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标题: [分享贴]李晶教授提供：细胞冻存、解冻方法与细胞计数 [打印本页]

作者: duoduo 时间: 2012-1-27 14:02 标题: [分享贴]李晶教授提供：细胞冻存、解冻方法与细胞计数

细胞冻存、解冻方法与细胞计数
一、细胞冷冻保存
1.材料：
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene　5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法：
（1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤：
（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
4、注意事项：
（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。
（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。
（4）冷冻保存之细胞浓度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。
（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。

二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤：
（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

作者: duoduo 时间: 2012-1-27 14:02

三、细胞计数与存活测试
1、原理：
（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
2、材料：
0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。
3、步骤：
（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。
（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例：
T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；
细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；
细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106

作者: dongdongqiang 时间: 2012-1-27 14:03

很好。谢谢！我前几天冻的肿瘤细胞在－20℃放了2小时(好多资料上写的），不知道效果如何，解冻后不会都死掉吧？!

作者: 盼盼 时间: 2012-1-27 14:03

我今天冻的肿瘤细胞在－20℃放了2小时(教授让的），不知效果如何呢。

作者: 伊莎贝拉 时间: 2012-1-27 14:04

-20度是危险温区，放置一般不要超过两个小时。不过有次我把细胞忘在了-20度放了一通宵，解冻后存活率还比较高。

作者: woshituzhu 时间: 2012-1-27 14:05

细胞计数
说起来容易，数起来眼花

作者: caihong 时间: 2012-1-27 14:06

教授：
您好，请问配好的2倍浓度的细胞冻存液在4度下可以存放多长时间啊？一个礼拜？2个礼拜？

作者: 969 时间: 2012-1-27 14:07

细胞冻存液在4度下我放过5天，发现对我的细胞可行！更长时间的没试过。

作者: yychen 时间: 2012-1-27 14:07

脑脊液细胞如何记数啊，谢谢

作者: nn255 时间: 2012-1-27 14:08

我的师姐对我说过,在-20度放置不要超过半小时.我都是这么做的.资料上说-20到-70度是危险区

作者: baidukk 时间: 2012-1-27 14:08

文章上说杂交瘤细胞的冻存密度不要过大，否则复苏后不易存活，我们在实验操作中也遇到过类似的问题，刚复苏时感觉细胞状态很好，可是第二天看大部分细胞却死了。
所以在以后的实验中，我觉得可以适当的调整一下细胞密度，看看能不能增加细胞的存活率。

作者: 969 时间: 2012-1-27 14:09

现在细胞的冻存很简单，不像楼主说的那么麻烦，我说一下我现在所用的细胞冻存方法，甚是简单，而且冻存的效果很好！取生长良好细胞消化后，用血清悬浮细胞，然后缓慢加入10%DMSO，混匀，每管细胞数为3*10^6个，每管1ml即可，然后放入细胞冻存盒(很多公司都有卖的)，置于-80度冰箱过夜，第二天就可以转入液氮中，这个方法百试不爽！

作者: 小螺号 时间: 2012-1-27 14:10

我还有更简单的方法，其实肿瘤细胞系没有那么娇气。我所用的方法如下：配置2*的冻存液。消化细胞后离心收集细胞，然后调整细胞密度，一般是25cm2的瓶子能动村2管左右（1.5-1.5ml/管），标记好之后，用纱布包裹好，然后将其放在液氮上方，注意不要接触液氮，一般是放在液氮罐盖上，这样放置大约45min左右，随后可以放入液氮中长期保存。效果不错的哟。

作者: xevin 时间: 2012-1-27 14:10

每次细胞复苏,细胞都不能贴壁.过几天后就都死了.都不知道是什么原因?
请高手指教!

作者: @STAR@ 时间: 2012-1-27 14:11

个人观点：每个实验室的冻存方法和冻存液的配方（包括解冻），或多或少有差异，但却是每个实验室的老师多年总结适合自己的方法，当然，老师的方法不一定完全正确。但要尝试一种新方法，就要对比，当证明新方法比老师总结的好的时候，也要和老师交流，而不是盲目的觉得他人的方法就一定比自己的好。适合自己的才是最好的！

作者: moonlight 时间: 2012-1-27 14:13

各位战友大家好！

我想请教大家一个问题：复苏的细胞，是一次性将复苏细胞加入预先温热的培养基中好呢，还

是将培养基少量多次分加好呢？

作者: 生物迷 时间: 2012-1-27 14:14

各位战友大家好！

我想请教大家一个问题：复苏的细胞，是一次性将复苏细胞加入预先温热的培养基中好呢，还

是将培养基少量多次分加好呢？

作者: 缘yuan 时间: 2012-1-27 14:14

因为有时实验很多，把冻存的细胞放在4℃或-20℃就忘了，损失很大，所以现在采用有盖的泡沫盒子，将冻存管直接放在里面，注意不要倒翻，放到-70℃冰箱，第二天在放到液氮里，效果很不错，推荐给大家。

作者: duoduo 时间: 2012-1-27 14:15

运气真是好啊，我一般在4℃30分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜) 这样的情况每次复苏都要看细胞的生命力，强的才能活，弱的直接就挂了。

作者: qqq111 时间: 2012-1-27 14:16

刚开始养细胞，复苏细胞都是直接就培养基就算了，是不是先离心会比较好？

作者: 911 时间: 2012-1-27 14:16

细胞计数一定得染色吗

作者: TNT 时间: 2012-1-27 14:17

学习了。降温步骤可以直接放程序降温盒里，置-80℃冰箱，用起来比较方便。

作者: loli 时间: 2012-1-27 14:17

我们实验室一般冻存细胞时都是放在4℃30分钟---> -20℃ 2小时--->-80℃ 隔夜--->液氮槽vaporphase长期储存，复苏后细胞也还好，不过如果长势不好的细胞不知道是不是-20°冻久了

作者: ffooll 时间: 2012-1-27 14:18

很好的东西！！谢谢教授！我还有一个问题想请教教授，我的细胞最近几次冻存和复苏，再立新的时候都没有细胞被离出来，但是重新吹打均匀后转入培养瓶培养，在倒置显微镜下却能看见密度还可以的细胞。请问教授这是什么原因呢？

作者: 生物迷 时间: 2012-1-27 14:18

我的转速是1000转5分钟，以前冻存复苏都是用的这个条件，是可行的。

作者: ha111 时间: 2012-1-27 14:19

我查了很多资料4度一小时，负20度两小时啊

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