测常规形态检查方法不能确认的造血干细胞。
2．红细胞系统的特点：
FCM系统地观察了红系统表面特异性抗原（Hle-1、CD71和Glycophorin A）核酸及红细胞体积的变化来研究红系在正常骨髓分化成熟的规律。Glycophorin A常作为红细胞晚期的特征，出现在有核红细胞，此时可与体积相似的淋巴细胞进行鉴别，Glycophorin A在成熟红细胞达到最大值，不再随红细胞的成熟而变化。CD71表达介于Hle-1和Glycophorin A之间，在Glycophorin A出现之前，达到最大值。Hle-1主要表达在最早期可鉴别的红细胞上，随着红细胞的成熟而逐渐减少，红系随着成熟细胞体积逐渐减少的物理特点，可由FCM的前向散射光来测得。另外，在CD71和Glycophorin A成熟红细胞中，DNA含量逐渐减少，以至只含有RNA，失去CD71成为成熟红细胞。
3.粒细胞的特点
（1）区别正常粒细胞和白血病克隆；
（2）确定白血病是以粒系为主，还是以单核细胞为主；
（3）探测粒细胞白血病的异质性。
4.巨核细胞的特点
应用FCM同时观察巨核细胞的体积，内部结构，DNA含量以及膜表面抗原在细胞分化成熟中的变化。
5.正常骨髓B细胞的分化和成熟
Ⅰ期：CD19、CD34、HLA-DR、TdT、CD10、Ig基因重排
Ⅱ期：失掉CD34、核TdT，CD10减弱，HLA-DR强度增加4倍，
同时表达HLA-DP和CD45 、CD19
Ⅲ期：CD20、HLA-DQ、SigM、CD19
Ⅳ期：CD19、CD21、CD22，不表达CD10
6.正常骨髓浆细胞的特点
两群：一群体积较小，表达CD22、CD35和SigE，是早期浆细胞。
另一群体积较大，膜抗原表达有明显异质性。
7.正常骨髓细胞DNA含量与细胞表型
S期：红系>粒系>单核系>淋巴系
淋巴系统中，S期的T细胞百分率明显低于B细胞

二、 流式细胞术在血液病学中应用

（一）白血病的分类研究
B-cell ALL
1.TdT positive.
2.CD10 positive, except for progenitor B-cell ALL.
3.HLA-DR positive.
4.CD19 frequently present without CD20.
5.Positive cytoplasmic μ chain in pre-B-cell type only.
6.Monoclonal surface immunoglobulin in L3 only.
7.Immunoglobulin gene or T-cell receptor gene rearrangement.

T-cell ALL
1.Positive TdT.
2.Usually negative CD10 and HLA-DR (more frequently positive in adult T-ALL).
3.CD7 is frequently the only positive T-cell marker, but all T-cell markers can be present.
4.T-cell receptor gene rearrangement.

Acute Myeloblastic Leukemia without Maturation (M1)
1.Greater than 90% of myeloblasts in the bone marrow.
2.Greater than 3% MPO-positive blasts in the bone marrow.
3.Blasts positive for CAE.
4.Blasts positive for CD33/CD13, HLA-DR.
5.Blasts negative for CD14, CD15,CD41/CD61,glycophorin.
6.Immunoglobulin and/or TCR gene arranged in mixed-lineage leukemia.
7.Specific cytogenetic abnormalities: t(9;22)(q34;q11) and inv(3) (q21;q26).
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 14:37

Acute Myeloblastic Leukemia with Maturation (M2)
1.30-90% of myeloblasts present in bone marrow.
2.Less than 20% monocytic precursors in the bone marrow
3.Less than 5×10 9 /L monocytic precursors in the peripheral blood.
4.Cytochemical stain for blasts: Positive for myelo-peroxidase and chloroacetate esterase but negative for α-naphthyl butyrate esterase.
5.Monoclonal antibody panelositive for CD13,CD15,CD33,HLA-DR,but negative for CD14.
6.Specific cytogenetic abnormality: t(8;21)(q22;q22).

Acute Promyelocytic Leukemia (M3)
1.Presence of more than 30% hypergranular (or hypogranular) promyelocytes in the bone marrow.
2.Presence of multiple Auer rods in the cytoplasm of leukemia.
3.Cytochemical staining: Strongly positive for myeloperoxidase and chloroacetate esterase, but negative for a-naphthyl butyrate esterase.
4.Immunophenotypeing : Positive for myelomonocytic antigens (CD13,CD15,CD33),negative for monocytic antigen (CD14) and HLA-DR.
5.Abnormal karyotype : t(15;17) detected by cytogenetic or molecular biological techniques.
6.Coagulation work up: Decreased platelets and fibrinogen; prolonged prothrombin, activated partial thromboplastin and thrombin times, and increased levels of fibrin degradation products.

Acut Myelomonocytic Leukemia(M4)
1.Presence of at least 30% myeloblast-monboblasts in bone marrow.
2.Monocytic component : More than 20% but less than 80% in bone marrow.
3.If monocytic component is less than 20% in the bone marrow.
A.Monocyte count in peripheral blood should be greater than 5×10 9 /L.
B.Serum lysozyme concentration should exceed three times the normal value.

4.Myeloblasts :More than 20% in bone marrow.Acute Myeloblastic Leukemia with Maturation (M2)
1.30-90% of myeloblasts present in bone marrow.
2.Less than 20% monocytic precursors in the bone marrow
3.Less than 5×10 9 /L monocytic precursors in the peripheral blood.
4.Cytochemical stain for blasts: Positive for myelo-peroxidase and chloroacetate esterase but negative for α-naphthyl butyrate esterase.
5.Monoclonal antibody panelositive for CD13,CD15,CD33,HLA-DR,but negative for CD14.
6.Specific cytogenetic abnormality: t(8;21)(q22;q22).

Acute Promyelocytic Leukemia (M3)
1.Presence of more than 30% hypergranular (or hypogranular) promyelocytes in the bone marrow.
2.Presence of multiple Auer rods in the cytoplasm of leukemia.
3.Cytochemical staining: Strongly positive for myeloperoxidase and chloroacetate esterase, but negative for a-naphthyl butyrate esterase.
4.Immunophenotypeing : Positive for myelomonocytic antigens (CD13,CD15,CD33),negative for monocytic antigen (CD14) and HLA-DR.
5.Abnormal karyotype : t(15;17) detected by cytogenetic or molecular biological techniques.
6.Coagulation work up: Decreased platelets and fibrinogen; prolonged prothrombin, activated partial thromboplastin and thrombin times, and increased levels of fibrin degradation products.

Acut Myelomonocytic Leukemia(M4)
1.Presence of at least 30% myeloblast-monboblasts in bone marrow.
2.Monocytic component : More than 20% but less than 80% in bone marrow.
3.If monocytic component is less than 20% in the bone marrow.
A.Monocyte count in peripheral blood should be greater than 5×10 9 /L.
B.Serum lysozyme concentration should exceed three times the normal value.

4.Myeloblasts :More than 20% in bone marrow.
5.Myeloperoxidase positive cells : More than 3%.
6.Chloroacetate esterase and a-naphthyl butyrate esterase-positive cells: Roughly more than 20% each.
7.Abnormal chromosome 16 in M4 : Associated with M4 EO subtype.
8.Immunophenotype : Positive for CD13,CD14,CD15,CD33,and HLA-DR ,negative for CD41/CD42/CD61 and glycophorin A.

Acute Monoblastic Leukemia (M5)
1.Presence of more than 80% monocytic component among the nonerythroid cells in the bone marrow.
A.M5a: 80% or more of monocytic components are monoblasts.
B.M5b: Predominantly monocytes and promonocytes.
2.Elevation of serum and urine lysozyme levels.
5.Myeloperoxidase positive cells : More than 3%.
6.Chloroacetate esterase and a-naphthyl butyrate esterase-positive cells: Roughly more than 20% each.
7.Abnormal chromosome 16 in M4 : Associated with M4 EO subtype.
8.Immunophenotype : Positive for CD13,CD14,CD15,CD33,and HLA-DR ,negative for CD41/CD42/CD61 and glycophorin A.

Acute Monoblastic Leukemia (M5)
1.Presence of more than 80% monocytic component among the nonerythroid cells in the bone marrow.
A.M5a: 80% or more of monocytic components are monoblasts.
B.M5b: Predominantly monocytes and promonocytes.
2.Elevation of serum and urine lysozyme levels.
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 14:38

3.Cytochemistry:
Myeloperoxidase : may or may not be positive.
Nonspercific esterase : strongly positive .
Specific esterase and periodic acid-Schiff: usually negative .
4. Immunophenotype : Positive for CD11c,CD13,CD14,CD15,CD33,HLA-DR,negative for CD41, CD42, CD61 and glycophorin.
5. Cytogenetics : Association with t/del(11)(q23).

Acute Megakaryoblastic Leukemia (M6)
1.Presence of at least 50% erythroblasts among all nucleated cells in the bone marrow.
2.Presence of at least 30% myeloblasts among all nonerythroid cells in the bone marrow.
3.PAS positivity in all mature and immature nucleated erythroid cells.
4.Glycophorin-A antibody or other erythroid antibodies: The only reliable antibody for phenotyping.
5.React variably to myelomonocytic (CD13,CD33) and platelet (CD41) antibodies.
6.Most frequent cytogenetic abnormalities: -5/5q- ,-7/7q- .

Acute Megakaryoblastic Leukemia (M7)
1.Presence of 30% or more megakaryoblasts in the bone marrow.
2.Excess of blasts with increased numbers of maturing megakaryocytes in bone marrow biopsy , plus identification of megakaryoblasts in the peripheral blood and bone marrow aspirate by immunologic techniques.
3.Electron microscopic identification of platelet peroxidase in leukemic cells.
4.Monoclonal antibodies : CD41,CD42,and CD61 are specific for megakaryoblastic.
5.Myelomonocytic markers : Positive for CD33 but negative for CD13,CD14 and CD15.
6.PAS Staining pattern in megakaryocyte-megakaryoblasts : Periphery of cytoplasm and concentrated on cytoplasmic blebs.
7.t(1;22)(p13;q13): Specific for M7 infants.

（二）白血病细胞动力学
1、不同类型急性白血病细胞动力学差异不大。
2、RNA含量与细胞增殖活性呈正相关，G1期细胞DNA含量高于G0期。RNA高的细胞具有较高的增殖能力。
3、治疗前RNA高的急性白血病，化疗效果好，缓解期较长；RNA含量越低，则更多的细胞处于G0期，化疗效果差，不易缓解。一旦获得缓解，缓解期相当长。
4、DNA非整倍体是恶性细胞的标志，但急性白血病的DNA非整倍体检出率低于实体肿瘤。

（三）预测化疗效果和微小残留病变（MRD）
1、小剂量阿糖胞苷（Ara-C）由于阻断DNA的合成而使S期增高；
2、小剂量阿糖胞苷（Ara-C）由于杀死S期细胞而使S期减少；
3、应用FCM动态观察化疗前后细胞动力学参数的变化，发现化疗有效者，化疗后S期和RNA 指数下降比无效者明显，且S期恢复较快。
4、MRD是白血病复发的根源。
（1）DNA非整倍体监测化疗效果；探测1%-3%残留白血病细胞；有DNA非整倍体的缓解期白血病多在三个月内复发。
（2）检测白血病相关抗原
CALLA+/TdT+ 抗原监测急淋或TdT+/CD5+抗原监测T细胞急淋。
（3）运用FCM分选感兴趣细胞分子水平的研究，如PCR、FISH等。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 14:38

四）其他恶性血液病的应用
1.骨髓增生异常综合征（MDS）
（1）依细胞动力学特点可分为RA、RARS、RAEB、CMML。
（2）低S期者预示生存期短。
（3）DNA非整倍体可作为MDS转化为白血病的早期指标。
2.慢性淋巴细胞白血病（CLL）
（1）表面Ig荧光强度弱是CLL的特点，借此区别慢性淋巴细胞性淋巴瘤和幼稚淋巴细胞性白血病。
（2）慢淋的细胞动力学特点是骨髓和外周血的S期低（0.2），而淋巴结的S期却高达60%。其RNA含量低于正常淋巴细胞，通常难以发现DNA非整倍体。
　　3.慢性粒细胞白血病（CML）
　 （1）CML是一种累及多种细胞系的白血病。
（2）90%以上CML Ph+，借此可探测MRD。
（3）CML急变时，可发现DNA非整倍体，急粒变时RNA升高，急淋变时RNA 下降。
（4）CML细胞动力学与正常造血细胞没有明显差异。
4．淋巴瘤
（1）大多数低危淋巴瘤的DNA多为二倍体或近二倍体。
（2）滤泡性淋巴瘤为近二倍体或近四倍体。
（3）弥漫性大细胞淋巴瘤多为高二倍体，Burkitt淋巴瘤为二倍体或高二倍体。
（4）滤泡性淋巴瘤主要表达B细胞标志，但不表达CD5，可区分滤泡性淋巴瘤白血病和CLL，区别Burkitt淋巴瘤（SIgG+，CD10-）和小细胞无核裂淋巴瘤（SIgG+，CD10+）。
（5）何杰金氏病多为二倍体，增殖活性不高，10%病人可为四倍体或高四倍体，伴有较多R—S细胞（CD15+、CD30+）。
5．骨髓瘤
骨髓瘤是干细胞疾病，其DNA非整倍体探测率高于其他恶性血液病（60%-80%），增殖活性低，RNA含量高，这些参数在不同类型的骨髓瘤中有一定预后意义。

（五） 分选造血细胞
分选细胞是FCM的又一重要功能，目前主要用于：
（1）骨髓移植，清除自身骨髓中恶性细胞或异体骨髓中参与移植反应的细胞。
（2）分选造血干细胞。
（3）进行分子生物学研究。

三．FCM在白血病基因产物的表达和细胞凋亡的检测

1．P53基因
P53是一种抑癌基因产物，此基因突变是包括白血病在内的恶性肿瘤常见的遗传学
变化。
2．P21ras原癌基因
其编码蛋白均为P21，对细胞分化生长起重要作用，其活化也是肿瘤发生的主要原因之一。
3．Bcl-2抗凋亡基因
Bcl-2高度表达不仅可抑制白血病细胞凋亡，使其长期存活，而且对治疗反应差。
4．凋亡 （apoptosis）
凋亡也称细胞程序性死亡（programmed　cell death，PCD）是细胞自我死亡的一种形式，是基因导向的细胞自我破坏的过程，通过细胞内核酸内切酶使核小体间DNA裂解，细胞死亡巨噬细胞清除。
5．P170多药耐药基因
其mdr-1编码P170蛋白是细胞膜泵，将进入细胞内的化疗药物主动泵出细胞，使细胞内药物和浓度降低，白血病细胞表达P170，则诱导缓解率减低，复发率高和持续缓解时间短。
6．谷胱甘肽转移酶（GST）
GST主要涉及细胞解毒包括对某些化疗药物的分解，使进入细胞内的药物浓度降低。
FCM具有多参数检测的优点，一次可检测细胞周期分布、DNA倍体，P53、P21、bcl-1、P170、GST、凋亡等，并可研究参数间相互关系。随着特异单克隆抗体的增多，FCM检测的项目也越来越多，其快速、简便、同一标本可检测多项等到特点使FCM 至今应用不衰。
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 14:44

四．FCM在器官和骨髓移植的应用

（一） 移植前
1．交叉配型
2．监测骨髓中的肿瘤细胞或造血干细胞

（二） 移植后FCM可用于监测移植后血液或植物内免疫成分的变化，以预测移植后免疫排斥反应、细胞免疫抑制治疗效果和移植物存活情况。

五．FCM在免疫血液病中的应用

FCM在免疫血液病的应用主要有以下几方面：
1．定量测定结合在细胞膜上免疫球蛋白或补体，协助自身免疫性溶血性贫血的诊
断。
2．探测少见的细胞群，如骨髓移植后所出现的嵌合体。
3．探测血小板和白细胞抗体，协助诊断血小板减少性紫癜和输血后免疫性血小板
减少。
4．检测细菌、病毒、寄生虫以及其所引起的免疫反应，协助感染性疾病的诊断和病原体确立。

FCM在血液学有广泛的应用前景，特别是随着免疫标记物的发展，FCM程序化和质量控制的采用，以及与分子生物学完美地结合，将会对血液学定量研究产生巨大推动力。

四川迈克医疗设备工程技术有限公司学术应用部　
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-29 14:45


流式细胞仪标本的制备


流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的
结果。
　　(一)　原理
　　活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
　　(二)　操作步骤
　　　　　制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
　　　　　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为
　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)
　　　　　　　　的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS
　　　　　　　　稀释)灭活正常兔血清
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃ 30min
　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右
　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠
　　　　　　　　　(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃ 30min
　　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右
　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入
　　　　　　　　　1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，
　　　　　　　　　视细胞浓度加入100～500μl固定液)
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
　　　　　　　　　　(标本在试管中可保存5～7天)
(三)　试剂和器材
　　1.　各种特异性单克隆抗体。
　　2.　荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
　　3.　10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
　　4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
　　(四)　注意事项
　　1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
　　2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
　　3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
　　4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
　　附:
　　1. DPBS (×10, 贮存液)
　　　　NaCl 80g
　　　　KCl 2g 　　　　　蒸馏水加至1000ml
　　　　Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
　　　　KH２PO４ 2g
　　2.　洗涤液
　　　　DPBS　　　　　　900ml
　　　　FCS 50ml (终浓度　5％)
　　　　4％NaN３???50ml (终浓度0.2％)
　　3.　固定液
　　　　DPBS　　　　1000ml
　　　　葡萄糖　　　　20g (终浓度2％)
　　　　甲　醛　　　　10ml
　　　　NaN３　　　0.2g (终浓度0.02％)
作者: 兔唇    时间: 2012-1-29 14:45

请教各位前辈、老师：
我想用流式细胞仪测定细胞总蛋白含量（大鼠心肌细胞），具体步骤我不是十分的清楚，大体上是将待测细胞消化成单细胞悬液后，固定，FITC染色，行流式测定细胞内FITC荧光强度，最后取平均荧光强度。我的问题是：
1、好多都是用流式测定某一特定的抗原，我想知道用流式测定细胞总蛋白含量是否可行，它与传统的BCA法、Lowy法相比有什么优缺点
2、FITC如何溶解，我手头有一份5-FITC不是国产的。
3、具体的操作步骤是什么啊
期待前辈、老师的回复，非常感谢！
作者: kewanqi2011    时间: 2012-1-29 14:46

１细胞数最少可到数百个。我用流式分选后，再让它分选数百个到另一管中，分析纯度。
２需要两种同型对照。尤其是在第一次，需要调整补偿。此时最好做三管同型对照，即一管标IgG1FITC，一管标IgG1PE，一管标IgG1FITC＋IgG1PE。第一次做完后，要save settings，以后可以只做IgG1FITC＋IgG1PE。

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第一次做三管同型对照的原因，为什么后来又不用作了？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 14:47     标题: 回复 #1229 kewanqi2011 的帖子

同型对照是两个荧光之间有光谱的重叠时为了相互减去干扰而做的单个荧光染色，从而调定荧光补偿。说白了就是调定机器和您的对照。
也就是平时说的单阳。标准定下来后，就可以上样品管了。
其实理论上每次都要两个单阳和双阳。但做熟练后可以不要单阳，直接上双阳就可以调好了。
作者: kewanqi2011    时间: 2012-1-29 14:47


请教高手：关于同型对照的问题。
使用CD14(mouse IgG2)/CD45(mouse IgG1)辅助设门，为了圈出的淋巴细胞更准确，但是目标管是CD4(mouse IgG1)/CD8(mouse IgG1)/CD3(mouse IgG1)，如果用mouse IgG2/mouse IgG1作同型对照，目的管的结果受影响，如果用mouse IgG1/mouse IgG1/mouse IgG1作同型对照，又怕门设的不准确。CD14无IgG1的。抗体和同型对照都没的换的了，因为我作的动物抗体种类少。请教大家有没有可以解决的方法。
马上开始实验了，急！
作者: kewanqi2011    时间: 2012-1-29 14:48

同型对照是两个荧光之间有光谱的重叠时为了相互减去干扰而做的单个荧光染色，从而调定荧光补偿。说白了就是调定机器和您的对照。
也就是平时说的单阳。标准定下来后，就可以上样品管了。
其实理论上每次都要两个单阳和双阳。但做熟练后可以不要单阳，直接上双阳就可以调好了。

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非常感谢！我怎么记得调电压，目的细胞群被压在双阴的那管是同型对照啊？我记错了？那我说的这个是阴性对照？
作者: kewanqi2011    时间: 2012-1-29 14:48

请教有没有人知道不用试剂盒，使用买的单个CD3抗体怎么用绝对计数管作CD3的绝对计数？
作者: 969    时间: 2012-1-29 14:49


在晶美《2005-2006产品目录》第ⅷ页看到测淋巴细胞亚群的三色标记CD4/CD8/CD3试剂（FITC/PE/PE-Cy5），价格是2600元，拟买。该产品也出现在晶美《临床研究试剂2005-2006》第八页，我怀疑只是供临床上人用的。哪位高手告诉我，能否用来测大鼠的外周血淋巴细胞亚群？我很困惑。谢谢！
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-29 14:49


待仪器稳定后调好ACCUDROP,应该可以.
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-29 14:50

在晶美《2005-2006产品目录》第ⅷ页看到测淋巴细胞亚群的三色标记CD4/CD8/CD3试剂（FITC/PE/PE-Cy5），价格是2600元，拟买。该产品也出现在晶美《临床研究试剂2005-2006》第八页，我怀疑只是供临床上人用的。哪位高手告诉我，能否用来测大鼠的外周血淋巴细胞亚群？我很困惑。谢谢！

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晶美此产品确实是做人淋巴细胞亚群分析的,不能用于做大鼠血.
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-29 14:50

１细胞数最少可到数百个。我用流式分选后，再让它分选数百个到另一管中，分析纯度。
２需要两种同型对照。尤其是在第一次，需要调整补偿。此时最好做三管同型对照，即一管标IgG1FITC，一管标IgG1PE，一管标IgG1FITC＋IgG1PE。第一次做完后，要save settings，以后可以只做IgG1FITC＋IgG1PE。
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同型对照是两个荧光之间有光谱的重叠时为了相互减去干扰而做的单个荧光染色，从而调定荧光补偿。说白了就是调定机器和您的对照。
也就是平时说的单阳。标准定下来后，就可以上样品管了。
其实理论上每次都要两个单阳和双阳。但做熟练后可以不要单阳，直接上双阳就可以调好了。
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园丁##老兄的观点不大正确(恕我直言):
做同型对照的目的不是为了调补偿,而是确定阴性范围,即单色时参照其画marker;做多色时参照其画十字.而且每次实验时只需做一管同型对照就可以了,单色实验时用单色同型对照,多色实验时用多色同型对照.
做单阳性管才是为了多色调补偿用.
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-29 14:51

请教高手：关于同型对照的问题。
使用CD14(mouse IgG2)/CD45(mouse IgG1)辅助设门，为了圈出的淋巴细胞更准确，但是目标管是CD4(mouse IgG1)/CD8(mouse IgG1)/CD3(mouse IgG1)，如果用mouse IgG2/mouse IgG1作同型对照，目的管的结果受影响，如果用mouse IgG1/mouse IgG1/mouse IgG1作同型对照，又怕门设的不准确。CD14无IgG1的。抗体和同型对照都没的换的了，因为我作的动物抗体种类少。请教大家有没有可以解决的方法。
马上开始实验了，急！



Re:其实你不用做CD14/CD45的同型对照，因为它只是为了圈淋巴细胞门用；只需做CD4/CD8/CD3的同型对照mouse IgG1/mouse IgG1/mouse IgG1就行了。
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-29 14:51


初做流式,请教.我要检测在不同条件下细胞表面的同一种蛋白的表达情况,请问我是比较该蛋白的阳性率还是平均荧光强度?
作者: junjie05    时间: 2012-1-29 14:52


大家好,我想请教一个问题:
流式测淋巴细胞增殖,用全血来做,其中用PMA(初浓度为2ug/ml)刺激,时间为4-6个小时,结果阳性率不高,会不会是我的培养时间短了,PMA没起什么作用?
作者: 大白菜    时间: 2012-1-29 14:53


请高手指教流式 和酶联免疫吸附的优缺点?
作者: xevin    时间: 2012-1-29 14:53

能否用无菌流式从单个核细胞中分选CD4＋CD25+ T CELLS 和 CD34+细胞 ？
作者: yhz1973    时间: 2012-1-29 14:54


请教各位大侠，我准备流式检测凋亡，选哪个公司或单位价格质量比较好？
作者: @STAR@    时间: 2012-1-29 14:54

请问
如果做 干细胞的流式鉴定
细胞如何处理 ？
另外，战友有成熟的检测方法和标记吗？
我打算用 CD34 44 106
作者: hold住    时间: 2012-1-29 14:55

能否用无菌流式从单个核细胞中分选CD4＋CD25+ T CELLS 和 CD34+细胞 ？

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是BD FACSCalibur带的分选系统吗？我问过BD的工程师，他们说主要看你对无菌的要求有多严格，因为即便用酒精冲洗管道，灭菌的作用也是有限的。由于它的分选速度很慢，最高才300个细胞/秒，意味着细胞在有菌的情况下时间长。如果分选得到的细胞还要培养再研究，很难做到不污染。
如果条件允许，可以使用其它的分选方式，比如磁珠分选，可以在操净台里做。
作者: loli    时间: 2012-1-29 14:56


请教一下，活细胞用JC-1染色，流式检测线粒体膜电位的变化，有哪位做过的吗？能否指点一下，多谢了先！
作者: eric930    时间: 2012-1-29 14:56


我想检测细胞的ICAM-1和VCAM-1 可以用流式吗？是高表达还是底表达啊？
作者: qqq111    时间: 2012-1-29 14:57

请教一下有没有用流式申请课题的？都是什么相关的课题阿
作者: baidukk    时间: 2012-1-29 14:58

今天使劲K了一下有关凋亡和流式的资料，总算小懂了一点。
想问一下，流式测细胞的凋亡，所用染料是FITC还是PI呢？其原理是不是就是Annexin-V FITC/PI试剂盒的原理啊？
作者: cocacola    时间: 2012-1-29 14:59

我做的是用流式检测培养细胞内的一种蛋白激酶，前期固定渗透都是按从国外购买的抗体说明书来的，今天结果出来了，所有组的峰值均在十的一次方之内，我不知为何如此？看了好多流式图，峰值均在十的一次方之上。我是第一次接触流式，很郁闷，敬请高手指点一下。多谢多谢。请问是不是就算改值有差异，也说明不了问题。
作者: cocacola    时间: 2012-1-29 14:59


图片还没拿回来,得其他指标做完才能拿.好象gate值就有6.0多，最高的一组值是22点多。反正图形扁扁的,峰值都在十的一次方之内,急死了。网上关于流式细胞术的结果分析几乎没有.真的很急.请问有什么原因可造成?pubmed上有老外做的,同样的指标,人家的峰值都挺高。还有一个问题请教，如果正常细胞内该蛋白磷酸化水平很低，做western几乎没有条带，做流式可否出现该情况。哪些问题可导致该结果？？多谢了！
作者: 小鱼鱼    时间: 2012-1-29 15:00

我是用Rh123测线粒体膜电位的，结果已经有了，但不知道怎么分析，哪位大侠可以指点一下，网上都找不到相关的分析，文献上也都是分析好的结果，没有原始的图片。
作者: 泡泡    时间: 2012-1-29 15:01


我合成的多肽上连有荧光蛋白，拿它作用于肿瘤细胞，用流式检测细胞的凋亡程度（多肽有促凋亡的作用），多肽上连有荧光蛋白会不会影响流式检测呢？
作者: loli    时间: 2012-1-29 15:01

今天使劲K了一下有关凋亡和流式的资料，总算小懂了一点。
想问一下，流式测细胞的凋亡，所用染料是FITC还是PI呢？其原理是不是就是Annexin-V FITC/PI试剂盒的原理啊？

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流式测细胞的凋亡，所用染料是PI。原理与Annexin-V FITC/PI试剂盒的原理不尽同。Annexin-V FITC/PI试剂盒检测早期凋亡。
作者: TAT    时间: 2012-1-29 15:02

我合成的多肽上连有荧光蛋白，拿它作用于肿瘤细胞，用流式检测细胞的凋亡程度（多肽有促凋亡的作用），多肽上连有荧光蛋白会不会影响流式检测呢？

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看你的荧光蛋白发什么荧光了，流式检测细胞的凋亡用PI（发红色荧光）染色。
作者: TAT    时间: 2012-1-29 15:02

请教一下有没有用流式申请课题的？都是什么相关的课题阿

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太多了。当然与细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖等相关。
作者: guagua    时间: 2012-1-29 15:03


请教有关透膜剂：
我用流式标记 细胞浆 内的抗体--vWF(间标，一抗为鼠抗人vWF,二抗为羊抗鼠IgG)
我对透膜剂不太了解，没有经验，计划如下，请指正!谢谢!

1.固定 ，用4%多聚甲醛，常温作用10分钟。
2.PBS洗涤一次
3.加0.5% 曲拉通100,常温作用15分钟，
4.不洗涤，直接加抗体孵育......
作者: october7    时间: 2012-1-29 15:03

最近由于课题的需要打算测药物作用后所培养的肝癌细胞株bel7402细胞株端粒长度，打算用两种方法，SOUTHERN BLOT是一种经典的方法，自己打算购买ROCH公司的试剂盒；另外，我想求助各位是否能用丹麦的DAKO公司的telomere pna kit/fitc来检测?根据流式细胞仪的测定原理，应该可以检测单个细胞的端粒的长度，但是我看了厂家的说明是推荐用来检测造血细胞的端粒长度，在PUBMED上检索到的测端粒长度的文献也基本上是关于造血细胞的，国内有查到几篇文献是测非造血细胞的。自己现在很头疼，希望高手指教。
作者: glass    时间: 2012-1-29 15:03

请问有关如何应用流式细胞仪进行抗体检测的原理及具体步骤？？

我要做的是检测小鼠 MHC抗体，请问应用流式如何检测？？

谢谢！！
作者: remenb    时间: 2012-1-29 15:04

我现在也正好在做骨髓基质干细胞的鉴定，下面是我查了一些文献对MSCs表面标记物的总结

阴性：14，34，45，133，HLA-1
阳性：29，44，73，105，106，HLA-2

但是不是100%阳性哦，有一定比例的

我马上就去中科院做流式了，到时欢迎大家和我交流
作者: ALALA    时间: 2012-1-29 15:04


请教各位高手，我用Annexin－PI在流式上测乳鼠心肌细胞的凋亡，为什么肉眼见到明显的凋亡，而流式的检测结果很低啊？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:05     标题: 回复 #1261 ALALA 的帖子

1，形态学上，您认为是凋亡，但是也许不是，也许是坏死的，因此，流式检测低。
2，流式检测问题，比如染色，操作，仪器情况等。
3，这种情况通常通过找时间点，药物计量，熟悉Annexin V－PI染色步骤等很容易解决！

好运！
作者: hold住    时间: 2012-1-29 15:06


悬浮细胞的固定
(1)甲醛法：在细胞悬液中加入等量的8%甲醛(用Hank'S液配)4℃下固定12-18小时。
(2)乙醇法：细胞悬于PBS中，缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇，使终浓度为70%，冰浴30分钟。
(3)丙酮法：于细胞悬液中，缓慢加入冷丙酮，使终浓度为85%。
2、实例：
(1)用预冷的无钙、镁含0.5mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液，将细胞制成1×106细胞的悬液。
(2)在4℃下逐滴加入3倍体积的95%乙醇，连续搅拌使乙醇终浓度达70%。
(3)该细胞可在4℃下保存数日。
(4)分析前先用1000r/min离心10分钟，弃去乙醇，再将细胞悬于PBS中或要求的试剂中。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:06     标题: 回复 #1263 hold住 的帖子

95％的酒精？？？
然后95除以4/3<75%,应该至少保持乙醇浓度在75％以上，因为固定过程中及固定以后都会在空气中操作，保存时也不可避免的会造成挥发，因此，我们实际操作中用80％的乙醇，以保证最佳的固定效果！
作者: DDD    时间: 2012-1-29 15:08

我做的是用流式检测培养细胞内的一种蛋白激酶，前期固定渗透都是按从国外购买的抗体说明书来的，今天结果出来了，所有组的峰值均在十的一次方之内，我不知为何如此？看了好多流式图，峰值均在十的一次方之上。我是第一次接触流式，很郁闷，敬请高手指点一下。多谢多谢。请问是不是就算改值有差异，也说明不了问题。

================================

可能原因及处理方法：

1，荧光染色效果不好，荧光强度不够。
2，改log为line，将峰值拉开。
3，加大电压和放大。
作者: DDD    时间: 2012-1-29 15:09

我合成的多肽上连有荧光蛋白，拿它作用于肿瘤细胞，用流式检测细胞的凋亡程度（多肽有促凋亡的作用），多肽上连有荧光蛋白会不会影响流式检测呢？

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看你测凋亡的方法中的荧光与荧光蛋白的荧光之间的影响程度了！
如果两者之间的荧光漏入较少，就可以，否则就不行，可以在网上查找你的荧光蛋白的发射波长和染色剂的波长，看看是否重复！
作者: DDD    时间: 2012-1-29 15:09

请问有关如何应用流式细胞仪进行抗体检测的原理及具体步骤？？

我要做的是检测小鼠 MHC抗体，请问应用流式如何检测？？

谢谢！

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如果有MHC的荧光抗体就买！
没有就用MHC的鼠抗，羊抗等，然后用带荧光的抗鼠，抗羊去标记，然后上机！
作者: gogo    时间: 2012-1-29 15:09


我刚刚开始做流式，有几个问题想请教大家
1，PI单染分析凋亡和细胞周期，因为细胞没有同步化是不是细胞周期得分析不太准确。分析细胞周期时CV%合适，我看园子上有人说cv不应大于8％。我测出得值cv％都在10－15％之间，是我得细胞不好结果不可信吗？（细胞周期得结果不可信，还是凋亡亚峰，计算的凋亡率和周期都不可信？
2，是不是每种细胞的周期都不太一样，有人做过卵巢癌SKOV-3的PI单染测细胞周期吗，我的正常细胞的G1=35%,S=47%,G2=17%.文献上好多细胞不都是以G1期为主吗？是我实验有问题，还是SKOV-3细胞本身就这样以S期为主（因为我还做了AO/EB染色，发现正常细胞中有大量双核细胞）
问题急盼解决，十分感谢！
作者: xueyouzhang    时间: 2012-1-29 15:10

求教 流式分选雪旺细胞的方法,应该怎么标记?? 有没有战友看过这方面的文献啊??
作者: ha111    时间: 2012-1-29 15:10


请教楼主，我做实验是将一种对细胞有毒的物质加到细胞的培养体系中，用MTT法检测细胞死亡。我在一篇文献上看到的可以用PI染色流式检测细胞死亡，但是操作写的不清楚，不知道我能否这样做。如果能这样做的话应该怎么操作
作者: hyuu    时间: 2012-1-29 15:11


请教高手，做的细胞周期来分析药物诱导的肿瘤细胞耐药株细胞周期变化
如图:1,2,3，4
其中3是肿瘤细胞株，4是药物诱导的耐药株

图片附件: 52400969.jpg (2012-1-29 15:11, 13.38 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10344

作者: hyuu    时间: 2012-1-29 15:12


第三张

图片附件: 39432428.jpg (2012-1-29 15:12, 10.27 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10345

作者: hyuu    时间: 2012-1-29 15:12

第4张

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10346

作者: tieshazhang    时间: 2012-1-29 15:13


据上面四张图，请高手帮忙分析，为何药物诱导的耐药株M4和M5是什么意思？是细胞聚集体？是异倍体？还是M3、M4、M5又组成了一个细胞周期？另外，BD-FACSCalibur分析所得的数据如何在PC机的cylchred软件或ModFit LT软件上打开？BD-Cellquest分析的图如何转到PC机上打开？谢谢！！请多多指点，不胜感激！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:13


4中G2/M期肉眼看有明显阻滞效应。
为什么要取到8倍体那么高的地方去？？不太清楚试验目的！
1，2请发直方图上来！并附上数据！
作者: tieshazhang    时间: 2012-1-29 15:14


谢谢再发一下，未诱导的肿瘤细胞及数据
Multiple Document Interface for Flow Cytometry
WinMDI Version 2.9 - Windows 3.95/DOS 5.0
Wed Mar 08 22:07:40 2006
Gates: *R3*R4
Project: Experiment:
File: Data.00
Date: 02 Parameters: 1
Total Events 20000 Gated Events 17313 86.57%
System: Log Parameter Means: Geometric

图片附件: 28553072.jpg (2012-1-29 15:14, 23.09 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10347

作者: tieshazhang    时间: 2012-1-29 15:14

点图和直方图

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10348

作者: tieshazhang    时间: 2012-1-29 15:15


耐药株的
Multiple Document Interface for Flow Cytometry
WinMDI Version 2.9 - Windows 3.95/DOS 5.0
Wed Mar 08 22:07:40 2006
Gates: R1*R2
Project: Experiment:
File: Data.
Date: 02Parameters: 1
Total Events 20000 Gated Events 10279 51.40%
System: Log Parameter Means: Geometric

图片附件: 68385067.snap.jpg (2012-1-29 15:15, 27.59 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10349

作者: tieshazhang    时间: 2012-1-29 15:15

4中G2/M期肉眼看有明显阻滞效应。
为什么要取到8倍体那么高的地方去？？不太清楚试验目的！
1，2请发直方图上来！并附上数据！

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图小了点儿，放大看吧，帮别人做的，目的是分析肿瘤细胞与耐药株的区别，谢谢
作者: utt0989    时间: 2012-1-29 15:15


我是刚开始做流式，测细胞凋亡率，我想请教一下各位高手，收集细胞的时候培养液要倒掉吗？因为我看到加药24小时后培养液中有很多凋亡的细胞（我养的是贴壁细胞）就没有倒掉，但我不知道这个操作对不对；还有我有一种细胞很难吹打成单细胞悬液，我担心太用力吹打会造成细胞碎片太多，但轻柔吹打根本分不散，我想请教一下如果是细胞团的话会对测定结果有影响吗？谢谢！急盼答复！
作者: remenb    时间: 2012-1-29 15:16

我做的是Annexin/pi双染发检测细胞凋亡，但是做出来的结果分区不明显，成一条直线样的，请问各位高手这样的结果是不是有问题？是什么方面的问题，谢谢，期待解答

图片附件: 25050570.snap.jpg (2012-1-29 15:16, 50.55 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10350

作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:17

这个图肯定不行！
1，两个参数要log！
2，进行荧光之间的compensation！这一步最重要，也最难，否则图出来就是您这样。
3，后期软件进行荧光补偿效果不好，只有重做！

建议，先学习补偿的方法，再开始做试验！做一次全阴，两个单阳性的调试上样管出来，进行荧光补偿，然后再上机做试验！
作者: zranqi_1    时间: 2012-1-29 15:17

大侠，请教关于流式的问题，先谢谢！
我研究肿瘤细胞表面的一种受体，想用流式检测表达这种受体的细胞在总细胞中的比例及表达量。用RnD的一抗（按照说明书推荐25ug/ml），二抗是Sigma的FITC标记的（原液稀释150倍），分为四组（一抗10ul及二抗10ul，一抗15ul及二抗20ul，一抗20ul及二抗30ul，对照组不加一抗只加二抗），标记完就在流式下观察，结果显示对照组占0.7％，一抗20ul及二抗30ul的那一组占5％，结果不甚理想（与文献报道相差甚远），但在荧光显微镜下可见绿色荧光，请教：1.需要加小牛血清封闭吗？；
2.二抗加量是否可以提高。；
3.对照组设置是否恰当，是不是需要抗Ig的抗体？
作者: langlang    时间: 2012-1-29 15:18


我想用流式测白血病细胞BCL-2，请问需双标记吗？具体步骤如何操作？应注意什么问题？
作者: caihong    时间: 2012-1-29 15:18


请问用流式可以检测血清及皮肤组织中的血管紧张素II及血管紧张素转换酶吗?具体方法如何呢?非常感谢!
作者: chuntian1983    时间: 2012-1-29 15:18

我有几个问题想请各位前辈帮忙解答一下：
1.我做的实验是测患者外周血中CTL的perforin的表达，获得患者血标本的时间并不是固定的。因为流式不在我们科室做，如果每天都去做，那是相当麻烦。
因此，我想问，是不是可以把血标本冷藏，待收集了一定数量的标本再一次做流式？如果可以，怎么保存，能保存多久？
2.研究经费只有3000，但我看了一篇文章中说，CD3+CD8+双标抗体就要2000多。如果真是这么多钱的话，我就真作不成了。CD3+CD8+双标抗体真的要这么多钱吗？
3.有没有什么办法可以一次性把CD3+CD8+T细胞从外周血中提取出来？我听说有一种磁珠可以达到这种效果，（how much？）
4.因为CD3+存在于T细胞而不在NK细胞，而穿孔素则表达于CTL和NK细胞中，
那么，我是不是只要检测CD3+和穿孔素呢(我的意思是，只有表达CD3+和穿孔素的才可能是CTL，这样就不用检测CD8了，不知道我说明白了没有)？
请各位达人帮帮忙了！
作者: vera+    时间: 2012-1-29 15:19

我前不久刚接触流式,现在初步掌握操作,但有些问题一直困扰:
1、画MARKER到底有没有一定之规？不管以同型对照或是阴性来画，说正好圈住细胞就行了，像直方图上画，不同人分析可能有不同结果，如果阳性率低的话，结果差距相当明显。不知道画阴性区有没有百分比要求？而这一要求有没有文献支持？
2、直接法设同型对照，间接法也需要吗？是否就设阴性对照就可以？需要空细胞对照吗？
3、同型对照怎样判断已不能用？（练手时发现几年前的对照和新买的没什么区别）
4、单细胞系单标分析时，用FSC/SSC设门，监测信号时，SSC在适当位置，FSC超过横坐标最大值，这时机器怎么调整？是不是样品问题？
5、抗体说明中，如：20ul/10 6细胞，能不能用2ul/10 5代替，只是增加数据获取时间而已！（实践中好像对结果没有影响）

弱智问题，急盼解惑！
作者: jkobn    时间: 2012-1-29 15:19


求助：
我想测Her－2/neu转基因小鼠的细胞neu基因的表达高低。买的一抗
是多克隆抗体。说明书建议用Westernblot，没说做流式。请问多克隆抗体可作一抗吗？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:20

我前不久刚接触流式,现在初步掌握操作,但有些问题一直困扰:
1、画MARKER到底有没有一定之规？不管以同型对照或是阴性来画，说正好圈住细胞就行了，像直方图上画，不同人分析可能有不同结果，如果阳性率低的话，结果差距相当明显。不知道画阴性区有没有百分比要求？而这一要求有没有文献支持？

==============================================================================================================

一般marker需要有经验的人来划分。而经验应该是从ModFit这样的自动分析软件上得来的，因此，如果没有足够的把握，最好用自动分析软件进行周期分析，以免人为因素干扰。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:20

直接法设同型对照，间接法也需要吗？是否就设阴性对照就可以？需要空细胞对照吗？

===================================================

间接法当然需要同型对照。阴性对照根据试验，一般是需要的。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:21

单细胞系单标分析时，用FSC/SSC设门，监测信号时，SSC在适当位置，FSC超过横坐标最大值，这时机器怎么调整？是不是样品问题？

====================================================

fsc调到最小还破图的话，将E0那里再降低到E－1，E－2看看！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:21

抗体说明中，如：20ul/10 6细胞，能不能用2ul/10 5代替，只是增加数据获取时间而已！（实践中好像对结果没有影响）

==========

没问题！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:21

求助：
我想测Her－2/neu转基因小鼠的细胞neu基因的表达高低。买的一抗
是多克隆抗体。说明书建议用Westernblot，没说做流式。请问多克隆抗体可作一抗吗？

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可以，注意做同型IgG对照！
作者: xingyi08    时间: 2012-1-29 15:22

一般marker需要有经验的人来划分。而经验应该是从ModFit这样的自动分析软件上得来的，因此，如果没有足够的把握，最好用自动分析软件进行周期分析，以免人为因素干扰。

间接法当然需要同型对照。阴性对照根据试验，一般是需要的。

===============================================================================================================

fsc调到最小还破图的话，将E0那里再降低到E－1，E－2看看！

==============================================================================================================

没问题！

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marker的界限是根据阴性对照样本来划分的,这是客观的,不是靠经验.Modfit是自动分析DNA倍体的软件.这样的软件有不少,不同软件采用的是不同的方法来拟合周期曲线的,同样的数据会得到不同的结果甚至结论.软件分析并不是很可靠,当然CV非常小的DNA峰图还是可以用它分析的.
作者: 小螺号    时间: 2012-1-29 15:22


本人做细胞培养，标记后用流式仪分选，但污染，无菌如何解决？？
作者: is2011    时间: 2012-1-29 15:23

本人做细胞培养，标记后用流式仪分选，但污染，无菌如何解决？？

作为空气喷射电场偏转方式的流式分选,除非在无菌室里,一般很难说能保证是绝对无菌的.

根据我的经验,只要分选处理得不是太糟,分选出来的细胞在其通常用的培养基里培养是不会有细菌长出来的.因为一般培养基都有抗生素,如果你不放心,可以适当提高抗生素浓度.

那么如何处理才适当呢?我个人总结如下:
1:首先确保你的样本和收集被分选细胞的收集管绝对无菌.
2.作为鞘液的PBS无菌(高温高压灭菌锅处理即可)
3.流式细胞仪跑75%酒精使其管路无菌.仪器表面擦洗除尘.
4.流式操作的微环境无菌,大环境无尘.这一点最重要.具体来说就是,分选细胞的小室事先喷酒精,并在分选时尽量不要中途打开;流式所在工作间先行打扫除尘,并保持较高的空气湿度使灰尘难以扬起;房间内空气尽量不要流通(尽量不要开空调,门窗等);工作间里一个流式操作者一个用户实验人员,不要有过多的人进来;尽量不要到处走动;特别注意不要对着样本呼吸和大声说话!;另外让仪器工作状态保持稳定.
封闭的流式系统要简单许多,但实验操作原则上都是一样的.

呵呵,做到这些一般是不会发生细胞污染的.
作者: yes4    时间: 2012-1-29 15:23


请教几个最基本的问题：1、我做大鼠外周血淋巴细胞黏附分子如ICAM-1、LFA－1等的检测，用什么荧光素表达较好？2、以前有没有战友做过类似的实验？结果如为阳性该如何判断？3、相对与免疫组化方法相比较，流式细胞学在方法学上有何优点？
作者: zzzz    时间: 2012-1-29 15:23

楼主，您好！我是您单位的研究生，以前听过你讲的课，受益匪浅。下了附件打开后，才发现原来是您！
有个问题请教，我想测细胞内脂皮质素-1，cox2、IL-2、IL-6、TNF-a、血管紧张素转化酶ACE，由于western-blot需要的样本含量过大，想用流式测，行吗？
作者: kulee    时间: 2012-1-29 15:24

一般marker需要有经验的人来划分。而经验应该是从ModFit这样的自动分析软件上得来的，因此，如果没有足够的把握，最好用自动分析软件进行周期分析，以免人为因素干扰。

细胞周期画MARKER可能要经验,但免疫分型这类图型画M应该有一定要求吧!前些天请教了其它人,说要画到99%!我想肯定越高越好，但有时同型对照做得不是很好的话，画99%要画好宽。这对结果肯定有影响的.

间接法当然需要同型对照。阴性对照根据试验，一般是需要的。

关于这一点仔细想想我不认同。间接法用的荧光抗体大部分是兔或羊来源的抗体,是标记的多抗,应该不存在同型对照。

关于细胞数与抗体用量，这几天看了国外实验室做白血病的流式分析，上样量为：1-30000个细胞！看来科研中完全可以降低细胞数和抗体用量！没必要按照说明书的用量，真是浪费！
作者: one    时间: 2012-1-29 15:24


请教贵人一个问题：
比方说某钟细胞A，它能够在特定波长的紫外线激发下自发蓝绿色荧光，因其含有大量VIT A，，但是荧光过段时间可能衰减掉。那么通过流式能否在衰减之前把它从细胞悬液中分离出来呢？如果能，还要注意哪些方面来提高分离纯度？
请不吝赐教！谢谢！
作者: plaa    时间: 2012-1-29 15:25

我用的尼龙筛网（布），用的时候在接收容器口将筛布绷紧，用枪将待过滤细胞悬液缓慢吹打几次，待发现液滴可以透过时（克服了表面张力），可直接将剩余液体顺利过滤而不怎么浪费。我用的200目和300目的，不会有什么问题，而且是一次行的，减少了有毒样品对人身健康损害的可能行。

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谢谢大侠夸奖，顺便问一下过滤是用筛子还是用戴有滤膜的滤器？我呈试过300目的筛子，可细胞悬液都被筛网给吸收了，没省多少细胞给我做实验，怎么办？
作者: plaa    时间: 2012-1-29 15:25

呵呵，我们跟这做法差不多，做了好几次，而且有好几个人在场，没染菌哦

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作为空气喷射电场偏转方式的流式分选,除非在无菌室里,一般很难说能保证是绝对无菌的.

根据我的经验,只要分选处理得不是太糟,分选出来的细胞在其通常用的培养基里培养是不会有细菌长出来的.因为一般培养基都有抗生素,如果你不放心,可以适当提高抗生素浓度.

那么如何处理才适当呢?我个人总结如下:
1:首先确保你的样本和收集被分选细胞的收集管绝对无菌.
2.作为鞘液的PBS无菌(高温高压灭菌锅处理即可)
3.流式细胞仪跑75%酒精使其管路无菌.仪器表面擦洗除尘.
4.流式操作的微环境无菌,大环境无尘.这一点最重要.具体来说就是,分选细胞的小室事先喷酒精,并在分选时尽量不要中途打开;流式所在工作间先行打扫除尘,并保持较高的空气湿度使灰尘难以扬起;房间内空气尽量不要流通(尽量不要开空调,门窗等);工作间里一个流式操作者一个用户实验人员,不要有过多的人进来;尽量不要到处走动;特别注意不要对着样本呼吸和大声说话!;另外让仪器工作状态保持稳定.
封闭的流式系统要简单许多,但实验操作原则上都是一样的.

呵呵,做到这些一般是不会发生细胞污染的.
作者: 兔唇    时间: 2012-1-29 15:26


楼主：你好，流式细胞室给了我一份蛋白表达的报告，无奈看不明白，很想好好分析一下，特请您给分析一下：
我发不了图，只能提供图下面的数据，
Rehion X
Number 1484
%Total 6.97
X-mean 35.5
X-Mode 25.9
就是这些了，据流式的老师讲用Mode值进行统计，但需要转化一下，即lg［mode］X340,不明白为什麽这么转化，文献也没见过这样转换的，请明示
作者: lixi559    时间: 2012-1-29 15:26

求助：我要做Annexin V/PI检测凋亡，想知道哪家公司的试剂盒比较好？
作者: skytree    时间: 2012-1-29 15:26     标题: 回复 #1304 lixi559 的帖子

当然BD的好。前提是BD的机器
作者: 克隆鱼    时间: 2012-1-29 15:27


不要误导。BD和coulter的机器在运行原理、性能和功能上没有多大差别，哪些试剂和应用在哪个公司的机器上运行才好的说法更是无稽之谈，所有流式试剂在所有流式上的表现能力都是基本一致的。
作者: yysr238    时间: 2012-1-29 15:28


有哪位使用过BD的Annexin V PE/7-AAD凋亡检测试剂盒的，我做全血标本中淋巴细胞的凋亡检测。
技术支持告诉我先溶血(不含固定成分的溶血素是ebioscience的），完了洗后加抗体。我检测的是CD3+/CD8+细胞群的凋亡。
现在的情况是：单加Annexin V PE的管没有阳性细胞群，单加7－AAD的有明显阳性细胞群，而加了CD8FITC/Annexin V PE/7-AAD/CD3APC的管在两种条件下是两种情况：
1.FL2-FL1的补偿为0时，Annexin V PE/7-AAD点图出现四群细胞，横平竖直，非常漂亮，此时CD8FITC/Annexin V PE点图上双阳性群呈45度斜线。
2.FL2-FL1的补偿为21％时，Annexin V PE/7-AAD点图只有两群细胞，无Annexin V PE阳性细胞。此时CD8FITC/Annexin V PE点图上只有CD8FITC＋/Annexin V PE-群。
问题：
1.操作步骤对不对？
2.FL2-FL1的补偿对Annexin V PE/7-AAD点图的影响怎么会如此大？
3.应该怎么做才有正确的数据？
另：我的全血在Annexin V PE/7-AAD点图上应出现四群细胞。
作者: gogo    时间: 2012-1-29 15:29

也许是机器不同，我们这边做补偿是这样的：
1.既然是4colors，就要4种单染sample。
2.每种单染sample单独上样，对另外3个通道做补偿。
3.全部4种单染sample都这样做完才算完成full matrix。
作者: zhezhe    时间: 2012-1-29 15:29


这个技术对于做死亡率应当是小菜了。 PI染色后计数。。。
作者: 白白的    时间: 2012-1-29 15:30     标题: 回复 #1309 zhezhe 的帖子

这位，人家的要求没有这么简单啊，能够单color说明问题的谁也不会用4color了。
作者: 一叶    时间: 2012-1-29 15:30

FL2-FL1的补偿为0

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我没有做过这四个标记.
我觉得你的补偿为0不合适,从图上看ANNEXIN V的阳性率过高,你的实验未必会达到如此高的凋亡诱导率.
另外,单标ANNEXIN V时,阳性率很低,这个结果不受其他荧光干扰,应该是可靠的.所以我倾向于你用21%的补偿.在这种情况下,CD8的图挺好的.
检测结果低很有可能是你的实验真实的结果.
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-29 15:33


下载后，解压缩提示要有压缩卷，可我有WINRAR解压缩软件，为何不能解压缩！
作者: 克隆鱼    时间: 2012-1-29 15:33


在做细胞凋亡时，是不是新鲜标本好，还是要70％的乙醇固定？谢谢
作者: ha111    时间: 2012-1-29 15:34


请问我做的是绒毛和蜕膜组织的凋亡的检测，先用研磨法制成细胞悬液，再用Annexin V ,PI染色，上机检测，但是凋亡率一直很低，请教可能的因素会是什么，组织的凋亡不适合用流式检测吗？还是悬液的制备有问题？
谢谢！
作者: guagua    时间: 2012-1-29 15:34

一般来说，组织制备成单细胞悬液的过程中有不少对细胞产生明显损伤的因素，原本凋亡的细胞较容易丢失，所以和体外培养的细胞样本相比的确不太适合做fcm。视样本特性不同，效果不好也许是很难改善的，可以考虑做原位。
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-29 15:35


看到大家都用流式检测，我想问一个问题。临床上怎么用流式检测肿瘤，是必须取到肿瘤组织，还是仅仅需要肿瘤患者的血液就行？
作者: hold住    时间: 2012-1-29 15:35


发错图了，不好意思
我也不能解压缩！老是弹出要压缩分卷才能继续解压，为什么啊？

图片附件: 12063691.jpg (2012-1-29 15:35, 35.01 KB) / 该附件被下载次数 7
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图片附件: 61965839.jpg (2012-1-29 15:35, 25.04 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10352

作者: whitesheep    时间: 2012-1-29 15:36


各位战友、老师：你们好!
我想请教的问题是，我要用流式细胞术测肿瘤细胞株表达蛋白的量及凋亡率。我将一个带在绿色荧光蛋白的质粒转至细胞中，导致该细胞本身表达绿色荧光了。那么，在检测我的目的蛋白的时候，选择什么样的二抗、带有什么样的荧光(PI、PE或其它)比较合适呢？哪家的这种抗体比较合适？可不可以用Annix V来检测凋亡？如果可以，是双标合适，还是分成两个标本分别检测合适？如果不可以，用其它什么方法检测较合适？(我需要使用间接法测蛋白。据我所知，FITC抗体是发绿色荧光的。)请高手能否不吝赐教。谢谢!
作者: 小糖块    时间: 2012-1-29 15:36


大家好，我们刚买了一台Beckman小流式细胞仪，我们单位主要用来测鱼类的倍性，初学者都不太懂，现在有一张图不知道怎么解释，请大家帮我分析一下。
到底算几倍体 ？
作者: vvmmoy    时间: 2012-1-29 15:37

不知道巨噬细胞能不能上流式？由于我养的细胞要处理好几个小时，这样细胞贴壁就很强，非常难消化下来。不知道您以前碰到过这样的问题没有，或是你有什么好的建议？谢谢！
作者: 薄荷侠    时间: 2012-1-29 15:37


大侠:
课题应用流式研究细胞表面的受体，已购买R&D的PE标记的抗体，可是被我放在－70度冰箱，后来才了解到PE不能冻融，现在该怎么办？抗体还能够用吗？
谢谢！
作者: ritou1985    时间: 2012-1-29 15:39

看下第二页，把文件名改一下就可以了，而且只解压缩第一个就可以了。再试试看吧肯定可以呵呵
作者: ritou1985    时间: 2012-1-29 15:40


我是做流失的新手，而且我们没有流失仪器需要先固定才能做，因此有几个比较菜的问题想问，我是做药物诱导肿瘤细胞凋亡的，我测的时间点是36，48，72，72小时的时间实在是太长了，到最后我始终弄不清我的细胞是饥饿凋亡死了还是药物作用的，很是郁闷，所以我想问下流失到底对细胞数的要求是怎样的，我固定的大概步骤：细胞培养在75cm的培养瓶中（hela细胞），加入药物作用一定时间后，冷PBS洗胰酶消化收集细胞，1200转，离心5分钟，最后100ul的细胞细胞悬液加900ul的70％的冷乙醇。我看到有说最后固定的时候把细胞调整到10的6次方，但是我觉得我们肯定超过了。
希望各位指点！非常感谢！
作者: yueban-1147    时间: 2012-1-29 15:40

不要误导。BD和coulter的机器在运行原理、性能和功能上没有多大差别，哪些试剂和应用在哪个公司的机器上运行才好的说法更是无稽之谈，所有流式试剂在所有流式上的表现能力都是基本一致的。

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BD机器适应性好，各个公司的试剂同吃
C的机器对自家试剂敏感，对其他家试剂不敏感，荧光强度弱
作者: gemei0115    时间: 2012-1-29 15:41

大侠:
课题应用流式研究细胞表面的受体，已购买R&D的PE标记的抗体，可是被我放在－70度冰箱，后来才了解到PE不能冻融，现在该怎么办？抗体还能够用吗？
谢谢！
========================================================
可能已经失效，试做一个标记，上机检测，看效果如何，实践检验一下
作者: gemei0115    时间: 2012-1-29 15:41

我是做流失的新手，而且我们没有流失仪器需要先固定才能做，因此有几个比较菜的问题想问，我是做药物诱导肿瘤细胞凋亡的，我测的时间点是36，48，72，72小时的时间实在是太长了，到最后我始终弄不清我的细胞是饥饿凋亡死了还是药物作用的，很是郁闷，所以我想问下流失到底对细胞数的要求是怎样的，我固定的大概步骤：细胞培养在75cm的培养瓶中（hela细胞），加入药物作用一定时间后，冷PBS洗胰酶消化收集细胞，1200转，离心5分钟，最后100ul的细胞细胞悬液加900ul的70％的冷乙醇。我看到有说最后固定的时候把细胞调整到10的6次方，但是我觉得我们肯定超过了。
希望各位指点！非常感谢！
================================================================================
乙醇固定后-20度可保存数天，所以多个时间点也不成问题，固定时有10的6次方细胞足够了，没问题。
作者: gemei0115    时间: 2012-1-29 15:42

各位战友、老师：你们好!
我想请教的问题是，我要用流式细胞术测肿瘤细胞株表达蛋白的量及凋亡率。我将一个带在绿色荧光蛋白的质粒转至细胞中，导致该细胞本身表达绿色荧光了。那么，在检测我的目的蛋白的时候，选择什么样的二抗、带有什么样的荧光(PI、PE或其它)比较合适呢？哪家的这种抗体比较合适？可不可以用Annix V来检测凋亡？如果可以，是双标合适，还是分成两个标本分别检测合适？如果不可以，用其它什么方法检测较合适？(我需要使用间接法测蛋白。据我所知，FITC抗体是发绿色荧光的。)请高手能否不吝赐教。谢谢!
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如果已带有荧光，可不用2抗了啊
不可以用AV检测了，荧光重叠了
作者: gemei0115    时间: 2012-1-29 15:42

我做的是Annexin/pi双染发检测细胞凋亡，但是做出来的结果分区不明显，成一条直线样的，请问各位高手这样的结果是不是有问题？是什么方面的问题，谢谢，期待解答

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做对照了吗？
作者: gemei0115    时间: 2012-1-29 15:44

我有几个问题想请各位前辈帮忙解答一下：
1.我做的实验是测患者外周血中CTL的perforin的表达，获得患者血标本的时间并不是固定的。因为流式不在我们科室做，如果每天都去做，那是相当麻烦。
因此，我想问，是不是可以把血标本冷藏，待收集了一定数量的标本再一次做流式？如果可以，怎么保存，能保存多久？
2.研究经费只有3000，但我看了一篇文章中说，CD3+CD8+双标抗体就要2000多。如果真是这么多钱的话，我就真作不成了。CD3+CD8+双标抗体真的要这么多钱吗？
3.有没有什么办法可以一次性把CD3+CD8+T细胞从外周血中提取出来？我听说有一种磁珠可以达到这种效果，（how much？）
4.因为CD3+存在于T细胞而不在NK细胞，而穿孔素则表达于CTL和NK细胞中，
那么，我是不是只要检测CD3+和穿孔素呢(我的意思是，只有表达CD3+和穿孔素的才可能是CTL，这样就不用检测CD8了，不知道我说明白了没有)？
请各位达人帮帮忙了！
小的orz！

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1。血标本最好不要过夜
2。肯定不够，用便宜的国产抗体效果很差的
3。成本非常大
4。不明白
作者: gemei0115    时间: 2012-1-29 15:44

请教各位高手，我用Annexin－PI在流式上测乳鼠心肌细胞的凋亡，为什么肉眼见到明显的凋亡，而流式的检测结果很低啊？

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你在处理细胞的时候，已经凋亡的细胞多半在洗涤时流失了，所以上机检测时就看不到了
作者: gemei0115    时间: 2012-1-29 15:44

今天使劲K了一下有关凋亡和流式的资料，总算小懂了一点。
想问一下，流式测细胞的凋亡，所用染料是FITC还是PI呢？其原理是不是就是Annexin-V FITC/PI试剂盒的原理啊？

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用PI，是测细胞周期的方法检测凋亡
与AV不一样
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:45

看到大家都用流式检测，我想问一个问题。临床上怎么用流式检测肿瘤，是必须取到肿瘤组织，还是仅仅需要肿瘤患者的血液就行？

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一般是检测肿瘤相关蛋白，用血液、尿液、泪液等，根据肿瘤种类不同而异。如果是检测肿瘤本身的一些如膜蛋白以及非分泌性物质如cyclins等，当然要肿瘤细胞本身！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:47

各位战友、老师：你们好!
我想请教的问题是，我要用流式细胞术测肿瘤细胞株表达蛋白的量及凋亡率。我将一个带在绿色荧光蛋白的质粒转至细胞中，导致该细胞本身表达绿色荧光了。那么，在检测我的目的蛋白的时候，选择什么样的二抗、带有什么样的荧光(PI、PE或其它)比较合适呢？哪家的这种抗体比较合适？可不可以用Annix V来检测凋亡？如果可以，是双标合适，还是分成两个标本分别检测合适？如果不可以，用其它什么方法检测较合适？(我需要使用间接法测蛋白。据我所知，FITC抗体是发绿色荧光的。)请高手能否不吝赐教。谢谢!

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前面的战友说得很对，GFP＆FITC都用一个detector，无法去分开，这时可以选和PI＆GFP通道不同的荧光物质标记得Annexin V。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:48

我是做流失的新手，而且我们没有流失仪器需要先固定才能做，因此有几个比较菜的问题想问，我是做药物诱导肿瘤细胞凋亡的，我测的时间点是36，48，72，72小时的时间实在是太长了，到最后我始终弄不清我的细胞是饥饿凋亡死了还是药物作用的，很是郁闷，所以我想问下流失到底对细胞数的要求是怎样的，我固定的大概步骤：细胞培养在75cm的培养瓶中（hela细胞），加入药物作用一定时间后，冷PBS洗胰酶消化收集细胞，1200转，离心5分钟，最后100ul的细胞细胞悬液加900ul的70％的冷乙醇。我看到有说最后固定的时候把细胞调整到10的6次方，但是我觉得我们肯定超过了。
希望各位指点！非常感谢！

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您的药物是持续作用起效果的话，还真不好区分。能不能换液后重新加药，对照就可以排除饥饿的作用了。但药物浓度有点问题。
固定最好事10……6，原理我并不清楚，可能是个经验值吧。上机至少10……5比较合适，当然这跟各种检测目的、方法有关，可以查资料解决。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:48

我做的是Annexin/pi双染发检测细胞凋亡，但是做出来的结果分区不明显，成一条直线样的，请问各位高手这样的结果是不是有问题？是什么方面的问题，谢谢，期待解答

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补偿的问题。通过对照解决。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:48

请教各位高手，我用Annexin－PI在流式上测乳鼠心肌细胞的凋亡，为什么肉眼见到明显的凋亡，而流式的检测结果很低啊？

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可能是洗涤掉了，因为消化的时候被冲走了。————时间点提前。
还有就是可能染色问题造成的检测值偏低。————严格按手册操作。
作者: guagua    时间: 2012-1-29 15:49


请教：是否只要存在凋亡流式都可以检测呢？它有局限性吗？
为什么我的细胞加了药后有杀伤作用却检测不到凋亡峰呢？谢谢
作者: guagua    时间: 2012-1-29 15:50

凋亡除了用PI染色外，Hoechst染色可以吗？如何操作？谢谢
作者: yes4    时间: 2012-1-29 15:51


请问分离原代细胞胶原酶浓度是多少？购买那个公司的比较好？
作者: sunnyB    时间: 2012-1-29 15:51

我用两种抗体标记一种细胞，进行流式检测，结果如下，这是否说明着红细胞是双阴性的？另外，如果细胞难以消化下来，是不是可以在充分消化的基础上，轻轻的用细胞刮子刮下来？

图片附件: 37772655.jpg (2012-1-29 15:51, 8.15 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10353

作者: 彼岸花opp    时间: 2012-1-29 15:52

请问版主和各位学长：
小弟对流式细胞仪不懂，老板叫我准备做这方面的实验。请问我用荧光标记的siRNA通过脂质体转染肿瘤细胞，能用流式细胞仪检测转染效率吗？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:53

请教：是否只要存在凋亡流式都可以检测呢？它有局限性吗？
为什么我的细胞加了药后有杀伤作用却检测不到凋亡峰呢？谢谢

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这个问题不知道怎么回答，也许不是吧！凋亡的检测方法版内说得很多了，每种方法都有其优缺点，根据试验选取最适合的方法来检测。凋亡峰不是所有的细胞凋亡都会产生的，比如检测时间过早、DNA片断化不足、细胞状态不好等。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:54

凋亡除了用PI染色外，Hoechst染色可以吗？如何操作？谢谢

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凋亡时，染色质会固缩。所以Hoechst染色时，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

方法用“Hoechst染色” 在google检索可见！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:55

我用两种抗体标记一种细胞，进行流式检测，结果如下，这是否说明着红细胞是双阴性的？另外，如果细胞难以消化下来，是不是可以在充分消化的基础上，轻轻的用细胞刮子刮下来？

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right！
操作一定要轻柔！
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 15:55

请问版主和各位学长：
小弟对流式细胞仪不懂，老板叫我准备做这方面的实验。请问我用荧光标记的siRNA通过脂质体转染肿瘤细胞，能用流式细胞仪检测转染效率吗？

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只要检测的时候荧光标记仍然存在，就可以！
作者: rxcc33    时间: 2012-1-29 15:56


请教各位高人:我想做有关SDF-1和CXCR4的流式细胞术,但现在就是找不到抗大鼠的流式细胞试剂,不知道各位高人有无这方面的信息,另外如果实在没有的话,我想用抗人的试剂,不知道效果如何?急盼结果,谢谢!
作者: jujuba    时间: 2012-1-29 15:56


我有用coulter机器做流失的原始数据,请问如果想用modfit 分析细胞周期的话要怎么办呢，谢谢！！是不是必须要BD的机子才能用配套的modfit分析阿，谢谢！
作者: fei1226com    时间: 2012-1-29 15:57

EXPO32需要软件狗才能正常使用，不然只能在Demo模式下运行。

软件狗不是下载的，它是由软件厂商提供的一个插在LPT口的硬件设备，整套软件关键值钱的部分就是这个狗，软件可以随便拷贝，但这个狗没有就没法正常使用。
作者: owanaka    时间: 2012-1-29 15:58

我要用流式测原代中的低频细胞，技术支持说至少要取10万个细胞，可做流式老师说流式仪取到1万个细胞后就不再进样了，到底谁说的对啊，请高手指点，谢谢！
作者: 66+77    时间: 2012-1-29 15:59


各位老师、战友：

我最近想做一种疾病外周血CD3＋CD25＋淋巴细胞的检测，但是每天能收集到的标本至于几个，我想收集3－5天的标本，然后一起上流式细胞仪检测。

现在我不知道怎样处理保存外周血标本。是不是先将淋巴细胞提取出来，然后用固定液保存，到要检测时再将抗体加入标本中，然后上机检测，还是有另外的方法？

先谢谢热心战友的帮助！
作者: duoduo    时间: 2012-1-29 15:59


“我要用流式测原代中的低频细胞，技术支持说至少要取10万个细胞，可做流式老师说流式仪取到1万个细胞后就不再进样了，到底谁说的对啊，请高手指点，谢谢！！!!!

思 语 说“可以分选更多，可能是老师不想分了吧！”
是定量，不是分选，谢谢关注！
作者: DNA    时间: 2012-1-29 16:00


各位老师、战友：
我最近要做关于混合嵌合体诱导异种免疫耐受的课题。选用模型是豚鼠到大鼠，我想问下豚鼠骨髓干细胞输注到大鼠后，嵌合率怎样检查？
作者: tangxin_80    时间: 2012-1-29 16:00


请问各位高手，我最近在用淋巴细胞分离液分离小鼠外周血单个核细胞，然后上流式，意欲找到单核细胞那一群，然后进行荧光单标（F4/80）.但是分离出的细胞上了流式以后，做流式的人说是看不到单核细胞那一群，连同显示的细胞他都没有肯定地说是淋巴细胞。这一步很重要，我做了两次，流式技师都告诉我这个比较难，似乎是让我放弃。不知道有没有高手做出过小鼠外周血个细胞群的流式图，要怎么做啊，做不出跟小鼠血液量少有关系吗？
分离白细胞进行流式分析可以吗？那种方式更好？国外一些文章用ACK裂解后的白细胞做的。但详细的方法还不清楚。高手请指教，谢谢！
作者: join    时间: 2012-1-29 16:00


我是新手,我现在准备做细胞表面的CXCR4表达,但买来的试剂要间接标记,有一抗和二抗,关键是流式的老师没有做过大鼠的,他说很难区分细胞种类,而且这种间接标记的也很繁琐,具体步骤他不清楚,要我自己摸索,请问战友们,这种间接标记的步骤是什么?是否通用?还有我的一抗没有工作稀释浓度,一般是多少?谢谢!
作者: 3648755    时间: 2012-1-29 16:01

各位大侠，我有一问题急急的向大家请教，还望答复
我用CFSE标记反应细胞，做混合淋巴细胞反应，再加入第三种细胞，目的是观察第三种细胞对反应的抑制作用。用流式测定CFSE荧光强度，可以反应细胞的增殖情况，那么我应该用什么软件进行分析呢？是分析细胞周期的就行吗？采用哪些参数作为结果呢？

先谢过各位了！
作者: 吴才子    时间: 2012-1-29 16:03

最近我做了一下药物对昆虫细胞周期的分析，用70%乙醇固定的，PI单染，但是上流式以后发现FL2A-Number图中纵坐标细胞数目峰很小，只有很小的起伏，不知是什么原因？烦请版主和各位学长给予指导。非常感谢！
作者: 阿敏    时间: 2012-1-29 16:03

多谢！
我要分析骨髓间充质干细胞的表面抗原，以分析我提纯的细胞是否有许多造血干细胞和成纤维细胞。请赐教！！

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可以选CD34,HLA-DR,CD29,CD44,CD105
作者: 阿敏    时间: 2012-1-29 16:05

最近我做了一下药物对昆虫细胞周期的分析，用70%乙醇固定的，PI单染，但是上流式以后发现FL2A-Number图中纵坐标细胞数目峰很小，只有很小的起伏，不知是什么原因？烦请版主和各位学长给予指导。非常感谢！

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是Ｇ０／１期，Ｇ２／Ｍ期，还是Ｓ期细胞小，还是都很小，可以把图传上来先！
作者: 阿敏    时间: 2012-1-29 16:05


我做流式，发现说明书100UL的血对我们而言，好象太多了，如果减少血量是不是相应减少抗体用量，可是抗体太少不容易准确吸样，可以用什么溶液稀释抗体，又不会影响抗体质量？
作者: 阿敏    时间: 2012-1-29 16:05

我做一个三色荧光的流式检测，是检测ＣＤ３ＥＣＤ／ＣＤ４ＦＩＴＣ／细胞内因子－ＰＥ的．
这种方案是涉及补偿问题，我应该如何设计方案及实验能避免三色荧光补偿的难调的问题．
作者: TAT    时间: 2012-1-29 16:06

我需要用荧光标记效应性记忆性T细胞（Tem）
人类记忆性T细胞有两种亚型：中枢性记忆性T细胞central memory T cells (TCM)和效应性记忆性T细胞 effector memory T cells (TEM),这两种细胞和幼稚的T细胞Naive T cell 分别有以下特征

Naive T cell： (CCR7+CD45RA+)
TCM：CCR7+CD45RA–
TEM：CCR7–CD45RA–
文献上区分这3钟细胞做了如下标记：
细胞   FITC-conjugated CCR7 mAb(绿色)  PE-conjugate anti–human CD45RA mAb（橙红色） PE-conjugated anti-CD4 mAb （橙红色      
Naive T cell CCR7+  CD45RA+  CD4+)  黄色  
Tcm:  (CCR7+  CD45RA–  CD4+)  绿色      
Tem:  (CCR7–  CD45RA–  CD4+)  橘黄色或橙红色  
现在我想得到Tem不管Naive T cell 和Tcm，我买这两种荧光标记的抗体FITC-tagged anti-CCR7 mAb 和PE-conjugated anti-CD4 mAb 标记外周血分离的PBMC能否实现？按照推理将是Naive T cell 和Tcm都显绿色，Tem显橘黄色或橙红色。而现在试剂公司只能提供PE-tagged anti-CCR7 mAb和FITC－conjugated anti-CD4 mAb，就是PE和FITC标记的抗体换了，我能得到相同得结果吗？
•  我查了质料说：PE最强，适用于弱表达抗原
FITC最便宜，适用于强表达抗原
请问我能得到我想要得结果吗？急！
作者: TAT    时间: 2012-1-29 16:07

可以选CD34,HLA-DR,CD29,CD44,CD105

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前两个是造血干细胞的标志
后三个是间充质干细胞的标志.
作者: greenbee    时间: 2012-1-29 16:08


喊一嗓子，我是新手，问个问题。
关于双色标记，比如我要标PE-CD80，FITC-CD11C（mouse）用ebioscience的抗体，在封闭后，是同时加入两种抗体，还是标完一种后洗一下再标另外一种呢？这两种方法中，与单色标记相比，标记时间会不会有改变呢？
非常感谢！
作者: abc816    时间: 2012-1-29 16:09     标题: 回复 #1363 greenbee 的帖子

据我的印象这两个CD分子都是细胞表面抗原,那么双色荧光的一般步骤就可以了:
1、先用全血与抗体结合
(ebioscience是5ul抗体加100ul全血,严格的话你可以计数细胞按比例加抗体，说明书有比例)
2、再溶血洗涤等步骤
（ebioscience上有操作步骤，它的代理联科生物有提供所需要的商品化的溶血剂，洗涤液用PBS就可以了，但是最好要抽滤已避免未溶解的颗粒和杂质影响你的结果）
3、最后用PBS悬浮上机就可以了,不马上测定可以用固定液悬浮。

所谓的封闭就是用FBS或者BSA加到PBS中使用。各个公司使用的比例有所不同，你可以根据他们的说明书配制。
作者: abc816    时间: 2012-1-29 16:09     标题: 回复 #1363 greenbee 的帖子

忘了说了，标记的时间是一样的，你买的是同一个公司的吧！
注意抗原抗体结合的时候要避光，这点ebioscience的抗体有明确的要求。
作者: greenbee    时间: 2012-1-29 16:10

那就是说。两种抗体是同时加进去了？
非常感谢！
作者: cj_mondy    时间: 2012-1-29 16:10

斑竹好，我现在想用流式做下细胞膜电位和线粒体膜电位 ，以及钙离子变化，但是本实验室的流式新买来 的，没有经验，也不知道具体该怎么做，尤其 好的图形是什么样子的，不是很清楚 ，您能否给些帮助？ 不胜感激！！
作者: 00无名指00    时间: 2012-1-29 16:11


请问高手：
我想用流式检测外周血中的ＣＤ４＋ＣＤ２８－Ｔ细胞，所用的抗体是
phycoerythrin-conjugated anti-CD4 antibodies　和fluorescein isothiocyanate– conjugated　anti-CD28 antibodies，用这两种抗体的话我怎么设阳性对照和阴性对照．
还有，如果我想分出这种细胞再做后续实验，那么这两种抗体够吗，需不需要再加别的抗体．
作者: 66小飞侠    时间: 2012-1-29 16:14

请问哪位高手可以告知用流式细胞仪进行间接免疫荧光标记法检测胞浆蛋白的详细步骤，零零碎碎看了这么多，小妹糊涂了，呵呵！

谢谢。现在很茫然啊。。。
作者: DDD    时间: 2012-1-29 16:17


请教高手：
流式结果是ＰＣＸ文件格式，而且是原始图形，我如何把它转换成直方图，即发文章要用的图形．

谢　　谢！
作者: gogo    时间: 2012-1-29 16:17

是Ｇ０／１期，Ｇ２／Ｍ期，还是Ｓ期细胞小，还是都很小，可以把图传上来先！
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是G2/M期很小。传对照细胞的流式图上来麻烦各位帮忙分析。我用的是PI单染。

图片附件: 67771287.jpg (2012-1-29 16:18, 58.82 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10354

作者: windy+++    时间: 2012-1-29 16:18

我打算用流式细胞仪分析移植后外周血中CD4＋和CD8＋的T细胞亚群的变化以及两者的比值变化，借以观察肌体的免疫反应的状况。文献见过报道，现在有一个问题：
由于本研究室没有流式细胞仪，再加上本人的动物试验样本量较多，而且需要进行多种检测。所以想问问：可以把大鼠的外周血取出后可以在体外保存，等样本收集齐后一起去检测吗？如果可以该如何保存？如果不行，对于我这种情况，前辈们有什么建议吗
还有一个问题：大鼠取血必须取外周静脉血吗，能用心脏取血吗，心脏取血对流式结果有什么影响
非常感谢
作者: abc816    时间: 2012-1-29 16:18

我要用流式测原代中的低频细胞，技术支持说至少要取10万个细胞，可做流式老师说流式仪取到1万个细胞后就不再进样了，到底谁说的对啊，请高手指点，谢谢！

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10000个细胞是分析结果的一个较低的标准，是采集软件默认的一个量。
给你做流式的老师应该是个菜鸟吧，低频细胞的分析必需根据在所有细胞
中的比例来调整分析的细胞数，还要考虑是否会有假阳性细胞的影响。
你这个实验应该至少要取10W个细胞才有意义。
作者: join    时间: 2012-1-29 16:20


我正在做血小板内VASP磷酸化的检测。枸橼酸钠抗凝血2毫升分2管后分别加ADP和ADP+PGE1(均为10uM)室温孵育10分钟后加3%多聚甲醛1毫升固定5分钟， 0.2% triton X 100打孔。 10分钟后加16C2(抗VASP的单抗)+FITC孵育30分钟后上机检测，我要检测两种状态即静息(+ADP)和激活(ADP+PGE1)态的平均荧光强度(MFI),请问接下来该如何做？应该如何设门，如何取值？要不要加CD61识别血小板？如何对照？请详细指导及说明原理，因我是外行，我们的检验师也不太懂原理。如您还未开展该技术，请帮我设计 一下。先谢赐教。
作者: redbutterfly    时间: 2012-1-29 16:20

我做流式，发现说明书100UL的血对我们而言，好象太多了，如果减少血量是不是相应减少抗体用量，可是抗体太少不容易准确吸样，可以用什么溶液稀释抗体，又不会影响抗体质量？

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抗体的用量是根据细胞数定的，一般来说抗体的一个test对应的细胞数是1-2×10E5个，但是在实际使用中，我通常用到一个test的1/4-1/2量（我们做过对比，就我们检测的指标未有明显差别），所以全血的体积取决于目的细胞的浓度。
作者: redbutterfly    时间: 2012-1-29 16:24

我需要用荧光标记效应性记忆性T细胞（Tem）
人类记忆性T细胞有两种亚型：中枢性记忆性T细胞central memory T cells (TCM)和效应性记忆性T细胞 effector memory T cells (TEM),这两种细胞和幼稚的T细胞Naive T cell 分别有以下特征

Naive T cell： (CCR7+CD45RA+)
TCM：CCR7+CD45RA–
TEM：CCR7–CD45RA–
文献上区分这3钟细胞做了如下标记：
细胞   FITC-conjugated CCR7 mAb(绿色)  PE-conjugate anti–human CD45RA mAb（橙红色） PE-conjugated anti-CD4 mAb （橙红色      
Naive T cell CCR7+  CD45RA+  CD4+)  黄色  
Tcm:  (CCR7+  CD45RA–  CD4+)  绿色      
Tem:  (CCR7–  CD45RA–  CD4+)  橘黄色或橙红色  
现在我想得到Tem不管Naive T cell 和Tcm，我买这两种荧光标记的抗体FITC-tagged anti-CCR7 mAb 和PE-conjugated anti-CD4 mAb 标记外周血分离的PBMC能否实现？按照推理将是Naive T cell 和Tcm都显绿色，Tem显橘黄色或橙红色。而现在试剂公司只能提供PE-tagged anti-CCR7 mAb和FITC－conjugated anti-CD4 mAb，就是PE和FITC标记的抗体换了，我能得到相同得结果吗？
•  我查了质料说：PE最强，适用于弱表达抗原
FITC最便宜，适用于强表达抗原
请问我能得到我想要得结果吗？急！！！！！！

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请问你是使用流式做实验吗？
如果是，那么你不必太在意颜色问题，关心的应该是细胞分群的问题。
此外，你检测T细胞，为什么只用CD4，CD3/CD8那群细胞你不需要吗？检测总T细胞，应该使用CD3的抗体；一管内加3种不同标记的（如CCR7 PE/CD45RA FITC/CD3 PerCP），以CD3阳性细胞群为门，CCR7/CD45RA图上应该可以分出四群即CD3+CCR7+CD45RA+ Naive T cell, CD3+CCR7+CD45RA- TCM, CD3+CCR7-CD45RA- TEM, CD3+CCR7-CD45RA+ .再加一管相应的同型对照就好了。
BTW:如果你想CD4/CD8两群分开可以加一个CD4 APC 或CD8 APC，那就需要做3管（对4色流式而言）了。
作者: u234    时间: 2012-1-29 16:25

BD机器适应性好，各个公司的试剂同吃
C的机器对自家试剂敏感，对其他家试剂不敏感，荧光强度弱

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我们一直使用的是BD Pharmingen的抗体，仪器也是BD的，在使用时发现CD8 PE明显比CD8 APC好，CD8 PE的强阳，弱阳和阴性分的很漂亮，而APC则差很多，后来coulter的技术支持给我们一些试用装，单标记对比发现，C家好过BD的有CD25 PE,CD8 APC,CD 16 FITC和HLA-DR FITC以及IFN-γ PE（好的标准：分群和生物学意义更加一致，荧光强度更强。我们用的是猴的抗体，只比较了几种我们需要的）；但是C家的CD4 FITC太快淬灭了，我不喜欢用；BD的抗体种类更多，选择的余地也大，毫无疑问是有优势的。但是如果有质量相当甚至更好而价格却便宜的抗体，为什么不用？
别家的产品没有试过，没有发言权^_^。
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-29 16:25


如果同型对照用的不对，譬如说IgG2a用成IgG2bl了，对结果的影响大吗？而以前采集到的数据能重新分析吗？检测的是CD4、CD8。 谢谢帮助。
作者: cj_mondy    时间: 2012-1-29 16:26


请问用流式细胞术检测是必须选用新鲜的标本么？我想测核蛋白ki67，用-70度保存的肿瘤标本能检测么？
谢谢！
作者: qqq111    时间: 2012-1-29 16:27


请教楼主，我是一名研究生，想用流式测一下肝吸虫感染后 脾脏和淋巴结 内单个核细胞中CD4+CD25+调节性T细胞所占的比例 ，所用的动物模型是大鼠，那么，用流式时需要用的抗体应该是什么样的啊？应该怎样用荧光标记呢？到哪里能买到试剂盒呢？一般的流式细胞仪能不能测呢？我对流式不懂啊，还希望多多指教。
作者: is2011    时间: 2012-1-29 16:27


请问各位大侠，国内哪个单位有12色的流式细胞仪？
如果知道，请Email我。谢谢！
作者: vcve    时间: 2012-1-29 16:28


Annexin-v/PI 双标测细胞凋亡，每组需要测几个样本？我听说每次每组只要测一个样本，重复3次就行，那这样每组就只三个数据，能进行统计学分析吗？谢谢赐教！
作者: 薄荷侠    时间: 2012-1-29 16:28


请教流式高手，我刚开始做流式，做的是骨髓液白细胞表面某抗原表达。我的试验步骤是：
1，取100ul肝素抗凝骨髓液，溶血；
2，1500转/每分钟，离心5分钟，弃上清；加PBS1ml洗涤一次，同上离心，弃上清；
3，加单抗室温温育30分钟，加PBS1ml洗涤一次，1500转/每分钟，离心5分钟，弃上清；
4，加荧光标记二抗避光室温温育30分钟，同上洗涤一次，加PBS 0.6ml重悬细胞，上机检测。
问题是：
试验过程中，试管下细胞往往结成一团，加PBS洗涤也只能看到类似白色絮状沉淀物，而不是试验要求的单细胞悬液。这样上机检测前用滤布滤过后基本上就没有什么细胞了！是不是细胞静置的时间太长所致？还是别的原因？
作者: tianmei001    时间: 2012-1-29 16:28

本人想用免疫组化标记的样本分选阳性细胞，但是不知道皮下组织能不能达到该种目的？因为我了解的大多是肝、脑、睾丸组织。谢谢大侠相告。
作者: ero11    时间: 2012-1-29 16:29


各位大虾：
我最初的实验设计想用流式细胞术进行初步观察，即用三色荧光分别标记以区分细胞亚群，如CD3-PE-Cy5/CD4-PE/Tim-3-FITC。但是市场上没有直接荧光标记的抗人Tim-3抗体，只能采用间接标记。据实验室技术师说，间接标记分子不能同时进行双标及三标，即我原来的实验方案不可行，只能观察该分子在外周血PBMNC整体中的表达。因此我想请教一下，若Tim-3采用间接荧光标记，是否确实不能进行单通道双标或三标的检测？
谢谢！
作者: mickeylin    时间: 2012-1-29 16:29

间接标记不如直接标记理想 ，也可以做，一抗选择不同来源的抗体即可，如，分别选鼠抗人、兔抗人，二抗选择羊抗鼠、羊抗兔不同荧光标记，尽量避开FITC、PE同时用，非要一起用也可以，调好补偿就行，非常重要的是要做好同型对照，阴性对照，最好能做单阳性对照（不是必须）。以上只是举例，具体的根据你的实验和所具备的抗体再设计一下，但愿对你有所帮助。
作者: 小螺号    时间: 2012-1-29 16:30

我现在想要在原代细胞中通过标记一种蛋白来分选我要的那群细胞。但这种蛋白是一种细胞骨架蛋白，不知道能否用流式的方法来做。而且我分出来马上要抽提RNA不知道是否可以用多聚甲醛固定？
最后有谁可以提供流式细胞抗体标记的protocol 就十分感激了。
作者: junhun    时间: 2012-1-29 16:30


请教各位，我做的是流式细胞术检测细胞表面抗原的表达，有几个问题，希望大家帮帮忙：
1.流式结果中的阳性细胞表达率平均荧光强度之间是什么联系呢？因为有些阳性细胞表达率很低，平均荧光强度却很高。如果做不同细胞间的比较，用哪个参数会比较合适。
2.被检测的细胞阳性表达率很低，但是流式结果图中波峰落在同型对照组波峰的右边，是否就能说明是阳性表达呢？（因为看到国外文献上将被检测细胞与同型对照的流式图合成在一张图上比较）
作者: 831226    时间: 2012-1-29 16:30

真是高手云集。小弟想用流式测一乳腺癌细胞表面抗原，有一抗和荧光标记的二抗，由于不是定的试剂盒，不知道具体操作步骤和一抗二抗体加多少。请各位高手给个这方面的步骤。万分感谢。
作者: any333    时间: 2012-1-29 16:31


请教各位高手，本人刚开始做流式，准备测药物对体外培养的肿瘤细胞周期的影响，
可做了几次都不成功，后发现细胞经70％乙醇固定后，经PI染色就测不出，而同样
的细胞未经固定当天直接染色就能测出，已排除仪器问题、试剂原因及细胞原因。
问题肯定出在固定上，可所有文献都是这样做的。为什么。
作者: kulee    时间: 2012-1-29 16:31


楼主好专业啊，实在佩服！
我想请教楼主，本人打算做逆转耐药实验，具体是检查细胞内的阿霉素多少，实验室流式老师没有做过，请问我应该准备些什么资料呢？比如激发波长？标本处理等等？
实在是非常感谢，希望尽早得到楼主GG的答复！：）
作者: fsdd817    时间: 2012-1-29 16:31

请问我想用流式细胞仪检测贴壁生长型肿瘤细胞的凋亡，具体用什么方法好？想找一个又便宜又好做的，我看每种都有优缺点，原想用annexin-V，可又有人说这种方法只适合悬浮细胞。
作者: 49888    时间: 2012-1-29 16:32

现在我做的课题，老板为了省钱，要我用师兄留下的试剂做试验，但是都没有说明书了，你帮我辨认一下好吗？有一个试剂盒里装有DAB substrate、 peroxidase solution、 tris buffer concentrate 这些事做免疫组化用的吗？还有另一个试剂盒里有：羊抗鼠IgG-FITC、另外有两个单克隆抗体，这个试剂盒可以作流式检测吗？我要检测的两个抗体，只能用间接法，并且必须分开做是不?我的试剂还差哪些？放了快一年的试剂了（一直保存在4度冰箱里）还可以使用不？
作者: dragonkilly    时间: 2012-1-29 16:32

我的流式BCL-2检测试剂盒的说明书不小心丢了,不知朋友们可以帮忙吗?是catalog公司的产品.谢谢了!!!!!!!!!

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你好，请问你catalog公司的产品在哪个公司订购的？
作者: moonlight45    时间: 2012-1-29 16:33


请问一下，如果用新鲜细胞做流式，用什么破膜剂比较好？
作者: 四福晋    时间: 2012-1-29 16:33


请问一下，有将G0,G1区分开期检测的流式方法吗，技术是否成熟？
作者: 克隆鱼    时间: 2012-1-29 16:33

请问各位高手,做三色荧光检测对染料的选择有特殊要求吗,
PE FITC PE-Cy5三种染料可以搭配一起做三色流式检测吗
作者: 园丁##    时间: 2012-1-29 16:34


PC5-PE-FITC可作三标检测。
作者: 蒲公英    时间: 2012-1-29 16:34


请问各位,我做流式的,二抗已经使用后因为有事情,所以实验停了5个月,现在接着做,不知道二抗的荧光还能行吗(二抗存放在4度冰箱里)?急盼回复!!谢谢!!!
作者: zsxan1990    时间: 2012-1-29 16:34

帮忙看看我的流式做法行不行：大鼠外周血淋巴细胞亚群分析
1、由于试验限制，取血肝素抗凝后置于4度保存24小时后检测？？？
2、外周血100ul，加入抗体20ui，避光室温孵育20－30分钟
3、加入固定液100ul，避光室温孵育20分钟
4、加入溶血素1.5ml，混匀，避光室温孵育30分钟，上机检测
有老师说最后一不可以多放置一段时间，让溶血素充分作用，利于单核细胞分出。
固定后可以放置1－2天检测也不影响结果？？
可以吗？？谢谢
作者: BOSS2011    时间: 2012-1-29 16:35

最近也准备做流式，主要是检测大鼠肝移植（DA-LEW）术后急性排斥反应时CD4、CD8 细胞的检测，因为前面的师兄做了一些，都未能成功，表现为上机检测时检测不到荧光，有点担心，所以请教老师：

1. 用红细胞裂解液和淋巴细胞分离液两种不同的方法各有何优缺点，首选哪种方法？

2. 这是我的实验步骤，不知道对不对？请老师指正，谢谢！！
我的抗体是 CD4:FITC/CD8: RPE : DUAL REAGENT ( AbD serotec)

红细胞裂解方法：
1) 取1000U/ml肝素100μl抗凝静脉全血，置于FCM测量管中；
2)加入带荧光标记的单克隆抗体试剂20μl（每个抗体10μl），充分混匀，4℃冰箱中反应30min；
3)在加入300μl溶红细胞液，充分混匀，在37℃冰箱中反应5-10min；
4)以1500r/min离心5min，去上清；
5)用Hanks液洗1遍，收集细胞，上机检测。

淋巴细胞分离液法：
1)外周取血2.0ml，注入盛有肝素的无菌试管中（每lml全血加0.1ml 125-250U/ml肝素溶液)，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。
2)加入等体积的室温Hanks液，使血液等体积稀释，可降低红细胞的凝集，提高分离效果。
3)吸取淋巴细胞分层液4ml，置于15m1离心管中，将稀释血液在距分层液界面上lcm处沿试管壁缓慢加至分层液上面，应注意保持两者界面清晰。
4)将离心管置水平离心机内，在18-20℃下以1500r/min离心15min，离心后可见试管内的血液清楚地分为4层，上层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞所处于血浆层和分离液层中间）底层为红细胞层，红细胞层上为粒细胞层。
5) 用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出收集到另1个试管中，用生理盐水洗2遍，每次均以2000r/min，离心10min，弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液，调整细胞浓度至1×106/ml。
6)取上述淋巴细胞混悬液50u1。
7)加入标有荧光素的单克隆抗体工作液50u1（每种抗体各25 u1）。
8)37℃水浴30分钟，避光。
9)加入PBS10m1，混匀。
10)离心l000转／分，10分钟；
11)重复9．10步骤；
12)加入lmlPBS缓冲液混匀；
13)上机检测。
祝各位战友、老师春节快乐！！
作者: BOSS2011    时间: 2012-1-29 16:35

最近做流式，检测正常人及患者PBMNC各亚群Tim-3的表达，用三色标记，其中（1）管为FITC-CD4/PE-Tim-3/PE-Cy5-CD3；（2）管为FITC-CD8/PE-Tim-3/PE-Cy5-CD3；（3）管为FITC-CD14/PE-Tim-3/PE-Cy5-CD3；（4）管为FITC-CD16+CD56/PE-Tim-3/PE-Cy5-CD3；（5）管为FITC-CD19/PE-Tim-3/PE-Cy5-CD3。
操作步骤如下：
（1）Falcon管分别标记，加入荧光标记的单克隆抗体（每种抗体10μl）；
（2）加入EDTA-Na2抗凝全血100μl，充分混匀，室温避光静置30min；
（3）加入红细胞裂解液2ml/管，轻轻振荡，室温避光静置10min；
（4）离心800rpm，10min；
（5）弃上清，PBS洗涤，离心800rpm，10min；
（6）重复步骤（5）；
（7）弃上清，加入600μlPBS混匀，上机检测。

2周以前出图正常，上周二作图突然出现异常，表现为（1）管CD3/CD4的图标准，外周血淋巴细胞分为CD3阳性群和CD3阴性群，阳性群细胞又分CD4阳性群和CD4阴性群。但CD4/Tim-3的图与CD3/CD4的图完全一致。且不说PBMNC中Tim-3是否能有这么高的阳性率，单以CD4+T细胞而论，不可能全部是Tim-3阳性。其余各管均是一、二通道与一、三通道的图几乎完全相同。

已经排除操作过程中加错抗体的可能性，请教各位前辈，还有什么原因可能会导致这样的结果？如何验证？谢谢帮助！
祝各位前辈及战友新年快乐，实验顺利！
作者: vera+    时间: 2012-1-29 16:36

最好要用一管未处理且完全不染FITC的作对照，另未处理和处理的都染FITC作分析。
未处理且完全不染FITC的作对照可以作为阴性对照，同时用于标定流式的仪器参数，未处理的作为阳性对照。然后比较处理后的荧光变化。

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您好！正在做流式，今天才发现这么好的版块！真是“相见恨晚”！楼主辛苦了！不过晚辈也来打扰了，而且以后可能还有很多问题要不断的来麻烦前辈，向前辈请教，望前辈不吝赐教^_^
我检测的是胞内蛋白表达在干预前后表达量的变化，与eming43战友的实验类似，您是说要用“未处理且完全不染FITC的作对照可以作为阴性对照，同时用于标定流式的仪器参数”，不是有同型对照可以作为阴性对照吗？
还有您上面说的“未处理的作为阳性对照”这句指的是？看不明白，我想是不是“有处理的作为阳性对照”？
望前辈多多指教，谢谢!
作者: 二子    时间: 2012-1-29 16:37


小弟做外周血，分CD4（PE）与CD8（FITC），CD4T细胞老分不出来。原因何在？

图片附件: 38359778.jpg (2012-1-29 16:37, 12.81 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10355

作者: 131415    时间: 2012-1-29 16:38


处理细胞为成纤维细胞 ，欲应用流式细胞技术检测细胞核内DNA甲基化水平，间接法，在实验中涉及到两次打孔（胞膜与核膜），请问有哪位战友有具体的操作方法。多谢！
作者: xueyouzhang    时间: 2012-1-29 16:38


处理细胞为成纤维细胞 ，欲应用流式细胞技术检测细胞核内DNA甲基化水平，间接法，在实验中涉及到两次打孔（胞膜与核膜），请问有哪位战友有具体的操作方法。多谢！
作者: glass    时间: 2012-1-29 16:38

帮忙看看我的流式做法行不行：大鼠外周血淋巴细胞亚群分析
1、由于试验限制，取血肝素抗凝后置于4度保存24小时后检测？？？
2、外周血100ul，加入抗体20ui，避光室温孵育20－30分钟
3、加入固定液100ul，避光室温孵育20分钟
4、加入溶血素1.5ml，混匀，避光室温孵育30分钟，上机检测
有老师说最后一不可以多放置一段时间，让溶血素充分作用，利于单核细胞分出。
固定后可以放置1－2天检测也不影响结果？？
可以吗？？谢谢

4度保存24小时没做过应该是没问题的
国外有很多这方面的文献，关于血样的采集于保存的，因为很多时候血样要经过长途运输到参考实验室进行检测，途中样品的保存与处理很重要，你可以找来看一看。关键次cryopreservation preservation FACS等
抗体反应时一般冰浴、避光20-30分钟

固定后放置1－2天是不影响检测结果的
不过我做的时候一般是先溶血洗两到三次，再固定上机。
作者: 穿越时空    时间: 2012-1-29 16:39


请教：我用组织块准备做流式检测细胞周期，手术室取好标本后剪成直径约2mm大小，2小时后先用机械法没有细胞出来，又用胰酶消化还是没有细胞，只有一些细胞碎片，是什么原因。谢谢！
作者: 羊咩咩    时间: 2012-1-29 16:39


我培养了小鼠骨髓基质细胞，要进行流式检测，可我不知道怎么制备单细胞悬液，这是我的操作步骤，请给予帮助和指正。
弃去培养液，PBS洗两次，加入胰酶消化3分钟，在显微镜下观察细胞形态，用含有血清培养液终止消化，吹打，使它充分分散，离心1000rpm/5min，弃去上清，再用PBS重悬细胞，以同样的转速离心一次，再用PBS重悬细胞，细胞计数，调成每毫升含有10的7次方细胞，然后是否要用多聚甲醛固定？谢谢
作者: owanaka    时间: 2012-1-29 16:40

大家好，我近来正在做流式，6－OHDA不同浓度损伤后测线粒体膜电位，结果发现膜电位变化不明显，但有文章显示，线粒体膜电位应变化很明显（处理因素与我的相同),我想向各位请教一下，流式检测是不是很敏感？有没有也做这方面的师哥师姐，我刚开始做有很多不懂的的地方，请指导一下！非常感谢！
作者: 2541    时间: 2012-1-29 16:40

我不懂流式，可我在实验中要用到流式细胞术，我想请教哥哥，姐姐，我做的是树突状细胞的流式细胞术，结果每次都不是很理想，每一组都不一样，没有什么趋势。当我们把弱阳性加到强阳性里面去时，结果就会很好，不知道这中将弱阳性加到强阳性里，有没有说服力？
作者: junhun    时间: 2012-1-29 16:41


插一段, 我想测一下骨髓巨核系的倍体水平,查到如下做法: 单个核细胞悬液与CD61-FITC孵育30 min, 在PBS洗涤后, 用70%(700ml/l)冷乙醇固定, 4℃冰箱过夜。用PBS洗去乙醇,加入含0.002%(0.02ml/l) Triton X 100, 100U RNase和50μg/ml(50mg/l) PI的染液进行DNA染色, 室温避光30 min。以FACSort流式细胞仪读取分析数据, fL1和FL2间的光谱重叠通过调节荧光补偿修正。在FL1对FL2-H点图上设门获取CD61+细胞5000～10000个。用LysysⅡ软件对巨核细胞的DNA倍性分布进行分析.那位大侠给看一下,这样做行不？
作者: 33号    时间: 2012-1-29 16:41

各位GGJJ帮帮小弟！

小弟最近要做一个试验，使用流式检测细胞表面的某种蛋白质表达情况趋势。小弟以前从来没有做过流式，不知道这个试验怎么样做，希望能够得到各位高手的帮助，谢谢。

小弟以前在论坛上求救过，别人提了一些意见，如下：
1. 收集细胞，PBS洗涤两遍
2 细胞消化后计数，离心，弃上清
3. 根据需要分装进合适数量的EP管（5×10 5-6×10 6每管）
4． 离心1000rmp5min足够，弃上清，加入适量的（1%BSA(PBS)按一定比例稀释的一抗（看抗体说明书）一抗，混匀，4度，避光，时间要根据抗体的说明书来定。一般膜表面的抗原30分钟就可以. 孵育要放在冰上避光孵育
（PBS稀释一抗，二抗，所用量比孵育PVDF肯定要大，先问抗体公司）
5. PBS洗涤两遍，离心，弃上清，加入适量的二抗，混匀，4度(室温)，避光，30分钟
6. PBS洗涤后，加入含1％多聚甲醛的PBS，混匀，上机

不知道这种方法是否正确呢？小弟还有几个问题要请教：

1. 洗涤用的PBS是纯PBS还是含有1％新生牛或BSA的PBS呢？
2. “用1%BSA按一定比例稀释的一抗”，是不是还有1％BSA的PBS呢？
3. 孵育抗体后是可以直接放入EP管然后上机，还是在抗体孵育后用胰酶先消化细胞然后再放入EP管？
4. 1％多聚甲醛是最后一步固定还是最开始就固定？

小弟不知道怎么孵育细胞的抗体，希望各位能够给我很多帮助
万分感谢！
作者: tieshazhang    时间: 2012-1-29 16:42


请教那位有有jc-1检测细胞的图？如何解释结果？
想要给本科生做个幻灯 不知道怎么解释？ 是不是荧光越小 膜电势越低？ 和用rodamine 123 检测的结果解释一样？
作者: tieshazhang    时间: 2012-1-29 16:43

我不懂流式，可我在实验中要用到流式细胞术，我想请教哥哥，姐姐，我做的是树突状细胞的流式细胞术，结果每次都不是很理想，每一组都不一样，没有什么趋势。当我们把弱阳性加到强阳性里面去时，结果就会很好，不知道这中将弱阳性加到强阳性里，有没有说服力？

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做了什么标记呢？CD11c？弱阳性加到强阳性？
做FACS时都需要用Isotype标记后设定阴阳性界限（阳性界限设定在阳性率为2％的位置），根据这个阴阳性界限所测得的百分比就是阳性细胞百分率，包括弱阳性和强阳性的细胞
作者: 铜雀    时间: 2012-1-29 16:44

各位GGJJ帮帮小弟！

小弟最近要做一个试验，使用流式检测细胞表面的某种蛋白质表达情况趋势。小弟以前从来没有做过流式，不知道这个试验怎么样做，希望能够得到各位高手的帮助，谢谢。

小弟以前在论坛上求救过，别人提了一些意见，如下：
1. 收集细胞，PBS洗涤两遍
2 细胞消化后计数，离心，弃上清
3. 根据需要分装进合适数量的EP管（5×10 5-6×10 6每管）
4． 离心1000rmp5min足够，弃上清，加入适量的（1%BSA(PBS)按一定比例稀释的一抗（看抗体说明书）一抗，混匀，4度，避光，时间要根据抗体的说明书来定。一般膜表面的抗原30分钟就可以. 孵育要放在冰上避光孵育
（PBS稀释一抗，二抗，所用量比孵育PVDF肯定要大，先问抗体公司）
5. PBS洗涤两遍，离心，弃上清，加入适量的二抗，混匀，4度(室温)，避光，30分钟
6. PBS洗涤后，加入含1％多聚甲醛的PBS，混匀，上机

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理论上这样来孵育抗体就可以了。但也要根据情况而定，我们最近的一个实验在四度进行抗体标记反而标记不上，改成室温才行，具体原因我也不清楚。需要注意的一点是，有的时候贴壁细胞用胰酶消化的时候，胰酶可能会影响所需检测的细胞表面蛋白与抗体的结合，我们最近的实验就是这样，检测不同细胞表面的同一蛋白的表达，悬浮的细胞可以标记的上，而贴壁细胞不可以，后来消化时将胰酶改为0.03％EDTA，就解决了这个问题
作者: 铜雀    时间: 2012-1-29 16:44

1. 洗涤用的PBS是纯PBS还是含有1％新生牛或BSA的PBS呢？
2. “用1%BSA按一定比例稀释的一抗”，是不是还有1％BSA的PBS呢？
3. 孵育抗体后是可以直接放入EP管然后上机，还是在抗体孵育后用胰酶先消化细胞然后再放入EP管？
4. 1％多聚甲醛是最后一步固定还是最开始就固定？

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1.最好用含有1％新生牛或BSA的PBS，有助于保持细胞的活性和状态。
2.什么意思？就是用含1％BSA来稀释一抗
3.是先消化细胞，将细胞处理为细胞悬液，在悬液中进行抗体标记。
4.做膜表面蛋白标记，如果马上进行检测，可以不用1％的多聚甲醛固定，直接检测，如果需要保存一段时间后检测，可以在标记完了以后加多聚甲醛进行固定。4度保存。
作者: 铜雀    时间: 2012-1-29 16:44

小弟做外周血，分CD4（PE）与CD8（FITC），CD4T细胞老分不出来。原因何在？

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请问你用的是什么仪器？如果用的是BD 的仪器，你选用的参数就不是很正确，PE是在FL2检测，你做散点图应该用FL1&FL2做散点图。如果是coulter的仪器我不是很清楚，是不是PE就在这个通道检测，如果是，FL1-FL3的补偿从图上看出也没有调节好。可以根据情况看一下是哪里出了问题，祝实验顺利
作者: ritou1985    时间: 2012-1-29 16:45


我想用流式细胞做大鼠血液中性粒细胞或单核细胞的内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS)，请问要任何做，标本怎么制备。谢谢
作者: duoduo    时间: 2012-1-29 16:46

流式分析紧求助;PBMC细胞内因子染色CD4/PECY5,IFN-g/PE,IL-4/FITC;

设BLANK管(没加剌激剂),多肽管,BCG管,及PMA+Inomycin管;用多肽(0.5ul)或BCG(10ul)或PMA(0.5ul)+Inomycin(1ul)剌激后,表面染色(室温30min),2%多聚甲醛固定(室温,30min),PBS洗两次,加胞内单抗及1%SAPONIN-10%BSA-PBS,染色两小时(因配试制错误,原计划用0.1%,两小时后发现终止).用0.1%SAPONIN-1%BSA-PBS洗两次(感觉有泡没有洗干净),用1%多聚甲醛分散第二天上机.

问题一,BLANK出现IL-4达90%(圈定的左下角细胞,FS/SS图与附件的图类似),不知何原因;

问题二,BCG剌激图中,发现FS/SS图(附件第二行图)中,圈定的位于左下角的细胞其IL-4达23%(第二行中图),IFN仅0.2%(第二行右图),而其右上位的细胞(附件第三行图)中,IL-4仅18%.现在的问题是,第二行跟第三行分别是什么细胞,为什么产生这种差异?谢谢!

图片附件: 36803514.snap.jpg (2012-1-29 16:46, 37.64 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10356

作者: +小生怕怕+    时间: 2012-1-29 16:46


楼主你好，我是一名临床研究生，刚开始接触实验。我打算用流式细胞仪对小鼠的脾细胞悬液进行T细胞亚群进行分析。我想求教一个问题：制成脾细胞悬液后能否保存于4度，或冷冻后复融，再进行标记，上机检测？还有以你的经验，使用哪个公司的抗体比较好？
作者: yysr238    时间: 2012-1-29 16:46


我想检测JURKAT细胞的IFNg的表达,ELISA等检测了是有分泌的,我刺激后加BFA阻断(有P/I与BFA共孵育4-6H,也做过P/I先刺激16H,BFA再刺激4H).FACS怎么我就做不出来呢?
2%多聚甲醛固定(0.1%SAPONIN,2%FBS,室温,30min,PBS,),WASH BUFFER((0.1%SAPONIN,2%FBS,PBS)洗两次,加胞内单抗(PE-IFN g ,稀释于WASH BUFFER),避光染色半小时.WASH BUFFER洗两次.上机检测.
MS过程也没什么特别的实验我咋就做不好呢? FACS检测这种分泌因子到底好不好做啊?
我快死掉了, 急度抓狂中, HELP ME!
作者: cocacola    时间: 2012-1-29 16:47

我是一个新手，我要做有关白念株菌的多药耐药蛋白，它是一个药物外排泵蛋白，不知道能否用流式细胞做？怎么做？多谢赐教，非常感激！
作者: 3648755    时间: 2012-1-29 16:47


我是刚踏入流式技术的菜鸟，询问一下两个问题：
1、看了本题的很多发言，但还是有些不是很明白，我如果要进行Th1/Th2细胞检测，是否要买三色标记试剂盒（一个表面CD4和两个胞内IL-4/IFN-r），能否具体告知操作步骤！
2、我如果要从结肠组织中提取淋巴细胞进行实验，是不是要用到胶原酶和胰酶，我还看到用了DNA酶，我不知道有何作用，用了这些酶对细胞会有多大的影响？？
作者: utt0989    时间: 2012-1-29 16:48


想请教关于细胞周期各亚期比例（G0/G1, S, G2/M)随时间变化的统计分析，不知这样的资料该用什么分析方法？实验分两组，对照和阳性组。因为各亚期的比例变化是关联的，具有相干性。不知该用什么方法？谢谢！
作者: pencil菲    时间: 2012-1-29 16:48


大家好,我是才使用流式细胞仪不久的新手,主要测PNH.测得的PNH的RBC上的CD55和CD59 与WBC的CD55和CD59 的结果不平行,一般RBC上的呈阴性,而WBC上的呈阳性,不知道怎么会这样,请教各位师兄师姐!
作者: lagua123    时间: 2012-1-29 16:49

测CD55和CD59本来在红细胞及白细胞上的表达就不一致，红细胞的表达率往往受临床处理及患者血液状态的影响，如溶血或有无输血等，不知你所说的阴性和阳性指什么。
作者: nn255    时间: 2012-1-29 16:49


我测的基本上都是门诊病人,很多例测出来都是表达不平行的.
我们实验室所设定的阴性指标是:不表达CD55和CD59的细胞数<5%为正常.最近测出来的很多RBC上CD55和CD59都<5%,但WBC的CD55和CD59高达70%~90%,觉得很奇怪.
作者: milkdog    时间: 2012-1-29 16:49

我是流式新手，想问这位大师，一般情况下，测肿瘤药物对细胞的杀伤作用时，是不是只要通过fsc/ssc设gating就可以去除细胞碎片？
作者: BUK    时间: 2012-1-29 16:50

头一次做流式，要命的是在国外机器要自己操作，前天打开保存过的文件，就费了半天时间。标本制备过程有很多资料可查，机器操作和结果分析方面的资料却少得可怜，能不能提供这方面的资料？我现在连SSc和FSC意味着什么都不知道。万分期待！
作者: bananapeople    时间: 2012-1-29 16:50

我也开始做流式了，今天找到了这里。
CFSE细胞增殖，细胞凋亡，EGFP转染细胞检测，细胞内细胞内子（ICS）等等。希望同各位同行多多交流。
作者: shenkunjie    时间: 2012-1-29 16:51

我做单参数分析。请问我这样做对不对。
第一：同型对照管进行设门并且调阴性区
第二：上样时，首先上同型对照，这样在分析的时候可以调出第一个图，即设门的三点图
第三：以后依次上样（实验组）
对否？
作者: c86v    时间: 2012-1-29 16:51

请教：准备做流式测处理过的细胞的细胞调亡和细胞周期有什么变化，应该如何设计实验，如何做对照，如何制作单细胞悬液，流式时应测什么相关参数？
作者: c86v    时间: 2012-1-29 16:52


刚做的流式，发几张图片请高手帮忙分析，细胞调亡情况
第一张，

图片附件: 18981560.png (2012-1-29 16:52, 24.44 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10357

作者: c86v    时间: 2012-1-29 16:52

第二张，

图片附件: 33906718.png (2012-1-29 16:52, 57.09 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10358

作者: c86v    时间: 2012-1-29 16:53

第三张，

还有应该如何做荧光补偿，在WinMDI这个软件中可以做补偿么？
请大家帮忙分析一下，处理过的细胞调亡有什么变化啊？
总共收集20000个细胞。

刚接触流式一周时间，又很多要向大家学习的，请多多指教，谢谢！

图片附件: 91066791.png (2012-1-29 16:53, 55.27 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10359

作者: 04906    时间: 2012-1-29 16:53

请问用流式细胞术检测P38的表达具体实验步骤是什么呢？我的1抗p-p38是带荧光标记的，可以做流式。
作者: xue258    时间: 2012-1-29 16:53


各位大侠，用流式可以分选出处于G1/S期、G2/M期的细胞么，谢谢
我想检测处于不同细胞周期时相的细胞中某种蛋白表达的差异，我想先用流式分选出处于G1/S期、G2/M期的细胞，然后分别做免疫细胞化学，可行么？望赐教！
作者: hyuu    时间: 2012-1-29 16:54


我培养神经元的，也想做流式，可是自己用一个试剂盒有点浪费，有想合用的吗？
作者: hyuu    时间: 2012-1-29 16:54


请问各位大侠，我想用FCM测蛋白的磷酸化的表达（P38信号转导通路），以了解P38的活性，在一抗说明书上有一下步骤，大家看看这样对吗？（全英文的说明书，不知道自己翻译的多对不对）。多谢各位大侠了，着急ing!
1 固定：先细胞离心后去上清液，然后加入1mlPBS混匀细胞，加入甲醛使甲醛终浓度为2-4%，在37°下固定10分钟，最后把试管放进冰上1分钟。
2 接着缓慢加入100％冰冻甲醛到预冷的细胞中，，边加边搅拌，使甲醛终浓度为90％，然后离心后使细胞悬浮于90％的甲醛中。（自己都不知道在说些什么了。）
3 加入1000000个细胞到试管里，再加2－3ml 0.5%BSA到试管里，离心，去上清。
再加入100ul 0.5%BSA使细胞混匀。室温下孵育10分钟。加入稀释好的一抗。室温下孵育30－60分钟。离心去上清。细胞混匀后加入荧光标记的2抗，室温下孵育30分钟，离心去上清，加入0.5mlPBS混匀细胞，上机检测。
作者: kswl870    时间: 2012-1-29 16:55


请问前辈，我想利用流式细胞术检测血液中的内皮细胞，除了制备血液中单个核细胞悬液外，还需要准备什么呢？首次接触流式细胞术，望赐教。
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-29 16:55

请问前辈，我想利用流式细胞术检测血液中的内皮细胞，除了制备血液中单个核细胞悬液外，还需要准备什么呢？首次接触流式细胞术，望赐教。

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血液单个核细胞的制备，只要用红细胞裂解液溶掉红细胞就可以了。还需要准备的就是内皮细胞的特异性标记的抗体了，我知道人的有CD31，CD105，CD146这几个。你们应该是专门做内皮细胞这方面研究的，可能知道的更详细吧！
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-29 16:55

各位大侠，用流式可以分选出处于G1/S期、G2/M期的细胞么，谢谢
我想检测处于不同细胞周期时相的细胞中某种蛋白表达的差异，我想先用流式分选出处于G1/S期、G2/M期的细胞，然后分别做免疫细胞化学，可行么？望赐教！

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带分选功能的流式细胞仪是可以的，例如BD的FACS Aria 。机器操作上没有技术难度。
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-29 16:56

我想用流式细胞做大鼠血液中性粒细胞或单核细胞的内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS)，请问要任何做，标本怎么制备。谢谢

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标本制备，用红细胞裂解液溶血去处红细胞，后面再用eNOS的流式抗体标记就可以了。问题是大鼠的eNOS流式抗体估计不大好找，找试剂公司问问吧！
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-29 16:56

流式分析紧求助;PBMC细胞内因子染色CD4/PECY5,IFN-g/PE,IL-4/FITC;

设BLANK管(没加剌激剂),多肽管,BCG管,及PMA+Inomycin管;用多肽(0.5ul)或BCG(10ul)或PMA(0.5ul)+Inomycin(1ul)剌激后,表面染色(室温30min),2%多聚甲醛固定(室温,30min),PBS洗两次,加胞内单抗及1%SAPONIN-10%BSA-PBS,染色两小时(因配试制错误,原计划用0.1%,两小时后发现终止).用0.1%SAPONIN-1%BSA-PBS洗两次(感觉有泡没有洗干净),用1%多聚甲醛分散第二天上机.

问题一,BLANK出现IL-4达90%(圈定的左下角细胞,FS/SS图与附件的图类似),不知何原因;

问题二,BCG剌激图中,发现FS/SS图(附件第二行图)中,圈定的位于左下角的细胞其IL-4达23%(第二行中图),IFN仅0.2%(第二行右图),而其右上位的细胞(附件第三行图)中,IL-4仅18%.现在的问题是,第二行跟第三行分别是什么细胞,为什么产生这种差异?谢谢!

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IL-4 FITC怎么会用FL-4分析？？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-30 14:11     标题: 回复 #1446 乌贼老弟 的帖子

流式分析紧求助;PBMC细胞内因子染色CD4/PECY5,IFN-g/PE,IL-4/FITC;

设BLANK管(没加剌激剂),多肽管,BCG管,及PMA+Inomycin管;用多肽(0.5ul)或BCG(10ul)或PMA(0.5ul)+Inomycin(1ul)剌激后,表面染色(室温30min),2%多聚甲醛固定(室温,30min),PBS洗两次,加胞内单抗及1%SAPONIN-10%BSA-PBS,染色两小时(因配试制错误,原计划用0.1%,两小时后发现终止).用0.1%SAPONIN-1%BSA-PBS洗两次(感觉有泡没有洗干净),用1%多聚甲醛分散第二天上机.

问题一,BLANK出现IL-4达90%(圈定的左下角细胞,FS/SS图与附件的图类似),不知何原因;

问题二,BCG剌激图中,发现FS/SS图(附件第二行图)中,圈定的位于左下角的细胞其IL-4达23%(第二行中图),IFN仅0.2%(第二行右图),而其右上位的细胞(附件第三行图)中,IL-4仅18%.现在的问题是,第二行跟第三行分别是什么细胞,为什么产生这种差异?谢谢!

IL-4 FITC怎么会用FL-4分析？？

我的IL-4应是在FL-1.也许是没改坐标名吧.我觉得当时操作不规范.现在改用BD机了,不再用那台BECKMAN的四色了.我现在用六色,只是预试验还不理想.
作者: tianmei001    时间: 2012-1-30 14:14

请教破膜问题

我做某分子的流式细胞术检测，据文献免疫组化检查认为该分子在细胞膜表面和细胞内都有表达，因此我买了破膜剂。关于破膜后的荧光情况我听到或看到3种说法：

1、未加破膜剂者有荧光。加破膜剂后，细胞膜表面的分子不会被破坏，仍能与荧光抗体结合，加破膜剂者荧光强度比未加破膜剂者强，说明该分子在细胞膜表面和细胞内都有表达。

2、在加破膜剂后有荧光，但不能区分荧光的来源，即使加破膜剂者荧光强度比未加破膜剂者强，也并不能说明其在细胞内表达与否。

3、加破膜剂后，细胞膜表面的分子被破坏，仅细胞内的分子才能被结合，故加破膜剂者有荧光，则提示该分子在细胞内有表达。

上述3种说法哪种对? 或是还有别的说法？

请帮助回答，谢谢！
作者: langlang    时间: 2012-1-30 14:15


请问各位大侠：
最近我做PI染色,我碰的问题是：我用的是贴壁癌细胞，各种药物处理，每个处理都做３个重复，重复３批。批内的重复都不错，但是３批重复结果重复性不好。
１。是不是样品处理过程有问题，什么样的问题可能导致？
２。是不是一定需要有血细胞做对照？
３。仪器本身可能导致问题吗？
４。分析过程中什么可能导致问题？

请帮助回答，谢谢！
作者: milkdog    时间: 2012-1-30 14:15


用流式细胞仪器检测F-actin的变化，阴性对照的荧光值总是比阳性高，但是整体趋势还对。别人做过同样的实验，我是完全按照他们的方法做的。 不知道为什么？各位高手帮忙分析分析。
是不是固定对细胞骨架也有影响啊，有人建议不固定，直接标记。不知道可行不？
另外，我的细胞随着温度变化会活化，活化后F-actin的量也会增加。我做的阴性对照有三个：1.细胞重悬后一直放在冰上，最后和阳性组的细胞一起固定，中间大概有一个多小时吧。2.细胞重悬后先放在冰上，然后和加了抗体的阳性组的细胞一起放到37度10分钟做刺激，然后固定。3.细胞重悬后，以小鼠的IgG为抗体作同行对照，和阳性组走同样的过程。最后结果显示这三个对照的荧光值基本一致，这很好理解，但是，阴性组的荧光值居然比阳性组的高，这与前人的结论相反。不知道是什么原因。各位请帮帮我， 谢谢先！
作者: windy+++    时间: 2012-1-30 14:16

请教高手：FITC对APC有影响吗？我检测含有APC标记的表面抗体的某群细胞胞内蛋白的表达，胞内蛋白抗体是ＦＩＴＣ标记，间标。可是加了胞内蛋白的抗体后，就无法分出ＡＰＣ－抗体标记的细胞群了。破膜剂对表面标记没有影响，苦恼ｉｎｇ。请各位帮帮忙。
作者: ritou1985    时间: 2012-1-30 14:18


“各受试对象分别取外周静脉血6 ml ,其中3 ml 缓慢注入备有3. 8 %枸橼酸钠的塑料试管中(1∶9 抗凝) ,小心混匀,500转/ 分离心5 分钟,取富含血小板的上清血浆( PRP) 200 nl ,加等体积的Fluo23 AM 应用液,37 ℃避光孵育30 分钟,用PBS
洗两次, 用美国产FACS Vantage 型流式细胞仪检测钙离子荧光强度,以公式[Ca2 + ]i = Kd ( F - Fmin/ Fmax - F) ( Kd 为解离常数450 nmol/ L) 求得血小板内[Ca2 + ]用CELLQuest 软件分析, 检测盒由美国Bio Team Laboratories 公司提供”
最近查阅文献只看到了这么一段文字，想请教各位大侠有谁曾经用流式细胞仪测过血小板的Ca啊？***具体方案！谢谢！
作者: xue258    时间: 2012-1-30 14:19

各位高手：
我想测定贴壁细胞的细胞凋亡和细胞周期情况。准备用AnnexinV－FITC试剂盒测细胞的凋亡情况，也知道测细胞周期要用PI染色。现在我的问题是能否用AnnexinV－FITC试剂盒里面的PI 也测出细胞周期呢？小妹刚开始做流式，请高手指教！
作者: utt0989    时间: 2012-1-30 14:22


请问这样的流式细胞凋亡图用WinMDI2.9怎么做的？
两个坐标是怎么确定的？还有旁边的标注是怎么弄的？

图片附件: 79674750.jpg (2012-1-30 14:22, 20.33 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10360

作者: 兔唇    时间: 2012-1-30 14:23


请教kent老师，您现在还在关注这个专题吗？测流式的话可用70%冷乙醇固定吧，那么请问一下用冷乙醇最多可以固定多长时间呢？用冷乙醇固定的原理是什么呢？先谢谢了！
作者: tangxin_80    时间: 2012-1-30 14:23


我想鉴定我养的细胞，标记有CK15，CK19，CD34，beta1，alpha6，CD71，原来想做免疫细胞化的，后来听说流式也可以用来鉴定，我向各位大虾请教一个问题，不知流式和免疫细胞化学有什么区别啊？
作者: star#room    时间: 2012-1-30 14:24

请教破膜问题

我做某分子的流式细胞术检测，据文献免疫组化检查认为该分子在细胞膜表面和细胞内都有表达，因此我买了破膜剂。关于破膜后的荧光情况我听到或看到3种说法：

1、未加破膜剂者有荧光。加破膜剂后，细胞膜表面的分子不会被破坏，仍能与荧光抗体结合，加破膜剂者荧光强度比未加破膜剂者强，说明该分子在细胞膜表面和细胞内都有表达。

2、在加破膜剂后有荧光，但不能区分荧光的来源，即使加破膜剂者荧光强度比未加破膜剂者强，也并不能说明其在细胞内表达与否。

3、加破膜剂后，细胞膜表面的分子被破坏，仅细胞内的分子才能被结合，故加破膜剂者有荧光，则提示该分子在细胞内有表达。

上述3种说法哪种对? 或是还有别的说法？

请帮助回答，谢谢！

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不知道详细的实验步骤，无法给你确切的答复，如果在做好对照，区别又很明显的话也许可以得到第一个结果
但我更倾向于第二种，从我的经验来看，破膜后的细胞自发荧光跟 未破膜的有很大差别，而且胞内染色非特异性染色也相对大很多
作者: star#room    时间: 2012-1-30 14:26

请教高手：FITC对APC有影响吗？我检测含有APC标记的表面抗体的某群细胞胞内蛋白的表达，胞内蛋白抗体是ＦＩＴＣ标记，间标。可是加了胞内蛋白的抗体后，就无法分出ＡＰＣ－抗体标记的细胞群了。破膜剂对表面标记没有影响，苦恼ｉｎｇ。请各位帮帮忙。

================================================================

FITC与APC之间干扰非常小的，估计是你操作过程中的问题
间标染胞内蛋白非特异性非常高，应注意
还有固定破膜的细胞自发荧光会有很大改变
建议阴性细胞对照和调补偿对照要设固定，破膜的细胞
胞内染色严格做同型对照，起码也要设不加一抗只加二抗的对照来界定阴阳性
作者: star#room    时间: 2012-1-30 14:26

各位高手：
我想测定贴壁细胞的细胞凋亡和细胞周期情况。准备用AnnexinV－FITC试剂盒测细胞的凋亡情况，也知道测细胞周期要用PI染色。现在我的问题是能否用AnnexinV－FITC试剂盒里面的PI 也测出细胞周期呢？小妹刚开始做流式，请高手指教！

=============================================

试剂盒里面的PI加上RNAse ,等也可以测细胞周期
但不建议使用
试剂盒中PI有限
PI非常便宜，就百多块，够你们实验室用半年以上
作者: pengke1983    时间: 2012-1-30 14:30


因实验需要，利用流式细胞仪检测细胞表面细胞因子的表达时，阴性对照利用PBS清洗细胞3次以上，不加抗体的情况下上机检测出现两个峰，各位战友你们出现过这种情况吗？我应该怎么处理阴性对照才不会出现两个峰？
作者: 泡泡    时间: 2012-1-30 14:31

请教各位高人：
新鲜的心肌组织制备单细胞悬液用什么方法比较好？机械法还是酶解法？
有什么注意事项？
还有就是冰冻的组织还能不能用流式检测细胞调亡？
那位战友有相关的文献？
万分感谢！
作者: fei1226com    时间: 2012-1-30 14:32

请教各位老师，流式行骨髓细胞免疫分型，细胞分群不理想，可能的原因有哪些，如何处理？谢谢。
作者: 小螺号    时间: 2012-1-30 14:32


请教高手指点：
我是临床的研究生，现在做的课题偏基础,目前想做的是用流式细胞仪做软骨细胞的凋亡率,想通过组织块直接做(细胞培养更不会),请教取材及实验步骤,小菜鸟万分感谢!
作者: mamamiya    时间: 2012-1-30 14:33

试剂盒里面的PI加上RNAse ,等也可以测细胞周期
但不建议使用
试剂盒中PI有限
PI非常便宜，就百多块，够你们实验室用半年以上

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当然不可以，因为DNA倍体的细胞是固定后的死细胞，所有的膜都是通透的；而AV-PI双染则是染活细胞，无法获取所有细胞的DNA含量信息。
作者: zsxan1990    时间: 2012-1-30 14:33


我想请问一下,用流式细胞仪测出T细胞的CD4和CD8,一个血液样品,一个结果,
不明白如何计算得出文献中的一个指数形式,是利用数学方法求出了其范围吗?如何求解?
高人解答,不胜感激!
作者: cj_mondy    时间: 2012-1-30 14:34


请教各位高手，人外周单个核细胞过染色时需要阻断非特异结合位点吗？我用的BD的染料，期待各位的回复。。。。。。。
作者: caihong    时间: 2012-1-30 14:35


PBMC染色最好用Fc受体结合物来阻断非特异性结合
人的可以购买到
如果有的话，用不会与你要检测的东西发反应的抗体也可以

实际上国内做这一步的不多，检测结果是计数的细胞足够，你检测的细胞比例又不是非常少的话，影响也不太大
作者: cj_mondy    时间: 2012-1-30 14:35

谢谢！再请教一下，如果做不加刺激的T细胞胞内内染色（CD4+Th亚群），不用BFA之类的蛋白阻断剂对结果影响大吗？
作者: hyuu    时间: 2012-1-30 14:36

谢谢楼主,能帮我看看这张流式图中范围门怎么画吗?红色的为不加抗体的空白对照,绿色的为加APC的一抗.图中门画的位置刚好可以使空白对照组的APC阳性细胞比例为0.这种画法对吗?

图片附件: 98021569.jpg (2012-1-30 14:36, 32.8 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10361

作者: hyuu    时间: 2012-1-30 14:36


还是应该把范围门向左移?(如下图所示).谢谢指导

图片附件: 16448321.jpg (2012-1-30 14:36, 33.08 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10362

作者: 笑弯了腰    时间: 2012-1-30 14:39


你都可以看出这两种设门法的荒谬之处了吧！
背景比例基本不变但是样本比例差别巨大，这可能是客观事实吗？
这种变化特征正确的设门方法应该是把背景和样本荧光全部放进来，然后用水平门全部覆盖，观察指标由比例改为平均荧光强度MFI。
作者: misswu61    时间: 2012-1-30 14:39

请问各位高手：
我测人外周血单个核细胞上CD23的表达，用流式，免疫组化还是免疫发光法？能否将具体步骤告知，我周围同学没有做这方面的！心急如焚，恳请各位不吝赐教！！
作者: okhaha    时间: 2012-1-30 14:39


想做大规模T淋巴细胞pentamer和细胞内INF流式检测，不知北京何处做的比较好，能否提供这方面检测服务，请斑竹指点，万分感谢！
作者: mimili_901    时间: 2012-1-30 14:40


小弟刚开始做流式，目前停留在临床检测阶段，最近单位想开始做一些细胞分选工作，请教一下各位大哥，哪位有流式的分选原理及全部操作流程。
我的机器是BECKMAN公司，型号为EPICS ALTRA, 操作软件是EXPO32

事情挺着急，谢谢大家，多多帮忙了
作者: yueban-1147    时间: 2012-1-30 14:41

回复：
我近期也要做流式细胞仪，但是同实验室没有人做过，所以这方面的经验比较少，看了这里发的帖子以后明白了许多，请问细胞固定后怎么保存呢？可以保存多少天呢？因为做time course的时候不能同时收集那么多的samples，而且要排队才能做上.

       一般来讲，实验是观察不同时间点对细胞的影响，我的建议是先作时间最长的点，依次递减。譬如：观察药物作用12h、8h、4h、2h对靶细胞的影响。可以同时培养细胞，12h的药物先加入培养细胞中，过4个小时后，加入药物预定观察8h的细胞，再过4h加入到预定观察4h的细胞中，再过2小时，加入药物到2h组。这样，可以同时收集各个时间点的细胞，同时处理上机检测，避免了细胞固定或者多次检测 的麻烦。
一般来讲，固定的细胞或多或少对检测有一定影响，我比较推崇采用新鲜细胞进行检测。所以我建议还是采用上述方法，同时检测，这样的结果会更好。
在我们实验室，我曾经多次回答类似的问题，希望其它想进行不同时间检测的同道采用这种方法。

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请教，不同的时间点细胞状态不同，如何具有相比性？另外，每个时间点是不是都要设对照？对照至少几种？好像要同型，阴性，阳性对照。加药和不加药组？同型好贵，比我的直标抗体还贵。
作者: yueban-1147    时间: 2012-1-30 14:41

小弟刚开始做流式，目前停留在临床检测阶段，最近单位想开始做一些细胞分选工作，请教一下各位大哥，哪位有流式的分选原理及全部操作流程。
我的机器是BECKMAN公司，型号为EPICS ALTRA, 操作软件是EXPO32
事情挺着急，谢谢大家，多多帮忙了

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好机器啊，要好好玩，否则太浪费了。
赶紧找BC的技术支持，看manual你是不可能玩得动这家伙的。
作者: mimili_901    时间: 2012-1-30 14:42

好机器啊，要好好玩，否则太浪费了。
赶紧找BC的技术支持，看manual你是不可能玩得动这家伙的。

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感谢前辈的回帖
我没有参加过BECKMEN COULTER的系统培训,不过听以前的同事说临床检测和细胞分选从难度上说根本是两个层次的。机器已经买来近两年了,虽然我刚刚才接受做,但心里还是很着急,毕竟是资源浪费吗......
请问一下,各位前辈是否知道有流式分选开展的比较成熟的单位,最好提供一个联系方式。

谢谢
作者: yueban-1147    时间: 2012-1-30 14:43     标题: 回复 #1478 mimili_901 的帖子

不过，这样联系的效果是有限的，务必尽可能多地召唤BC的技术支持。
altra是大机器，他们不会怠慢的。如果自己摸，猴年马月都整不好。
作者: rxcc33    时间: 2012-1-30 14:44


敢问各位前辈，用流式细胞仪怎样把超出正常体积的血小板圈出来？
作者: 气泡    时间: 2012-1-30 14:44


请教各位前辈，PI单染检测凋亡时所获得的图该怎么设门？
作者: 蒲公英    时间: 2012-1-30 14:45

有没有前辈做过CFSE 染色，看细胞增殖的，小鼠脾淋巴细胞和T细胞都做过，药物诱导和刀豆蛋白刺激都没有做出好的图，试剂说明书随着细胞增殖，CFSE荧光强度应逐渐减弱，并呈锯齿状，一个锯齿代表细胞分裂一次！

急需帮助！
作者: duoduo    时间: 2012-1-30 14:45

老师、师兄师姐好，我是一个新手，我要做有关白念株菌的多药耐药蛋白，它是一个药物外排泵蛋白，不知道能否用流式细胞做？怎么做？多谢赐教，非常感激！

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是做cdr1吗?
作者: abc816    时间: 2012-1-30 14:46

各位前辈,本人准备做流式测不同药物刺激后细胞周期的变化.
只是存在一些疑问:
1.流式要用70%的乙醇固定,可固定后细胞都死了,PI都能染上色的,我只想弄清药物作用于哪个期,如果用乙醇固定了,还怎么分清药物作用呢,是否能直接染色呢,被药物作用的细胞染上了色,其他细胞不被染色
2.triton-100同样的疑问,死细胞不用TRITON-100破膜也能染上色的啊,我只想看到药物的作用,如果用了上述两个步骤,为的是所有细胞都染色,那样药物作用是否就掩盖了呢?药物不可能对所有细胞都有影响,比如说大部分细胞在s期,结果肯定是s期细胞比例大啊

不知道我的表述是否清楚,请各位前辈给予指点!
小弟不胜感激!
作者: 蒲公英    时间: 2012-1-30 14:46

请教各位高手：
下图1是检测肿瘤中乏氧细胞内的pimonidazole抗体浓度得到的直方图，作者并没有做阴性对照，而是采用其所谓的“最小二乘法（least-squares approach）”得到第2张图中的三个高斯分布图，分别代表有氧、中度乏氧和乏氧的3群细胞（随着乏氧程度加重，抗体浓度越高）。
原文的描述是这样：Univariate histograms, plotted as cell number versus logarithm of fluorescent antipimonidazole antibody intensity, were analysed by a least-squares approach for 3 Gaussian distributions representing aerobic, intermediate, and hypoxic tumour cell populations. No constraints on the positions of the distribution meanswere imposed. Therefore, the range but not absolute fluorescence intensity determined whether a hypoxic fraction could be reliably identified within cells from different tumours.
我同我们实验室的老师商量过，他也不知道。
大侠们该出手时就出手吧，帮小弟想一下，如何实现这一步。

图片附件: 94646919.jpg (2012-1-30 14:46, 33.08 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10363

作者: DDD    时间: 2012-1-30 14:47

请教各位流式细胞操作高手，我们刚进了一台BD ARIA,，但是作了几次细胞周期PI染色，效果都不好，CV值太高。今天请bd技术支持过来，他们通过调节仪器内一个按钮调节光斑（他这么说的，不知道是不是这个词）可以得到相对比较满意的图形，但是，他说这样的话，在检测免疫标记等实验时还要重新调。他们说aria在普通分析试验中不如calibur好。
不过我还是觉得，ARIA应该兼容calibur功能的，只是有可能不方便吧？
技术支持告诉我只能下次做的时候再调节硬件这个环节，
我觉得这样不仅不方便，也不是很合理，硬件是不是有一个最佳状态可以满足不同试验要求？请各位高手帮忙解惑。
谢谢
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-30 14:48

aria是怀着兼容上下五千年的理想入世的，但是已有的实践显示其高不成低不就。我上个月和四军大的老师聊过aria，按她的亲身操作体验，分选实际上还是不及经典的vantage SE和altra，分析不如calibre和fc500。中山眼科这边的aria也基本那个了。更后面的长时间实践可能证明这是一款较为失败的概念机型。

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请教各位流式细胞操作高手，我们刚进了一台BD ARIA,，但是作了几次细胞周期PI染色，效果都不好，CV值太高。今天请bd技术支持过来，他们通过调节仪器内一个按钮调节光斑（他这么说的，不知道是不是这个词）可以得到相对比较满意的图形，但是，他说这样的话，在检测免疫标记等实验时还要重新调。他们说aria在普通分析试验中不如calibur好。
不过我还是觉得，ARIA应该兼容calibur功能的，只是有可能不方便吧？
技术支持告诉我只能下次做的时候再调节硬件这个环节，
我觉得这样不仅不方便，也不是很合理，硬件是不是有一个最佳状态可以满足不同试验要求？请各位高手帮忙解惑。
谢谢
作者: is2011    时间: 2012-1-30 14:48


想要用流式PI单染测原代培养的心肌细胞凋亡，但贴壁的心肌细胞用0.25%的胰酶（含0.04%EDTA）很难完全消化下来，为保证细胞数量能否用细胞刮刀？这种机械损伤对测定影响大吗？细胞总数至少要达到多少，测定结果才较可靠？用70%的乙醇固定细胞前必须用PBS冲洗吗？谢谢回复!
作者: dotaaa    时间: 2012-1-30 14:49

想要用流式PI单染测原代培养的心肌细胞凋亡，但贴壁的心肌细胞用0.25%的胰酶（含0.04%EDTA）很难完全消化下来，为保证细胞数量能否用细胞刮刀？这种机械损伤对测定影响大吗？细胞总数至少要达到多少，测定结果才较可靠？用70%的乙醇固定细胞前必须用PBS冲洗吗？谢谢回复!

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原代心肌细胞真的很难消化，但相比细胞刮造成的损伤还是好一些，两种方法我都试过，0.25％胰酶37度消化10分钟外加反复吹打损伤大概在10％～15％，而细胞刮损伤要30％～40％。无论哪一种做法对测定都会有不小的影响，我用PI-AnnexinV测定都不敢保证结果的准确，更不建议PI单染测凋亡了
作者: is2011    时间: 2012-1-30 14:49

的确很头痛，心肌细胞本来就不好贴壁，细胞数量又不多，但测流式细胞时又得尽可能多的消化下来，吹打多了又会对细胞损伤太大，结果很不稳定。

再问：细胞总数至少要达到多少，测定结果才较可靠？有人说得达到10000，有的说>3000就可以，迷惑……
作者: HP007    时间: 2012-1-30 14:50


广州中山二院胸外科宋尔卫博士课题组将实验结果发表在最新（2007年12月14日）一期CELL杂志上，以乳腺癌细胞为研究对象，将最近热得发烫的两大主题（分别是2006年和2007年诺贝尔医学奖得奖主题）——miRNA和干细胞概念相结合。
其中大量使用流式数据，包括活性分选和SP测定是高级（大）流式系统应用的较经典战例。
cuturl('http://www.cell.com/content/article/fulltext?uid=PIIS0092867407014171')
作者: HP007    时间: 2012-1-30 14:50


使用的设备为BC公司目前最强大的EPICS ALTRA。
对应的BD公司的VANTAGE SE（也包括DIVA扩展模块）也能做出同样好的数据。
Cytomation的Moflow本来就分选而言是较上述两者更专一些，但是该公司目前已被BC并购，期待BC推出全新的顶级机型。
至于aria，限于过度超前和不实际的设计，实际应用限制太多，功能的强大程度无法赶上上述机型。
所以，有ALTRA、VANTAGE和Moflow的用户具有干细胞深入研究的最有利条件，其他同学要做细胞尤其是干细胞分选的找到这些就可以了。
作者: TAT    时间: 2012-1-30 14:52

我现在也只有遗憾了。买机器是别人说了算的，我当初也不懂, 但是我也认为普及率高的机型应该是比较好的，能够满足决大多数科研要求.
但决策者认为, 有钱就买好的，被销售人员忽悠了。
直到现在销售经理还是会说ARIA好，也许技术支持的话现在才最可信.
作者: 中国特色    时间: 2012-1-30 14:52


请教各位前辈，都说PI可以检测细胞周期和晚期的凋亡，Annexin/PI可以检测早期凋亡，但是晚期和早期的时间相差多少恩，比如细胞的周期约24H，药物作用48H即可见PI单染的亚二倍体峰，那么Annexin/PI检测时，如何选择检测时间呢！是24H,还是24H-48H之间的时间呢！
相应的线粒体膜电位、活性氧、CA浓度的检测时间呢，如何选择？
有没有做过相关方面实验的高手指点下！
作者: BOSS2011    时间: 2012-1-30 14:53


问个问题：
想做脾脏的FACS，同时还要脾脏白细胞细胞（CD4+, and CD8+）总数，可不可以不红细胞裂解，然后看白细胞占total细胞的比例。用技术板计数的总细胞X白细胞占total细胞的比例得到
作者: BUK    时间: 2012-1-30 14:53

理论上说，是可以的，实际就不一定了。不裂解红细胞，干扰可能很大。
（1）在FSC vs SSC 散点图上，淋巴细胞是否有明显的分群是个问题。
（2）除了CD4&CD8，还可以加CD3（染全部的淋巴细胞）。
（3）可以比较lysis前后的结果差别，lysis buffer 的配方在网上可以查到的。

最后，纠正一个错误：CD4+与CD8+的细胞总数和CD3+的细胞总数理论上相等，应该是淋巴细胞，而不是白细胞。
作者: qhyu    时间: 2012-1-30 14:54

我现在也在做VASP流式检测,我检索了以前有位战友有提过:|我正在做血小板VASP磷酸化的检测。枸橼酸钠抗凝血2毫升分2管后分别加ADP和ADP+PGE1(均为10uM)室温孵育10分钟后加3%多聚甲醛1毫升固定5分钟， 0.2% triton X 100打孔。 10分钟后加16C2(抗VASP的单抗)+FITC孵育30分钟后上机检测，我要检测两种状态即静息(+ADP)和激活(ADP+PGE1)态的平均荧光强度(MFI),请问接下来该如何做？应该如何设门，如何取值？要不要加CD61识别血小板？如何对照？请详细指导及说明原理，因我是外行，我们的检验师也不太懂原理。如您还未开展该技术，请帮我设计 一下。先谢赐教。"但是我一直没有找到有战友给予答复,不知有没有哪位战友指教一下..........谢谢
作者: qhyu    时间: 2012-1-30 14:54

我现在也在做VASP流式检测,我检索了以前有位战友有提过:|我正在做血小板VASP磷酸化的检测。枸橼酸钠抗凝血2毫升分2管后分别加ADP和ADP+PGE1(均为10uM)室温孵育10分钟后加3%多聚甲醛1毫升固定5分钟， 0.2% triton X 100打孔。 10分钟后加16C2(抗VASP的单抗)+FITC孵育30分钟后上机检测，我要检测两种状态即静息(+ADP)和激活(ADP+PGE1)态的平均荧光强度(MFI),请问接下来该如何做？应该如何设门，如何取值？要不要加CD61识别血小板？如何对照？请详细指导及说明原理，因我是外行，我们的检验师也不太懂原理。如您还未开展该技术，请帮我设计 一下。先谢赐教。"但是我一直没有找到有战友给予答复,不知有没有哪位战友指教一下..........谢谢
作者: 969    时间: 2012-1-30 14:55


我要做流式CD4和CD8，我们实验室不能做，要送到外面做，请问细胞先要怎么准备？
作者: ero11    时间: 2012-1-30 14:55

现在开始正式的学习流式了，我要做骨髓干细胞的鉴定，请有经验的朋友多多帮助哦！！先谢过了
表达CD105、CD73、CD29、CD44和CD166，不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR。 这个是没有什么问题的吧？
其实还是主要费用的问题了，请问做两个因子大概费用是多少呢？？
作者: 西子    时间: 2012-1-30 14:56

紧急求救,流式测凋亡实验含药培养液中血清含量多少比较合适啊?血清会干扰药物诱导肿瘤细胞凋亡的吧???
早期凋亡的Annexin单阳性对照怎么弄啊??有什么尺度说是早期凋亡吗???
对照组(裸细胞) 和阴性对照组需要双染吗,有啥区别?????
多谢了啊,请高人帮忙回答下啊!
作者: any333    时间: 2012-1-30 14:56


cuturl('http://www.bbioo.com/bio101/2007/8370.htm')
中文操作方法，写得很详细，很实用。

血清含量自己摸索，先正常加，结果不理想再调节。
单阳性对照，我没弄，不会影响结果，画象限之后，在右下的是早期调亡群。
对照组当然要双染，然后用它画象限。
作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 14:57

流式细胞术原理，大家一起学习了！！

图片附件: 67002305.snap.jpg (2012-1-30 14:57, 67.76 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10364

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 14:57


到处找关于流式细胞术的一些书籍或是资料，就是没有找到一个系统的讲解；去图书馆查书，居然全部被人借走，在阅览室看见唯一的一本，想是大家都在学习。
于是把我查到的资料发上来，方便大家作个系统的学习！
此是王书奎所著《实用流式细胞术彩色图谱》2004版。如果有看不清楚的战友可以把它下载下来，在PDF上放大了来阅读！！

图片附件: 85677441.snap.jpg (2012-1-30 14:57, 90.8 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10365

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 14:58

好像还是看得比较清楚的，就是比较费眼睛，没关系，我就是这样学习了一遍的，呵呵

图片附件: 18846492.snap.jpg (2012-1-30 14:58, 72.58 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10366

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 14:58


继续发了，如果有比较感兴趣的战友可以向我要原版的哈，大点可能比较好看点！！

图片附件: 61032680.snap.jpg (2012-1-30 14:58, 48.13 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10367

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 14:59


这是对流式原理的介绍，看了应该有个基本的了解！！

图片附件: 49949339.snap.jpg (2012-1-30 14:59, 61.07 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10368

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 14:59


下面是各种不同样本的流式细胞检测的制备方法（sample preparation and analysis of flow cytometry)：
一. 新鲜实体组织样本(fresh tissue)

图片附件: 71326785.snap.jpg (2012-1-30 14:59, 49.98 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10369

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:00

前面是酶消化法，这个是机械消化法：（照的不是很清楚了，想仔细研究的战友可以下载下来哈，放大了比较好看一点的）

图片附件: 97349892.snap.jpg (2012-1-30 15:00, 59.57 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10370

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:00

这是化学处理的方法和制备的注意事项:

图片附件: 45584651.snap.jpg (2012-1-30 15:00, 56.81 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10371

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:00


2.活检组织和内境取材样本的制备,3.石蜡包埋组织样本的制备

图片附件: 90444276.snap.jpg (2012-1-30 15:00, 77.44 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10372

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:01


4.外周血单个核细胞的样本的制备.5.骨髓组织单细胞的制备:

图片附件: 91302060.snap.jpg (2012-1-30 15:01, 72.49 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10373

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:01


6.7,培养细胞和脱落细胞样本的制备

图片附件: 78196464.snap.jpg (2012-1-30 15:01, 69.11 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10374

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:01

下面是很多战友都关心的细胞样本的荧光标记的问题,有荧光原理的介绍,检测时的注意,和最后结果的识读分析.

图片附件: 71132043.snap.jpg (2012-1-30 15:01, 62.29 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10375

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:02


原理介绍,就是照的太不清楚了,晕!

图片附件: 91940452.snap.jpg (2012-1-30 15:02, 54.86 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10376

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:02


各种荧光素的特点!

图片附件: 47291962.snap.jpg (2012-1-30 15:02, 94.13 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10377

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:04

各种荧光素的激发波长和发射波长,及用途的对照表!

图片附件: 91383848.snap.jpg (2012-1-30 15:04, 72.66 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10379

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:04

破膜剂的使用,还是也发上来吧,可能有用!!!

图片附件: 54409215.snap.jpg (2012-1-30 15:04, 70.22 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10380

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:05

使用的比较多的免疫细胞的制备.这节我想很是重要吧!

图片附件: 56797820.snap.jpg (2012-1-30 15:05, 68.24 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10381

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:05


接着昨天的继续发了!!!免疫细胞的检测原理:使用三色荧光标记的必要性,用同型对照设定"门"的方法(在双参数直方图上)

图片附件: 10295278.snap.jpg (2012-1-30 15:05, 73.86 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10382

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:06

CD4,CD8,自然杀伤细胞的鉴定检测!!

图片附件: 10618914.snap.jpg (2012-1-30 15:06, 72.52 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10383

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:06

外周血免疫细胞的检测的实用程序,及其注意事项!

图片附件: 61152364.snap.jpg (2012-1-30 15:06, 69.55 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10384

作者: 阿敏    时间: 2012-1-30 15:07


DNA样本的制备和检测!!!发到这里不知有多少战友有兴趣,这可是我专门去图书馆照的哦.找了好久才找到这本书,虽然有点老了(2004)的,但是流式还是选择比较热门的哦,而且方法很是实用!

图片附件: 26992361.snap.jpg (2012-1-30 15:07, 70.8 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10385

作者: dotaaa    时间: 2012-1-30 15:09

本人刚做了关于调亡的流式细胞，可是图谱的原始图谱调不出来，看到很多的文章都是引用的原图，不知哪位高手告诉我，该怎么样才可以打开原图，
我用画图，ACDsee都不能打开啊！
急！盼高手指点！
作者: Ao7    时间: 2012-1-30 15:09


有关FAC都额图示有很多道理，但要完全懂很难，如发表文章时用的流式图并不是原来的测图，怎么转换，请指教。
作者: skytree    时间: 2012-1-30 15:10

请教高手，流式细胞仪为什么不能用去离子水？会有什么影响？
本室Millipore去离子水本身带0.22um过滤，想偷懒就用这水。但看手册上不建议用，不知何故？谢谢！
作者: TNT    时间: 2012-1-30 15:10


请教高手流式细胞仪能否测细胞膜内外电势？
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-30 15:11

小弟用流试测肿瘤细胞膜表耐药蛋白，结果如下，请高手指点
１.对照组

图片附件: 26992361.snap.jpg (2012-1-30 15:11, 70.8 KB) / 该附件被下载次数 124
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10386

作者: woshituzhu    时间: 2012-1-30 15:11

２.实验组a

图片附件: 74511348.jpg (2012-1-30 15:11, 20.49 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10387

作者: woshituzhu    时间: 2012-1-30 15:11


实验组b

图片附件: 23405108.jpg (2012-1-30 15:11, 20.54 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10388

作者: woshituzhu    时间: 2012-1-30 15:12


问题：１．实验组间似乎没有差异
　　　２.　实验组阳性率似乎太高，和文献差距较大（采用空白对照）．　　　３.　图形的集中趋势和什么有关　

别人建议我采用同型对照，并且预测结果可能是阴性，不知是否可行
作者: yychen    时间: 2012-1-30 15:12


本人也是初次接触流式，看了些资料还是不明白，快毕业了，但课题还没完成。正在火烧眉毛之际，我想问问各位高手有没有流式测细胞内PH值的步骤？

本人将EGFP融合目的基因转入细胞内，观察目的基因对细胞PH值的影响。

先谢谢各位了！
作者: 羊咩咩    时间: 2012-1-30 15:13

我准备先用磁珠分选出CD34＋CD38—的细胞，再用流式检测所分选细胞表面的CD117和CD123。只是自己不太清楚完成分选后至上流式细胞仪检测前样品的处理步骤，根据自己上网查询的内容，，请指正：：

1. 荧光标记抗人单抗染色15 min（室温密封避光，作用时间是否准确？）
2 .PBS液洗涤2次（我还未作过，听说所提取细胞数太少，故想是否能减少洗涤次数，细胞为悬浮细胞）
3.1％多聚甲醛固定20min固定（此浓度和作用时间是否适合，还是测细胞表面分子不需这一步？）
4.上流式细胞仪检测（用我们自己的试管还是流式专用？）

所有洗涤和固定的操作是否需要在低温环境下进行，各应于？度合适呢，迷惑中。
作者: 羊咩咩    时间: 2012-1-30 15:14


还进一步想知道，所用荧光抗体的浓度，用量，PBS的用量以及多聚甲醛的量，看了某些文章上写还需要小牛血清白蛋白压背景，不知该放在哪一步，以及最后上去检测溶液应该不是多聚甲醛溶液吧，是否离心弃上清后待测溶液的液体是三蒸水呢，请原谅我的无知，谢谢！
作者: 羊咩咩    时间: 2012-1-30 15:15


还进一步想知道，所用荧光抗体的浓度，用量，PBS的用量以及多聚甲醛的量，看了某些文章上写还需要小牛血清白蛋白压背景，不知该放在哪一步，以及最后上去检测溶液应该不是多聚甲醛溶液吧，是否离心弃上清后待测溶液的液体是三蒸水呢，请原谅我的无知，谢谢！
作者: junjie05    时间: 2012-1-30 15:15


老板给了一片文献，是用流式做MDS的表型分析的，希望能够把它重复出来。
文献中骨髓液标本先用10％胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释两倍，4度冰箱过夜，第二天再加抗体上机检测，由于典型MDS患者的CD45/SSC图会表现出中性粒细胞低颗粒化（low SSC），现在做流式的老师说标本放过夜了（没有加RPMI-1640，只放在4度冰箱了）中性粒也会脱颗粒表现出low SSC，会与病态表现难鉴别，因此送来的标本当天就做了。

请问用RPMI-1640培养一晚的细胞是不是数量会多很多？对CD34＋CD45＋双阳性细胞表型的分析有什么影响？

因为在这个讨论区看了很久也没有看到谁用培养基培养了再上机检测的。

另外 斑竹能不能给我加分 ？很多帖子要积分大于一才能看，好可惜，新手还望多包含。
作者: kewanqi2011    时间: 2012-1-30 15:16

我最近在做流式，可是做了好久，总是阴性的结果，希望得到帮助：
做的是大鼠淋巴细胞内的抗原检测，大概步骤如下：
1.取抗凝血50ul,用coulter专用溶血仪器溶血，并离心去上清；
2.用4%多聚甲醛100ul固定约15分钟，用2mlPBS清洗，离心去上清；
3.加0.1%tritonX-100约50ul破膜约15分钟;
4.加带荧光表记的抗体10ul,室温避光孵育30分钟，用PBS清洗
5.加适量PBS重悬，上机检测
结果：做了好多次，总是没有阳性的结果。检测时的细胞分群还算比较理想，能够分得出淋巴细胞群，但就是没有阳性结果。已经用荧光显微镜检测过抗体没有问题。不知道问题出在哪里，还请园子里得朋友帮忙。好急呀！
不知道是不是透膜的问题呀，如果是，该怎么改进呀？
作者: xueyouzhang    时间: 2012-1-30 15:17

我想用流式检测贴壁生长的细胞膜表面抗原在干预前后的量的变化，有人建议：
1）消化时用胰酶，消化时间短一些就行；但是，我担心胰酶会影响到膜表面抗原，而且消化时间实在很难以主观把握。
2）只用EDTA消化细胞。我看了几份关于细胞凋亡检测的说明书，看到检测细胞膜表面的凋亡信号要用不含EDTA得胰酶消化贴壁细胞，我也弄不明白怎么回事了。
不知道各位高手有没有更好的方法，急盼赐教！
作者: 小野花    时间: 2012-1-30 15:18

问一个粗浅的问题：用流式做细胞分选对细胞的量有何要求？与磁珠分选方法比较，各自的优缺点是什么？谢谢
作者: fsdd817    时间: 2012-1-30 15:18


明天是我第一次做。师姐说先用PBS洗，重悬于0.5ml PBS中，再用3倍无水乙醇固定细胞。

可这样的话。1 .5ml ep管不是装不下了？实验室没有比这个稍大一点的管子啊～～ 可以减少重悬体积到0.3ml嘛？这样总体积就只有1.2ml了。。

er 这个问题 很菜。。。请帮忙！
作者: yapuyapu    时间: 2012-1-30 15:19



QUOTE:
原帖由 fsdd817 于 2012-1-30 15:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

明天是我第一次做。师姐说先用PBS洗，重悬于0.5ml PBS中，再用3倍无水乙醇固定细胞。

可这样的话。1 .5ml ep管不是装不下了？实验室没有比这个稍大一点的管子啊～～ 可以减少重悬体积到0.3ml嘛？这样总体积就只有1.2ml了。。

...

直接用流式管做就行了。
作者: pencil菲    时间: 2012-1-30 15:28


本人的实验是用脂质体法转染反义寡核苷酸到胆管癌细胞,想知道怎么用流式细胞仪来测定转染率,我们实验室的流式可以检测FITC PE ECP P25,请问我怎么标记和该买些什么抗体来检测,并简单的告诉下我原理(小弟刚刚涉及这方面),希望各位高手不吝赐教,谢谢大家了!
作者: zranqi_1    时间: 2012-1-30 15:28


请教各位老师，最近做流式，用六孔板培养8910，种板的时候总是往中间聚堆，以致无法判断细胞数目。等到收集细胞的时候，肉眼看觉得细胞不少，等收集到ep管中发现细胞特别少。我做的是加化疗药看肿瘤细胞早期凋亡。我怀疑在收集过程中包括用pbs冲洗过程中细胞大量丢失，尤其是凋亡细胞。很确定六孔板上已经没有细胞。很可能在离心过程中丢失。离心采用1500转，10分钟。而且做了好几次都出现正常细胞占90%以上，而早期凋亡基本看不到，然后小部分中晚期凋亡。请教老师，怎么在收集过程中避免细胞丢失呢？
作者: jujuba    时间: 2012-1-30 15:29

请教各位老师，最近做流式，用六孔板培养8910，种板的时候总是往中间聚堆，以致无法判断细胞数目。等到收集细胞的时候，肉眼看觉得细胞不少，等收集到ep管中发现细胞特别少。我做的是加化疗药看肿瘤细胞早期凋亡。我怀疑在收集过程中包括用pbs冲洗过程中细胞大量丢失，尤其是凋亡细胞。很确定六孔板上已经没有细胞。很可能在离心过程中丢失。离心采用1500转，10分钟。而且做了好几次都出现正常细胞占90%以上，而早期凋亡基本看不到，然后小部分中晚期凋亡。请教老师，怎么在收集过程中避免细胞丢失呢？

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用PBS冲洗离心几次，细胞就会少很多的。我一般直接用complete Medium冲洗细胞1-2次，就直接上机的，这样损失会少很多的。你试试。
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-30 15:29

请教楼主:

以DCFH-DA 为探针, 测病理模型下动物外周血内中性粒细胞的活性氧. 有什么需要注意的呢?
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-30 15:30

本人的实验是用脂质体法转染反义寡核苷酸到胆管癌细胞,想知道怎么用流式细胞仪来测定转染率,我们实验室的流式可以检测FITC PE ECP P25,请问我怎么标记和该买些什么抗体来检测,并简单的告诉下我原理(小弟刚刚涉及这方面),希望各位高手不吝赐教,谢谢大家了!

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流式检测转染效率一般可以用标记基因如GFP（可以在FITC通道被检测）而无需另外的抗体
流式的原理简单的说类似于荧光显微镜，细胞在悬液中逐个通过检测点，由激发光源激发荧光，然后通过一系列滤片将各种不同波长的发射光分开并由光电系统转化成电信号传入电脑，被软件所识别分析
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-30 15:31

请教楼主:

以DCFH-DA 为探针, 测病理模型下动物外周血内中性粒细胞的活性氧. 有什么需要注意的呢?

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检测生物学活性指标要注意保证细胞活力，不能加含固定剂的溶血素，另外DCFH-DA染色荧光很强，检测时可能不能完全根据阴性对照调节电压
作者: ha111    时间: 2012-1-30 15:33

请问这里面的各位高手：我们用标记有绿色荧光蛋白的慢病毒转染细胞后，若想检测该细胞的凋亡，应该用哪种荧光标记来检测？
这个问题一直困扰我们很久了，希望在这里找到答案！
非常感谢！
作者: 101010    时间: 2012-1-30 15:34

我现在在做外周血树突状细胞（DC）的培养，其中有一步是要用流式细胞仪检测DC的表面分子，现在出现了这样一个问题，因为我要收集的标本是逐一进行的，那我每次要送去作流式的话，只有几个，而每次开机费是50元，我觉得很不划算，是否可以待收集一半再一起作，。标记的细胞用1％ 多聚甲醛固定能保存多久，而不影响检测结果，作流式一般需要在细胞培养什么时候做最佳，如果太晚了，是不是细胞本身也有损伤，它表面的蛋白是不是会失去活性，影响检测结果，对于这个问题我该如何解决，希望你能给我一些建议，非常感谢！！
作者: u234    时间: 2012-1-30 15:34

介绍一本新书，不能下载的留条

cuturl('http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/booktoc?ID=89011951')

Flow Cytometry: First Principles (Second Edition)

Published Online: 27 Dec 2001

Author: Alice Longobardi Givan

ISBN: 0471223948 (Electronic) 0471382248 (Print)
Copyright © 2001 by Wiley-Liss, Inc.
正在摸索流式，下不了，帮忙啊，谢谢
作者: wu11998866    时间: 2012-1-30 15:35


用一家公司的抗体做CD4,CD8，非特异结合超高
写信问，他们说要做FcR受体封闭，但我们以前做从来没有做过它们，结果也很好呀，是不是非特异性结合高必须做这项呢。

是否直接用商业IgG就可以呢。
作者: one    时间: 2012-1-30 15:35


有谁知道FITC的荧光淬灭半衰期的时间？谢谢啦
作者: 生物迷    时间: 2012-1-30 15:35

我现在在做外周血树突状细胞（DC）的培养，其中有一步是要用流式细胞仪检测DC的表面分子，现在出现了这样一个问题，因为我要收集的标本是逐一进行的，那我每次要送去作流式的话，只有几个，而每次开机费是50元，我觉得很不划算，是否可以待收集一半再一起作，。标记的细胞用1％ 多聚甲醛固定能保存多久，而不影响检测结果，作流式一般需要在细胞培养什么时候做最佳，如果太晚了，是不是细胞本身也有损伤，它表面的蛋白是不是会失去活性，影响检测结果，对于这个问题我该如何解决，希望你能给我一些建议，非常感谢！！

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多聚甲醛固定后最好在24小时内完成flow
细胞培养时选择对数生长期细胞完成流氏最好！
作者: 分子式    时间: 2012-1-30 15:36


前段时间发现了这个好地方，当时看了十多页的样子，没想到今天发现，现在这个帖子还有回复！太好了！因为我有很多关于流式的问题啊；

最近做了一批三色染色，可是分析时，非常奇怪的事情出现了，GATE后，阴性对照的HISTOGRAM 上，什么都没有，这时为什么呀。（如附件所示）；

另外：7-AAD 是染DNA从而显示死细胞，而不是特定的死亡细胞的吧？

怎么根据Histogram来调荧光补偿呢？

先谢过了。

流式真难啊。。。。。。。。。以前真是低估了。。。。。
作者: guagua    时间: 2012-1-30 15:37

请教各位老师：
欲构建真核表达载体做瞬时表达，能否用流式细胞仪检测细胞内真核表达的蛋白？
作者: vvmmoy    时间: 2012-1-30 15:37

我现在要标记胞内的一种蛋白质，但是一直染不上，请问有那些方法可以使用，比如延长固定和破膜时间有用么？还有其他要注意的么？谢谢！
作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-30 15:38

新手问一个困惑的问题：流式数据分析时什么情况下需要分析平均荧光强度值？什么情况下分析占gata的百分比？这两个参数各代表什么意思啊？谢谢！
作者: zhezhe    时间: 2012-1-30 15:38


一般的是当门内百分比比较接近的时候,百分比反映不出结果差异的时候用平均荧光强度值来分析.
作者: tudou85    时间: 2012-1-30 15:38


想请教，直接荧光标记细胞表面抗原，选择PE或FITC有没有讲究，在指标一个的情况下，那个更好？
谢谢
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-30 15:39

我的试验必须要做流式细胞分析，而我又对流式一知半解，我想在加干预因素之前做流式检测细胞处于哪一期，再加干预因素，我想问一下，做流式会不会影响我的细胞的后期生长。期待答复，因为我就要写计划了，急待！
作者: ququer787    时间: 2012-1-30 15:39


请教各位：核内因子FoxP3的标记，如果没有那种公司专门的破膜试剂（如ebioscience的专用试剂），应该怎么破膜标记？用triton可以吗？谢谢
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-30 15:40


需要补假实验为发表文章，急需能做WB的E-cadherin抗体，请帮忙，西安的为好，以后有需要也可交换，我是四医大的，谢谢
作者: wsll    时间: 2012-1-30 15:43


最近在做非细胞大颗粒（有些大于100微米）的流式，calibur很容易就堵了，肯定不能用，Accuri C6也不行，Aria的300微米nozzle找不到了，各位高手请帮帮忙了，还有哪些流式仪或其他类似仪器可用？
作者: hold住    时间: 2012-1-30 15:44


各位大虾好,我想用流式细胞仪来分选树突状细胞,请问这样经标记分选出来的DC能不能继续培养?会不会影响活性?谢谢!
作者: owanaka    时间: 2012-1-30 15:45     标题: 回复 #1565 hold住 的帖子

能够继续培养, 细胞活性与流式分选原理不冲突, 当然很多因素不注意,会影响细胞的存活
作者: owanaka    时间: 2012-1-30 15:46

前段时间发现了这个好地方，当时看了十多页的样子，没想到今天发现，现在这个帖子还有回复！太好了！因为我有很多关于流式的问题啊；

最近做了一批三色染色，可是分析时，非常奇怪的事情出现了，GATE后，阴性对照的HISTOGRAM 上，什么都没有，这时为什么呀。（如附件所示）；

另外：7-AAD 是染DNA从而显示死细胞，而不是特定的死亡细胞的吧？

怎么根据Histogram来调荧光补偿呢？

先谢过了。

流式真难啊。。。。。。。。。以前真是低估了。。。。。

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你的gate 1中就几乎没有细胞啊!
作者: utt0989    时间: 2012-1-30 15:47


我想做流式细胞分选技术,我的细胞自身带有EGFP荧光,同时我想再用另一种抗体标记,类似于双标,对细胞进行分选,请问该如何做?能否有具体做的步骤,谢谢!急~
作者: plaa    时间: 2012-1-30 15:47


想请教，直接荧光标记细胞表面抗原，选择PE或FITC有没有讲究，在指标一个的情况下，那个更好？
谢谢
两个都可以,大多数人用fitc,不过不一定的,要看你的细胞表面抗原是什么,有没有现成的荧光标记的抗体卖
作者: 911    时间: 2012-1-30 15:48


请教高手:做流式分选细胞时用PBS加1%皂甙,其中的皂甙的作用是什么?
作者: idea2011    时间: 2012-1-30 15:48


请教各位高手：我准备用流式细胞仪检测处理后肿瘤细胞活性，准备用annexin v/pi染色
我的问题:1.我的肿瘤细胞是和血液中的红细胞混在一起的，是否需要把肿瘤细胞单独的分离出来后再检测，直接把混合液体进行检测行不行？
2.用流式细胞仪能不能帮助收集肿瘤细胞？
3.经过annexin v/pi染色后的细胞经过流式细胞仪后，我想再把这些细胞收集起来看细胞的生长能力和成瘤能力，染色和流式会对细胞的活性产生影响吗？
作者: toy    时间: 2012-1-30 15:49

小弟生手 请各位高手帮忙分析一下细胞周期结果
下面4图是同一细胞在不同药物处理浓度处理后48H细胞周期的结果 PI染色 图一为对照 没有加入药物 图二至四为加入药物的处理组 药物浓度依次递增 欲作细胞凋亡方面的试验
不知为何 结果中的S期越来越多 而G2期也越来越多 反而G1期越来越少 请教高手如何分析这个结果 而且CV的值是否有些大了 是否与后期软件分析有关系
前期我已经得到很明显的MTT曲线

图片附件: 10782481.snap.jpg (2012-1-30 15:49, 30.81 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10389

作者: toy    时间: 2012-1-30 15:50


图2-4

图片附件: 30164061.snap.jpg (2012-1-30 15:50, 12.65 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10390

作者: sunnyB    时间: 2012-1-30 15:50


请问各位老师，最近用吖啶橙（AO）染色后用流式细胞仪测定精子DNA遇到几个问题：1.用AO染色得到的是双荧光，但不知道背光补偿怎么调节？2.由于荧光信号不强应用线性放大，并且最大道通数到200就够了，否则图像都挤到左下一团了，但操作仪器的老师选择换到线性放大后X,Y坐标轴最大值总在1000，如何能调到200呢？3.除了以单一通道的荧光采集直方图外，怎样得到FL3/total fluorescence比值的直方图呢？
谢谢！盼复。
作者: ALALA    时间: 2012-1-30 15:51

请教一下楼主：流式如何测细菌呢？（用PI染色。）
有什么洗液清洗管道吗？
与细胞有何不同呢？
该怎么定方案呢？谢谢！
作者: ffooll    时间: 2012-1-30 15:51

我想请教您，我想做实验组和正常组的平滑肌细胞膜上表达的一种抗原的表达量的区别，流式细胞术可以做吗？就是说流式细胞术可不可以做类似于Western blot的定量呢？谢谢！再次感谢！我的理解是可以的，可是我师姐说不行。盼您给答复。
作者: newway    时间: 2012-1-30 15:52

我想用流式细胞分选仪分选CD44+/CD24-细胞，分选后剩下的细胞也能被收集吗？因为我想比较一下CD44+/CD24-细胞和分选后剩下细胞的生物学特点差异！
多谢了 ！
作者: am10    时间: 2012-1-30 15:54

我们自己设计了一个实验，要拿流式检测大鼠的CD42b、CD41a、CD62p，因为完全是自己设计，所以差了很多资料却完全没有经验，在这里想请教一下，我们使用FITC标记的抗GP Ⅱb/Ⅲa2McAb，PE标记的抗CD62p2McAb， 叶绿素蛋白标记的CD42b2McAb，来做，不知可行否，另外可以拿一管来测这三个指标么？还是需要分别检测？谢谢回答~~
作者: jujuba    时间: 2012-1-30 15:56


我想用annexin/pi法测凋亡，哪家公司的试剂可靠些。有什么要注意的地方
前辈多多指教啊
作者: one    时间: 2012-1-30 15:56

各位战友，我做流式的时候出现了一点问题，希望大家能帮忙解决一下。
就是我用阴性对照以及单标（质控管）调好电压和补偿以后，再上机检测我所要检测的指标时，整个细胞群向右上方或是左下方漂移的很厉害，具体向哪个方向漂移不定，必须重新调整电压和补偿才行，要是不调的话，整个图根本就没法看，而且结果也完全不对了。这是怎么回事呢？不知大家有没有出现过类似的情况？是因为抗体对细胞的影响太大吗？这种情况我究竟应该怎么处理呢？谢谢大家的帮忙！
作者: moonlight45    时间: 2012-1-30 15:57

各位高手：我想请教两个问题
一，目前我检测患者和健康人单核细胞表面某个CD分子的表达，其中我运用了直接荧光法三标记，其中以FITC-CD14作为单核的标志，另外两个标记目的CD分子。目前我重复了四次后，每次先通过淋巴分离液提取PMBC，然后加入抗体避光孵育40分钟，但是我做了四次健康人标本，该目的CD分子分别表达4%，70%,71%,89.2%.第一次可能是抄作因素（我个人认为，参考文献提示至少50%，甚至会100%）。但是每次检测表达量都不一致，让我确定不了正常人标准，因为我要与患者的表达想比较，患者同种疾病的标本分别为0.8%，68%，29%，78%，变化实在太大，让我觉得无法定夺。有同学认为我是没有每次调整流式管中的细胞浓度，即每管细胞个数一致导致非特异性反应，产生误差。我个人认为既然有分选标志，不会影响百分比。（因操作时没有倒置显微镜个人觉得不方便，就没每次调整细胞数量）

请求高手帮忙想想可能的原因，提个解决的办法。本人急着毕业，实验进展太慢，让人想哭。

二，本人硕士期间做的细菌，想请问有谁做过细菌的流式分选活细菌和死细菌，能否通过流式得到两者的荧光强度之比，确定活细菌与死细菌的比例。当时我问我们学校流式老师说分不出来，我怎么看文献说可以，如果可以我想补点数据。
作者: moonlight45    时间: 2012-1-30 15:57


还有第三个问题，就是关于有个免疫细胞标记的实验步骤，和我采用的有啥区别，通过这种方法能否解决细胞量不一致的问题，就是
1 取1000Uml的肝素抗凝学于FCM管中，这样我可以都确定一定的学
2 直接加入抗体10UL，避光30分钟，
3，加入溶红细胞液，去掉白色上清后，洗涤后上机检测

这是我今天在浏览帖子时看到的方法，和我采用的方法有何区别，首先血量要多少，10ul抗体够不够？能通过这种方法能否解决每次健康人以及患者细胞量不一致的问题，
作者: moonlight45    时间: 2012-1-30 15:58


各位高手：我想请教两个问题
一，目前我检测患者和健康人单核细胞表面某个CD分子的表达，其中我运用了直接荧光法三标记，其中以FITC-CD14作为单核的标志，另外两个标记目的CD分子。目前我重复了四次后，每次先通过淋巴分离液提取PMBC，然后加入抗体避光孵育40分钟，但是我做了四次健康人标本，该目的CD分子分别表达4%，70%,71%,89.2%.第一次可能是抄作因素（我个人认为，参考文献提示至少50%，甚至会100%）。但是每次检测表达量都不一致，让我确定不了正常人标准，因为我要与患者的表达想比较，患者同种疾病的标本分别为0.8%，68%，29%，78%，变化实在太大，让我觉得无法定夺。有同学认为我是没有每次调整流式管中的细胞浓度，即每管细胞个数一致导致非特异性反应，产生误差。我个人认为既然有分选标志，不会影响百分比。（因操作时没有倒置显微镜个人觉得不方便，就没每次调整细胞数量）

请求高手帮忙想想可能的原因，提个解决的办法。本人急着毕业，实验进展太慢，让人想哭。

二，本人硕士期间做的细菌，想请问有谁做过细菌的流式分选活细菌和死细菌，能否通过流式得到两者的荧光强度之比，确定活细菌与死细菌的比例。当时我问我们学校流式老师说分不出来，我怎么看文献说可以，如果可以我想补点数据。
作者: gogo    时间: 2012-1-30 15:58


请问有没人做过将组织块打散为细胞悬液，再流式细胞仪测细胞周期的？在组织块处理为单细胞悬液过程中需要用到什么酶？消化多长时间？处理之后的细胞周期检测结果可靠吗？谢谢赐教啊！！
作者: KGZ564    时间: 2012-1-30 15:59

各位高手：我想请教两个问题
一，目前我检测患者和健康人单核细胞表面某个CD分子的表达，其中我运用了直接荧光法三标记，其中以FITC-CD14作为单核的标志，另外两个标记目的CD分子。目前我重复了四次后，每次先通过淋巴分离液提取PMBC，然后加入抗体避光孵育40分钟，但是我做了四次健康人标本，该目的CD分子分别表达4%，70%,71%,89.2%.第一次可能是抄作因素（我个人认为，参考文献提示至少50%，甚至会100%）。但是每次检测表达量都不一致，让我确定不了正常人标准，因为我要与患者的表达想比较，患者同种疾病的标本分别为0.8%，68%，29%，78%，变化实在太大，让我觉得无法定夺。有同学认为我是没有每次调整流式管中的细胞浓度，即每管细胞个数一致导致非特异性反应，产生误差。我个人认为既然有分选标志，不会影响百分比。（因操作时没有倒置显微镜个人觉得不方便，就没每次调整细胞数量）

请求高手帮忙想想可能的原因，提个解决的办法。本人急着毕业，实验进展太慢，让人想哭。

二，本人硕士期间做的细菌，想请问有谁做过细菌的流式分选活细菌和死细菌，能否通过流式得到两者的荧光强度之比，确定活细菌与死细菌的比例。当时我问我们学校流式老师说分不出来，我怎么看文献说可以，如果可以我想补点数据。

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一、不知你做的什么抗原，但大多数CD分子表达即使在健康人，差异也是很大的，拿最普通的T淋巴细胞标志CD3来说，上下幅度都有百分之十几，所以要看差异至少要50甚至200个以上的样品进行统计
二、细菌分选对仪器配置有一定要求，不是所有仪器都可以
作者: KGZ564    时间: 2012-1-30 15:59

请问有没人做过将组织块打散为细胞悬液，再流式细胞仪测细胞周期的？在组织块处理为单细胞悬液过程中需要用到什么酶？消化多长时间？处理之后的细胞周期检测结果可靠吗？谢谢赐教啊！！

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可以，推荐机械法，最简单又普遍适用，会有碎片干扰结果，但如果有明显差别的话还是可以看出来
作者: gogo    时间: 2012-1-30 15:59

但是我还是弄不清楚是否因为我是没有每次调整流式管中的细胞浓度，即每管细胞个数不一致导致非特异性反应，产生误差。我个人认为既然有分选标志，不会影响百分比。能否再帮我解释一下，不胜感激，不然我还是按原来的方案接着做实验了。
作者: gogo    时间: 2012-1-30 16:00

那如何去掉细胞碎片呢？低速离心后洗？固定后的细胞能保存多久？
作者: jrwyyplt    时间: 2012-1-30 16:08


如果用酶消化法消化组织块为单细胞悬液，会不会影响到流式检测细胞周期的结果/？使坏死细胞增多？
作者: ending    时间: 2012-1-30 16:08


各位大侠，我想用流式检测脊髓里的中性粒细胞，用什么裂解液将脊髓匀浆成为单细胞悬液啊？ 有谁做过没有，请哪位大侠指点一下，不胜感激！
作者: dog002    时间: 2012-1-30 16:08

但是我还是弄不清楚是否因为我是没有每次调整流式管中的细胞浓度，即每管细胞个数不一致导致非特异性反应，产生误差。我个人认为既然有分选标志，不会影响百分比。能否再帮我解释一下，不胜感激，不然我还是按原来的方案接着做实验了。

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抗体应用中经验上抗体浓度>1ug/ml，0.1~0.5ug/10~6阳性细胞（如果是多少test的，1test足够检测1~2*10~6阳性细胞），如果细胞数太多或反应体系过大导致抗体量相对不足也会影响结果。因此如果细胞数量相差10倍以上比如慢粒高白的病人，还是应该调整细胞数的
作者: dog002    时间: 2012-1-30 16:09

那如何去掉细胞碎片呢？低速离心后洗？固定后的细胞能保存多久？

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离心可以去除部分碎片。固定后的细胞可以保存很久，理论上DNA不降解就可以，具体多少时间，几周没问题，再长没试过
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-30 16:10

各位你们好，我想用流式细胞仪检测人外周血中的血管内皮祖细胞数量，有几个问题需要高手指教：
1.取血的时候不能同时取够所需例数，不知标本能保存多少天，如何保存。
2.进行计数的时候必须要做阴性对照吗？
3.本人对流式不太懂，有人有具体的操作步骤吗？
请高手帮助，谢谢
作者: wmp1234    时间: 2012-1-30 16:11


你好！我想问下，eGFP与目的基因融合表达在细胞的表面，可否用FSM技术对eGFP进行定量呢？应该如何操作？有没有相关的文献啊？非常感谢！
作者: 大白菜    时间: 2012-1-30 16:11


1.我想做细胞周期，我的流式细胞输出的图片是这个样子的 但是凋亡的细胞不是太多，即使是大剂量组出现的凋亡也不是太多的，是不是哪个操作过程可能会导致这样的情况产生？
2.我有原始数据，请问我应该用什么流式细胞的分析软件分析的呢？还有就是最好斑竹能提供流式细胞软件分析的步骤，没有找到分析的步骤。
谢谢

图片附件: 48354867.snap.jpg (2012-1-30 16:11, 27.36 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10391

作者: yysr238    时间: 2012-1-30 16:12


流式检测抗体具体步骤是什么，要单独一步来封闭？
作者: kewanqi2011    时间: 2012-1-30 16:13


贴主大哥，你好。看了你的东西受益匪浅。我现在在实验室做annexin-v--pi双染检测凋亡，也没什么经验，还在开始阶段，想请教下，怎么调节机器的条件。我看bd上的protocol说的是，先拿处理组的双染细胞调，是这样吗？反正没怎么调好，请教下有什么这方面经验
作者: baidukk    时间: 2012-1-30 16:13


请问一下我们做流式，固定前细胞数目还比较多（试管底部可见）；但经过PBS洗过后细胞就快没了（离心管试管底部基本不可见），这是什么问题？多谢！
作者: ALALA    时间: 2012-1-30 16:13


请教各位一个很白的问题：能否用流式细胞分选仪来分离转入GFP-目的基因的细胞和未能成功转染的细胞？谢谢啦
作者: dongdongqiang    时间: 2012-1-30 16:15

分子克隆的细胞实验指南上说：在制备单细胞悬液时，由于细胞是单层生长，不能用胰蛋白酶，否则会破坏细胞表面的受体。而是采用加入1mmol/EDTA/1mmol/L EGTA的PBS（不含Ca和Mg）溶液，轻摇，收获细胞。4℃1000g离心5分钟
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-30 16:15


检测淋巴细胞内细胞因子时也要用FACS lysing solution 吗，为何有时在全血中加入FACS lysing solution 后细胞不见了，加入FACS permeabilizing solution 后细胞也看不到
作者: pengke1983    时间: 2012-1-30 16:17


在这里获益匪浅啊，近来一直想利用流式细胞仪测细胞凋亡的一些指标，比如PI染色测DNA含量，比如线粒体膜电位，但是如何分析流式细胞仪的图啊？
作者: 04906    时间: 2012-1-30 16:17

我这个实验是联合用药后测定对凋亡的诱导有没有协同效应，我不知道流式细胞仪的结果如何统计？是不是做3次以上实验后，将不同治疗方案组的结果汇总到一起，对右下象限（早期凋亡细胞）和右上象限（中晚期凋亡细胞）的细胞比例进行统计？
请高手指教。
作者: lixi559    时间: 2012-1-30 16:17


大家好，我是新来的，刚才看了一下还是不明白，我想问问你们参数是怎么设置的？
我要检测胞内蛋白SMA和GFP的双阳性，不知道红细胞裂解液都有什么要求？我要的是肝组织的！谢谢了
作者: 969    时间: 2012-1-30 16:19

我是一个40岁的临床外科医生，流式细胞术的门外汉，现在正在做乳腺癌干细胞的课题，您说“ 做荧光双标,一抗可以同时加,二抗也同时加.但是,两个一抗要不同种属来源,两个二抗用不同的荧光标记.比如说,第一个一抗为鼠抗A(单抗),第二个一抗为兔抗B;第一个二抗为抗鼠IgG(cy2标记,绿色荧光),第二个二抗为抗兔IgG(cy3标记,红色荧光)”不知是什么原因？我用FITC anti-human CD44和PE anti-human CD24标记MDA-MB-231(乳腺癌)干细胞未成功，CD44+细胞为96%，单标CD44和同标CD44CD24都差不多。我认为是CD44抗体有问题，或者诚如您说抗体为同种属来源（其他人否定此说），请百忙中抽空赐教，不胜感激！
作者: windy+++    时间: 2012-1-30 16:20

细胞只标记CD44时，CD44+=96%;细胞同时标记CD44、CD24时，CD44+CD24-=96%
作者: windy+++    时间: 2012-1-30 16:21


CD44＋CD24＋双阳性这部分比例≈3%，详情见附件


图片附件: 51731431.snap.jpg (2012-1-30 16:21, 21.7 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10392

作者: windy+++    时间: 2012-1-30 16:22


关键问题是CD44+表达太高了，没有特异性。由该图得出的结果CD44+CD24-细胞(肿瘤干细胞)为95%。这还是干细胞吗？按干细胞理论，它只是一小部分，1-3%左右。不知问题在哪里？
作者: windy+++    时间: 2012-1-30 16:23

关键问题是CD44+表达太高了，没有特异性。由该图得出的结果CD44+CD24-细胞(肿瘤干细胞)为95%。这还是干细胞吗？按干细胞理论，它只是一小部分，1-3%左右。不知问题在哪里？

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干细胞不可能就凭这两个标记鉴定的。CD44只是一个粘附分子，并非是干细胞特异性表达的。可以表达在很多细胞上，比如淋巴细胞、成纤维细胞等，而这类细胞CD24也是阴性的。
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-30 16:23

各位高手帮帮忙啊。最近用流式细胞测了细胞内的钙离子浓度，但是不会看图，结果上反映出来的数据不知道该看哪一个，该用哪个进行分析。各组之间是看P1,P2中的parent%.还是P1,P2中的mean值进行比较呢。感谢大家！

图片附件: 31717192.snap.jpg (2012-1-30 16:23, 51.64 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10393

作者: 月牙牙    时间: 2012-1-30 16:24

我是用Fluo-3AM标记的
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-30 16:26

我没有做标准曲线，所以我比较的结果都是钙离子的强度，对吗？是直接用P2的mean值比较，而不进行相应的数据处理吗？再次感谢。
作者: 月牙牙    时间: 2012-1-30 16:28

再问一个关于流式做凋亡的问题，做出来的图上有四个区域，表示凋亡早期，过渡期，晚期和死细胞。我比较凋亡情况的时候是用平均的凋亡百分数进行各组之间的比较，还是用不同凋亡时期的百分数进行各组比较。期待你的回答。
作者: jujuba    时间: 2012-1-30 16:29


请问一个问题
文章意见修回，有一条是关于流式细胞技术的
The second apoptosis assay is even more problematic in its presented form. First the figure needs the explanation what is measured (AnnexinV-FITC x-axes; PI y-axes?). Second, constant cell numbers should be shown for all dot blots. Third, the controls already have too many PI positive cells (maybe due to a too long exposition of the cells to trypsin?). Fourth, the percentage data in the lower right quadrant can't be correct, especially in the important samples with drug combinations.
这段话当中的constant cell numbers should be shown for all dot blots.是什么意思啊
作者: wsll    时间: 2012-1-30 16:29


我正在查流式检测小鼠外周血CD3.CD4.CD8的实验步骤，但很多文献里的步骤不够具体，或者有一定差异。还有一个问题，人和小鼠全血的检测方法一样吗？
我查到一篇文章的步骤还算具体，想请大家指点一下是否可靠。如下：
外周血单个核细胞的分离：取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5ml。在试管内加入淋巴细胞分离液3ml。将外周血以等体积Hanks液稀释后，轻轻加入淋巴细胞分离液上层。2000g离心20min。取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞，加入Hanks液3ml，混匀后，1500g离心5min。弃去上清，细胞加入0.5ml RPMI 1640培养基（含10% 小牛血清，50 μg/ml penicillin 和50μg/ml steptomycin）重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度。
2 不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入不同浓度的PMA（10ng、20ng和50ng终浓度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血单个核细胞，同时加入0.7µl Golgistop，37 ℃ CO2孵箱刺激4h。收集单个核细胞，分为三部分，分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10ul，室温避光孵育30min。加入红细胞裂解液（FACS Lysing Solution）1ml裂解残余红细胞，2ml PBS洗涤细胞一次。流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson)检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。采用前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。
作者: wsll    时间: 2012-1-30 16:30


还有一个问题：一般检测CD3CD4不用刺激物吧？请大家指点！谢谢！
作者: TAT    时间: 2012-1-30 16:31

各位好，我是流式新成员，在此问些基础，但对我来说很实际的难题：（还没看完67页，不知道前面有没有谈及这些的）

弱智问题1：要有多少经验才能自如用SSC VS FSC 来区分白细胞中的淋巴亚群？我经常分不开中性粒和单核，也经常分不开淋巴和碎片。再怎么加大FSC的电压，图形中还是那样。
问题2：我最近做的淋巴亚群中，应该是一群淋巴的那个位置，出现了两群分离的细胞，它们都是淋巴细胞吗？为什么会分离？怎样做才能让它们合起来呢？

作者: yes4    时间: 2012-1-30 16:33


你的SSC电压调得太高，你的图的最右边那群应该是单核，最左边那群应该是碎片，中间这群是淋巴细胞。
作者: 131415    时间: 2012-1-30 16:34

我准备做流式细胞术检测细胞内细胞因子。因为标本收集时间长，请问应该怎样处理用肝素钠抗凝后的血液标本？谢谢！
作者: baidukk    时间: 2012-1-30 16:35


你好，我最近用FACs检测细胞周期出现了个怪现象，2倍体结果区没有G2-M而在结果中确多了个4倍体结果区，这是什么问题呢，结果见图
还有在检测两种细胞周期差异时G0-G1期差异在10%以内算是有差异吗？两种细胞出峰的横坐标位置要一致才能说结果可信性较高吗？我刚接触流式，所以望站友解答疑问，感激不尽！谢谢

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作者: baidukk    时间: 2012-1-30 16:36

为什么要分析四倍体？你这种细胞会不会出现四倍体？
如果把四倍体分析去掉，你的结果就会正常的。
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谢谢版主回答第一个问题，但是同一批次做的细胞中有的就没有四倍体这一项，所有运行程序和分析程序都一样啊，这是为什么呢？（见图）
希望版主也能帮忙解决：在检测两种细胞周期差异时G0-G1期差异在10%以内算是有差异吗？两种细胞出峰的横坐标位置要一致才能说结果可信性较高吗？

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作者: xevin    时间: 2012-1-30 16:37


你好，我想请教一下，我做的是流式的三标，其中两个抗体是直标，另一种只查到间标的抗体，在实际的操作中，直标的抗体是应该和间标的一抗一起孵育呢，还是和间标的二抗一起孵育？不同公司的抗体在一起使用可以么？会产生什么问题？您推荐用哪个公司的抗体呢？（我师姐用的ebioscience，但大家说BD的更好，我比较迷茫）。不胜感激！
作者: 麦丽素1986    时间: 2012-1-30 16:37


我们用的是贝克曼的原装试剂，为什么不同病人的血需要的溶血时间不等，37度水浴有的十分钟就溶的很清亮了，有的需要20分钟，而上周有个病人的血怎么都溶不好，一个小时还是很混，全是红细胞及红细胞碎片（同时拿正常人的血做对照，12分钟就溶好了），没有办法圈门，得出来的CD3比例只有不超过10%，不知道大家是否遇到过此类情况啊，该怎么办呢，是什么原因导致红细胞如此结实呢？
注：该病人是肿瘤病人，手术后肾功能异常，BUN,CR很高
作者: 2541    时间: 2012-1-30 16:38

请教流式各通道补偿的理论值是多少？
作者: nn255    时间: 2012-1-30 16:39

由于刚刚接触这方面的知识有个问题想请教。如果我要分选肿瘤组织中的某一类细胞在用流式分选之前应该做些什么样的处理呢？
作者: 小野花    时间: 2012-1-30 16:40


哪位老师能提供流式测定ＣＤ４ＣＤ２５的操作步骤啊？
作者: baidukk    时间: 2012-1-30 16:41


新手问个菜鸟问题 ，请问BD Calibur 仪器 使用630nm的荧光时候怎么开启啊 ， Cellquest软件调荧光电压的那个界面有个four Color的选项勾了能选择FL－4 这个通道 ，然后会出现FL－4A 和 FL－4W ，如果我用annexin-APC/PI 测凋亡 是选择哪个通道啊
作者: baidukk    时间: 2012-1-30 16:41


各通道的理论补偿值 如下图

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作者: shenkunjie    时间: 2012-1-30 16:42


请教高手 最近用流式细胞仪测了蛋白含量流式细胞仪如何进行数理统计啊？
X-Mode X-mean HpX-cv 都是什么意思？如何用呀？在网上看到有人说用340lgX-Mode的值那标准差是什么啊？ 希望有个详细的!~万分感谢
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-30 16:42


初学流式，请教几个基本概念;

FL2-A ，FL2-W 中A和W的含义

FL2-H1024，FL2-H256 中H的含义，1024和256又代表什么呢。

名词“道数”是怎么定义的？
w好像代表脉冲宽度，但是脉冲宽度反映的是细胞什么特性呢？
H-脉冲高度反映细胞什么特性呢？
作者: dotaaa    时间: 2012-1-30 16:43


大家帮忙分析一下这个流式图做的对吗？BD公司流式细胞仪，横坐标：FITC anti-mouse CD8a，纵坐标：PE anti-mouse IFN-γ，谢谢！

图片附件: 29902504.png (2012-1-30 16:43, 8.36 KB) / 该附件被下载次数 8
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作者: 66+77    时间: 2012-1-30 16:44

小弟刚开始做流式不久，而且也都是在做分选，对于流式分析的图谱理解的不多，现在有这样一张图，是从paper里看到的，有几个问题
1.图上各种颜色是什么意思呢？尤其是红色区域，为什么会出现在中间？
2.关于这张图，paper里有这么一句 Lhx6-GFP+cells were isolated by FACS,and the GFP+ cells, which were ～2% of the total viable cells，想请教一下，从图上如何看出是2%呢？
问题比较弱弱，希望好心战友能给解答一下，谢谢

图片附件: 55138923.jpg (2012-1-30 16:44, 16.77 KB) / 该附件被下载次数 5
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作者: woshituzhu    时间: 2012-1-30 16:45


因为我对流式的结果分析不太明白，请教您一个问题，谢谢您指教：相同药物处理后的细胞在流式细胞周期中出现的凋亡峰代表的凋亡率与流式细胞凋亡中测的凋亡率之间有没有什么联系？谢谢！

图片附件: 38138099.jpg (2012-1-30 16:45, 14.27 KB) / 该附件被下载次数 6
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作者: woshituzhu    时间: 2012-1-30 16:46


还有Debris 和Aggregated 是什么意思？我的是美国BD公司的仪器测的，为什么我测出来的Debris是负值？
作者: kulee    时间: 2012-1-30 16:46


一般的流式多通道只提供了488，633nm的激发，但我的实验中涉及到一种蓝色荧光信号的检测，我想请问要完成哪种实验的流式仪才会配置紫外激发模块？ 有没有哪些服务商配有紫外模块，请大家为我提供信息，谢谢！
作者: bananapeople    时间: 2012-1-30 16:47


您知道如何用7-AAD检测细胞活性吗？多谢！
作者: tianmei001    时间: 2012-1-30 16:48

谢谢各位前辈的资料先
顺带提个问题，分选CD4+CD25+的Treg究竟是用磁珠分离好还是流式好？
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-1-30 16:50

caroline0701下载完以后将所有压缩包放到一个文件夹内，然后按Schoman老师的说法把每个压缩包的名称中的数字前缀去掉，解压第一个压缩包就OK了，我就是这样解决的
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-1-30 16:50


还有Debris 和Aggregated 是什么意思？我的是美国BD公司的仪器测的，为什么我测出来的Debris是负值？
debris是碎片的意思，aggregate是粘连体的意思就是说染PI时会有一部分细胞黏连在一起。
一般来说debris是不会为负值的，有可能是凋亡的值被算高了。
而且你那细胞峰太宽了，凋亡小峰也太宽了，看起来不像是凋亡峰。
也就是你的分析结果cv值太大了，这样的话分析出来的结果是不可信的。
作者: 00无名指00    时间: 2012-1-30 16:51


刚接触流式，最近就有个棘手的问题。用来做流式的一抗二抗如何选择
作者: 00无名指00    时间: 2012-1-30 16:51


实验室刚进了一台分选仪FACSAria，想了解一下相关的情况，注意事项等等。哪位好心人有什么相关的资料吗？谢谢啦！
作者: zzzz    时间: 2012-1-30 17:41

一般的流式多通道只提供了488，633nm的激发，但我的实验中涉及到一种蓝色荧光信号的检测，我想请问要完成哪种实验的流式仪才会配置紫外激发模块？ 有没有哪些服务商配有紫外模块，请大家为我提供信息，谢谢！

一般就配的是蓝光和红光，紫外可以选配，配紫外是因为要测另外几个只能用紫外测得荧光...表达不好，见谅，BD 的Aria型就能选配，别的没用过。。。
作者: zzzz    时间: 2012-1-30 17:42

各位好，我是流式新成员，在此问些基础，但对我来说很实际的难题：（还没看完67页，不知道前面有没有谈及这些的）

弱智问题1：要有多少经验才能自如用SSC VS FSC 来区分白细胞中的淋巴亚群？我经常分不开中性粒和单核，也经常分不开淋巴和碎片。再怎么加大FSC的电压，图形中还是那样。
问题2：我最近做的淋巴亚群中，应该是一群淋巴的那个位置，出现了两群分离的细胞，它们都是淋巴细胞吗？为什么会分离？怎样做才能让它们合起来呢？

我入门甚匆忙，由于种种原因，无法得到及时的指导。（我一共才接受1天的培训，而对方说，培训都是这样的。）希望大家不要笑话我，更希望得到你们的指导。哪怕只是一点点，也好过我在黑灯瞎火中摸索啊。

看图以后，觉得你FSC电压和SSC电压均过大，淋巴细胞群应在FSC轴50-100之间，SSC轴+方向，且让粒细胞群完整体现在图中，单核细胞在这两细胞群之间偏右，你图最左的大群是碎片，有可能裂解血没裂解好，还有就是没有设置阈值，造成碎片过多。
作者: zzzz    时间: 2012-1-30 17:42

流式检测大鼠CD3-FITC/CD8-PE/CD4-APC时，有几个样本的细胞呈对角线状，但是其分群还是有的，不知道怎么回事？同样

的条件，有几个样本则分群很好！见下图的简易自画图。

未命名.jpg (1779.67k) 在线查看

做完荧光补偿了么
作者: milkdog    时间: 2012-1-30 17:43


用来调节流式细胞仪的单染PI和单染Annexin V 可以用烫死后的细胞做吗？
作者: 66+77    时间: 2012-1-30 17:43

请教LZ和各位大侠：骨髓间充质干细胞的分选，抗体怎么选择？？我要分选的是FITC荧光标记的CD105（+）和PE标记的CD34（-）干细胞？？还要同型对照，感觉好麻烦啊！劳烦各位大侠帮忙！不甚感激！
作者: skytree    时间: 2012-1-30 17:43


流式细胞测量血液中的循环内皮细胞有没有哪位高人做过的？希望能够交流一下
作者: qumm1985    时间: 2012-1-30 17:44

大家好~我的实验需要我用流式细胞仪来检测DC细胞表面甘露糖受体（MR）的表达情况，即使用FITC标记的甘露糖化的BSA（FITC-Man-BSA,Sigma）来与DC细胞作用，然后用流式测定其荧光强度。由于刚刚接触流式，所以即使有参考文献也还是有几个问题不是很懂，在这里向请教楼主和各位高手：
1 文献上只提到用1mg/ml的FITC-Man-BSA在37℃孵育1h，然后用PBS洗两遍，最后重悬细胞。但是究竟是先将细胞用胰酶消化成单细胞悬浮液再与FITC-Man-BSA作用呢，还是应该在细胞贴壁的状态下与FITC-Man-BSA作用后再消化呢？
2 之前了解到PI染色法大多是用于检测细胞周期的，但文献上也有提到在最后的待测细胞悬浮 液中加入2ug/ml的PI染料，这里的作用是什么呢？一般PI染色的浓度都在100ug/ml作用，这里的2ug/ml会不会太低呢？
3 我这个实验需不需要固定细胞呢？如果需要的话用70%乙醇可以么？固定时间是多少呢？

劳烦楼主和各位高手了，万分感谢啊！
作者: duoduo    时间: 2012-1-30 17:44

我是流式新手，今天第一次做流式，结果不理想，有几个问题想向各位大侠们请教一下：
1、我测得是贴壁细胞的凋亡，我的细胞贴壁能力很强，常规要用含EDTA的胰酶消化10分钟左右才能下来，但annexin V/PI检测要求细胞要用不含EDTA的胰酶消化，这样的我的细胞几乎没办法下来，想请问各位该怎么办。。。
2、我做的是一个胞膜蛋白通道，在氧化应激情况下可以引起通道开放而导致细胞死亡，我现在在癌症细胞上检测到这种蛋白，根据文献用常规不影响细胞生长的梯度H2O2来处理细胞，然后检测是否会引起细胞凋亡或者死亡，做之前我差了些资料说消化之前细胞上清不能丢弃，要收集起来一起离心，那么残留在里面的H2O2是否会对检测结果产生影响？？
希望各位高手赐教，谢谢~
作者: 66小飞侠    时间: 2012-1-30 17:45

帮忙看看这个流式结果，为什么在G1前出现一个柱状的

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作者: kulee    时间: 2012-1-30 17:45


我想做细胞内蛋白测定。采用标记双抗的方法。由于标本来源不一，想收集一起用。是先标记抗体再固定等待上机,还是先固定保存。要测定之前才标记抗体呢？哪位仁兄做过相关的实验呢？急。是不是用甲醛和乙醇固定后可以不用打孔了呢？还是还要加tritonx100呢？谢谢
作者: Ao7    时间: 2012-1-30 17:46


楼主您好，我想检测大鼠外周血红细胞CD35，能帮我介绍一下血液标本的需求量和与处理过程吗？谢谢！
作者: remenb    时间: 2012-1-30 17:46


外周血中最多的就是红细胞，如果想检测红细胞只需要几ul的外周血标本就可以了。处理也非常简单，直接将外周血取到含有抗凝剂的PBS稀释液中就可以直接标记抗体了，注意稀释的倍数尽可能的大，最起码十倍以上。
作者: 04906    时间: 2012-1-30 17:47

帮忙看看这个流式结果，为什么在G1前出现一个柱状的
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这是用MODFIT软件分析的嘛？
门圈的都不对。
作者: tianmei001    时间: 2012-1-30 17:47

各位前辈好，我是先分离出PBMC。然后分别加药和TNF-a，三天后加HUVEC，紧接着加入抗人CD14FITC以及抗人CD45FITC，然后上流式检测HUVEC与PBMC的黏附率，但是没有结果，请问是什么地方出了问题?谢谢
作者: ququer787    时间: 2012-1-30 17:47

各位前辈好，我是先分离出PBMC。然后分别加药和TNF-a，三天后加HUVEC，紧接着加入抗人CD14FITC以及抗人CD45FITC，然后上流式检测HUVEC与PBMC的黏附率，但是没有结果，请问是什么地方出了问题?谢谢

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什么叫检测HUVEC和PBMC的粘附率？如何检测的？
作者: plaa    时间: 2012-1-30 17:48

为什么我做了几次流式检测细胞凋亡，结果包括对照组在内的每个组的早期凋亡细胞率显示的都很高，很费解!请专家指点，万分感谢！
作者: 49888    时间: 2012-1-30 17:48

流式的抗体还是挺贵的，而且有些实验用了一些稀有的抗体，下次难得再用一次，白白放着过期失效也实在可惜，希望有更多的人能够参与流式抗体的交流，因为抗体还是很抗折腾的，国内普通邮寄也不会使抗体失效。
有多余抗体的人可以将抗体贴到流式区或者试剂区以便进一步交流。
作者: october7    时间: 2012-1-30 17:49

各位大侠：
你们好！
最近在外面做流式，采用的是Beckman-Coulter公司的Epics XL 型流式细胞仪，可回来后进行数据分析时没有配套的分析软件即Expo32-ADC分析软件，不知道那位大牛有？可否发给小弟一用？
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-31 08:45

今天做的PI和Annexin V测细胞凋亡，但本人经验不足，希望大家提点意见。

图片附件: 15771239.jpg (2012-1-31 08:45, 52.22 KB) / 该附件被下载次数 11
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作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-31 08:45


第2张

图片附件: 67335153.jpg (2012-1-31 08:45, 52.27 KB) / 该附件被下载次数 6
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作者: 乌贼老弟    时间: 2012-1-31 08:45


这张是结果，但不知道应该怎么样判断结果是否理想，采集时各项参数是否调节合适，希望各位高手指点。

图片附件: 63551530.jpg (2012-1-31 08:45, 48.55 KB) / 该附件被下载次数 7
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作者: one    时间: 2012-1-31 08:47

谁能讲解几张造血干（祖）细胞的流式图片？

还有红细胞的，就是CD235a的

谢谢
作者: zranqi_1    时间: 2012-1-31 08:47

贴两张图，大家一起讨论一下：
这是我自己做的移植经标记的细胞后小鼠的骨髓（BM）和脾细胞的流式图，这里想和大家讨论的是：
1。从图来看，有没有什么问题？
2。gate设的是否理想？
3。门外靠近原点的那些难道都是死细胞吗？
4。有没有战友做过小鼠的骨髓和脾细胞的流式？细胞是这样分群的吗？
注：这里BM是经过红细胞裂解过程的，而脾细胞直接研磨后制成单细胞悬液直接上机。


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作者: zranqi_1    时间: 2012-1-31 08:48


脾脏：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10420

作者: zranqi_1    时间: 2012-1-31 10:19

BM确实看上去有两群细胞。

我的标本的处理过程已经尽量缩短，可还是有这么多细胞碎片！

另外再请教一下，在设门时究竟有怎样的原则呢？hdhdhd0000兄说门还可以更小一些，我的实验目的是检测经荧光标记的细胞比例，而且我的标记

细胞体积明显大于其他细胞，就这2张图而言，若门再小些，会不会把我的标记细胞就圈到外面去了？

碎片与细胞群的分界就根据两“团”之间的缝隙来分吗？
作者: 园丁##    时间: 2012-1-31 10:22


1,关于细胞碎片，如果是在固定前，则操作要尽可能轻柔，固定后则要求稍微松些。如不固定则同固定前。离心要<1000转－5min，要是细胞数够的话，试试800转（实际上说转速是不科学的，应该讲离心力！）
2，关于gates，如果处理的好，目的细胞在前、侧向角上成团较好，则gates可小些，反之当然相应大些，否则影响结果！
3，你要区分碎片和正常细胞，可以在分析的时候，用其它散点图做gates反过来看fsc/ssc的散点图，可以知道哪是碎片，哪是细胞。如果你做的是DNA，可以用荧光2的高度来区分，具体方法前面讲过。其实就是您说的细胞团间的间隙，但有很大的主观因素，因此平时分析时想办法找到合适的分界线！
还有，其实流式细胞术专区有许多高手，可以向他们请教的：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=43649&sty=1&tpg=1&age=-1')
作者: newway    时间: 2012-1-31 10:24

造血干（祖）细胞的流式分析比较复杂，三言两语说不清，请参考流式细胞术彩色图谱48～55页！说明非常详细！

=============================

流式细胞术彩色图谱 哪里找呀？
作者: ladyhuahua    时间: 2012-1-31 10:25

近这里怎么门庭冷落？
贴两张图，大家一起讨论一下：
这是我自己做的移植经标记的细胞后小鼠的骨髓（BM）和脾细胞的流式图，这里想和大家讨论的是：
1。从图来看，有没有什么问题？
2。gate设的是否理想？
3。门外靠近原点的那些难道都是死细胞吗？
4。有没有战友做过小鼠的骨髓和脾细胞的流式？细胞是这样分群的吗？
注：这里BM是经过红细胞裂解过程的，而脾细胞直接研磨后制成单细胞悬液直接上机。

BM：

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我觉得你门有一点划得太大了。关于门的画法，一般认为应该尽可能把要分析的目标细胞包括进来。当然太大就会带入很多不符合要求的细胞，比如说一部分细胞碎片，还有粘连的细胞团。在你的图上可以看到左下角的细胞群基本上是细胞碎片，而右上方的零星细胞多为粘连在一起的“大细胞”，“大细胞”在散点图上表现为很分散，数量少，其原因是这些“大细胞”只有少数能够通过检测喷嘴。
因此一般在散点图上画门时只需要把中间的细胞密集的地区画入即可，其目的是使画入的细胞群能够基本代表所需要分析的细胞特征。

在您的图片上前向角（fsc）可以画到800以下（个人观点）。
作者: chuntian1983    时间: 2012-1-31 10:26

細胞: saos-2 (p53-/-)
condition: cell infected label adenovirus 36hr, pi stain

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10421

作者: 00无名指00    时间: 2012-1-31 10:27

这是我做的凋亡细胞PI染色，请高手们指教

图片附件: 51277831.jpg (2012-1-31 10:27, 46.15 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10422

作者: 00无名指00    时间: 2012-1-31 10:27


第二张

图片附件: 54824790.jpg (2012-1-31 10:27, 56.07 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10423

作者: 00无名指00    时间: 2012-1-31 10:28


第三张

图片附件: 78501733.jpg (2012-1-31 10:28, 54.79 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10424

作者: 园丁##    时间: 2012-1-31 10:33

如上三张图都是用PI染DNA以检测细胞凋亡及细胞周期。用Modfit分析细胞周期是国际上比较认可的方法。

三张图的凋亡都比较多，但遗憾的是与G1峰分得不是很开，因此，Modfit分析的时候，会根据您的结果用统计学原理将它们分为Apo和G1，但这样可能掩盖真正的结果！

建议做PI染色的时候，在PBS洗两次后，加入PC buffer，这是一种轻破膜剂，可以使断裂成小片断的DNA出细胞而降低其在FL2-Ad上的值，这样就容易区分G1和APO了。

另：没有看到对照，因此，不好说实验结果如何。
作者: cj_mondy    时间: 2012-1-31 10:33

下面是对照和另外三张测定凋亡的

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10425

作者: cj_mondy    时间: 2012-1-31 10:34


第二张对照

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10426

作者: cj_mondy    时间: 2012-1-31 10:34


第三张对照

图片附件: 25795333.jpg (2012-1-31 10:34, 25.27 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10427

作者: cj_mondy    时间: 2012-1-31 10:35


第一张测定凋亡

图片附件: 82595115.jpg (2012-1-31 10:35, 21.52 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10428

作者: cj_mondy    时间: 2012-1-31 10:35


第二张测定凋亡

图片附件: 89085642.jpg (2012-1-31 10:35, 22.53 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10429

作者: cj_mondy    时间: 2012-1-31 10:37


第三张

图片附件: 13612287.jpg (2012-1-31 10:37, 20.81 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10430

作者: bananapeople    时间: 2012-1-31 10:38

对照很好，特别是第一张，cv值不错，凋亡率控制得也不错！

三张凋亡特别是第三张非常明显，而且峰也很漂亮。

唯一的美中不足就是凋亡峰的位移稍低，如能用PC buffer 轻破膜，效果将更漂亮！请查阅cnki中关于Sub-G1法测凋亡的关于PC buffer的使用方法（用作者：龚建平 关键字：Sub-G1查），将对您的实验有很大帮助！

好运！
作者: summerxx    时间: 2012-1-31 10:38

我之前做过一次流式，但是整个曲线呈现锯齿状，不过各个期也能区分出来
这是因为细胞状态不好吗？

另外如果mtt作出来的抑制率，24h是10% 48h是30% 72h60% 96h62%
那选取那个时间作流式比较合适呢 我现在取得是72h

谢谢指点
作者: 101010    时间: 2012-1-31 10:38

请问
如果做 干细胞的流式鉴定
细胞如何处理 ？
另外，群友有成熟的检测方法和标记吗？
我打算用 CD34 44 106
作者: leifengta    时间: 2012-1-31 10:39


要预答辩了,我的细胞周期分析,modifit
不知凋亡细胞为什么没和G1期分开?我用这个答辩行么?本人不想造假

图片附件: 16528679.jpg (2012-1-31 10:39, 20.65 KB) / 该附件被下载次数 7
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作者: leifengta    时间: 2012-1-31 10:40

这个是对照

图片附件: 85564101.jpg (2012-1-31 10:40, 20.07 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10432

作者: tuuu2    时间: 2012-1-31 10:42


我用的是muticycle，所以不太能确定。但是不管是哪家的软件，都是按一定的数学模型（公式）结合数据进行模拟，所以在数据分布不够典型的时候是会产生很大误差的。就像你的结果，我根据经验判断是modfit强行进行subG1计算，其实算进去的基本上都不是凋亡细胞，但是它没有模糊概念，生硬地套用了subG1的模拟方程，所以才有“subG1”的出现。如果你对sample只进行one cycle模拟，结果会不一样的。个人建议，除非subG1和G1分隔干净利落，否则不要随便应用cycle软件进行模拟，否则大部分结果是错误的，cycle软件本质上说适合作周期分析，作AP分析有较为严格的限制。直接拉水平门就可以了。
作者: 园丁##    时间: 2012-1-31 10:42


新做的API

图片附件: 99841584.jpg (2012-1-31 10:42, 11.95 KB) / 该附件被下载次数 10
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作者: tie8    时间: 2012-1-31 10:49


贴几张做的PI凋亡分析图:
1\对照:

图片附件: 98567258.jpg (2012-1-31 10:49, 16.9 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10434

作者: tie8    时间: 2012-1-31 10:50


2\设门

图片附件: 20063542.jpg (2012-1-31 10:50, 40.61 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10435

作者: tie8    时间: 2012-1-31 10:50


3\样品:
感觉以碎片为主,SUB-G1不明显,这样的图用M1分析好像没有意义,要如何分析?

图片附件: 90058775.jpg (2012-1-31 10:50, 15.67 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10436

作者: tie8    时间: 2012-1-31 10:50


4\另一样品:

图片附件: 41889803.jpg (2012-1-31 10:50, 15.95 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10437

作者: ha111    时间: 2012-1-31 10:52

DNA含量图：

====================================================

请问怎样看出峰形4是异倍体的G0/1峰，而不是G2/m期的峰哪？
作者: ha111    时间: 2012-1-31 10:54

而有时凋亡和坏死同时存在。如下图：蓝色的为apo峰（第一个三角），而白色的为坏死峰。第二个三角为G0/G1峰。第三个为异倍体G0/G1峰。

=============================================================

还是同样的问题，第三个为异倍体G0/G1峰，为什么不能看作G2/M期的峰哪
作者: join    时间: 2012-1-31 10:54

这是我门在北京做的流失结果，是药物诱导肿瘤细胞凋亡的，
看了前面的分析我感觉是我的细胞坏死和凋亡都有阿，之前固定前离心的时候我用了2000转5分钟 ，会不会把细胞都弄破了呢？可是我们同学有用1000转5分钟 的，结果只有明显的周期阻滞而没有凋亡，我们以为是因为转速太小而没有把凋亡的细胞收集上。请斑竹帮忙分析一下吧，到底要用多少转速阿，谢谢！！

图片附件: 70123958.gif (2012-1-31 10:54, 36.79 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10438

作者: join    时间: 2012-1-31 10:55

再发一张，方便大家看，

图片附件: 99598917.jpg (2012-1-31 10:55, 47.04 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10439

作者: 爱老虎游tt    时间: 2012-1-31 10:56

这是我门在北京做的流失结果，是药物诱导肿瘤细胞凋亡的，
看了前面的分析我感觉是我的细胞坏死和凋亡都有阿，之前固定前离心的时候我用了2000转5分钟 ，会不会把细胞都弄破了呢？可是我们同学有用1000转5分钟 的，结果只有明显的周期阻滞而没有凋亡，我们以为是因为转速太小而没有把凋亡的细胞收集上。请斑竹帮忙分析一下吧，到底要用多少转速阿，谢谢！！

==============================================================================================================

我个人认为，转速不要太快了，很容易把细胞损坏了，甚至弄破死亡，我一般做都用1000转3－5分钟就OK了；你的第二张图最左边的峰应该是死细胞峰，第三张图最左边的宽峰应该就是凋亡峰了。其余两张两者都有。
作者: wmp1234    时间: 2012-1-31 10:57


大家好！我是一名新手，最近做了一点药物对细胞周期的影响，但是不知道这种图能不能用，结果怎么分析，请高手指点。这是对照。

图片附件: 63471933.jpg (2012-1-31 10:57, 59.75 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10440

作者: wmp1234    时间: 2012-1-31 10:57


这是药物处理图片。

图片附件: 22006461.jpg (2012-1-31 10:57, 60.23 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10441

作者: 2541    时间: 2012-1-31 10:58


我用伽玛射线诱导脾细胞凋亡，凋亡率目前最高是30％，不知道那位同仁做过此类实验，凋亡率有没有到达60％的，早期凋亡率。多谢！

图片附件: 74178387.jpg (2012-1-31 10:58, 57.33 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10442

作者: is2011    时间: 2012-1-31 11:40

请问：准备用Annexin V、PI双染法用流式细胞仪检测凋亡：用培养瓶养肿瘤细胞，在用胰酶消化细胞之前，用预冷PBS液清洗培养瓶内细胞，以去除剩下的血清，然后消化，离心，冷PBS洗3遍，离心，加染色剂上机检测。下面是我的同一份标本不同分析条件下的结果。 请高手们帮忙分析一下

图片附件: 32986240.png (2012-1-31 11:41, 16.47 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10443

作者: is2011    时间: 2012-1-31 11:41


下面这张图片是PI单染周期分析的结果，和凋亡检测是同一次实验的细胞样品，前面的处理一样，加入70%的乙醇固定，4度放置了3天，才上机检测。下图是同一份标本，技术员给的不同条件的检测结果，大家帮忙分析一下。谢谢！

图片附件: 71534220.png (2012-1-31 11:41, 20.37 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10444

作者: 园丁##    时间: 2012-1-31 11:42

直接把图片上传到某个网站，然后将图片的url用[img][/img]的方式帖上来看！
尽量不用doc等附件的形式，以免染毒等麻烦！
作者: zhezhe    时间: 2012-1-31 12:21

这是我门在北京做的流失结果，是药物诱导肿瘤细胞凋亡的，
看了前面的分析我感觉是我的细胞坏死和凋亡都有阿，之前固定前离心的时候我用了2000转5分钟 ，会不会把细胞都弄破了呢？可是我们同学有用1000转5分钟 的，结果只有明显的周期阻滞而没有凋亡，我们以为是因为转速太小而没有把凋亡的细胞收集上。请斑竹帮忙分析一下吧，到底要用多少转速阿，谢谢！！

================================================================================

和离心转速关系不大，分析一下其他原因吧，我也是做凋亡的，1000－2000转每分5分钟都没有问题。
作者: zhezhe    时间: 2012-1-31 12:22

下面是我用直线加速器照射200rad剂量后孵育12小时测得的凋亡图，凋亡率40％，坏死率13％，重复几次基本上都是40％多，增加照射剂量凋亡率也没有明显增高，有没有那位同仁获得接近60％凋亡率的，希望给予指点意见。

图片附件: 44781659.snap.jpg (2012-1-31 12:22, 43.87 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10445

作者: tuomu45    时间: 2012-1-31 12:23


大家好:这是我的流式结果，我认为我的细胞应在G1期较多．我觉的这个结果不妥，请您指教！等候回话，谢谢！


图片附件: 61063587.gif (2012-1-31 12:23, 13.12 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10446

作者: zhezhe    时间: 2012-1-31 12:24

第2张

======================================================================================================

我做过大鼠脾淋巴细胞凋亡检测，摸索条件两个月，经流式仪技术员多次指点，得出几点心得：
1.待测细胞的获取要无菌，污染的细胞对凋亡率影响很大。
2.细胞制备过程中要尽量减少物理性损伤，物理性损伤细胞在流式图上主要集中在左上象限，正常情况下该区是没有荧光信号的。
3.诱导凋亡的方法很多，在施加某种处理因素后，要寻找最佳的孵育时间以 获取最高的凋亡率。
4.细胞洗涤液中可以添加适量血清，以减少洗涤过程中对细胞的损伤。
5.右下象限代表凋亡细胞，右上象限代表双阳性细胞即坏死细胞，左下象限代表正常细胞。左上正常情况下没有荧光信号。
6其计数原理：计数一万个细胞，再计数凋亡细胞坏死细胞正常细胞分别所占比例。
7.按照凋亡试剂盒说明书加入合适浓度试剂，选择合适孵育时间。不同地试剂盒要求不尽相同。
个人意见，仅共参考，希望和大家一起交流学习。
作者: kulee    时间: 2012-1-31 12:25

请问G0/1,G2/M,S区是根据什么区分的？不好意思。。。初次接触流式。。。先谢谢了！
-------------------------------------------------
横坐标：荧光2的面积
纵坐标：荧光1的高度
图中，我将要观察的细胞分成6个区。
R1~3为viable:
R1：G0/G1
R2: G2/M
R3: S
R4~6为early apo
R4: G0/G1
R5: G2/M
R6: S
作者: kulee    时间: 2012-1-31 12:25


大家好，我是新手。。。第一次做流式，分析遇到问题了。。请问这个图怎么解释？001是阴性对照，002是转染试剂对照，003是空载体对照，004是带目的基因的载体转染细胞。。。。感觉区别不大啊。。。555
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-31 12:26

而有时凋亡和坏死同时存在。如下图：蓝色的为apo峰（第一个三角），而白色的为坏死峰。第二个三角为G0/G1峰。第三个为异倍体G0/G1峰。

===================================================================================

不明白，第三个三角位置不刚好是第二个的二倍吗？？为什么是异倍体G0/G1峰，而不是G2/M呢？请教
作者: 黄花菜    时间: 2012-1-31 12:26


接上贴

图片附件: 84406901.jpg (2012-1-31 12:26, 25.69 KB) / 该附件被下载次数 5
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作者: 黄花菜    时间: 2012-1-31 12:27

DNA含量图：

这张图能否这么解释？
最右的三角是G2/M，4号峰是G0/G1，3号峰是凋亡，1、2号峰均为碎片。
我不懂，请教各位


图片附件: 69536647.jpg (2012-1-31 12:27, 26.89 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10448

作者: 黄花菜    时间: 2012-1-31 12:27

以上5张图片及以下部分图片来自流式彩色图谱一书，部分是我做实验的结果。

Apoptosis 和 necrosis 的区别：
下图为坏死图。坏死的位于G0/G1峰前的峰形为从左至右的反抛物线形。如下：

==================================================================================

为什么坏死峰形不对称，而凋亡峰形对称，仅靠此就能区分两者吗？

图片附件: 71963973.jpg (2012-1-31 12:27, 18.6 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10449

作者: 黄花菜    时间: 2012-1-31 12:28

未固定细胞样品染色后存放时间对细胞表面标志检测结果的影响：
左图：染色后马上上机————细胞集中，阳性率高
右图：4度5h后上机————分散，阳性率低

=====================================================

如果固定的样品染色后存放，时间的影响是否不会这么大了？？？

图片附件: 66293558.jpg (2012-1-31 12:28, 23.19 KB) / 该附件被下载次数 7
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作者: 黄花菜    时间: 2012-1-31 12:28

而有时凋亡和坏死同时存在。如下图：蓝色的为apo峰（第一个三角），而白色的为坏死峰。第二个三角为G0/G1峰。第三个为异倍体G0/G1峰。

=============================================================

请问图中紫色区域是什么？就是apo峰下面趴着的那一带状区域，请指教

图片附件: 76436793.jpg (2012-1-31 12:28, 25.69 KB) / 该附件被下载次数 8
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作者: greenbee    时间: 2012-1-31 12:29

这张图能否这么解释？
最右的三角是G2/M，4号峰是G0/G1，3号峰是凋亡，1、2号峰均为碎片。
我不懂，请教各位

===============================

根据经验，同意你的判断。
如果有对照组周期图就一目了然了。
作者: greenbee    时间: 2012-1-31 12:29

为什么坏死峰形不对称，而凋亡峰形对称，仅靠此就能区分两者吗？

============================================================

坏死峰形不对称，而凋亡峰形对称是理论上的一种看法，实践中很不一定。
仅靠此不能区分两者。
作者: greenbee    时间: 2012-1-31 12:30

如果固定的样品染色后存放，时间的影响是否不会这么大了？？？

======================

也尽量不要overnight。
作者: greenbee    时间: 2012-1-31 12:31

请问图中紫色区域是什么？就是apo峰下面趴着的那一带状区域，请指教

==============================================================================================================

周期分析软件也不是完全的“傻瓜机”，在遇到相对复杂的峰形分布，比如说多于一个周期分布的时候会要求操作者自行选择按哪种模式进行分析。
这个例子里面的分布其实并不复杂，就是一个周期加一个AP，有可能操作者使用机器默认的选定模式，趴着的紫峰明显是错误的分布计算结果。
作者: ending    时间: 2012-1-31 12:31


刚做的流式，发几张图片请高手帮忙分析，细胞调亡情况
第一张，

图片附件: 70974490.png (2012-1-31 12:31, 24.44 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10452

作者: ending    时间: 2012-1-31 12:32


第二张，

图片附件: 52364325.png (2012-1-31 12:32, 57.09 KB) / 该附件被下载次数 6
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作者: ending    时间: 2012-1-31 12:32


第三张，

还有应该如何做荧光补偿，在WinMDI这个软件中可以做补偿么？
请大家帮忙分析一下，处理过的细胞调亡有什么变化啊？
总共收集20000个细胞。

刚接触流式一周时间，又很多要向大家学习的，请多多指教，谢谢！

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作者: pengke1983    时间: 2012-1-31 12:33


请问各位高手从这个流式表中可以看出细胞各周期分布吗？
一般怎么知道细胞的确切分布比例呢

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作者: Ao7    时间: 2012-1-31 12:33

流式测钙的图应该是什么样子呢？急求！
作者: 04906    时间: 2012-1-31 12:33


紫色峰微凋亡峰
作者: dog002    时间: 2012-1-31 12:34

请问楼主
这是我做的一个RNAi后，检测是否引起凋亡的试验。
请教一下，这个凋亡水平，有意义吗？～
谢谢您！～

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作者: 04906    时间: 2012-1-31 12:34


流式细胞仪册细胞周期，测出个其细胞后怎么分析各期所占比例是否正常，有没有一个正常标准范围？怎么知道细胞阻滞于哪一期？非常疑惑！谢谢！
作者: 小野花    时间: 2012-1-31 12:35

下面是我为了了解大鼠外周血T细胞CD亚群CD4/CD8比值所做的流式分析图。但对于图的详细解释不太清楚，在此请教大家。对四个图所表示的意思、四个图的纵横轴的含义、每副图内的不同区域等都希望能给一个详细的解释，或者帮着指点一些参考文献或书籍也行。谢谢

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作者: 园丁##    时间: 2012-1-31 12:35


R1为淋巴细胞群体，是您的目的细胞群体，针对这一群细胞进行分析！
右上角的图片是CD4和8的双荧光检测。右下象限是CD8单阳性，左上是CD4单阳，右上为二者双阳，左下为双阴。比例如图。
剩下的二图为CD4、CD8直方图。实际上用刚才的双标也可以看出比例来。不要也罢。
作者: vivian4123    时间: 2012-1-31 12:36


我的细胞周期结果,不知道怎么分析,请大家帮帮我，我是要看药物是否把细胞阻止在G1期，g1期是有变化，但是为什么s期很多都是0啊，图是阴性，其它从上到浓度依次增加，我发现g1期有明显的变化，可是s期的却很奇怪?这个结果能用吗。
作者: okhaha    时间: 2012-1-31 12:36


这是我做的胃癌细胞株SGC7901的流式检测，请大家帮我看看结果是否OK？谢谢各位了~~~


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作者: DDD    时间: 2012-1-31 12:37

PI单染测细胞凋亡，加药后培养时间很重要，比MTT测出来的时间要少很多才能做出典型凋亡峰。FL2-H对数图在二倍体峰前有一峰，与二倍体峰不能相隔太远，太远则考虑为碎片。FL2-A图亚二倍体峰应比较对称，最好不是因设门而形成的“偏峰”，随加药时间的增加（以小时或30分钟计），亚二倍体峰会逐渐向左移。部分细胞对某些药物敏感，基本上做不出典型凋亡峰。

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作者: guagua    时间: 2012-1-31 12:38

刚做了一个流式，初步接触周期的操作。直方图形状还挺好的，可用分析软件分析出来，只有G0/G1期，S和G2都是0，debris和aggregate占好大比例，更夸张的是，RCF100多。。。。
请教下是什么原因。
作者: zhenxin    时间: 2012-1-31 12:38


有没有人有兔骨髓间充质干细胞的CD90 CD44 CD34 CD45 的流式图片呀？请问怎么分析？
作者: woshituzhu    时间: 2012-1-31 12:39

请教高手，图片中做得是外周血单个核细胞（PBMC）的分析，不知道左边的那群细胞是什么细胞？

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作者: loli    时间: 2012-1-31 12:39

请问谁能把黑白的图变成彩色的图,谢谢：）

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作者: mamamiya    时间: 2012-1-31 12:40

请各位高手帮我分析一下怎么看这流式细胞凋亡，谢谢！
标本部位是脑组织，检测一种止血剂对脑组织是否有影响。

图片附件: 95276545.snap.jpg (2012-1-31 12:40, 35.87 KB) / 该附件被下载次数 8
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作者: mamamiya    时间: 2012-1-31 12:41


继对照组生理盐水

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作者: baidukk    时间: 2012-1-31 12:41


请问双染流式分析图中的四个象限是怎么分的，那两条线是根据什么画的啊？
作者: lagua123    时间: 2012-1-31 12:42


我的这个为什么有异倍体峰？不加药的对照没有这个峰的， 为啥加药后就有这个了？
请问是不是细胞固定过程中出现的这个问题，应该不会啊，因为同一批我处理了好几瓶呢!

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作者: zwsyrt    时间: 2012-1-31 12:42

请问我的fsc /ssc我的怎么是这样了，我用的是winmdi

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作者: eric930    时间: 2012-1-31 12:43

细胞70%乙醇固定过夜，PI染色，30min后上机，flowjo做的直方图，想分析DNA异倍性，可是不懂，求高手指教！感激不尽

图片附件: 54925774.png (2012-1-31 12:43, 21.68 KB) / 该附件被下载次数 11
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作者: yysr238    时间: 2012-1-31 12:43


流式测定化疗药物作用肿瘤细胞后，p-gp蛋白的变化，可否详解下步骤和注意事项，谢谢



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