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标题: [讨论帖]肿瘤细胞培养 [打印本页]

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:26 标题: [讨论帖]肿瘤细胞培养

肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。
一、组织培养肿瘤细胞生物学特性
肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：
（－）形态和性状
培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
（二）生长增殖
肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。
（三）永生性
永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。
（四）浸润性
浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。
（五）异质性
所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（Stem Cells）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖；把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。
（六）细胞遗传
大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。
（七）其它
肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：①依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性；②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力；③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少；④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。

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作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:32

二、培养方法
肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。（一）要点
1．取材：
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。
2．培养基：
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
3．成纤维细胞的排除：
成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法（表2－1）。

表2－1 抑制成纤维细胞生长因素

方法因素组织细胞
选择性附着

选择性附着底物

汇合饲细胞层

选择性培养基胰蛋白酶
胶原酶
聚丙烯酰胺
聚四氟乙烯（Teflon）
胶原（猪皮）
小鼠3T3
人胎小肠
D-缬氨酸（Valine）
MCDB-710
MCDB-153
Phenobarbitone 胚胎小肠、心肌、表皮
乳癌
各种肿瘤
转化细胞
表皮细胞
表皮
正常和恶性乳腺上皮
结肠癌
肾组织
乳腺
表皮
肝细胞

注：上表结果为个别实验室经验，仅供参考

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:33

（二）成纤维细胞排除法
1．机械刮除法：
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：
（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；
（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；
（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；
（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止
2．反复贴壁法：
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。
（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；
（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；
（4）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
3．消化排除法：
此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
4．胶原酶消化法：
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。
（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；
（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
5．其它方法：
有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g离心 10分种。在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1.050～1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。
选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。
（三）提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施
根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞初代接种培养后，常出现以下几种情况：
完全无细胞游出或移动；
有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代；
有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡；
传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。
以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求，并需经过对新环境的适应才能生长，因此欲获得好的培养效果，不能局限于一般培养法，必须采用一些特殊的措施。
1．适宜底物：
把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。
2．生长因子：
应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。
为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞（干细胞）的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。
3.动物体媒介培养方法：
（1）瘤块接种：取新鲜瘤组织，用Hanks液洗净血污，切成1～3毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤块；
（2）饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织；
（3）进行体外培养。
（4）为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量增多，细胞培养易于成功。
肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞完全相同，但成功率比正常细胞高。
（四）体外培养肿瘤细胞生物学检测
一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系（或株）后，不论用于实验研究还是建立细胞系，都需要做一系列的细胞生物学测定，主要的目的在于求得证明：
所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞，而非正常细胞或其它细胞。均具有瘤种特异性。阐明一般生物学性状。测定项目数量无明确规定，根据需要而定，以下为常做的项目和要点。
【形态观察】主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。
【细胞生长增殖】检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。
【细胞核型分析】检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。
【凝集试验】检测凝集力。
【软琼脂培养】检测集落形成能力。
【异体动物接种】向异体动物体内（皮下）接种细胞悬液，观察成瘤能力。
【其它】除上述项目外，根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析，荧光显微镜观察等。
在上述肿瘤细胞生物学检测中，最主要的为：异体动物（以用裸鼠为上）接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抗癌基因等的检测，这些项目将在本书第二篇中介绍。
（五）对肿瘤细胞系或细胞株的评价

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:33

已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。但根据研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变动。以近年建成的各种肿瘤细胞系为例，都已传代少则几十，多则百代以上后，才确认建成了细胞系。这种情况下很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。已如前述，癌细胞在培养中并非能很顺利地传下去，凡已长期传代的细胞系，都已获得不死性。当前尚未完全确证所有癌细胞都具有不死性；因此尚难肯定在长期培养中的癌细胞的生物学性状与体内时仍完全相同（包括不死性）。据上述对用癌细胞系所获实验结果应尽量做分析性的结论，避免做概括性的与体内等同的结论，外推与体内等同更是不妥的。广泛来说，应用各种较长时间培养细胞做实验时，都应如此

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:34

细胞培养FAQ

1 冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后，须立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。

7 何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
8 培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。

10 悬浮性细胞应如何继代处理？
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。

12 细胞之接种密度为何？

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

13 细胞冷冻培养基之成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？
冷冻保存使用之DMSO 等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

15 冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微
降低一些。

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:34

16 细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

17 应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
直接灭菌后丢弃之。

19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，
无法以其外观分辨之。

20 支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

21 侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

23 为何培养基保存于4 °C 冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？
培养基保存于4 °C 冰箱中，培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH 值。

24 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？
不同厂牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。

25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？
研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。

27 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:35

细胞传代培养

一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
1、细胞：贴壁细胞株
2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）
3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等
三、操作步骤
1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2、加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。
观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
附：消化液配制方法：
称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02％

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:36

细胞株的培养、冻存和复苏

细胞株的培养、冻存和复苏

1）细胞株的培养和传代

培养：

用于检测细胞因子的细胞株通常培养于含10％小牛血清和抗生素的培养液中，培养细胞因子依赖细胞株还有加入适量细胞因子。在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养，3～4天传代一次。

悬浮生长细胞的传代：

直接直接吸去或离心后吸去培养上清液，用新鲜培养液悬浮细胞，1：3或1：5稀释细胞后，分瓶继续培养。

帖壁生长细胞的传代：

吸去培养液，用PBS洗涤细胞一次，加入消化液，在37℃中消化约3～10分钟，待细胞开始脱落时，倒去消化液，加入新鲜培养液，悬浮和吹打分散细胞。也可以待细胞完全消化脱落，500×g离心5分钟，去除消化液，用新鲜培养液悬浮细胞。1：3或1：5稀释细胞后，分瓶继续培养。

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:37

2）细胞株的冻存：

1．取培养2～3天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106～2×107/ml。

2．在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜（或甘油），混匀后密封。置4℃ 1小时，－20℃ 2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。

3）细胞株的复苏：

复苏时，从液氮中取出冻存管，立即置37℃水浴中融化细胞。将细胞直接加入10ml含15％小牛血清的RPMI-1640培养液中，置37℃ 5％CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。悬浮细胞待细胞全部沉降后小心吸去上清液，更换新鲜的上述培养液，继续培养；帖壁细胞则培养2～3实验

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:37

细胞直接计数细胞

直接计数细胞

1．如果靶细胞是帖壁细胞，在细胞因子作用适当时间后，用生理盐水洗去死亡细胞，用0.25％胰蛋白酶液消化细胞。加适量生理盐水吹打，使细胞分散成单个细胞。直接在血细胞计数板上计数细胞。

2．如果靶细胞是悬浮细胞，则需要用染色剂区分死细胞和活细胞然后再计数。通常用台盼蓝染色细胞，活细胞可以排除进入细胞的台盼蓝而不着染，死细胞着染呈深蓝色。

3．计数血细胞计数板上4个大方格中的全部活细胞，按下式计算活细胞数：活细胞数（个/ml）＝计数的全部活细胞数×10 000×2×1/4

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:38

微生物污染的排除

细胞受各种霉菌、细菌和支原体污染后，一般都较难排除或杀灭，其中以支原体更难排除，因此从预防着眼为上。

1）抗生素除菌法：用BM－1（截耳素衍生物）和BM－2（四环素衍生物）抑制支原体

1．抗生素制备：均可用PBS配成250×浓缩液－20℃备用，使用浓度参考《组织培养和分子细胞学技术》117页表6－2。

2．处理：取受支原体污染的细胞，吸除培养液，加入含BM-1的1640培养液培养3天后，吸除培养液，再加入含BM-2的1640培养液培养4天，如此连续三个轮回。

3．检测：用33258荧光染色镜检（每个轮回末应检测一次）。

4．培养：清除支原体后的细胞，在不加上述抗生素的培养液中，再传代培养3～4次。

5．镜检：如清除不彻底可再进行处理至纯净为止（一般3个轮回即能被完全消除）。BM-1和BM-2与CIP（4-氟，2-羟基喹啉）联合应用亦可，即先用含BIP培养液培养12天后，再按上述方法处理。

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:40

2）加温除菌法

把受污染的细胞置41℃中作用5～10小时。

3）动物体内接种除菌法

把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

4）巨噬细胞吞噬法

从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:41

特殊培养法

1）二倍体细胞培养法

二倍体细胞培养法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为：

1. 吸除旧培养液注入另瓶中。

2. 用温BSS冲洗1次。

3. 用0.25%温胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖细胞层即可；作用1~5分钟。

4. 待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化。为防止细胞丢失，可不必再用BSS冲洗，直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1新旧混合）。

5. 轻轻反复吹打制成单个细胞悬液。

6. 按一分为二比例接种培养。

2）支持物培养法

加支持物培养法与一般培养法相同，只是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物。

1. 支持物制备：如用特氟隆薄膜，无菌条件下启封，用剪刀按需要剪成各种不同大小的块，于培养接种细胞前，先置入培养容器中即可；通常多用盖玻片做支持物，用前先要把盖片用玻璃刀切成一定形态，以便装入培养瓶中，然后按如下顺序处理：自来水浸泡24小时—96%酒精30～60 min—蒸馏水浸泡30～60 min—用干净软布擦拭干净—装入培养皿中—高压或干热灭菌备用。

2. 培养法：初代消化培养、初代组织块培养、传代培养等皆可应用加支持物培养法。接种细胞后，可在任何时间取出支持物，做各种观察或实验。

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:42

3）细胞分离（克隆）培养

多孔塑料培养板单细胞克隆法：

1. 消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液。

2. 低密度细胞悬液的制备：做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液，然后稀释细胞，使之成为1~2细胞/毫升悬液，最适宜细胞密度为1~2细胞/ml培养液。

3. 接种：先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5毫升。接种时要迅速准确，争取在最短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO2温箱培养。

4. 标记：培养6~12小时后，待细胞下沉冰贴附于培养板孔底，从温箱中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含有单个细胞的孔，置CO2温箱培养。在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养3~4周。待孔内细胞增至500~600个时，可进行分离培养。

5. 分离扩大培养：培养86~96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1~2次，继加胰蛋白酶少许，加入量已能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。置于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入0.1ml含10%血清的克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增殖，使之形成新的细胞群后，即转用常规培养法培养。

必须保证分离出来的细胞确为一个而不是两个或更多。因此必须提高克隆形成率才易克隆成功，为此常采取以下一些措施：

使用适应性培养基或条件培养基（Conditional Medium）。制备：

1. 培养同源细胞（未克隆前时的同一细胞）至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24~48小时后，吸出所有培养液。

2. 离心：3000~4000/分离心10分钟，吸取上清液。

3. 滤过：再经直径0.22μm滤孔的滤膜过滤，低温冻存贮备用；用时取1分适应培养基+2分培养基混合使用。

使用饲细胞(Feeder Cells)。制备：

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:42

1. 取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按105细胞/毫升重新接种培养。

2. 在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml的丝裂霉素C，按2μg/106细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量30～50戈瑞。

3. 细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5×104（104细胞/cm2）接种入新培养基中。

4. 48小时后，即可用于细胞克隆之用。

ont-family: 'Times New Roman'; mso-hansi-font-family: 'Times New Roman'">制备浓度为1 mg/ml的多聚右旋赖氨酸的水溶液，用以湿润培养瓶底。

2. 倒出多聚赖氨酸溶液，用5ml PBS冲洗一次后，可立即使用，或存数周内使用。

4）球体细胞培养

1. 琼脂铺底的培养瓶：30ml无菌培养瓶，每瓶中加5 ml 2%琼脂培养基，冷却，形成平坦底层后备用。

2. 取生长状态良好已连接成片的细胞，用弯头吸管伸入瓶内，把细胞纵横割划成若干小区后，倒出培养液。

3. 加入0.25%的胰蛋白酶液，在倒置显微镜下边消化边观察，当细胞小区边缘微卷起后便立即终止消化，倒出消化液，用Hanks轻轻漂洗一次，加入新培养液3~5 ml，用吸管把已松动的细胞片吸打下来，分装入1~3个含2%琼脂培养基底层的培养瓶中，置温箱继续培养，数日后便可生长成细胞球体。

4. 换液：培养1~2日后，如需换液，微倾斜培养瓶，令培养液集于培养瓶底角，停片刻，待球体细胞下沉后，吸除部分培养液，再补充新培养液。

5）微载体细胞培养法

1. 微载体选择：先用利用三种小量微载体做培养实验，观察细胞在一定时间内细胞的吸着率和计算细胞数，以得到最大量细胞为佳。

2. 水化：称一定量的微载体放入容器中，按每克微载体加50～100ml的比例，加入无Ca2＋和Mg2＋的磷酸缓冲液（PBS），室温下放置应不少于3小时，并不时轻微搅动，然后再用新鲜PBS洗一次。

3. 消毒：可采用高压蒸汽消毒，也可在水化后用70％酒精浸泡消毒，再用无菌的PBS漂洗一二次。

4. 传代培养：在连续进行微载体培养时，可以不必把细胞从微载体分离下来，可将带有细胞的微载体和新的微载体混合进行培养细胞能移动到新载体上。如果进行其它实验或需要分离细胞进行传代培养时，和常规培养相同，先用EDTA＋胰蛋白酶溶液作用使细胞脱离微载体表面。细胞脱离微载体后，可用自然沉降法，即在室温下静止5分钟，微载体将先自沉在底部，细胞大部分仍在上清中，然后离心上清即可得到细胞。如果需要分离程度较高时，需用孔径为100微米的尼龙网或不锈钢网过滤后，再离心滤过液，就可得到较纯净的细胞。

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:43

6）悬浮培养法

悬浮培养是使帖壁细胞呈悬浮状态生长。如所需培养的细胞本身属悬浮生长型，则无须做任何处理；在传代时先做离心处理去除旧培养液，添加新培养液即可。但在培养帖附型细胞时，必须进行干扰细胞不能帖附，方法有二：

1．用大培养瓶增加含有铁芯的无毒的聚苯乙烯棒，在培养中进行电磁搅拌，使细胞不能帖壁而成悬浮培养。

2．用试管培养细胞，把试管置入带有旋转鼓的特制温箱中进行培养，旋转鼓不停徐缓转动，干扰细胞帖壁遂成悬浮培养

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:44

常规组织培养法

1）初代消化培养法

1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:45

2）初代组织块培养法

1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。

4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
3）传代培养法

1. 吸除培养瓶内旧培养液。

2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。

5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:45

原代神经元培养

Protocol for the Primary Culture of Cortical and Hippocampal neurons
Solutions and media required:

Poly D-lysine/laminin solution - pdf
DM/KY - pdf
Optimem - pdf
Neuronal growth medium - pdf
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Set-up for the dissection:

Day 1:

Add poly D-lysine/laminin solution to culture dishes/coverslips. Swirl the plate to ensure that the coating mix covers the entire bottom of the plate. Leave the dishes/coverslips in the 37oC/5% CO2 incubator overnight.

Day 2:

Wash the dishes/coverslips twice with sterile water; remove the final wash and leave them liquid-free in the incubator.
Make up DM/KY, sterile filter and place on ice
Make up the trypsin inhibitor solution and the papain solution BUT DO NOT add papain at this point; place solutions on ice.
Pour ice-cold DM/KY solution into several culture dishes: 1 large dish for the pups and 10cm dishes for the pup heads, for the intact brains and for the dissected cortices. Place dishes on ice.
Obtain pregnant rat

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作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:46

Dissection of hippocampus and cortex:

Sacrifice the rat by placing a plastic dish containing dry ice in the cage and then pouring water into this plastic dish; cover the top of the cage with a bag.
After the rat fails to move spontaneously or in response to pain (touch the eye and look for a reflex), incise along the abodmen and remove the uterus. Place the pups into the large culture dish.
Remove the heads of the pups and place in a 10cm dish
For each head, remove the skin and cut along the scalp in the midline with fine scissors. Make a similar midline cut in the calvarium. Deflect the calvarium with a blunt spatula and scoop the brain into another 10cm dish containing ice-cold DM/KY.
Dissect the coritces: place the brain ventral side up. Place the spatula in the medial aspect of the ventral cortex and midbrain and cut the cortices off. Discard the midbrain.
Dissect the hippocampus and cortex: place a cortex medial side up and place the spatula into the lateral ventricle pushing forward through the lateral aspect of the frontal cortex. Extend the cut through the cortex inferiorly and superiorly to isolate the posterior half of cortex and hippocampus. Discard the remainder.
Dissect the hippocampus from the cortex: place the spatula in the lateral ventricle underneath the hippocampus. Make cuts superiorly and inferiorly to free the respective ends of the hippocampus. Roll out the hippocampus with the spatula and cut the hippocampus from the cortex near the dendate/entorrhinal cortex junction. Place the individual cortices or hippocampi in 10cm dish containing ice-cold DM/KY.
Add the papain to the enzyme solution before stripping the meninges (or 30min before anticipated completion of dissection) and place the papain and trypsin inhibitor solutions in a 37oC water bath.
Strip the meninges and cut the tissue into small 1mm3 pieces.
Sterile filter the papain and trypsin inhibitor solutions.
Transfer all of the cortical/hippocampal tissue to a 15ml conical tube. Use one 15ml tube per 5 cortices dissected. Once the tissue has settled remove the extra DM/KY solution.

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作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:46

Papain treatment:

Add 5ml of the enzyme solution to the dissected tissue and incubate at 37oC for 15min, mixing every 5min.
After 15min, remove the enzyme solution and replace with a second 5ml of enzyme solution. Incubate for a further 15min with mixing at 5min intervals.
After 15min (total of 30min) remove the enzyme solution and wash with warmed DM/KY 3-4 times or until the tissue solution turns pink.

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Trypsin Inhibitor treatment:

1. Add 5 ml of trypsin inhibitor, mix the tissue and incubate for 5 min.

2. After 5 min, remove the trypsin inhibitor and replace with fresh 5 ml aliquot

3. Repeat a total of 3x / 15 min trypsin inhibitor treatment. Remove excess and was twice with 1 ml of Optimem / glucose.

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作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:46

Trituration:

1. Transfer tissue to a 50 ml conical tube with 5 ml Optimem/glucose solution (3 ml for hippocampus).

2. Triturate gently with a 5 ml pipette until cloudy. Add 3-5 ml (1-2 for hippocampus) of optimem/glucose solution and allow the tissue to settle for a few minutes. Transfer 3-5 ml (1-2 for hippocampus) of cloudy supernatant to a second tube.

3. Repeat step 2 as many times as necessary to obtain adequate numbers of cells. Transfer supernatant from second tube to a third tube, taking care to avoid any small tissue bits that have settled in the interim.

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Plating cells:

1. Mix the cell suspension and transfer 10ul aliquot to a tube that contains 10 ul of DM/KY and 10 ul of Trypan blue. Mix thoroughly and count the number of cells in the 16 box squares in the 2 opposite corners of the field. Average the 2 counts or recount if the 2 numbers are different by more than 10%. Multiple the average by 30, 000 to get the number of cells per ml.

2. Dilute the cells with optimem/glucose solution to final count of 2.5-3 million per ml and plate 2ml per 60mm plate. After 2 hours remove the plating media (optimem/glucose) and replace with growth media.

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:52

细胞学技术

概述及注意事项：

细胞学检查包括有细胞的涂片与染色技术，其来源先于组织切片技术，目前是较为常用的病理检查方法之一。它所运用的范围也很广泛，如女性生殖系统、食管、胃、肺、浆膜腔积液、泌尿管道、鼻咽部等部位的脱落癌细胞，以及胸、腹腔的肿块、淋巴结、乳腺、和其它组织器官的细胞学诊断。

标本采集注意事项：：

1、要在较为准确病变的部位采集病变标本。
2、标本应及时处理，固定。以防止细胞自溶***。
3、避免异物掺入标本，如血液、粘液。
4、无菌操作，动作快，以防止并发症和扩散。

标本采集：

1、直接法：在女性的外阴、阴道等部位采集时，要求患者在取材前一天避免性生活，盆溶、阴道灌洗、涂药和月经期。此法可用鼻咽、眼结合膜、皮肤、口腔和肛管、咽管等部位。

2、磨擦法：使用工具如海绵磨控器、线网套和气囊等，用于鼻咽、食管、胃等处。

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:53

3、自行分泌：

1）痰液：患者人深处咳出可疑痰液，如含有血液，立即涂片并固定。此法可用于呼吸道恶性病变，肺石棉沉着及肺霉菌感染等病。当出现嗜酸性粒细胞时也可用于过敏性哮喘的诊断参考。

2）尿液：以离心后取其沉淀物。

3）乳腺分泌物：于患处按摩挤出分泌物作涂片，或用针吸法后涂片检查。

4）前列腺液：按摩腺部取分泌物。

标本固定：

涂片在尚未完全干燥时，投入固定剂中固定。以防止涂片细胞脱落。一般时间为10-30min。常用固定剂可选用：95％乙醇、乙醚－乙醇（乙醚与95％乙醇1：1混合），20％甲醛，甲醇及Carnoy液

巴氏染色法：

试剂配制：

OG6染液桔黄G0.5g 95％乙醇100ml 磷钨酸0.015g
EA36染液 0.5％亮绿SF水溶液15ml 0.5％伊红Y水溶液45ml 0.5％俾士麦棕水溶液10ml 磷钨酸0.2g 碳酸锂饱和水溶液1滴

染色方法

1、涂片固定后经梯度乙醇至水。
2、苏木素液染5－10min。流水冲洗返蓝。
3、OG6染液1-2min后，用95％乙醇洗两次。
4、入EA36或EA65染液2－3min。
5、用95％乙醇洗两次，分色。
6、梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：细胞核呈蓝色。表层扁平细胞质粉红色。中间与基底旁细胞胞质蓝至绿色

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:53

细胞培养的一般技术

促细胞分裂剂激活单核细胞

基本原理：

本方法是通过促细胞分裂剂与细胞表面受体相互作用，在体外触发细胞的多克隆激活。根据所使用的促细胞分裂剂的不同，应答细胞可以是T淋巴细胞、B淋巴细胞，或两者同时，或者是单核细胞。细胞激活可以通过细胞增殖、细胞因子分泌、表面抗原表达和/或细胞体积的增加进行检测。例如在使用B细胞激活剂时，可以通过多克隆免疫球蛋白的分泌进行检测。

表1 常用的促细胞分裂剂和多克隆淋巴细胞激活剂

促细胞分裂剂
所用浓度
应答细胞

刀豆蛋白A ConA
1- 10 μg/ml
T 淋巴细胞

植物凝集素PHA
1-5 μg/ml
T 淋巴细胞

佛波醇酯PMA
1-10 ng/ml
T 淋巴细胞

娄诺霉素+PMA
100-500 ng/ml
T 淋巴细胞

脂多糖LPS
2-25 μg/ml
鼠B细胞（T不依赖型），

单核细胞

美洲商陆PWN
试验测定
人B细胞（T依赖型）

葡萄球菌A，SAC
1/1000-1/10000
人B细胞

试剂和设备：

l 细胞悬浮液；

l 96孔平底组织培养板；

l 含血清培养基（通常为 RPMI 1640,含10% 胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）；

l 促细胞分裂剂（见表1），要求纯品或半纯品，有市售商品；

l 多通道移液器和微量移液器；

l 带570nm滤片的酶标仪；

l 超净工作台；

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:54

l CO2孵箱；

l 冷冻离心机。

操作步骤：

（一）促细胞分裂剂制备

根据说明书将促细胞分裂剂重新溶解于水或培养液中，制成储存液（如100´），保存于-20℃。

（二）促细胞分裂剂滴定

1．在培养液中稀释储存液到所需的第一个浓度，通常为理论最佳浓度的10倍；

2．在培养板或试管中直接将促细胞分裂剂进行浓度递减系列稀释（100 μl/孔）；

3．每孔平行重复三次；

（三）细胞激活

1．分离外周血单核细胞；

2．室温下用培养液300´ g离心10分钟，收集并洗涤细胞；

3．计数细胞并将细胞在培养液中重新悬浮至106细胞/ml，在培养板中每孔加入100μl；

4．在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育（细胞增殖需2-3天；细胞因子测定测定6小时-2天；免疫球蛋白分泌测定需5-10天）；

（四）细胞激活定量测定方法

1．细胞增殖检测方法采用MTT测定法；

2．细胞因子分泌测定或使用市售商业化试剂盒；

3．免疫球蛋白分泌测定采用ELISA检测

对照试验：

1．阴性对照：不含促细胞分裂剂的培养液为对照组；

2．促细胞分裂剂没有阳性对照。通常利用滴定曲线进行预试验确定促细胞分裂剂的最佳浓度以及最佳培养时间。

实验要点及说明：

1．促细胞分裂剂的计量应答曲线通常为钟形，并且高浓度的促细胞分裂剂其效果较差；

2．尽量避免细胞浓度过低，不要采用圆底培养板；

3．抗CD3和抗TCR抗体可以用于T淋巴细胞激活；

4．偶联到小珠上的抗免疫球蛋白抗体可以用于B淋巴细胞激活。

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:55

第一节细胞冷冻和复苏

基本原理：

在长期的细胞培养过程中可能会出现微生物污染或基因型改变等情况，会导致具有优良特性细胞系的丢失。为防止这些细胞的丢失，细胞可以经快速冷冻并几乎无限期保存在非常低的温度下，如液氮（-176℃）。

试剂和设备：

l 冷冻液: 90%灭活血清+10%DMSO（或甘油），用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存；

l 培养液；

l 台盼蓝溶液（0.4%溶解于PBS）；

l 70%乙醇；

l 组织培养瓶；

l 15-50 ml 无菌圆锥底离心试管；

l 离心机；

l 血球计数板；

l 超净工作台；

l 光学显微镜；

l 37℃水浴；

l 冷冻管；

l -80℃冰箱；

l 液氮和液氮容器。

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:57

操作步骤：

（一）冷冻细胞

1．收集对数生长期细胞；

2．以25μl台盼蓝溶液稀释25μl细胞悬液；用血球计数板计数并计算细胞存活率（至少应该在90%以上）；

3．细胞悬液在4℃ 条件下200´g离心10分钟；

4．将沉淀的细胞重新悬浮在冷冻液中（大约5´106细胞/0.5 ml 冷冻液）；

5．将细胞悬液加入到冷冻管中，每管0.5 ml；

6．将冷冻管置于-80℃冰箱中；

7． 24小时后，将冷冻管移入液氮罐中；

8．在记录本或电脑中记录下每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

（二）细胞复苏

1．将冷冻管迅速由液氮转入到37℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定时搅拌加速解冻；

2．当细胞完全解冻后，用含70%乙醇的纱布擦拭冷冻管消毒；

3．将解冻后细胞转移到含4℃预平衡培养液的试管中；

4．细胞悬液在4℃下200´g离心10分钟；

5．弃上清，将细胞重新悬浮在新鲜培养液中；

6．将细胞转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养；

7．是用倒置显微镜检查细胞存活率以及细胞密度，如果细胞密度过高，用培养液稀释至适宜浓度。

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:57

对照试验

在冷冻细胞被移入到液氮罐中一段时间后，取出一管细胞复苏并进行培养以检测存活率。

实验要点及说明：

1．严格遵守液氮操作规则（即戴上合适的手套和护目镜），液态氮对眼睛极为有害；

2．对一瓶细胞培养液要尽可能多分装几个冷冻管；

3．延长暴露在DMSO中的时间对细胞有害，因此冷冻和解冻操作要尽可能快；

4．细胞可以暂时稳定保存在-80 ℃达数月；

5．每批次冷冻和复苏的细胞的存活率可能会不相同，为避免这个问题，每次细胞冻存最好分两批以上进行；

6． DMSO可以防止在细胞内部出现冰结晶，冻存过程需要逐步降低温度；

7．如果复苏后细胞难以恢复到良好状态，可以使用含10%鼠胚胎成纤维母细胞培养上清的培养液以促进恢复；

8．也可以用含20%热灭活胎牛血清和10%DMSO的培养液为冷冻液。

第二节支持物培养法培养贴壁细胞

基本原理：

通过在支持物（如盖玻片）上培养贴壁细胞，可以应用抗体检测细胞表面抗原的表达或进行酶细胞化学以及免疫细胞化学检测。该方法的优点是细胞贴壁牢固，能够维持细胞生长时的状态。

作者: plaa 时间: 2012-2-2 14:59

试剂和设备

l 细胞悬浮液；

l 6孔平底组织培养板，或φ60 mm培养皿；

l 18mm x 18mm 或20mm x 20mm浸于75%乙醇中的盖玻片；

l 含血清培养基（通常为 RMPI 1640,含10% 小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）；

l 超净工作台；

l CO2孵箱；

l 盖片镊；

操作步骤：

1．用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布；

2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）；

3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时；

4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中；

5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。

实验要点及说明

1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法；

2．所使用的盖玻片应该为优质玻璃制造，并经过铬酸洗液处理；

3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻；

4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率；

5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:01

组织培养方法 Bradley Lab at Baylor College of Medicine
[iframe]http://www.imgen.bcm.tmc.edu/molgen/labs/bradley/protocol.htm[/iframe]

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:02

培养液检索 ATCC 用的数千种不同培养液

cuturl('http://www.atcc.org/SearchCatalogs/MediaFormulations.cfm')

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:03

细胞原代培养

一、原理
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
二、仪器、材料及试剂
仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）
材料：胎鼠或新生鼠
试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒
三、操作步骤
（一）胰酶消化法
1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。
（二）组织块直接培养法
自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
四、注意事项
1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
五、无菌操作的几个注意事项
1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
6、吸溶液的吸管等不能混用。

附：Hank’s液配方：
KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml
注：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:04

本帖来自：医药在线〉〉医药词典

旧称红血球。血液中的一类细胞。除骆驼和鹿的红细胞呈卵圆形状外，人和大多数哺乳动物正常成熟的红细胞呈双凹圆盘形，中央较薄，周缘较厚，平均直径红7～8微米，无细胞核和细胞器，胞质内含有血红蛋白，因而使血液呈红色。成年男性每立方毫米血液里红细胞为400～500万个，成年女性为350～450万个；婴儿和高原居民红细胞数较多。红细胞的主要机能是运输氧和二氧化碳。红细胞的特殊形态增加了红细胞的表面积，缩短了细胞表面到细胞中心的距离，有利于气体进出红细胞。胞质内的血红蛋白由珠蛋白和血红素构成。血红素中含有二价的铁原子，它能与氧作可逆性的结合。血红蛋白末端的氨基则能与二氧化碳作可逆性结合。血红蛋白是红细胞中担负气体运输的功能蛋白。正常成年男性每100毫升血液中含血红蛋白12～15克，女性为11～13克。红细胞由红骨髓生成，发育成熟后进入血液循环，平均寿命120天。衰老死亡的红细胞在肝、脾等处清除。正常人生成、破坏保持着动态平衡，使红细胞数量维持相对稳定。这种平衡遭到破坏，则导致红细胞数量的异常，其大小和形态也会改变。如果血液中红细胞数量或血红蛋白含量低于正常值则叫做贫血。贫血时一般有面色苍白、无力、心慌、气短、头晕等现象，这时由于血液运氧能力降低，身体缺氧所致。造成贫血的原因很多。在造血过程中若原料不足，如缺铁、血红蛋白合成减少，会产生缺铁贫血。若缺乏促进红细胞成熟的物质如维生素B12和叶酸，则使细胞发育停滞而产生巨细细胞贫血又称恶性贫血。若骨髓受到放射性物质、药物等作用而影响其造血功能时，则会患再生障碍性贫血。正常红细胞生成还受到肾脏所产生的促红细胞生成素的调节，当肾脏发生严重病变影响此调节物质的生成时，也可引起贫血。另一些因素如溶血性链球菌感染、疟疾、蛇毒等对红细胞有破坏作用可出现溶血性贫血。此外还有遗传因素的影响，这种影响往往涉及到某种功能蛋白分子结构的变化而致病。如镰状细胞贫血，就是在组成血红蛋白分子的574个氨基酸残基中仅两条β链上N端第六位的谷氨酸残基换为缬氨酸所致。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:05

白细胞计数
转贴自：绿野仙踪
【参考值】
自动计数仪法为：男性4.1～10.4×109/L，女性4.1～10.8×109/L。
【分析变异】
自动计数仪法的变异系数CV=4%。
【生理学变异】
1.升高婴儿约高150%，吸烟者约高37%，妊娠约升高20%，昼夜节律（晚上）约高16%，饮酒约升高14%，4～10岁的儿童约高12%，肌肉活动约升高12%，女性黄体期约高9%，周年节律约升高7%。
2.降低绝经约降低10%，月经期约低15%，纯种黑人约降低35%。
【药物影响】
1.升高能引起嗜酸性白细胞增加或能引起过敏反应导致嗜酸性白细胞增加从而导致WBC总数升高的药物有苯妥英钠、甲基多巴、氨苯喋啶、链激酶、碘化物、碘化钾、二甲氧苯青霉素钠、新生霉素、万古霉素、卡那霉素、紫霉素、异烟肼；别嘌呤醇、氯磺丙脲、氨苄青霉素、先锋霉素I、卷须霉素、氨基水杨酸、去郁敏和金。

　乙醚和氯仿引起的WBC升高为麻醉的正常反应。氟烷引起过敏反应，严重的副醛中毒均可致WBC增加。

　　丙咪嗪、苯印二酮和强的松龙可引起一时性白细胞增多。阿托品可引起儿童的WBC增多。洋地黄（少数病例）、红霉素、汞化合物，铜（毒性所致显著升高），竹桃霉素（应用2周后偶然发生），二性霉素B和磷中毒时均可致WBC升高。

　　羟保泰松可引起白血病样反应。保泰松与氯霉素可引起白血病。苯丙胺可引起原始粒细胞白血病。放射性碘可引起较高的急性白血病发率

　毛果芸香碱致脾收缩引起WBC增加。奎宁引起脾收缩致最初WBC增加，尤以淋巴细胞明显。对于秋水仙碱开始用药时WBC减少，以后则WBC增加。苯致淋巴或多形核WBC增加。四环素引起非典型淋巴细胞的白细胞计数增加。口服避孕药对骨髓产生刺激作用。促皮质素引起明显的中性粒细胞增加。番木鳖碱致肾上腺分泌上腺素，而肾上腺最初使淋巴细胞增多随后引起中性粒细胞增多。

　2.降低引起全血细胞养活或再生障碍性贫血药物有鲁米那、眠尔通、三氟吡啦嗪、他巴唑（或粒细胞缺乏）、消炎痛（或粒细胞缺乏）、维生素K、自力霉素、金霉素、氯喹（或粒细胞减少）、马利兰（或白细胞减少）、妥拉苏林、砷剂、铅、安眠酮（个例报道）、苯妥英钠、乙琥胺、三甲双酮、非那西丁、保泰松（或粒细胞缺乏）、羧苯碘胺（暂时性再障）、速尿（或白细胞减少）、铋盐（或粒细胞减少）、甲碘丁脲（或粒细胞缺乏）、磺胺药（或粒细胞缺乏）、磺胺二甲基异恶唑（或粒细胞缺乏）、新生霉素、氟化物和金（或WBC减少或粒细胞缺乏）。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:05

引起白细胞减少的药物有巴比妥酸盐、安定、利眠宁、安替比林（或粒细胞减少）、左旋多巴（少数病例发生暂时减少）、辛可芬（或粒细胞减少）、肼苯达嗪、双氢氯噻嗪（或粒细胞减少）、单胺氧化酶抑制剂（一时性）、二氮嗪、安妥明、消胆胺、氯噻嗪（或全血细胞减少）、多噻嗪、苯噻嗪、环塞嗪（一时性）、乙酰唑胺（或粒细胞减少）、双香豆素、皮质类固醇、强的松龙、甲基硫脲嘧啶（偶尔或粒细胞缺乏）、扑尔敏、二氯苯磺胺、呋喃啶（或粒细胞缺乏）、氨苄青霉素、先锋霉素I（少数）、红霉素（或中性粒细胞减少）、粘菌素（或粒细胞减少）、四环素、灰黄霉素（或中性粒细胞减少）、环丝氨酸（伴巨幼红细胞贫血）、氨基水杨酸、奎宁、抗肿瘤制剂（对造血系统损害所致）、硫唑嘌呤、光辉霉素（可逆）、长春新碱（可逆）、秋水仙碱、门冬酰胺酶（25%病人轻度减少）青霉素（伴皮疹）、异丁嗪（或粒细胞缺乏）。

　　引起骨髓抑制的药物有三氯甲噻嗪、苯唑青霉素、二甲氧苯青霉素钠、溶肉瘤素、环磷酰胺（可逆的WBC减少）、噻替派、癌宁、硫鸟嘌呤、局部麻醉剂（或粒细胞缺乏）苯（对骨髓的毒性作用），导致WBC减少。

　　引起粒细胞缺乏的药物有吩噻嗪（尤在开始时）氯丙嗪、普马嗪、奋乃静、三氟丙嗪、闷可乐（少见）、氨基比林（数分钟内发生）。羟葆泰松（或白细胞↓）、肼苯达嗪、洋地黄（或WBC↓）、奎尼丁（或WBC↓）、普鲁卡因酰胺、噻嗪类、氯噻酮、利尿酸、苯茚二酮（或WBC↓）、硫脲嘧啶（约1%病例），丙基硫氧嘧啶（约1/200病例）、氯碘丙脲、异丙嗪（或WBC↓）、扑敏宁（少见）、磺胺嘧啶、青霉素、先锋霉素II（致中性粒细胞↓或WBC↓），林古霉素（或WBC↓或N↓）、链霉素（或WBC↓或N↓）、异烟肼（少见，停药后很快恢复正常）、胺苯硫脲（少数）、伯氨喹林、6-巯基嘌呤、氨甲喋呤（或淋巴细胞减少）、噻唑苯咪唑、去郁敏。

　汞利尿剂引起中性粒细胞减少或粒细胞缺乏。新霉素在有严重的巨幼红细胞贫血时，可发生白细胞减少。
【病理学变异】
1.升高见于骨髓增殖综合征（LLA、LLC、LMC、LLA），选择性的最常见的白细胞综合征、单核细胞增多症（包括MNI、单核细胞增多性李斯特菌病、弓浆虫病、流感和心内膜炎）、多核细胞增多症（包括急性感染、腹膜炎、阑尾炎、脓肿、脓性指头炎、传染性疾病、痛风、麻醉药、酸中毒、汞盐所致的中毒、肿瘤、肉瘤、肝硬化和出血等）、啫酸性白细胞增多症（包括变态反应病和某些蠕虫寄生虫病）、急性或慢性淋巴细胞增多症、类白血病和皮肤病。

　　2.降低未成熟白细胞减少的疾病有苯中毒、铅中毒、射线（甚至定位）、病毒与伤寒等多种传染病、寄生虫病、疟疾、重症肝炎、叶酸和B12等维生素缺乏

　成熟白细胞减少则见于特发性白细胞减少症、骨髓再生障碍（原发性或由白血病，转移癌侵犯引起的继发性的），治疗性成熟白细胞减少症。
【医学决定性水平】

　　1.20×109/L以上说明存在严重感染、新生物或白血病重要的危险限。

　　2.14×109/L以上存在感染、寄生虫病等的界限。

　　3.2.5×109/L以下说明存在传染病，中毒和骨髓再生障碍的重要的危险值

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:06

外周血干细胞移植简介

什么是外周血干细胞移植？
　　干细胞由骨髓大量生成，其中少量的干细胞被释放到血液中，这就是外周血干细胞(PBSC）
　　通过使用一种叫做Filgrastim的药物（重组人粒细胞集落刺激因子），我们能够增加释放到血液中的干细胞数量，从而有可能直接从血液中采集到干细胞移植所需要的足量的干细胞。
外周造血干细胞移植的现状：
1979年Goldman等为一组加速期或急变期慢性粒细胞白血病患者移植初诊时采集冻存的外周血细胞，使患者重新回到慢性期，开始了外周血造血干细胞移植(PBSCT)的临床应用。 80年代中期以后，由于细胞分离机性能提高，1990年以后G—CSF应用于PBSC动员获得成功之后，PBSCT得到迅速发展。
　　据统计，1995年欧洲PBSCT达6476例，远远超过ABMTl384例。已成为治疗恶性血液病、淋巴瘤和乳腺瘤等实体瘤的有效方法，尤其多用在多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤和乳腺癌等实体瘤的治疗。
　　1990年以来，自体造血干细胞移植的数量已超过异基因移植。
　　1993年以后，自体外周血干细胞移植的数量又超过了自体骨髓移植。
　　1990-l994年，用于淋巴瘤和乳腺癌患者的自体造血干细胞移植增加了5倍，同期，外周血干细胞移植的百分比也由15％增至75％，成为造血干细胞的主要来源。
异基因PBSCT病例迅速增加。我国自1995年异体PBSCT成功以采，发展也极为迅速。
　　外周血干细胞动员的方式有3种，即大剂量化疗、单用造血生长因子或二者合用。异体供者单用HGF动员，肿瘤患者则采用大剂量化疗加HGF。
　　与BMT相比，PBSCT最大优点是可以采集到大量的造血干细胞，具有造血恢复快，术后并发症少，3年LFS及复发率与ABMT相当，尤其适合实体瘤的治疗。
Allo -PBSCT近年发展也较快。它具有造血、免疫功能恢复快，治疗费用少，不用采髓术。供者更容易接受等优点，疗效与Allo-BMT相当。以往人们担心Allo-PBSCT所输入的PBSC中含有大量淋巴细胞会引起严重GVHD，但实践证明急性GVHD发生率不比Allo-BMT高，但慢性GVHD发生率则高于Allo-BMT。

　　外周血造血于细胞移植在临床应用时存在以下几个问题：
　　1、收集的外周血干细胞可能混杂有肿瘤细胞；
　　2、移植物中存在大量T细胞，可能诱发严重GVHD ；
　　3、初步的结果表明，PBSCT急性GVHD的发生率与骨髓移植相似，但慢性GVHD为Allo—BMT的2-3倍；
4、重组细胞因子作为动员剂对供者的安全有待于观察。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:08

外周血干细胞移植时，如何对外周血造血干细胞进行采集?
　　㈠采集方法：
　　外周血干细胞(PBSC)的采集方法与成分血的单采术类似，即用血细胞分离机分离采集外周血的单个核细胞组分。目前最常用的细胞分离机机型是FewnalCS—3000(或CS—3000Plus)。多采用分离淋巴细胞的程序分离。一般情况下行大静脉穿刺即可，外周静脉穿刺困难(尤其是小儿)时需中心静脉穿刺。
采集成人时的血流速度为50—60m1／min，每次分离4—6循环(约3—4h)，分离血液的总容积9L，依据情况连续或隔日采集。对儿童采集时的血流速度和分离的总容积依年龄和体重而定。
　　㈡采集的时间：
　　一般情况下，恶性肿瘤患者大剂量化疗+造血生长因子动员PBSC时，外周血白细胞＞1.0x109/L、血小板＞(20- 50)x109/L、CD34+细胞＞1％时开始采集，根据血象的恢复速度连续或隔日采集，至血象达到高峰时止，一般采集1—3次。
健康供者用G-CSF动员时，虽在4-6h即可见白细胞增多，但血中CD34+细胞只有在3天后才持续增加，在用G-CSF 5-6天达峰值，其后即使继续用G-CSF，血中CD34+细胞数量逐渐下降，故采集时间应在动员后5-6天，多数1次即能采够，少数需于次日再采1次。为避免血中白细胞过高可能引起的副作用，在白细胞＞70×l09/L时，应减少G—CSF剂量。
　　㈢采集的质量指标：
　　目前多数医生主张用CD34+细胞数作为采集PBSC时的质量指标。也有作者认为，用处于DNA合成期的MNC数作为 PBSC的质量指标，它比用CD34+细胞更快捷更稳定。
　　㈣植活所需的细胞数量：
　　PBSCT植活所需PBSC量远超过BMT所需的骨髓细胞量，根据多数作者的报告，MNC＞(5-8)×108／kg，CFU-GM＞ (20-50) ×104／kg，CD34+细胞＞ (2.0-50) x106／kg，可以作为PBSCT植活所需的参考阈值。

　　如何进行外周血造血干细胞的动员?
　　正常情况下，外周血中的干／祖细胞的含量占单个核细胞的 0.01％—0.1％相当于骨髓的1％—10％，动员后外周血MNC中CD34+细胞数及CFU—删数均明显高于骨髓。迄今已发现多聚阴离子化合物(如硫酸葡聚糖)、糖皮质激素、细菌内毒素、抗肿瘤药物、四氢叶酸以及造血生长因子等均能有效地动员骨髓和其它部位的造血干／祖细胞进入外周血。
但由于一些药物本身的局限，目前广泛用于临床动员PBSC的主要是抗肿瘤药物和造血生长因子。
　　常用的方式有3种：
　　1) 大剂量化疗；
　　2) 单用造血生长因子(HGF)；
　　3) 化疗十造血生长因子。
　　异体供者单用HGF动员。
　　肿瘤患者则采用大剂量化疗或大剂量化疗加HGF。
HGF较常用的是G-CSF或GM-CSF，其中G-CSF效果优于GM-CSF，因后者的副作用多于前者。

　　进行外周血干细胞移植的优点有哪些?
　　㈠造血及免疫功能恢复快，移植的费用／效益之比优于BMT。
　　不管是自体还是异体PBSCT，移植后的植活时间 (白细胞＞1.0x109/L，中性粒细胞＞0.5x109/L和血小板＞20×109/L) 大都在2周左右，比BMT至少提早1周；如果在移植后加用G-CSF或GM-CSF，则植活时间可以缩短至10天左右。
　　由于PBSC中含有大量淋巴细胞，为骨髓10倍，故移植快速重建免疫。
由于PBSCT后造血免疫功能恢复较快，移植后的感染等并发症及移植相关死亡率明显降低，抗生素及血制品等支持治疗减少，住院时间缩短，因而其费用及效益优于BMT。
　　㈡采集干细胞安全简便：
　　采集PBSC可以避免采集骨髓干细胞时的麻醉及由麻醉引起的意外，也可避免采髓穿刺的痛苦。对于异体移植而言，动员供者采集PBSC可能比献髓更易被接受，有可能扩大供者尤其是无关供者的队伍。
对于部分晚期MM和肿瘤患者，由于骨质破坏和肿瘤浸润等原因不宜或不能采髓时，采集PBSC是其干细胞的唯一来源。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:09

㈢受肿瘤细胞浸润或污染的机会较少：
　　对于这一点尚有争议。 MM、恶性淋巴瘤和一些实体瘤动员采集的PBSC产物检测表明，PBSC并不能完全避免瘤细胞的污染，但其检出率及水平均低于骨髓。部分CML在联合化疗后可以采集到 Ph (-)的PBSC，而骨髓仍然 Ph (+)。
然而从现有的ABSCT临床资料看，其移植后的复发率并不比ABMT低，有作者认为 PBSC受肿瘤细胞浸润或污染少，其占采集细胞的比例低，但由于ABSCT时所回输的细胞数是ABMT的几倍至数十倍，因此ABSCT时所回输的瘤细胞总数可能并不比ABMT少。
　　㈣潜在的抗残留病优势：
　　PBSCT后免疫功能重建较早，可能有利于移植后的抗残瘤病作用。对于异基因移植而言，回输大量的异体T细胞和NK细胞，在理论上有可能增强移植后的移植物抗肿瘤细胞效应(GVLR)，有利于清除残瘤病，减少复发。

　　自身外周血造血干细胞移植的临床应用如何?
　　APBSCT已成为治疗恶性血液病、淋巴瘤和乳腺瘤等实体瘤的有效方法，尤其可用于多发性骨髓瘤及恶性淋巴瘤和乳腺癌等实体瘤的治疗。

　　外周血造血干细胞移植存在的问题和发展趋势如何?
　　㈠外周血造血干细胞移植临床应用存在问题：
　　1）外周血干细胞数量采集困难，不能满足移植所需数量。
　　2）收集的外周血于细胞会混杂有肿瘤细胞。
　　3）异基因外周血移植物中存在大量T细胞，可能诱发严重GVHD，初步的结果表明Allo-PBSCT急性GVHD的发生率与骨髓移植相似，但慢性GVHD显著高于Allo-BMT。
　　4）PBSCT后肿瘤复发。
　　㈡发展趋势：
　　动员的外周血移植较骨髓移植可获得更快的造血和免疫重建，还可以使大剂量化疗更安全，现已成为自体移植的主要细胞来源。动员的异基因外周血移植在快速重建造血的
同时，伴有较高慢性GVND，因此目前尚不能判断从Allo-PBSCT是否能得到广泛应用。所以今后的发展趋势：
　　1) 细胞因子和化疗方案进一步优化组合，减少细胞分离的次数和过程，并发展正常
细胞和肿瘤细胞的不同动员方案。
　　2) 提高PBSC的净化技术，一方面采用各种方法如化疗、免疫净化、生物学净化消灭可能混杂肿瘤细胞；另一方面直接选择CD34+细胞，以减少肿瘤细胞或T细胞，降低GVHD的发生。
　　3) 此外动员的外周血移植，还将用于非肿瘤疾病的治疗和基因治疗的载体，淋巴系统的重建也将使之用于自身免疫性疾病的治疗。

造血干细胞移植种类

造血干细胞移植(HSCT)是经大剂量放化疗或其他免疫抑制剂预处理，清除受体体内的肿瘤细胞、异常克隆细胞，阻断发病机制，然后把自体或异体造血干细胞移植给受体，使受体重建正常造血免疫，而达到治疗目的的一种治疗手段。目前广泛应用于恶性血液病1非恶性难治性血液病、遗传性疾病和某些实体瘤治疗，并获得了较好的疗效。

造血干细胞移植有哪些种类?

造血干细胞移植根据来源、免疫遗传学、血缘关系进行分类：

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:10

㈠根据造血干细胞来源分类：
　　　骨髓移植 (BMT)
　　　外周血干细胞移植 (PBSCT)
　　　脐带血干细胞移植 (UCBT或UCBSCT)
　　　胎肝细胞移植 (FLCT)
　　㈡免疫学分类：
　　　自体 (autologous)
　　　同基因 (syngeneic)
　　　异基因 (allogeneic)
　　　异种 (xenogeneic)
　　㈢根据血缘关系分类：
　　　血缘性 (related)
　　　非血缘性 (un-related)

异基因骨髓移植和自体骨髓移植的现状和比较

异基因骨髓移植的现状如何?
　　近20年来骨髓移植在全世界广泛开展。对于许多难治性血液病，特别是白血病、遗传性血液病、再生障碍性贫血等，用异基因骨髓移植(Allo-BMT)治疗取得了显著疗效。自90年代全世界骨髓移植例数明显增多，每年进行异基因移植例数达到1.2万例以上。
国际骨髓移植登记处(IBMTR)统计资料显示3年无病生存率分别为：
慢性期慢性粒细胞白血病(CML)：（59±2)%
急性髓细胞白血病(AML)： (50±4)%
急性淋巴细胞白血病(ALL): (54±4)％
急性重症再障（SAA): (73±4)％ (＜20岁者)
(61±5)％ (＞20岁者)
　　异基因移植存在的问题：
　　㈠供者采源有限：
　　因受到供者来源及患者年龄的影响，只有10％—20％的患者能进行Allo—BMT。
　　HLA不完全匹配的亲属移植，由于急性移植物抗宿主病发生率较高而影响疗效；非血缘性移植，至1998年10月，国际上已有529万人自愿登记献骨髓，其中30％已作了HLA配型。
IBMTR的报告：
　　497例确诊 CML l年以后、122例确诊CML l年以内、89例CR l期AML、102例CR l期ALL患者进行了非血缘性骨髓移植(URBMT)，3年LFS年分别为(35±3)％、 (47±3)％、 (57±13)％、 (37±14)％。
　　URBMT主要问题是寻找合适供者时间长(平均135天，国内还要更长一些)，植入失败及GVHD发生率较高。
　　㈡移植物抗宿主病(GVHD)：
　　这是异基因骨髓移植的一个极为严重的并发症，它直接影响患者的生存率和生活质量。目前从发病机制、预防及治疗均有所进展。急性GVHD由来自供者的同种反应性细胞毒T细胞和分泌细胞因子的辅助T细胞引起。供者T细胞能识别宿主主要组织相容性复合体(MHC)差异，并导致GVHD。新近证明。非HLA基因遗传控制的次要组织相容性差异也可引起GVHD反应。这种反应可经细胞因子连锁放大。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:10

自身骨髓移植的现状如何?
　　自体骨髓移植(ABMT)因不受供者来源限制，移植后并发症少，近年来发展迅猛。到1995年，ABMT病例数已超过Allo-BMT，尤其是对实体瘤具有Allo—BMT无可替代的优点。
IBMTR的报告：
　　858例CR l期AML、102例CR l期ALL患者ABMT后3年LFS分别为(50 ± 4)％、 (43 ± 12)％；
　　49例CR l期、463例首次复发后、224例CR2期、257例从未缓解的霍奇金病患者ABMT后3年生存率分别为(86 ± 12)％、(60±6)％、(76 ± 8)％、 (49 ± 9)％；
　　CR l期143例、首次复发594例、CR2 期250例、从未缓解者426例中度恶性非霍奇金淋巴瘤, ABMT后3年生存率分别为(68± 10)％、 (45± 5)％、 (60±8)％、 (40 ± 7)％；
上述这些均提示 ABMT对AL及淋巴瘤、某些实体瘤具有良好治疗效果。
自体骨髓移植存在问题：
　　ABMT较异基因骨髓移植的复发率高是其主要缺点。
　　其原因可能是：
　　1、移植物中含有肿瘤细胞；
　　2、自身骨髓移植缺乏GVL作用。
　　近几年针对上两个问题进行了大量研究，即用体外净化技术清除移植物中残留细胞。有关这方面的报道较多，但临床效果有待评估。目前主要方法包括物理学和免疫学两类方法。
为进一步清除体内残留的肿瘤细胞，移植后可采用小剂量化疗或生物反应调节剂如自身GVHD、IL—2、干扰素等治疗。
　　异基因骨髓移植及自身骨髓移植有什么不同? 各自的优点缺点是什么?

项目
自身骨髓移Auto-BMT 异基因骨髓移植Allo-BMT

干细胞来源
患者本人正常供者

优点
①不受供者限制 ①复发率低

②年龄的限制较宽 ②长期无白血病生存率高

③移植并发症少③治愈某些疾患的唯一方法

④不发生GVHD ④适应证广泛

⑤移植后生活质量好 ⑤不需要冷冻和净化技术

⑥我国易开展

存在问题容易复发供者来源有限

②骨髓须冷冻保存易发生GVHD,移植并发症多症

③缺乏GVL作用 ③患者(受者)年龄＜55岁

④骨髓须净化处理 ④须使用免疫抑制剂

⑤长存活者生活质量差

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:11

造血干细胞移植的适应症及疗效

造血干细胞的适应症有哪些？
　　㈠血液系统恶性肿瘤：慢性粒细胞白血病慢性期、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征。
　　㈡血液系统非恶性肿瘤：再生障碍性贫血、范可尼贫血、地中海贫血、镰状细胞贫血、骨髓纤维化、重型阵发性睡眠性血红蛋白尿症、无巨核细胞性血小板减少症。
　　㈢其它实体瘤：乳腺癌、卵巢癌、辜丸癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌等。
　　㈣免疫系统疾病：重症联合免疫缺陷症、严重自身免疫性疾病。

　　造血干细胞移植疗效如何?
　　由于造血干细胞移植须进行大剂量放化疗，最大限度地杀伤肿瘤细胞，显著提高了临床疗效。
　　急性白血病、慢性粒细胞白血病、淋巴瘤的长期生存率分别为50％— 70％、
70％—80％和60％—80％，明显高于常规化疗。重型再生障碍性贫血治愈率也达到70％—80％。另外近年来在乳腺癌等实体瘤中应用越来越广泛，并且获得了良好的疗效。

　　影响骨髓移植的疗效因素有哪些?
　　㈠移植患者病情：
　　骨髓移植复发率与移植时病情有关。对于急性白血病在CR l期疗效最好，复发率约为20％左右，而在 CR2期或复发期移植复发率达50％以上。
　　对于慢性白血病患者，异基因干细胞移植是唯一的治愈方法，疗效在慢性期最好，急变期最差，一般讲从诊断至移植时间长，疾病处于进展期的患者疗效差。

　　㈡对放化疗的敏感性：
　　大剂量放化疗预处理是清除体内肿瘤细胞的主要方法，故肿瘤细胞对放化疗敏感性直接影响移植疗效。
　　㈢移植物质量：
　　对于自体骨髓移植，何时采集骨髓、移植患者缓解质量及骨髓冷冻储存技术、骨髓净化效果均影响患者长期生存的质量。
　　㈣预处理方案：
　　移植后疾病的复发率与预处理方案的强弱有关，复发多在1年以内，复发的白血病多数来自患者原来的细胞。
　　㈤年龄：
　　也是影响疗效的一个因素，供受体均在20岁以下者疗效最佳，患者年龄大于30岁者略差，40岁以上的患者其BMT的疗效与单纯化疗无显著差异。
㈥ HLA匹配程度：
异基因移植的主要并发症是移植物排斥和GVHD，与HLA匹配程度密切相关。

　　非相关的HLA相配合的骨髓移植后存活情况如何?应用前景如何?
　　异基因造血干细胞移植应用最大限制是HIA相匹配的同胞供者有限，只有30％可进行同胞之间移植。为解决供者来源，1970年开始欧美国家相继建立骨髓库，对献髓志愿者进行HLA配型，到1998年10月为止全世界已有529万人申请登记，并对其中30％做了HLA配型。目前非血缘性BMT为异基因BMT的25％左右。而且处于上升趋势。
影响非血缘性BMT的主要因素是供受者之间主要或次要组织相容性抗原差异，由此出现较高的移植物排斥、GVHD等合并症，严重影响临床疗效。
　　美国国家骨髓供者规划署报道，1184例CML接受无关供者Allo-移植，分析779例CML-CP 3年无病生存率为40％；在年龄＜35岁组，采用HLA相合供者在确诊后1年期内接受移植的CP期患者3年无病生存率显著提高，达到51％-71％。
血清学配型确定的表型是一个较粗的指标，目前许多单位已采用新的基因型配型技术为选择供者提供更为准确HIA的配型依据；新近研究的UDBM—CD34+细胞移植和体内T细胞去除法，已应用于临床，据报道移植后患者移植相关合并症降低，生存率明显提高。
随着GVHD发病机制的研究、HLA配型技术、免疫抑制剂、生物技术的发展，非血缘性BMT将成为造血干细胞的主要来源之一，尤其在我国具有更为广泛的应用前景。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:12

细胞培养技术

出处：西京医院妇产科 --医海拾贝

一、细胞培养基本概念
　　细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
　　在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。
二、细胞培养的环境
　　细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
　　1、无污染环境
　　培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
　　2、恒定的温度
　　维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。
　　3、气体环境
　　气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
　　二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。
　　细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:13

4、细胞培养基
　　培养是既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。
　　（1）合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。
　　（2）天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合志培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。常见使用最为5-20%。
三、细胞培养设施和基本条件
　　1、实验室设计
　　细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养工作包括：工作液配制、无菌操作（采样）、温育、无菌处理，细胞和用品贮存等。细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。
　　2、常用设施及设备
　　（1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。
　　（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓部间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。
　　（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物品。
　　（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。
　　（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。
　　3、培养器皿
　　细胞培养以玻璃器皿为主，常准备最需是使用最的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面几种。
　　（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常以500ml、250ml、100ml生理盐水瓶或血浆瓶代替。
　　（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等几种。用于外周血培养的常用10ml普通圆瓶。两种培养瓶均要求选用优质玻璃制成。
　　（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm、60mm、120mm等几种。
　　（4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用1ml和10ml两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。
　　（5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml和5ml。
　　（6）其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。
四、培养细胞形态
　　体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。
　　1、成纤维型细胞
　　在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:14

2、上皮型细胞
　　此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有园形核，细胞紧密相连单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。
　　3、游走型细胞
　　本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细腻包形态。常见于羊水细胞培养的早期。
五、培养细胞形态分析
　　培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。
六、培养用品的清洗与消毒
　　目前我国细胞培养器皿主要仍使用能反复使用的玻璃器皿，清洗的主要目的为清除杂质和微生物，使在器皿内不残留任何影响细胞生长的成份。因而在组织细胞培养中清洗和消毒是一项极为重要的环节。
　　（一）清洗
　　在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法。
　　1、玻璃器皿的清洗
　　组织细胞培养中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、侵酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。
　　（1）浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液（5）浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。
　　（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。
　　（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。清洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）（A）强清洁液 63 1000 200000 B）次强清洗液 120 200 1000 （C）弱清洁液 100 100 100
　　清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。
　　（4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或洁液的残迹。冲洗最好用洗涤装置。即省力、效果又好。如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用。
　　2、胶塞的清洗
　　细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。
　　3、塑料制品的清洗
　　塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用2% NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:15

（二）消毒
　　细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底，由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。
消毒方法分为三类：（A）物理灭菌法（紫外线、湿热、过渣等）。（B）化学灭菌法（各种化学消毒剂）。（C）抗生素。
　　（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米，且消毒进物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。
　　紫外线可产生臭氧，污染空气，试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤也有伤害，不宜近照射也进行实验操作。
　　（2）温热消毒：即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止消毒及表皮意外事件发生。
常用物品消毒压力及时间：
　　培养液、橡胶制品、10磅10分钟；
　　布类、玻璃制品、金属器械、18磅20分钟。
　　上两种是最常见的物理消毒方法。
　　（3）化学消毒法：最常见的是70%酒精及1‰的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学消毒法操作简单、方便有效。
　　（4）抗生素消毒：确切应记成抗生素灭菌，主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。
七、绒毛染色体制备
　　绒毛来源于胚胎的中胚层，最早的初级干绒毛出现于孕三周初，孕8周左右是绒毛发育最旺盛时期。目前国内外绒毛取材多选于8-9周。研究资料表明，绒毛取样不影响胚胎的发育及胎盘的功能。但取样的失败可导致胚胎丢失而终止妊娠。
绒毛取样前者首先要检查阴道分泌物以判别阴道的洁净度，防止取样导致宫内感染。其次需做B超检查，一是确定胚胎大小，二是确定胚芽有无心血管搏动，三是确定胚芽在子宫内的位置，用以判别取材时间，是否取材及取样器进宫的角度及深度。
　　1、实验材料
　　妇科阴道冲洗物品、绒毛取样器、5ml注射器、培养皿、小镊子、5ml离心管、甲酸、柠檬酸钠、冰乙酸、PMRI 1640、秋水仙素、载玻片等。
　　2、培养液配制
　　PRMI 1640 10-15ml
　　秋水仙素10ug/ml 1ml

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:15

3、操作过程
　　（1）1‰新洁而灭冲洗阴道，用卵圆钳固定子宫颈，根据妇查及B超提示选择角度及浓度探性插入绒毛取样器，当有弹性阻挡感且深度符合B超所示时，抽出取样器内芯，接上5ml注射器，抽出4-5ml，此时，注射器内可见有血性液体流进；
　　（2）取一干净培养皿，内加PRNI 1640 5ml，内含秋水仙素0.06ug/ml。慢慢抽出取样器，将所吸出物注入培养皿内，并用1640冲洗注射器及取样器，混匀。置培养箱30-40分钟；（3）挑选发育良好的绒毛放入另一小培养皿中，用预温37℃的0.075M。KCL与10%柠檬酸钠1∶1混合液漂洗两次。（4）用眼科小剪剪碎绒毛，再将2滴秋碱加入上途漂洗低渗液低渗30分钟；（5）加3∶2的甲醇冰乙酸固定液0.2ml，预固定，1000rpm8分钟，弃上清液；（6）加新鲜配制的3∶2固定液3ml；固定30分钟，2000rpm8分钟，弃上清液；（7）第二次固定可加3∶1甲醇冰乙酸固定液3ml固定30分钟，2000rpm8分钟，弃上清液；（8）离心后，加所余体积的60%冰乙酸，打匀，2分钟后加等量甲醇，打匀，2000rpm8分钟，弃上清液。（9）3m1 3∶1甲冰固定液过夜，冰水制片；（10）80℃考片2小时，自然冷却。（11）G分带处理，观片。
八、羊水细胞培养
　　羊水中含有胎儿脱落的上皮细胞，可在体外培养用以分析胎儿染色体核型。目前国内外大都采用腹腔羊膜穿刺术，妊娠12-30周的羊水细胞均可培养成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色体分析，最佳孕周为16周左右。因此时羊水增长快，羊水中细胞较多，细胞培养易于生长，而且不易损伤胎儿。国内多数选择的穿刺时间在妊娠的第16-30周。国外现已较多地采用妊娠早期的羊膜穿刺，但需在B超下定位及穿刺。羊水量按妊娠时间大致计算（1ml/w）。资料表明，穿刺病例的妊娠结局、分娩方式、胎儿的出生体重等与未穿刺无明显差异。
　　1、实验材料
　　2,5%碘酒、75%酒精、无菌棉签和棉球、镊子、20-22号无菌腰穿针、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、199、F10、F12）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培养皿、盖玻片等。
　　2、培养液配制
　　F-12 85%
　　小牛血清 15%
　　双抗 100u/ml
　　小瓶贮藏 4-8℃
　　3、操作过程
　　A（盖玻片培养法）
　　（1）采样：选择妊娠13-14周妇女，在无菌条件下抽取羊水5ml，立即注入无菌离心管中；（2）收集：离心分离细胞，1000rpm10分钟，去上清，留0.5ml，轻打混匀；（3）接种：30mm培养皿中放盖玻片1张，每片滴混匀的细胞液1-2滴，置培养箱内培养30-60分钟；（4）培养：取出后从盖玻片外加培养液2ml，静置培养48小时后观察细胞生殖状况并定时换液，5-10天后，可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长；（5）终止培养：当有大量圆形发亮细胞出现时，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小时；（6）低渗：倒掉培养液，加预温37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃温育30分钟，镜下可见胀大的羊水细胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液预固定；（7）固定：倒掉低渗液，加5ml固定液固定30分钟以上，反复3次；（8）干燥：将附有细胞的盖玻片斜放于培养皿中，置80℃烤箱处理2-3小时；（9）胶片：将附有细胞的盖玻片用树脂胶封固于玻片上，正面朝外，小心细胞破坏；
　　B（常规培养法）
　　（1）—（2）相同于盖玻片培养法；（3）接种：将混匀的羊水细胞种置于50ml或100ml细胞培养瓶内，平均10ml羊水细胞收集的细胞种置一瓶加5-10ml混合培养液。（4）培养：酒精灯火先封口，静置培养48小时后观察细胞贴臂及生长情况，5-10天后可见瓶底面有大量羊水细胞生长；（5）终止培养：同A法；（6）细胞收集：将培养液倒入一干净离心管中，加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶，轻轻摇动，使培养瓶底面完全接触消化酶，然后用弯头吸管吹打，待细胞全部脱落后加前培养液终止胰蛋白酶消化。用吸管移细胞悬液于离心管中。1000-2000rpm10分钟，弃上清，留细胞沉虑。若一次消化不彻底，可反复消化；（7）低渗及预固定：加预温37℃KCL溶液10ml，37℃温育30分钟，加0.5-1ml新鲜配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液预固定，用气泡吹打细胞使其混匀。（8）固定：用新鲜配制的3∶2甲冰固定三次，每次30分钟。固定液加入时沿管壁缓慢加入；（9）制片及干燥：用绒毛制片；
（10）分带处理。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:16

九、人外周血淋巴细胞培养
　　在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有HPA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。具有用血量少、操作简单等优点。
　　1、实验材料
　　2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。
　　2、培养液配制
　　无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂：
　　RPMI 1640或199 90%
　　小牛血清 10%
　　PHA（自制） 0.1ml 3%
　　肝素 10u/ml 2%
　　双抗 100u/ml（选择）
　　分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。
　　3、操作过程
　　（1）采样接种：用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶盖，用酒精灯火焰过烤，无菌条件下抽取患者外周血0.5-1ml，每瓶加20滴左右，轻摇均匀，尽量避免培养物与瓶盖接触；（2）培养：置36℃培养箱中培养72小时，每隔12小时左右轻遥1次，以促进细胞生长增殖；（3）抑止分裂：收获前2小时左右加秋水仙素，最终浓度为0.02ug/ml培养液，摇匀后置培养箱中继续培养，以抑止细胞在分裂中期。（4）终止培养：从培养箱中取出培养瓶，摇匀后移至10ml尖底离心管中，尽量收集培养细胞。2000rpm8分钟。（5）低渗处理：弃上清液，加入预温37℃的0.075MKCL8ml，迅速打匀，置37℃培养箱或水浴锅中10-20分钟；（6）预固定：取出低渗中尖底离心管，轻轻加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇：冰乙酸混合液，取相应编号滴管用汽泡轻轻软打2-3下。800-1000rpm8-10分钟；（7）固定：弃上清液。加入新鲜配制的3∶2甲醇冰乙酸混合液10ml，轻打混匀，封口置室温30分钟以上。1500-2000rpm10分钟，反复2-3次；（8）制片：使用蒸馏水制备冰水片进行滴片。留离心后沉淀细胞，加新鲜配制的固定液，制成细胞悬液，取1-2滴滴片，用于轻轻吹开。刻号后清理刻号污物，置80℃烤片2小时；（9）收片：待烤箱自然冷却后，取出烤片，置干净环境中或培养箱中以备进行显带处理。
十、植物油凝素的制备
　　植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。自制的方法常用生理盐水提取法。
　　（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。每8-12小时摇荡一次。（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。
　　（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。（4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:17

十一、组织培养细胞染色体制备
　　组织细胞用于遗传学分析最常见的是体外培养的细胞株，多为恶性肿瘤细胞株，且呈贴壁生长，仅小数细胞株为悬浮生长。培养细胞有来源易得、细胞分裂率高和染色体标本制出清晰度高等优点。组织细胞染色体制备的关键是掌握好体外细胞的生长动态，只有处在对数生长期的细胞才能出现较高的分裂相，所以积水仙素处理的时机及量是染色体标本形态及分裂指数的关键。
　　1、实验材料
　　培养液（PRMI 1640、M199、DMEM等），小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素，刻度离心管，直吸管及弯头吸管，培养瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、载玻片。
　　2、培养液配制
　　培养液 85-95%
　　小牛血清 5-15%
　　双抗（选择） 100u/ml
　　3、操作过程
（1）培养细胞：选择处于指数生长期、用大瓶培养的80-90%汇合单层培养细胞；
（2）终止培养：当有大量圆形发亮细胞出现时，加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培养混合液，置温箱继续培养6-10小时以抑制分裂期细胞停止于分裂中期；（3）聚集细胞：
　　（A）摇动法：
　　可利用分裂中期细胞变圆与底物附着不牢特点，此时可持培养瓶，左右反复横向水平摇动，可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落；
　　（B）消化法：
　　将培养液倒入离心管内，给培养瓶内加0.025%胰蛋白酶液0.5-1ml/瓶，水平左右摇动，便培养瓶底壁面完全接触消化酶，稍后用弯头吸管吹打，待细胞完全脱落后，加入3-5ml前培养终止消化。用吸管移入装有培养液的离心管内2000rpm10分钟。弃上清液，留沉淀细胞；
（4）低渗处理：给沉淀细胞加顶温的37℃0.075MKCL8ml左右，用吸管打均匀，在温箱中静置20-30分钟；
（5）预固定：向低渗处理适当的离心管中加新鲜配制的3∶2甲醇，冰乙醇固定液1-2ml，用吸管轻松吹打调匀，此措施能起到使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。
（6）固定：800-1000rpm10分钟，弃上清液加新鲜配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液10ml，加入时要沿管壁慢慢加入，后轻轻吹打，封口后室温静置30分钟以上，反复三次；
（7）制片：末次离心后，倒掉上清液，留沉淀细胞，加新鲜配制固定液0.5ml左右，混匀后冰片制片，其它同外周血方法。
十二、胸腹水细胞染色体制备
　　在恶性肿瘤的胸腹水中有大量的分裂期细胞，其中多以非整倍体细胞存在，并含有各种标记染色体。
　　1、实验材料
　　2.5%碘精、75%酒精、无菌棉球、镊子20-22号无菌腰穿包、50ml离心管、秋水仙素、KCL、甲醇、冰乙酸、载玻片等。
　　2、操作过程
（1）采样：选择有胸或腹水患者，在无菌条件下，轻腹穿刺或于手术取胸或腹水20-50ml；
（2）培养：立即加入秋水仙素培养，最终浓度为0.02-0.04ug/ml胸腹水，置37℃培养箱内4-6小时；
（3）低渗及后期制作羊水细胞。
十三、染色体制备体会
　　1、培养基PH浓度、小牛血清量及培养箱温度的恒定是培养成功关键；
　　2、秋水仙素适量、适宜的处理时机和时间，是获得良好、足够分裂相的条件。分裂相的多少和染色体形态及带型处理良好与否均受其影响。
　　3、低渗处理是获得分散良好的分裂相关键步骤，低渗过度或不足都会造成染色体形态不良的结果。在低渗处理时期细胞十分娇嫩，并且表面发粘，低渗细胞混匀时，吹打要适宜，避免细胞破碎及粘团，另外不要将细胞吸到吸管上部及离心管上部，避免细胞丢失。
　　4、固定技术是制备良好分散的染色体的重要步骤。若染色体分数不良，可适当加大冰乙酸含量，其同时有改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成的缺陷，但过量会造成染色体形态变化和影响分带结局。染色体形态不良与固定液速度有关，加第1次固定液过快或打过快，可造成飘带样染色体； 5、固定液每次使用必须新鲜配制，否则将会形成酯类，从而影响固定效果。6、滴片是染色体制备中影响染色体形态的关键一步。首先要载玻片要非常干净，否则会影响染色体的分散和分带效果。其次是滴片的距离、滴加量多少、制片的方式都会影响染色体分期效果。 7、烤片：是染色体制备中最后一步技术。烤片的温度、时间与染色体形态和分带有关。不宜温度过高和烤片时间过长。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:17

十四、染色体实验技术分析
　　染色体分裂指数低：患者处于非常时期（感染期、放、化疗期）：
　　　　　　　　　　　培养基营养成份不良；
　　　　　　　　　　　培养基PH偏低或偏高；
　　　　　　　　　　　PHA过量或不足；
　　　　　　　　　　　小牛血清质量不高；
　　　　　　　　　　　小牛血清数量偏低或过高；
　　　　　　　　　　　培养温度不稳定；
　　　　　　　　　　　培养箱温度偏低；
　　　　　　　　　　　秋水仙素处理时间过短；
　　　　　　　　　　　离心时间或速度不足；
　　　　　　　　　　　制备过程损失过大。
　　染色体形态不理想：受检者处于非常时期；
　　　　　　　　　　　PHA过量；
　　　　　　　　　　　小牛血清质量不高；
　　　　　　　　　　　培养箱温度不恒温；
　　　　　　　　　　　秋水仙素量不当；
　　　　　　　　　　　低渗时间不理想；
　　　　　　　　　　　低渗温度过高；
　　　　　　　　　　　离心速度过高；
　　　　　　　　　　固定液加速过快；
　　　　　　　　　　　固定混匀手法过重；
　　　　　　　　　　　吹片技术不良。
　　染色体形态偏长：培养基PH偏酸；
　　　　　　　　　　秋水仙素量偏低；
　　　　　　　　　　秋水仙素处理时间偏短；
　　染色体形态偏短：培养基PH偏碱；
　　　　　　　　　　秋水仙纱处理量过量；
　　　　　　　　　　秋水仙素处理时间过长。
　　染色体分带不良：血液状况不良；
　　　　　　　　　　培养基营养成分不良；
　　　　　　　　　　小牛血清质量不高；
　　　　　　　　　　小牛血清数量不当；
　　　　　　　　　　培养箱培养温度不良；
　　　　　　　　　　秋水仙素处理量过高；
　　　　　　　　　　 PHA量过高；
　　　　　　　　　　低渗处理时间或温度不良；
　　　　　　　　　　胰酶质量不良；
　　　　　　　　　　染色液质量不良；
　　　　　　　　　　染色技术不良；
　　　　　　　　　　分带技术不佳。
　　染色背景不良：　培养细胞生长不良；
　　　　　　　　　　低渗处理技术不良；
　　　　　　　　　　离心过程尘染；
　　　　　　　　　　分带技术不良；
　　　　　　　　　　染色技术不良；
　　　　　　　　　　染色液尘染；
　　　　　　　　　　载玻片处理不干净；
　　　　　　　　　　制片过程尘染；
　　　　　　　　　　存片环境不干净。
　　培养失败：　　　培养中损失；
　　　　　　　　　　血源质量不良；
　　　　　　　　　　培养中感染；
　　　　　　　　　　小牛血清污染；
　　　　　　　　　　培养箱温度失控；
　　　　　　　　　　 PHA过期或过量；
　　　　　　　　　　秋水仙素失效；
　　　　　　　　　　低渗失败；
　　　　　　　　　　离心机失误。
　　标本损失：　　　培养中损失；
　　　　　　　　　　制备中损失；
　　　　　　　　　　分带中损失；
　　　　　　　　　　保存中损失；

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:18

十五、染色体分带技术
　　染色体显带技术是在显示染色体基础上发展起来的技术，其优点是能显现染色体本身更细微的结构，有助于更准确地识别每条染色体及染色体异常疾病。染色体分带技术能适用于各种细胞染色体标本。
　　染色体显带是沿着整条染色体的长轴，能显现出着色深浅不同、横向走的带型。目前认为染色体显带现象是染色体结构所致。但用特殊方法处理后，再用染料染色，则带型更加清晰，随显带方法不同，显现出的带型的特点也不一样，这说明带的出现与染料的特异结合相关。人类染色体能显现出近2000个G带，这些带再融合成一般显微镜下可见的850条左右的高分辩染色体带型或350条带左右的常规带型。
常见的几咱显带方法：
（一）、G带
　　也称为G显带，是最常用的显带方法，具有操作简便、经济及标本能长期保存等优点。
1、Giemsa原液的配制：
　　（1）称3.75gGiemsa粉置研磨器中，加少许丙三醇研磨，研磨越细越好；
　　（2）将研细的Giemsa加丙三醇移入500ml棕色瓶内，丙三醇的总量为250ml，用一定量甲醇洗干净研磨器。
　　（3）摇匀，置60℃水浴锅24小时或37℃温箱72小时，经常摇动。
　　（4）取出冷却后，加甲醇总量至250ml混匀，密封棕色瓶备用。贮藏时间越长，染色效果越好。
2、实验材料：
　　中期染色体标本；
　　0.9%氯化钠注射水；
　　3%tris液体；
　　0.25%胰蛋白酶；
　　Gremsa染色液；
　　蒸馏水；
　　水浴锅；
　　立式染缸；
　　定时器或时针；
　　温度计；
　　镊子及纱布；
　　刻字笔；
3、操作程序：
　　（1）消化液配制：取0.9%氯化钠注射水100ml，加0.25%胰蛋白酶1ml，制成0.025%胰蛋白酶盐水消化液，加4-5滴tris液调PH6.8左右，移消化液于立式染色缸并置37℃水浴锅中备用；
　　（2）染液配制：取立式染缸，加蒸馏水500ml，加3滴tris液调PH并加入Giemea染液1ml左右，用吸管调匀备用；
　　（3）漂洗液：取立式染缸一个，内加蒸馏水备用；
　　（4）试消化：待消化液温度在37℃左右时，取同批标本较多者标本1张，分二节或三节进行消化，每节相差十五秒左右，从45秒或60秒开始增减。取出后先在纱布或吸水纸上直立除去带出胰蛋白酶，后置蒸馏水染缸内漂洗，取出后，标本斜面朝上，刮去染色缸内染液上浮膜，沿槽插入，每分钟移动1次，染色3-5分钟。
　　（5）洗片：从染色缸中取出标本玻片，自来水冲洗，取刻编号面朝上用纱布干净玻片背部染色，稍干，高倍镜下观片，确定分带与染色时间。
　　（6）分带：取4张待分带标本玻片，细胞面朝左侧按顺序插入37℃的消化液中，消化时间较试消化选择时间延长5-10秒钟，取出每片间隔时间约10秒钟左右。
　　（7）消化及染色调整：每次消化完一批标本后，需加入配好的消化液25ml于消化缸中，下次消化时间不变。同样，每次染色一批标本后加Giemsa染色液2-3滴，调匀，每次染色时间不变；
　　（8）Giemsa染色调整：若Giemsa染色标本偏红，说明染色液偏酸，可加tris数滴调蓝，若Gremsa染色标本偏蓝则说明tris加多了；
　　（9）保存：将分好带的及观察中的标本及时收集于玻片盒内保存，防止细胞涂面灰尘污染及擦损。
　　注意：Giemsa消化染色过程中，有两个重要的环节，一是胰酶消化环节，消化不足带不出现，消化过度染色体变得膨胀和不着色，必须把握好胰酶浓度、消化时间和消化温度；二是预处理或老化环节，对消化和带型清晰度有很大影响，其中80℃2小时热处理，是简便易行和效果较好的办法。
（二）姐妹染色单体分化染色
　　姐妹染色单体差别染色可使中期染色体显示深浅不同的两条单体，能借以观察姐妹染色单体互换（SCE）现象。SCE是两条染色单体在DNA合成中核苷酸序列发生互换而表现出来一种现象。即是细胞分裂是DNA同源重组的结果。SCE既是一种无害的变化（有生理波动），也可受射线、致突和致癌物三因素等作用而升高。SCE一定成度反映细胞的损伤与修复状态。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:19

1、原理：
　　在细胞培养过程中，加入一定是的5-溴脱氧尿苷（BudR ）,当细胞在DNA复制过程时，BudR能作为核苷酸的前体取代胸腺嘧啶而被掺入到新合DNA中。因此，当细胞处于第二个分裂周期时，同一染色体的两条姐妹染色单体，一条由双股都含有BudR的DNA链构成，而另一条为单股含有BudR的DNA链。在结构上双股含BudR的DNA螺旋化程度较低，故对染色剂亲合力低，在用Giemsa染色时其单体着色浅，只有单股含BudR的DNA链组成的单体则着色深而形成差别着色。
2、BudR贮存液的配制：
　　BudR 5mg（先用0.5ml 1N NaOH溶解）
　　然后加蒸馏水至 5ml
　　即成1000ug/ml的贮存液，因BudR遇光会发生分解，贮存液需置棕色瓶并黑纸封瓶避光冰冻保存。
3、实验材料：
　　所检培养细胞；
　　BudR贮存液；
　　2×SSC液；
　　常规染色体制片所需物品；
　　水浴锅；
　　20W紫外灯一个；
　　培养皿；
　　镜头纸；
4、操作程序
　　（1）BudR掺入：细胞培养24小时后于培养液中加入BudR，最终浓度5-15mg/ml，避光条件下继续培养。
　　（2）终止培养：待细胞经历两个细胞周期（48小时），培养终止前3小时加秋水仙素，秋水仙素终浓度为0.02ug/ml培养液；
　　（3）常规制片及烤片；
　　（4）紫外灯照射：取标本玻片置于大号培养皿内，正面朝上，上覆盖镜头纸，从玻片外镜头纸边沿加2×SSC液致使全镜头纸浸湿，移入50-60℃水浴锅内，紫外线灯距离5cm，照射30-40分钟；
　　（5）染色：取出照射后标本，蒸馏水冲洗，置PH6.8的2%Giemsa染色15分钟；
　　（6）洗片及存片：同G带片
　　注意：BudR是一种强突变剂，使用浓度不宜过高，否则会产生细胞毒性作用。
（三）染色体脆性部位（fra）
　　脆性位点也称危性部位，是在一定的培养条件下人类染色体上某些特异位点非随机地表现出的裂隙和断裂。脆性部位分为普通型和罕见型两大类。
1、实验材料
　　（1）常规外周血所用物品。
　　（2）培养基是用不含叶酸的MEM-Fra培养基或低叶酸的CT199培养基。
2、培养液配制
　　MEM-Fra 90-95%
　　小牛血清 5-10%
　　双抗 100u/ml
　　PH调至7.5左右
3、操作程序
　　与制备外周血的染色体方法相同。
　　注：脆性X综合症：（FraX）
　　这种染色体改变是在1969年被发现，1977年被定位于Xq27、记录为fra（X）（q），并命名为脆性部位。X连锁智力低下（MR）与fra（X）（q27）密切相关。FraX的发生率占新生儿的1/2500；占X连锁MR病1/2-1/3；占男性MR的1-2%；其发生率仅次于先天愚型。

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:19

细胞培养基本技术--幻灯片版（625K）

www2.zzu.edu.cn/cancer/ppt/细胞培养基本技术.ppt

作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:21

我在日本网站上找到了CHO细胞的培养方法，现译成汉语，希望对大家有用。
ＣＨＯ细胞培养方法（正统法）
译者：freechange 2004/11/16
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※准备
・DMEM培养基
・PBS(-)
・Trypsin（0.25％）
・MTX（100μM）
・移液管
・自动移液枪
・废液缸
※培养基量
　25 ｃ㎡・‥‥5　ｍｌ
　75 c㎡・‥‥10　ｍｌ
※操作顺序
① 把培养瓶内的培养基用5ml的移液管转移到保存用的离心管里。
② 用培养液量的1/2的PBS（25ml‥2.5ml）清洗细胞表面（2次）。
③ 再用培养液量的1/10的（25ml‥0.5ml）的胰酶冲洗细胞表面
④ 再CO2培养厢里静置5分钟。（利用这段时间，准备好15ml的大离心管，并也好标签做好记号。）
⑤ 物理方法处理，（敲击培养瓶两侧）是细胞脱离，再用显微镜确认是否完全脱离。
⑥ 加入等倍量的（25ml‥5ml）培养基，充分冲洗培养瓶内表面，在连同细胞全部转移到大离心管中。
⑦ 离心分离（1,000rpm、4℃、10min）。（这段时间准备新的培养瓶，按照9/10的量（25ml‥ 4.5ml），加入培养液准备好。加入MTX的同时加入。）：　50 nM MTX: 2.5 ul of 100 uM/final 5 ml 培养液
　（这期间，要在培养瓶表面写上细胞培养的诸多条件和细胞的种类等等。）
⑧ 离心分离后，为了避免沉淀细胞扩散到溶液里，要迅速将上清用吸管吸除。
⑨ 加入培养液(DMEM+FBS, 25ml‥5ml)，用移液管充分混匀细胞。
⑩ 按1/10量，（25ml‥0.5ml）将细胞悬浊液注入新培养瓶中。
⑪ 在CO2培养厢中37度条件下培养。培养液总量为５　ｍｌ
注：使用的移液管为培养专用玻璃移液管，在上面吸口处，塞上棉花经过干热灭菌的。干热条件：１８０℃、　３小时。

以下是日文原稿：
ＣＨＯ細胞培養方法（正統法）
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作者: abc816 时间: 2012-2-2 15:26

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※準備するもの
・DME・M培地
・PBS(-)
・Trypsin（0.25％）
・MTX（100μM）
・ピペット
・オートピペッター
・廃液入れ
※培地量
　25 ｃ㎡・‥‥5　ｍｌ
　75 c㎡・‥‥10　ｍｌ
※手順
① フラスコ内の培地をpypette(5 ml)で保存用のチューブに移す。
② 培地の1/2量（25・‥2.5・）のPBSで細胞表面を洗う（2回）。
③ 培地の1/10量（25・‥0.5・）のTrypsinで細胞表面をリンスする。
④ CO2 incubator 内に5分間静地。（この間に、グライナーチューブ15 ml
　を用意しておく、マークおよび標品名を記入）
⑤ 物理的処理（フラスコの横をたたく）により、細胞を剥がす。顕微鏡で細胞
　のほぼ完全な剥離を確認する。
⑥ 等倍量（25・‥5・）の培地を加え、フラスコ表面を十分にリンスし、
培地をグライナーチューブに全量移す（細胞が含まれている）。
⑦ 遠心分離（1,000rpm、4℃、10min）。（この間に、新しいフラスコを用意し、9/10　　量（25・‥ 4.5・）
の培地を入れておく。MTXを加えるときも、このとき入れておく）：　50 nM MTX: 2.5 ul of 100 uM/final 5 ml mdium
　（この間にフラスコの表面に細胞培養の諸条件と細胞の種類等を記入する）
⑧ 遠心分離後、沈殿細胞の溶液内拡散を避けるために、急いで上清をデカンテーションで除く。
⑨ 培地(DME+FBS, 25・‥5・を加え、ピペットで十分に細胞を懸濁する。
⑩ 1/10量（25・‥0.5・）の細胞懸濁液を、新しいフラスコに注ぐ。
⑪ CO2 incubator, 37C にて培養。：培地総量は５　ｍｌ
以上お疲れさまでした。
備考：　ピペットは培養用ガラスピペットの口元に綿を詰めピペット缶に入れ乾熱したものを
　　　　　使用する。乾熱：　１８０℃、　３時間

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