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标题: [分享贴]细胞培养减少污染的小细节 [打印本页]

作者: dongdongqiang 时间: 2012-1-27 11:15 标题: [分享贴]细胞培养减少污染的小细节

很多实验者都不bother自己洗手，酒精一喷就去实验了。我告诉大家，这极端错误
个人经验是，你仔细洗手比喷酒精效果还好。最好的是肥皂/香皂仔仔细细的洗手，一直到手腕，指甲缝都要洗。洗两遍是一个不错的选择。然后手上喷酒精，
有人穿半截袖的白大褂去做实验，每次我看到都想骂。白大褂袖口要长，最好是袖口扎紧的那种，如果不能的话，把袖口窝向手臂。裸露的手腕部分一定也要喷酒精。戴上手套后手请避免接触工作台外面，如果不得已接触，那再喷酒精。宁可手套酒精味多一些。
拿培养瓶和培养液时候请托下面拿，切忌不要拿瓶颈部位。
每天实验开始时候，超净台/实验间照20分钟紫外是不错的选择
有一点要注意的是，超净台里面的东西一定要尽量少放。放的越多越容易污染
尽量避免操作时候说话，尤其是严禁细胞房打闹说笑。
每天观察细胞状态，不要总想着save，而是发现细胞不对劲（比如生长缓慢）就立即扔掉。有些（比如支原体）污染，镜检是看不到的，但是细胞的生长异常。所以如果细胞生长异常，那么请扔掉，同时由于支原体空气传播，请检查自己的培养液和培养箱是不是污染。

注意：很多人有个误区，认为进口血清都是贵，其实不然。GIBCO的 NCS，马血清，都比国产的便宜的多，质量好的多。只有FBS才很贵，
很多时候国产血清往往是污染源，所以用国产血清要严格监控状态。

作者: xevin 时间: 2012-1-27 11:16

做实验应该戴一次性手套吧，怎么会洗手什么之类的，不明白？

作者: zhezhe 时间: 2012-1-27 11:17

真的很奇怪，楼主做细胞试验不戴一次性的无菌手套吗？

作者: abc816 时间: 2012-1-27 11:18

很多实验者都不bother自己洗手，酒精一喷就去实验了。我告诉大家，这极端错误
个人经验是，你仔细洗手比喷酒精效果还好。最好的是肥皂/香皂仔仔细细的洗手，一直到手腕，指甲缝都要洗。洗两遍是一个不错的选择。然后手上喷酒精，
有人穿半截袖的白大褂去做实验，每次我看到都想骂。白大褂袖口要长，最好是袖口扎紧的那种，如果不能的话，把袖口窝向手臂。裸露的手腕部分一定也要喷酒精。戴上手套后手请避免接触工作台外面，如果不得已接触，那再喷酒精。宁可手套酒精味多一些。
拿培养瓶和培养液时候请托下面拿，切忌不要拿瓶颈部位。
每天实验开始时候，超净台/实验间照20分钟紫外是不错的选择
有一点要注意的是，超净台里面的东西一定要尽量少放。放的越多越容易污染
尽量避免操作时候说话，尤其是严禁细胞房打闹说笑。
每天观察细胞状态，不要总想着save，而是发现细胞不对劲（比如生长缓慢）就立即扔掉。有些（比如支原体）污染，镜检是看不到的，但是细胞的生长异常。所以如果细胞生长异常，那么请扔掉，同时由于支原体空气传播，请检查自己的培养液和培养箱是不是污染。

注意：很多人有个误区，认为进口血清都是贵，其实不然。GIBCO的 NCS，马血清，都比国产的便宜的多，质量好的多。只有FBS才很贵，
很多时候国产血清往往是污染源，所以用国产血清要严格监控状态。

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忍不住还是要argue一下，虽然说得的确很有道理。
1，反复的洗手加喷酒精，为什么不带乳胶手套？夏天还好，冬天如何？男生皮糙肉厚还好，女生细皮嫩肉如何？不要说乳胶手套贵，比起反复的仍细胞便宜得多。
2，白大褂真的有那么干净吗？我一般都不穿白大褂，尤其夏天，热是其一，没必要是其二，穿白大褂那是为了防护自己。
3，超净台照紫外是步骤一，吹20分钟是步骤二，步骤二的重要性远大于步骤一。
4，说话对细胞培养是没有任何影响的，只要不影响到你的操作。大家一起边做细胞，边聊天，其乐无穷。
5，我倒认为save是做细胞的一条基本原则。至于细胞生长异常要具体问题具体分析，有些细胞你是仍不起的。

呵呵，尖锐些，别介意。
实验小心一些是好，但不要因而缩手缩脚，会吓走一批人

作者: 盼盼 时间: 2012-1-27 11:18

我是一个可悲的细胞培养者，细胞把我折磨到疯了，虽然不污染，但是就是长得不好

PS：我只说一点吧，不要直接酒精喷手就操作，戴手套绝对是最佳选择。

作者: whitesheep 时间: 2012-1-27 11:19

不是很同意楼主的意见。我养细胞从没污染过，从肿瘤细胞到间充质干细胞到神经细胞，一直很成功。现把我的程序说说，希望给学弟学妹一点经验：
1、注意实验室卫生，每周消毒液拖地板一次，擦所有工作台面一次。
2、实验前，实验室、生物安全柜紫外消毒。
3、进入实验室，穿隔离服，戴口罩帽子，戴手术手套。
4、实验中，注意各种细节，不能污染。
4、实验前后，细胞培养瓶一定要烧瓶口。

最后，个人经验：细胞长得慢的，可提高血清浓度；细胞老化快的，可减少血清浓度。

作者: 羊咩咩 时间: 2012-1-27 11:20

细胞污染我遇到过，大半年没污染的事也遇过，感觉不穿白大褂不是污染的原因，洗手、不戴手套也不是

作者: 一叶 时间: 2012-1-27 11:20

大家可能都听过这样说法，很多国外的实验室，养细胞的人很随便，不用穿白大衣，也不用酒精灯，我没有这样的经历，但是我一个刚刚回国的朋友就是这样做的，细胞几乎没污染过，我们讨论了一下原因，最主要的就是空气质量的问题，我们的环境差，污染的几率就会大增。所以平时的时候，我们实验室就是每周都要用过氧乙酸全面清洁，一旦多个人的细胞出现污染的情况，就必须全面清理消毒培养箱，不要把细胞扔了就算了。还有，我硕士养了2年细胞博士养了3年细胞，从来没有带过手套（除非手受伤了），我们的水池就在细胞间门口，洗完手直接进去，实验室的同学都是这么做的，细胞都长得很好。手套也是污染源之一，我们国内大多数实验室没有经济实力购买外科手术用的几块钱1付的手套，很多几毛钱1付的手套都不是无菌的，有的实验室更是节省，1副手套用坏为止，这样反倒增加了污染机会。

作者: 一叶 时间: 2012-1-27 11:21

LZ的有些话还是比较有道理的。
最主要的就是该注意的地方一定要注意到才行。
细胞间里不至于到不能说话的地步，但是嬉笑打闹应该是禁止的。
本来实验室就是工作的地方，还是要严肃一些。

作者: 社会主义好 时间: 2012-1-27 11:21

谢谢各位的经验，我最近也开始养细胞，污染了几次，跟师兄师姐们学习经验，发现还是有很多细节是自己没有注意到的。另外带着手套喷酒精进超净台手被烧了好几次，弄得自己现在缩手缩脚老怕污染。就其原因还是觉得自己在操作时的无菌意识不够强，在超净台东西乱放不说，还在养细胞的培养皿上晃来晃去，不污染都是奇迹啊！希望自己的教训能让大家的细胞养的更好！

作者: 园丁## 时间: 2012-1-27 11:24

1.喷酒精后擦一遍无菌台，然后再放东西进去，最好先干净一点的抹布
2.东西确实不能太多，注意摆放位置，这个我觉得很重要。可以避免很大的污染。
3东西放好后，再喷一次酒精，照二十到三十分钟紫外。
4.将要用的溶液放在旁边，有的要热的，要的要冷点的，都准备好
5.洗干净手，喷好酒精手到胳膊以上，点好酒精灯再放东西。
6.每个拿进去的东西都要喷酒精，我习惯先喷手，左手拿东西再喷，再放到台子里。
7.长袖短袖倒无所谓，我一直都短袖，没有污染过，呵呵。

作者: 园丁## 时间: 2012-1-27 11:24

就是你帶一次性手套，洗兩遍手還是必須的=============================================
真的很奇怪，楼主做细胞试验不戴一次性的无菌手套吗？

作者: 园丁## 时间: 2012-1-27 11:25

很有關系。短袖其實是不被允許的。尤其是更要求無菌的實驗================================================
7.长袖短袖倒无所谓，我一直都短袖，没有污染过，呵呵。

作者: 西子 时间: 2012-1-27 11:26

洗手？我们都直接带手套喷酒精。。。没事~~
有人穿半截袖的白大褂~~ 我是把长的白大褂挽起来，相当于半截
因为我觉得我们的白大褂没洗比喷了酒精的手还脏~~~

不过实验做了好多没啥污染的

作者: 911 时间: 2012-1-27 11:26

我认为与细胞污染有关的因素：
最重要的是环境，包括细胞培养箱。细胞培养最好能有单独的一间屋子，经常清洁。
其次是用的细胞培养相关器具的质量、无菌状况。
穿白大褂还是算了吧，一般都会很脏，有条件穿手术服，或者一次性服装。国外实验室细胞培养几乎不会有特别的衣服，即使有，别人首先是考虑的保护人，而我们却首先考虑的是保护细胞。
手套可以，也应该多注意喷酒精。无菌操作这些最基本的，应该都会，所以我认为这到是其次。
个人意见，大家愉快讨论。

作者: baidukk 时间: 2012-1-27 11:28

不住还是要argue一下，虽然说得的确很有道理。
1，反复的洗手加喷酒精，为什么不带乳胶手套？夏天还好，冬天如何？男生皮糙肉厚还好，女生细皮嫩肉如何？不要说乳胶手套贵，比起反复的仍细胞便宜得多。
2，白大褂真的有那么干净吗？我一般都不穿白大褂，尤其夏天，热是其一，没必要是其二，穿白大褂那是为了防护自己。
3，超净台照紫外是步骤一，吹20分钟是步骤二，步骤二的重要性远大于步骤一。
4，说话对细胞培养是没有任何影响的，只要不影响到你的操作。大家一起边做细胞，边聊天，其乐无穷。
5，我倒认为save是做细胞的一条基本原则。至于细胞生长异常要具体问题具体分析，有些细胞你是仍不起的。

呵呵，尖锐些，别介意。
实验小心一些是好，但不要因而缩手缩脚，会吓走一批人。

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看到楼主的话我也想这么argue一下
做了这么久细胞，我也有些自己避免污染的经验：
1 不怕花钱，宁可全部用一次性的也不要相信高温高压消毒。
2 不要穿长袖白大褂，胳膊可以洗干净，多喷点酒精，然后为了防止培养细胞用的液体把手弄脏，请戴手套（注意，不是为了防止你污染细胞，而是怕实验药剂伤害你）
3 使用平皿等开盖培养盘培养细胞时，开了盖，手不要在盘上晃来晃去
4 无论是实验时还是实验前用紫外照台子，都请用最大风量吹台子，这样可以防止外界的灰尘进入操作台！
5 拿进操作台的东西最好用酒精喷下或者跟着紫外照下，但是实验前，台子最好越空旷越好，因为吹风会吹得很干净
6 最重要的，不要怕污染，该保存就保存细胞，定期保存细胞一方面节省培养耗材另一方面也是保存实验成果的好方法
7 个人认为，不用点酒精灯。。除非你在实验过程中要用酒精灯考什么东西。我曾经就因为点了酒精灯然后戴橡胶手套的手被点燃。。

作者: 中国特色 时间: 2012-1-27 11:29

前两条说的是对的。可是好像没有那么苛刻吧？
我们实验室有人带乳胶手套，有人不带，反正操作前都用75%的酒精擦拭手了。
白大褂的问题，夏天穿短袖也没什么啊？
至于您后面说的，都比较赞同。
操作没有出现过污染的飘过~PS：仔细操作的话，想污染是一件比较困难的事。

作者: 小鱼鱼 时间: 2012-1-27 11:30

LZ有些地方说的过了，我养了这么久的细胞，肯定不是像LZ那些去洗手经常扔细胞，也没有出现大问题。

作者: whitesheep 时间: 2012-1-27 11:30

通常我不用紫外灯和酒精灯，但会很认真的洗手

作者: caihong 时间: 2012-1-27 11:31

没污染过，不知道啥时候开始全实验室污染了支原体，刚刚白搭了2个月，郁闷中
支原体恐怖，大家小心

作者: 缘yuan 时间: 2012-1-27 11:31

我感觉细胞培养，要时刻注意无菌观念。
首先，培养台要提前做好消毒，我们一般是至少紫外消毒30min，使用前，用酒精擦拭一下桌面
其次，关于带不带手套的问题，我倾向于不带，因为我养细胞都没带过，只是用酒精进行擦拭双手。
还有，所有转移到超净台的物品都要用酒精擦拭，包裹之类的可以用喷壶喷一下酒精。
还有，最好用火焰烤烧瓶口

以上只是我个人之间，欢迎拍砖

作者: @STAR@ 时间: 2012-1-27 11:32

实验室内说话是无法避免的。但是坐在净化台前要尽量避免说话。

作者: 中国特色 时间: 2012-1-27 11:33

谢谢LZ和一些下面的战友的忠告，我刚养细胞，收益匪浅。另外我想问一下，为什么我养的乳腺癌原代细胞用1mg/ml的胶原酶I消化后3-5天都不贴壁？而且很多杂质，不知道怎么去除。

作者: moonlight 时间: 2012-1-27 11:34

没污染过，不知道啥时候开始全实验室污染了支原体，刚刚白搭了2个月，郁闷中
支原体恐怖，大家小心

==============================================================================================================

这位老师，我一直很好奇支原体污染是怎么样的。可否告诉支原体污染的现象，以及检测方法。谢谢。

另外，用酒精灯烧瓶口起不了什么作用。那点瞬时温度，我觉得不足以烧死细菌。很多瓶口甚至还有残留水珠，那点温度都不至于让水沸腾，如果水里有细菌，能烧死么？养细菌的标准操作，比如接种环，是要烧到变红，而推平板的玻璃三角棒，是要蘸了酒精以后，直接点燃。所以关于酒精灯在养哺乳动物细胞方面的使用，我觉得不是那么重要。

作者: moonlight 时间: 2012-1-27 11:34

没污染过，不知道啥时候开始全实验室污染了支原体，刚刚白搭了2个月，郁闷中
支原体恐怖，大家小心

===============================================================================================================

这位老师，我一直很好奇支原体污染是怎么样的。可否告诉支原体污染的现象，以及检测方法。谢谢。

另外，用酒精灯烧瓶口起不了什么作用。那点瞬时温度，我觉得不足以烧死细菌。很多瓶口甚至还有残留水珠，那点温度都不至于让水沸腾，如果水里有细菌，能烧死么？养细菌的标准操作，比如接种环，是要烧到变红，而推平板的玻璃三角棒，是要蘸了酒精以后，直接点燃。所以关于酒精灯在养哺乳动物细胞方面的使用，我觉得不是那么重要。

作者: moonlight 时间: 2012-1-27 11:35

没污染过，不知道啥时候开始全实验室污染了支原体，刚刚白搭了2个月，郁闷中
支原体恐怖，大家小心

这位老师，我一直很好奇支原体污染是怎么样的。可否告诉支原体污染的现象，以及检测方法。谢谢。

另外，用酒精灯烧瓶口起不了什么作用。那点瞬时温度，我觉得不足以烧死细菌。很多瓶口甚至还有残留水珠，那点温度都不至于让水沸腾，如果水里有细菌，能烧死么？养细菌的标准操作，比如接种环，是要烧到变红，而推平板的玻璃三角棒，是要蘸了酒精以后，直接点燃。所以关于酒精灯在养哺乳动物细胞方面的使用，我觉得不是那么重要。

作者: moonlight 时间: 2012-1-27 11:36

没污染过，不知道啥时候开始全实验室污染了支原体，刚刚白搭了2个月，郁闷中
支原体恐怖，大家小心

这位老师，我一直很好奇支原体污染是怎么样的。可否告诉支原体污染的现象，以及检测方法。谢谢。

另外，用酒精灯烧瓶口起不了什么作用。那点瞬时温度，我觉得不足以烧死细菌。很多瓶口甚至还有残留水珠，那点温度都不至于让水沸腾，如果水里有细菌，能烧死么？养细菌的标准操作，比如接种环，是要烧到变红，而推平板的玻璃三角棒，是要蘸了酒精以后，直接点燃。所以关于酒精灯在养哺乳动物细胞方面的使用，我觉得不是那么重要。

作者: 911 时间: 2012-1-27 11:37

没污染过，不知道啥时候开始全实验室污染了支原体，刚刚白搭了2个月，郁闷中
支原体恐怖，大家小心

==============================================================================================================

这位老师，我一直很好奇支原体污染是怎么样的。可否告诉支原体污染的现象，以及检测方法。谢谢。

另外，用酒精灯烧瓶口起不了什么作用。那点瞬时温度，我觉得不足以烧死细菌。很多瓶口甚至还有残留水珠，那点温度都不至于让水沸腾，如果水里有细菌，能烧死么？养细菌的标准操作，比如接种环，是要烧到变红，而推平板的玻璃三角棒，是要蘸了酒精以后，直接点燃。所以关于酒精灯在养哺乳动物细胞方面的使用，我觉得不是那么重要。

作者: zhezhe 时间: 2012-1-27 11:37

很多实验者都不bother自己洗手，酒精一喷就去实验了。我告诉大家，这极端错误
个人经验是，你仔细洗手比喷酒精效果还好。最好的是肥皂/香皂仔仔细细的洗手，一直到手腕，指甲缝都要洗。洗两遍是一个不错的选择。然后手上喷酒精，
有人穿半截袖的白大褂去做实验，每次我看到都想骂。白大褂袖口要长，最好是袖口扎紧的那种，如果不能的话，把袖口窝向手臂。裸露的手腕部分一定也要喷酒精。戴上手套后手请避免接触工作台外面，如果不得已接触，那再喷酒精。宁可手套酒精味多一些。
拿培养瓶和培养液时候请托下面拿，切忌不要拿瓶颈部位。
每天实验开始时候，超净台/实验间照20分钟紫外是不错的选择
有一点要注意的是，超净台里面的东西一定要尽量少放。放的越多越容易污染
尽量避免操作时候说话，尤其是严禁细胞房打闹说笑。
每天观察细胞状态，不要总想着save，而是发现细胞不对劲（比如生长缓慢）就立即扔掉。有些（比如支原体）污染，镜检是看不到的，但是细胞的生长异常。所以如果细胞生长异常，那么请扔掉，同时由于支原体空气传播，请检查自己的培养液和培养箱是不是污染。

注意：很多人有个误区，认为进口血清都是贵，其实不然。GIBCO的 NCS，马血清，都比国产的便宜的多，质量好的多。只有FBS才很贵，
很多时候国产血清往往是污染源，所以用国产血清要严格监控状态。

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说说我们实验吧
戴无粉手套，从来不喷酒精，更不用洗手，也不见污染啊。
实验说笑自如，细胞在超净台里呢，有什么影响啊？
最重要的是细胞室里里外外都要干净，我们紫外都照30分钟以上。
我们的实验经验是，国产的四季青血清比进口的GIBCO便宜货好，而且也比它便宜。

作者: TAT 时间: 2012-1-27 11:38

这位老师，我一直很好奇支原体污染是怎么样的。可否告诉支原体污染的现象，以及检测方法。谢谢。

另外，用酒精灯烧瓶口起不了什么作用。那点瞬时温度，我觉得不足以烧死细菌。很多瓶口甚至还有残留水珠，那点温度都不至于让水沸腾，如果水里有细菌，能烧死么？养细菌的标准操作，比如接种环，是要烧到变红，而推平板的玻璃三角棒，是要蘸了酒精以后，直接点燃。所以关于酒精灯在养哺乳动物细胞方面的使用，我觉得不是那么重要。

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在没有超净台的时代，酒精灯的周围是被认为无菌的，我们的老一辈们就是在这样的环境下做过来的。现今有超净台了，再放入一个酒精灯，被认为是加了一个双保险。关于酒精灯的讨论，本版有很多，甚至好像还有一个精华帖，您可以看看。

我觉得您不能用培养细菌的标准来要求培养细胞过程时的无菌处理，因为细菌的数目不是一个两个数量级的，1个细菌烧一下可能就死了，1000个估计就得多烧几下了。

作者: 小野花 时间: 2012-1-27 11:39

开超净台的紫外前先吹几分钟的风效果会更好些的。

作者: xevin 时间: 2012-1-27 11:39

养细胞我认为主要是无菌操作习惯的形成。我们这边的一个老师说过，“能不用手的地方就不用手”很贴切的。习惯好了想污染也难的。

作者: whitesheep 时间: 2012-1-27 11:40

细胞培养和外科手术有类似之处，就是要有严格的无菌观念，这样细胞就不容易污染了。最容易导致污染的是操作者的双手，个人认为不必戴手套，因为操作起来不是很方便，但时刻要保持手的消毒，并避免接触瓶口等部位。另外环境卫生、物品消毒等也要务必注意！

作者: sunnyB 时间: 2012-1-27 11:41

去细胞室必须穿白大褂，这是态度问题。

传细胞前，培养液，PBS，胰酶的瓶口都要用酒精擦下，台面也要用酒精擦干净。

作者: 大尾巴 时间: 2012-1-27 11:41

不错，有的很多的细节值得注意
我现在就在国外，也在培养细胞，他们的细胞培养室确实是没有酒精灯的，也没有紫外，只是通风厨一直开着，做实验之前先用酒精擦拭里面的台面，先充分洗手在用酒精擦手，就ok了
真的比国内简单多了，我看过他们老美做实验，在里面边做实验，边聊天，合作普通实验一样，相反是我们这些国内的在里面做实验，就专心的做，从来不聊天，
呵呵，国内养成的习惯

作者: 大尾巴 时间: 2012-1-27 11:42

不错，有的很多的细节值得注意
我现在就在国外，也在培养细胞，他们的细胞培养室确实是没有酒精灯的，也没有紫外，只是通风厨一直开着，做实验之前先用酒精擦拭里面的台面，先充分洗手在用酒精擦手，就ok了
真的比国内简单多了，我看过他们老美做实验，在里面边做实验，边聊天，合作普通实验一样，相反是我们这些国内的在里面做实验，就专心的做，从来不聊天，
呵呵，国内养成的习惯

作者: 小糖块 时间: 2012-1-27 11:43

不错，有的很多的细节值得注意
我现在就在国外，也在培养细胞，他们的细胞培养室确实是没有酒精灯的，也没有紫外，只是通风厨一直开着，做实验之前先用酒精擦拭里面的台面，先充分洗手在用酒精擦手，就ok了
真的比国内简单多了，我看过他们老美做实验，在里面边做实验，边聊天，合作普通实验一样，相反是我们这些国内的在里面做实验，就专心的做，从来不聊天，
呵呵，国内养成的习惯

作者: 831226 时间: 2012-1-27 11:43

细胞污染缺失有时候说不清，可能自己很注意也会污染，而别人感觉随随便便也能做得较好。
我的体会是，操作注意一点防患于未然没什么不好，总比污染了回过头再去纠正手法改变习惯要好得多。
我也贴一点：
无菌操作注意事项：
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。
2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌。
4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

作者: sunnyB 时间: 2012-1-27 11:44

感谢大家的经验，不管重不重要，注意一下的比较好。
不过我觉得可能也是环境比较重要，我们条件也很简陋，不戴手套，没有酒精灯，我后来连实验服都不穿了，觉得还没自己衣服干净呢。但是我们的细胞间是单独一间，而且就我一个人，想说话也没人。没事用紫外线照照，消毒水消消毒，都两年多了也没出过啥问题。

作者: 生物迷 时间: 2012-1-27 11:44

1，反复的洗手加喷酒精，为什么不带乳胶手套？夏天还好，冬天如何？男生皮糙肉厚还好，女生细皮嫩肉如何？不要说乳胶手套贵，比起反复的仍细胞便宜得多。
2，白大褂真的有那么干净吗？我一般都不穿白大褂，尤其夏天，热是其一，没必要是其二，穿白大褂那是为了防护自己。
3，超净台照紫外是步骤一，吹20分钟是步骤二，步骤二的重要性远大于步骤一。
4，说话对细胞培养是没有任何影响的，只要不影响到你的操作。大家一起边做细胞，边聊天，其乐无穷。
5，我倒认为save是做细胞的一条基本原则。至于细胞生长异常要具体问题具体分析，有些细胞你是仍不起的。

呵呵，尖锐些，别介意。
实验小心一些是好，但不要因而缩手缩脚，会吓走一批人。

大家可能都听过这样说法，很多国外的实验室，养细胞的人很随便，不用穿白大衣，也不用酒精灯，我没有这样的经历，但是我一个刚刚回国的朋友就是这样做的，细胞几乎没污染过，我们讨论了一下原因，最主要的就是空气质量的问题，我们的环境差，污染的几率就会大增。所以平时的时候，我们实验室就是每周都要用过氧乙酸全面清洁，一旦多个人的细胞出现污染的情况，就必须全面清理消毒培养箱，不要把细胞扔了就算了。还有，我硕士养了2年细胞博士养了3年细胞，从来没有带过手套（除非手受伤了），我们的水池就在细胞间门口，洗完手直接进去，实验室的同学都是这么做的，细胞都长得很好。手套也是污染源之一，我们国内大多数实验室没有经济实力购买外科手术用的几块钱1付的手套，很多几毛钱1付的手套都不是无菌的，有的实验室更是节省，1副手套用坏为止，这样反倒增加了污染机会

作者: 社会主义好 时间: 2012-1-27 11:45

看了那么多，从我自己的实验室情况出发，防止染菌的关键是不要让手或其他可能带菌的器具在培养皿以及培养瓶的上方通过。其实，即便手上喷了酒精，到底有多少细菌可以被杀死，好像没有确切的统计。我曾经不喷酒精就在超净台里面操作，一点都没有染菌。只要不要把手悬在封口的培养基上，细菌哪里会那么容易被引入培养基里。

作者: 大白菜 时间: 2012-1-27 11:46

学习了，谢谢提出宝贵建议的楼主们。不过我们实验室都是裸手做细胞的，先洗下手再用酒精棉球擦手，就操作了。

作者: TNT 时间: 2012-1-27 11:47

我覺得也許你扔掉一大箱子細胞之后就會注意了。

國產血清我特意和進口血清培養過，實在是不如進口===============================================================

说说我们实验吧
戴无粉手套，从来不喷酒精，更不用洗手，也不见污染啊。
实验说笑自如，细胞在超净台里呢，有什么影响啊？
最重要的是细胞室里里外外都要干净，我们紫外都照30分钟以上。
我们的实验经验是，国产的四季青血清比进口的GIBCO便宜货好，而且也比它便宜。

作者: zhezhe 时间: 2012-1-27 11:48

我说几点意见吧。
1.戴手套喷酒精还是可以做到的
2.每周给水浴箱换水或者加入铜离子检测剂看水浴箱是否染菌
3.培养箱也是一个重要环节，每周定期用酒精擦拭或者观察壁面是否有异物生长，培养箱底部放置一个TRAY放一些BAXTRE WATER定期更换。

作者: ffooll 时间: 2012-1-27 11:48

养细胞不污染的细节还有很多的。源头要控制好，首先要确保培养基和胰酶，pbs的无菌，培养瓶的无菌，还有就是那该死的血清——黑胶虫污染！培养基是自己配置的要小心了，这个黑胶虫还是可能污染细胞的，对血清的质量要求很高，有时候灭火处理都不行。哎！
进细胞室请洗手，换鞋，（不带任何佩饰）然后用酒精对手消毒，换上细胞室衣服，然后在带无菌的一次性橡胶手套，然后在用酒精消毒。带上口罩。任何外部进入细胞室的东西应先下缓冲间内消毒后带入细胞室工作台。
细胞室每个月定期消毒，我们用的是甲酚皂，效果很好，就是味道不是很好闻，现在是我们细胞室专属气味，带着这种气味的人大老远就知道是细胞室出来的。
操作的时候，应注意传代时应吸出废弃液千万不能直接倒掉，很容易污染的。
总之养细胞是很花钱，不花钱是养不出好细胞的。
要用一次性的就得用一次性的，要用进口的就得用进口的，不能省！
大家共同努力，养好阿胞！

作者: whitesheep 时间: 2012-1-27 11:49

嘿嘿，夏天只要实验室没人，我做实验的时候基本上都是开空调，打赤膊上阵。因为觉得穿实验服对于减少污染没多大关系，超净台的无菌风是从里向外吹，我身上的灰尘进不去。
我觉得，减少污染最主要的是要知道污染源来自哪里。
一是空气中的，二是我们手上，再者就是放在超净台中的培养瓶或者装tip的盒子，枪等实验要用的物品，更要注意培养液。
空气中的污染源我们有超净台帮忙解决，不同厂家的超净台无菌风吹的方向不同，有从里向外吹的，也有从上往下吹的。这里要注意，如果是后者，那我们在用枪吸取培养基的时候，枪不能竖直的往瓶子里伸。无菌风可能会将枪上的灰尘吹到瓶中，增大污染几率。
手上的污染源，避免手上的细菌落到培养物中的方法就是注意手不要在培养物上方经过，更不能用手去接触瓶口。只要注意这两点，熟练了，手不洗，酒精懒得檫，都不会有危险，嘿嘿。。。不过大家做好按正规步骤，洗手，檫酒精。安全第一！
超净台里最好少放东西，东西越多越容易手忙脚乱，也越容易污染。一般我是习惯于在酒精灯左边放培养基，血清等要加到细胞中的东西。右边放装废液的瓶子。这样可以防止双手交叉。
其他一些细节，比如瓶子开盖后注意将瓶口烧一圈，盖子快速过火。操作尽量靠近酒精灯。实验前拖地，保持地面的湿度，防止灰尘飘起。个人觉得紫外开不开无所谓。

作者: @STAR@ 时间: 2012-1-27 11:50

大家对乳胶手套上的滑石粉是怎么处理的？多喷几次酒精？还是带一次性的塑料手套？

作者: xevin 时间: 2012-1-27 11:50

酒精伤手，戴手套好。
东西全部用一次性就行了，本人做了一年多都没试过污染

作者: dongdongqiang 时间: 2012-1-27 11:51

废话，我不戴手套，不穿实验服，不用拖鞋，不开酒精灯，实验室聊天，超净台里一大堆东西这样我也做过，也不污染

但是那是实验的态度吗！你知道万一污染了，是哪儿出事了吗？

作为实验者要把任何污染的可能扼杀在摇篮里，而不是一味迁就自己
而且，还有可能误导了别人

显示你自己怎么强是吧？造成那么多不确定因素，万一细胞有点问题，你怎么排除

我根本就不理解这是什么心态，显示？吹嘘？我只能说，I feel sick about him.

作者: 大尾巴 时间: 2012-1-27 11:52

洗手？我们都直接带手套喷酒精。。。没事~~
有人穿半截袖的白大褂~~ 我是把长的白大褂挽起来，相当于半截
因为我觉得我们的白大褂没洗比喷了酒精的手还脏~~~

不过实验做了好多没啥污染的

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如果白大褂那么脏，不如不穿。要穿的话一定要经常清洗和消毒。

作者: greenbee 时间: 2012-1-27 11:53

洗手？我们都直接带手套喷酒精。。。没事~~
有人穿半截袖的白大褂~~ 我是把长的白大褂挽起来，相当于半截
因为我觉得我们的白大褂没洗比喷了酒精的手还脏~~~

不过实验做了好多没啥污染的

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如果白大褂那么脏，不如不穿。要穿的话一定要经常清洗和消毒。

作者: greenbee 时间: 2012-1-27 11:54

另外，用酒精灯烧瓶口起不了什么作用。那点瞬时温度，我觉得不足以烧死细菌。很多瓶口甚至还有残留水珠，那点温度都不至于让水沸腾，如果水里有细菌，能烧死么？养细菌的标准操作，比如接种环，是要烧到变红，而推平板的玻璃三角棒，是要蘸了酒精以后，直接点燃。所以关于酒精灯在养哺乳动物细胞方面的使用，我觉得不是那么重要。

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经常在火焰上过一下，是有用的。不知道大家是不是有这样的经验，有时手背靠火还有点距离，但能闻到烧焦的味道，那是汗毛被烧了；如果再近点，可能就手背就有瞬时灼烧的痛感了，那是烧到皮了（手上酒精干的时候也会发生，当然如果刚擦的酒精就更容易发生了）。这说明即使在火边晃晃，蛋白也能被烧变性。细菌数量如果屈指可数，就很容易被烧死了。当然瓶口如果有液体，效果就大打折扣了。所以操作的一个细节就是如果采取倒的方式换液，一定不能让水珠挂在瓶口外（如果是培养液细菌很容易在瓶口滋生）。这里也有个诀窍（对新手而言），那就是倒液时快速翻转瓶口使向下，余液会在瓶口一滴一滴往下滴，在最后一滴下滴离开瓶口的瞬间翻转瓶口使向上，液滴就不会留在瓶口外了。万一瓶口外有液滴，用酒精棉（拧干酒精）擦干瓶口外的液滴（记住酒精棉千万不能伸入到瓶口内），并在火上灼烧（塑料瓶的话晃、转着烧，以免烧化）。
细胞培养，细节很重要。没污染不代表操作就一定正确。
污染也是有几率的，严格要求比如几率是千万分之一，不严格点比如是百万分之一，可能也很少污染，但是污染的几率增高了。

作者: guagua 时间: 2012-1-27 13:16

"本来实验室就是工作的地方，还是要严肃一些" 这个不敢苟同，实验室是工作的地方，是严谨的地方，不是严肃的地方，如果能享受实验是最好的。楼长的细胞培养方法，只能说楼长以前污染怕了，什么都怕，小心为上。其实实验室如果真有能达到细胞培养级别的独立地方，这些都不是关键，严格的操作步骤也没有这些内容。定期的消毒，清扫，专人的管理，操作带无菌手套，如果有层流，那么酒精灯都可以省略。污染的原因主要来源于不规范的操作，另外还有整个操作的环境，如果是在层流台中，保持层流是关键。酒精灯的火焰有时反而破坏了层流。关于血清，国产的肯定不好，进口的NBS，马血清便宜是多数细胞不能用，用什么并不是什么便宜，而是根据细胞来的。NBS绝大多数细胞是不能用的，里面有太多不明的细胞因子和其他不利于细胞生长的其他成分，这就是为什么大多数细胞必须是用FBS。细胞状态是否好，还是参考ATCC里面的图片或推荐传代比例来决定。毕竟他们这个是阳性对照，并不是长的快就是件好事。如果细胞污染（自己都能觉察到了）那就只能扔，不管你扔不扔的起。因为这是会影响实验结果的。

作者: 大尾巴 时间: 2012-1-27 13:17

废话，我不戴手套，不穿实验服，不用拖鞋，不开酒精灯，实验室聊天，超净台里一大堆东西这样我也做过，也不污染

但是那是实验的态度吗！你知道万一污染了，是哪儿出事了吗？

作为实验者要把任何污染的可能扼杀在摇篮里，而不是一味迁就自己
而且，还有可能误导了别人

显示你自己怎么强是吧？造成那么多不确定因素，万一细胞有点问题，你怎么排除

我根本就不理解这是什么心态，显示？吹嘘？我只能说，I feel sick about him.

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我只是根据我的经验说下我对养细胞注意细节的理解，穿与不穿白大褂，反复的洗与不洗手，以及操作细胞时可否谈笑，这不是避免细胞污染的重点，过分的强调这些非重点会对新手造成不必要的压力。实验不是高高在上，享受实验的乐趣，而不是痛苦，这是我实验的态度。

作者: 小鱼鱼 时间: 2012-1-27 13:18

废话，我不戴手套，不穿实验服，不用拖鞋，不开酒精灯，实验室聊天，超净台里一大堆东西这样我也做过，也不污染

但是那是实验的态度吗！你知道万一污染了，是哪儿出事了吗？

作为实验者要把任何污染的可能扼杀在摇篮里，而不是一味迁就自己
而且，还有可能误导了别人

显示你自己怎么强是吧？造成那么多不确定因素，万一细胞有点问题，你怎么排除

我根本就不理解这是什么心态，显示？吹嘘？我只能说，I feel sick about him.

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我只是根据我的经验说下我对养细胞注意细节的理解，穿与不穿白大褂，反复的洗与不洗手，以及操作细胞时可否谈笑，这不是避免细胞污染的重点，过分的强调这些非重点会对新手造成不必要的压力。实验不是高高在上，享受实验的乐趣，而不是痛苦，这是我实验的态度。

作者: guagua 时间: 2012-1-27 13:18

养细胞没有污染过是不可能的。不是没有，只是没有遇到而已。污染不一定是操作，也很有可能有其他途径：如血清黑胶虫（即使是同批号的进口血清）等。所有也没必要太畏惧了，太拘泥于细节，主要的无菌原则把握好，接下来主要就是靠你如何去优化细胞的生长条件了。

作者: ffooll 时间: 2012-1-27 13:19

呵呵，谢谢楼主，我们实验室养细胞是佩戴手套的，然后在手套上喷酒精，本人感觉还不错，还有就是每个人做完实验之后在超净台旁边的表格上登记，这样就能确保下一个人能在照射30分钟以上的超净台里面工作了，还有就是可以在细胞是里放几件无菌服，实验操作的时候可以用，这些对于防止染菌也挺有帮助的

作者: ladyhuahua 时间: 2012-1-27 13:19

看过国外的一本动物细胞培养的书里头好像说在超净台里用酒精灯无益，甚至是有害的，因为酒精灯产生的热气流会干扰向下吹的风。个人认为超净台里头的枪每次用之前最好用酒精棉球擦擦。

作者: 西子 时间: 2012-1-27 13:21

看了很多大大的分析和经验很受启发，但是我觉得其实归根结底是几个原因，
1，要细心，做好充足的实验准备，包括像喷手什么的
2，不能太节省，国外的试剂盒血清的质量确实比国内好，不是崇洋媚外，是客观差距，细胞可不便宜，死光了再买不划算
3，不能怕麻烦，别总觉得这样应该没关系，那样应该没问题，把所有想到的问题都预防了，实验想不出结果很难。

作者: baidukk 时间: 2012-1-27 13:21

我们实验室细胞室操作室是戴上橡胶手套，然后喷上酒精，再用纱布擦干手套，目的是擦掉滑石粉。

作者: woshituzhu 时间: 2012-1-27 13:22

呵呵，还是小心点的好，要有强烈的无菌意识。我养细胞从来不戴手套，我们细胞间条件也不是很好，但操作时一定要认真，打开瓶盖之前一定要烧烧瓶颈，然后再打开，打开后再烧烧，尽量在酒精灯前操作。我一直是这样做的，很少污染。

作者: loli 时间: 2012-1-27 13:23

不是很同意楼主的意见。我养细胞从没污染过，从肿瘤细胞到间充质干细胞到神经细胞，一直很成功。现把我的程序说说，希望给学弟学妹一点经验：
1、注意实验室卫生，每周消毒液拖地板一次，擦所有工作台面一次。
2、实验前，实验室、生物安全柜紫外消毒。
3、进入实验室，穿隔离服，戴口罩帽子，戴手术手套。
4、实验中，注意各种细节，不能污染。
4、实验前后，细胞培养瓶一定要烧瓶口。

最后，个人经验：细胞长得慢的，可提高血清浓度；细胞老化快的，可减少血清浓度。

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现在好像已经很少有人再烧瓶口了吧，没啥必要。隔离服，口罩帽子，拖鞋，手套也统统不用。只要保证3点就行：
1、实验用的培养皿是一次性的。
2、进口血清和液体培养基，实验前一混合就行了。
3、实验室内地面每天清洗1次。
我看国外的细胞培养间根本就没有酒精灯之类的火源。实验员也很少穿白大褂，更别说帽子口罩了。但是却极少污染。唯独以上三点我在国内的实验室不同。

作者: 中国特色 时间: 2012-1-27 13:24

我们试验室做细胞试验都是便装的，我觉得关键就是操作谨慎都没多大问题。本人也染过几次菌，不过事后查明是由于培养基配置的问题。所以我觉得配培养基一定要仔细，配完一定要做好测试才能放心使用。。

作者: duoduo 时间: 2012-1-27 13:24

支原体污染的细胞应该扔掉
超净台的东西越多飞沫就越多
不能因为一段时间没有污染就放松紧惕
因为有的实验室养细胞还是用双抗
污染会潜伏很久
随便操作的后果很不堪

作者: yychen 时间: 2012-1-27 13:25

谢谢各位的经验，我最近也开始养细胞，污染了几次，跟师兄师姐们学习经验，发现还是有很多细节是自己没有注意到的。另外带着手套喷酒精进超净台手被烧了好几次，弄得自己现在缩手缩脚老怕污染。就其原因还是觉得自己在操作时的无菌意识不够强，在超净台东西乱放不说，还在养细胞的培养皿上晃来晃去，不污染都是奇迹啊！希望自己的教训能让大家的细胞养的更好！

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为什么要戴着手套喷酒精呢？通常保险起见是洗手后喷酒精消毒然后戴上无菌手套就可以了。如果是生物安全柜，紫外消毒以后里边空气是很无菌的，不用也不能点酒精灯。我们通常把不能紫外照射的比如试剂一类的瓶子就用酒精擦一遍然后就带进去。这样开始连续做了两年（中间包括6-9月份也没停）到毕业细胞系也没污染过。个人觉得无菌控制里边操作台内的空气质量和个人的无菌操作是最重要的两环。无菌的意识从一开始就要绝对重视，养细胞可能就很好了。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-1-27 13:26

这些问题在国外都不是问题..............
很多实验者都不bother自己洗手，酒精一喷就去实验了。我告诉大家，这极端错误
个人经验是，你仔细洗手比喷酒精效果还好。最好的是肥皂/香皂仔仔细细的洗手，一直到手腕，指甲缝都要洗。洗两遍是一个不错的选择。然后手上喷酒精，
（国外本来就是要熄灯到手臂弯以上的，而且冬天也要打肥皂，酒精灭菌）
有人穿半截袖的白大褂去做实验，每次我看到都想骂。白大褂袖口要长，最好是袖口扎紧的那种，如果不能的话，把袖口窝向手臂。裸露的手腕部分一定也要喷酒精。戴上手套后手请避免接触工作台外面，如果不得已接触，那再喷酒精。宁可手套酒精味多一些。
（都是有专门实验服套换的，有专门的灭菌前室悬挂衣服，都是紧袖口的蓝色的手术服）
拿培养瓶和培养液时候请托下面拿，切忌不要拿瓶颈部位。
（。。。。。。。。。想象不到怎么会这样操作i）
每天实验开始时候，超净台/实验间照20分钟紫外是不错的选择
（这里都是灭菌过夜的，uv灯是不关的）
有一点要注意的是，超净台里面的东西一定要尽量少放。放的越多越容易污染
（不怎么少，翻到很多，一个实验室就2台子，一会儿就用完了）
尽量避免操作时候说话，尤其是严禁细胞房打闹说笑。
（大家都忙死了，还有机会说话啊）
每天观察细胞状态，不要总想着save，而是发现细胞不对劲（比如生长缓慢）就立即扔掉。有些（比如支原体）污染，镜检是看不到的，但是细胞的生长异常。所以如果细胞生长异常，那么请扔掉，同时由于支原体空气传播，请检查自己的培养液和培养箱是不是污染。
（我们是这样的，一旦污染，立即扔掉所有培育箱离得细胞，不论贵贱，全细胞室完全消毒。。。。。。开全体大会严厉批评，二次犯法者，终身不得下细胞室）

注意：很多人有个误区，认为进口血清都是贵，其实不然。GIBCO的 NCS，马血清，都比国产的便宜的多，质量好的多。只有FBS才很贵，
（全部国外购买的，这里比起国内穷多了）
很多时候国产血清往往是污染源，所以用国产血清要严格监控状态。
（每个月换新，使用的快的话，都是2周内换新的）

作者: toy 时间: 2012-1-27 13:27

感觉自己作实验，养细胞很马虎，从来不会特意去洗手，一般会用酒精喷一下，的确带手套，可是不会为了进细胞室特别换手套。
不用酒精灯。穿白大衣是为了保护自己。
曾经取老鼠细胞，忘记在细胞室里取，就在普通的试验台上做，然后拿去sort，还是没污染。养了5年细胞了，从来没污染过。
偶尔一次遇到细胞状态不对，继代换液后就好了。
感觉培养液里一般都加抗生素啊，很强悍的。
看看这帖子，很惭愧啊。

作者: guagua 时间: 2012-1-27 13:27

耐药细胞,只要注意不要偷懒污染一般不会,耐药细胞一般到一定浓度后及其容易污染

作者: zhezhe 时间: 2012-1-27 13:28

细节最重要！在从冰箱中拿出物品后要用酒精擦拭后再放入超净台，防止冰箱中的孢子污染带入超净台。

作者: 911 时间: 2012-1-27 13:29

酒精/火焰/紫外线/肥皂等都不是解决问题的全部,实验操作还有很多细节都需要注意的!　一双手在操作台里肆无忌惮......,　唉!

作者: ha111 时间: 2012-1-27 13:29

楼主说的虽然不是很全面，但是也还是有值得学习的地方的。酒精多喷喷还是有好处的，个人认为虽然戴了手套喷酒精还是有必要的。就像我以前在公司里做的时候，虽然穿着无菌服，戴了手套，但是不论是做实验前，还是拿东西进超净台前都要用酒精喷一下的。味道难闻了点，不过确实可以减少污染的机率。

作者: 社会主义好 时间: 2012-1-27 13:31

进细胞室不带手套、脚套的吗？我想问楼主，有没有那种白大褂，就是袖子很长，可以在超净台操作的时候，让手套能套住扎紧袖口，操作的时候又不会因为袖子被扎住了而影响活动。因为我觉得扎住袖口后胳膊的活动很受限制。还有，请问楼主有没有细胞被不同情况污染了后，具体的变化图片。谢谢楼主。这篇文章很不错。其实这些具体的实验室操作细节，才是所有从事这个的人员最珍惜的。小小的失误会浪费太多的人力物力和财力了。真心感谢。

作者: ladyhuahua 时间: 2012-1-27 13:31

感觉这些细节都注意到了，第一次做的原代培养还是出现了霉菌的污染，不知道是什么原因，培养基验菌没有啥问题啊！

作者: woshituzhu 时间: 2012-1-27 13:32

细胞有几年经验了，现在负责我们医院的细胞室，斗胆评论几句：
关于是否带手套的问题：这不是关键，看个人的习惯。有的同志是外科的研究生，有戴手套操作的习惯，好的，那就戴；有的学生，包括本人，不习惯带手套，那就肥皂洗手，酒精喷手；无论是否戴手套，手从超净台拿出，触碰了可能有污染的物品，就要再次酒精喷手。我的手在冬天的时候经常裂小口子，习惯了，这是咱们工作的象征，可以给领导看看。
穿白大衣？我们实验室有的学生即养动物又做细胞，他的白大衣绝对不可以穿进去，有的研究生不养动物，但是白大衣很脏，所以我在细胞室准备了一套白大衣，要求大家在从培养箱取细胞或者操作的时候一定换上。换一件干净的，不讨论是否这个步骤是否必要，但是这样做绝对有减少污染的可能。

作者: woshituzhu 时间: 2012-1-27 13:32

再补充点：

外国人用不用酒精灯的问题：外国我还没有去过，但是我知道国内的细胞室有的是超净台，有的是生物安全柜，这俩东西有区别的，大家可以搜搜既知道。我们细胞室这两样都有，其中的一个差别就是生物安全柜内禁用明火，据说明书解释是因为会影响到净化的气流，一开始我们刚买了生物安全柜的时候挺高兴，发现这个差别后，着实难受了一阵子，因为习惯了酒精灯，后来学生们还是把酒精灯放进去了，我也默许了，因为我自己也别扭。外国人不用酒精灯因为人家用的是生物安全柜，没有必要，而且空气干净，而且没有酒精灯情结。

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