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标题: [求助]来讨论讨论PC12培养那点事 [打印本页]

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:04 标题: [求助]来讨论讨论PC12培养那点事

马上要养pc12细胞了，我要做的是AD方面的，看了很多相关的文献和园子里的帖子，和大家分享一下，希望有经验的前辈和在养pc12的战友们来这里讨论讨论，大家一起努力把实验做好！

主要溶液配制

DMEM无血清培养基: DMEM干粉培养基(高糖)1袋(13.4g)，NaHCO33.7g，HEPES 3.576g，600ml三蒸水加入1000ml大烧瓶中，磁力搅拌使其完全溶解，用1N HCI或1N NaOH调节pH值至6.8一7.0，定容至1000ml后，以不锈钢滤器通过0.22卿微孔滤膜过滤除菌(pH值升至7.0一7.2)，分装于250ml玻璃瓶内，置 4℃(短期)或一20℃ (长期)保存备用，并留取少量于 1.5mlEP管中置入37℃孵箱中培养验菌。

DMEM完全培养基:其组成为DMEM无血清培养基90%，胎牛血清(FBS)10%，马血清(HS)5%，青霉素100ü/ml，链霉素100μg/ml，pH7.2一7.4，其中马血清经热变性处理(56℃，30min)，所有组成成分在超净台内混合于100ml玻璃瓶内，置4℃密封保存备用。

细胞冻存液:胎牛血清90%，DMSO10%。

PBS液:NaCl 8g，KCl 0.2g，N2HPO4 0.24g 7HZo2.29，KHZpO40.249，溶于950ml三蒸水中，磁力搅拌，用 IN NaOH(0.4gNaOH加l0ml水配成)调节pH为7.2一7.4，后定容至10O0ml，分装入500ml瓶中高压蒸气消毒(12l℃和10一15磅15~20分钟)，置4℃保存备用。

多聚赖氨酸包被液:以PBs配制成lmg加l母液，使用时将母液用三蒸水稀释成0.lmg/ml的使用浓度，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装入带盖小塑料管(约4ml)或 1.smlEP管中，一20OC保存。

PC12细胞的培养

PC12细胞为半贴壁半悬浮细胞株，故贴壁性较差，用多聚赖氨酸铺瓶底有助于其贴壁生长，传代时亦不用胰酶消化，单用吹打法即可，且需轻柔;PC12细胞有自我聚集成团的倾向，故吹打次数需多方能将其吹打为单细胞液，传代接种时分布均匀。所有培养瓶接种前用0.lmg/ml的多聚赖氨酸，以50μl/cm2的量均匀涂于底面，使瓶底表面全部被溶液覆盖，室温下静置6小时或过夜，吸出多聚赖氨酸液可重复使用，瓶底自然风干或使用前再用DMEM无血清培养基将瓶底未吸净的多聚赖氨酸液洗一遍。PC12细胞用DMEM完全培养基(含DMEM无血清培养基90%，胎牛血清5%，马血清(防止细胞分化)5%，青霉素100ü/ml，链霉素100μg/ml，pH7.2一7.4〕，按2xl05个细胞/m1细胞悬液的密度(或根据实验需要调整密度)传代接种于25cm2细胞培养瓶中。在37oC、5%COZ、饱和湿度的CO2细胞培养箱中静置培养，根据细胞生长情况，2一3天更换一次培养基，4一6天传代一次。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:04

PC12细胞的复苏

将冻存管从液氮中取出，迅速放入37一39oC水浴中快速摇动使其尽快融化。75%酒精擦拭消毒后，在超净台移入离心管(15ml装)中，补加10ml预热至37℃的DMEM完全培养基，轻轻吹打使细胞悬浮，IO00rpm离心5min，弃上清，重复漂洗一次以除去DMSO，加入新的DMEM完全培养基适当稀释，吹打均匀后(一般接种密度为5x105个细胞/ml)移入25cm2培养瓶中，放入CO2孵箱开始培养，次日更换一次培养液。

PC12细胞的传代

PC12细胞传代特点为不用胰酶消化。待PC12细胞长至铺满瓶底80%左右时可进行传代，从CO2孵箱中取出培养瓶，吸管吸弃旧的培养基，加入3ml新的完全培养基按顺序依次反复轻柔吹打瓶底50一80下，尽量使细胞呈单个分散状，根据实验需要以1:2一6的比例进行传代移入新的培养瓶继续培养。

PC12细胞的冻存

选用对数生长期、铺满瓶底80%左右细胞，在收集细胞24小时前，换液一次。吹打细胞制成单细胞悬液，移入离心管IO00rpm离心5min，去上清，沉淀细胞中加入含10%DMSO(v/v)的细胞冻存液重新悬浮细胞，计数，调整细胞密度达5xl06个/m1细胞悬液。用吸管分装入无菌冻存管中(每管1.5ml)严密封口并作好标记，4℃放置30一60min，一20℃放置90min，将冻存管放入纱布小袋中移入液氮罐口颈部气相中悬挂过夜，次日将冻存管完全浸入液氮中。根据“速溶慢冻”原则， 4℃ lh、–20℃4h、一70℃过夜后包装好后保存于液氮罐中。

细胞计数

酒精洗净计数板和盖玻片晾干，取细胞悬液加入o.l%台盼蓝染液，静置1min后，吸取少量加样计数，根据染色与否判断细胞死活。四角大格内的细胞总数计数，根据公式算出细胞密度:细胞数/ml=四大格细胞总数 /4X104×稀释倍数

作者: one 时间: 2012-2-2 17:06

养过PC12，研究方向也是AD，~~以后可以多探讨~~

有一点，当时冻存的时候，我用的是20%胎牛+10%DMSO+70%DEME（无血清）。你上面写的是90%的胎牛+10%DMSO。。。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:07 标题: 回复 #3 one 的帖子

遇到知音了太好了我要下周开始试验现在只是查资料看看大家都怎么样的冻存细胞液方面我看的大多都是胎牛+DMSO 浓度有些差别，而且我还发现其实在这个细胞培养过程中有很多环节都有差异，比如说细胞培养液，有不同的配方，各个成分也有不同的浓度，而且还都挺成功的。希望我也能很快就养好我的细胞，呵呵。希望我们能多交流哦

作者: zzzz 时间: 2012-2-2 17:07

请问多聚赖氨酸是多少分子量的？

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:08

QUOTE:

原帖由 zzzz 于 2012-2-2 17:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问多聚赖氨酸是多少分子量的？

15-30万分子量

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:08

注意事项：1. 复苏后首次分皿时经消化后尽量用tip头柔和吹打15次，使成单细胞。2. 包被非常重要。PLL要质量好，不要多次回收使用，一般使用两次就丢弃。包被过夜后要彻底用灭菌ddH2O 洗3遍。3. 实验尽量使用同一批号的试剂，以免细胞的表型发生变化影响实验结果。4. 7.5％co2 是最好的。你可以试试。当然5％也可以，但是长得慢
5. 用trypsin后PC12会不健康，所以有二个办法。(1)每次用完trypsin后1000rpm离心3min。将trypsin吸走。(2)每次subcuture时候不用trypsin,和PBS，直接用medium把贴壁的细胞吹下来吹成单个的再长。6. PC12细胞的生长密度在70-80%时，就可以传代了，如果等长到很密的时候，好多细胞会出现分化的状态，不是很适宜做下一步的实验呢。再有如果你的细胞是分散的密集，是不是传代时的密度不够呢，可以试一下1:2传代。7.分化后PC12细胞生长一段时间后贴壁能力有些会减弱，尤其板中间生长密集处或者培养时间稍长。此时，若用刚从冰箱中取出的PBS冲洗，很可能造成细胞脱落。PBS冲洗时一定不能用枪向孔中央直接大力吹打，很容易造成细胞被吹掉。结合以往经验，建议：（1）PBS自冰箱取出后置室温20～30min，然后使用。（2）用滴管或枪头研孔壁慢慢加入PBS。（3）也可以尝试用预热无血清培养基进行冲洗。8. 复苏后的换液时间取决于您复苏时是否洗涤离心细胞，去除了冻存液中的DMSO，如果没有去除DMSO，细胞培养过夜后就要彻底换液；如果复苏时洗涤离心过，可以待传代时再换液也可。（据我个人经验，还是复苏时去除DMSO，细胞的生长状态好一些）
9. 状态良好的细胞复苏后4 h即可贴壁，开始增殖48h应该到了对数增长期，即可传代。
10. 每天观察一两次细胞我不认为会对细胞的生长造成不良影响，不过每次观察的时间不易过长。
11. 传代时我认为最好不要用胰蛋白酶，因为胰蛋白酶对细胞有破坏作用。我以前用胰蛋白酶消化传代过PC12, 结果传代后的细胞虽然贴壁，形态也好，但就是增殖缓慢，所以我现在都是用枪吸取培养液直接吹打，传代后细胞增殖迅速，2 d就长满了（因为长的太快，我只好降低血清浓度，用5%FBS）
12. 传代的时机最好选在细胞生长旺盛，占瓶底70%－80%时最好，如果细胞长的太满，细胞的状态会越来越差，最后大片死亡；这种细胞传代后生长也不好；而且长的太满后，细胞贴壁牢，难于吹起来，相反，70%－80%时细胞很容易吹起来。
13. 如果细胞贴壁太紧，不得不用胰蛋白酶消化，注意低浓度，段时间，多洗涤。我一般用0.025％的胰蛋白酶，在镜下观察细胞突起收缩，有零星的细胞漂起就中止，或用肉眼观察，瓶底呈现薄雾状的模糊感时就中止，中止一定要彻底，要用含血清的培养液多洗涤离心几次，确保去除剩余的胰蛋白酶，否则传代后的细胞难以生长。
14. 就培养器皿的选用，我推荐在60mm的培养皿中培养传代，第一，在皿里细胞生长的更快，我想可能是皿比瓶的气体交换更好吧；第二，传代时吹打更方便，不易污染。去除胰蛋白酶时最好用含血清的培养液在4℃下离心，血清不仅可以中止胰蛋白酶的作用，对细胞也有保护作用，一般用800～1000rpm转10min即可，最好离心洗涤3次。传代后不长有可能与胰蛋白酶有关。15. 未分化的PC12是很难养的，要注意包被培养瓶。你的培养基最好换换，可以多查文献啊，一般是高糖的DMEM+5％FBS+10%马血清（我的经验是Gibco的马血清贴壁最好）；马血清的功能是抑制PC12细胞形态的变化，有利于贴壁生长，不会抑制你用NGF诱导的PC12分化的；胎牛血清的作用是与细胞的增殖有关。PC12换液不要太勤！3到4天换液都行，并且最好保留一部分（如三分之一）旧培养基，有利于细胞的贴壁与增殖！！有人说传代时用胰酶消化用0.025％的胰酶消化30秒就足够了，你可以试试，我没有用胰酶也行，为了让细胞不起团，我用了0.02％的EDTA帮助吹散细胞，但是也有点麻烦就是要离心一次。总之，养好PC12的关键在于马血清的选择（Gibco的最好）以及传代过程中对细胞的处理（吹打太多会影响细胞的贴壁，反之PC12会成团).还有PC12是不怎么贴壁，我们做MTT时要让它们贴壁都是用多聚赖氨酸进行包被。多聚赖氨酸分子量300000，储存浓度1mg/ml(用PBS液配制)。4度保存。用时稀释到50微克/毫升，加到包被的容器里，37度孵育过夜（我们一般都晚上做的），早上回收多聚赖氨酸，照紫外4小时后，再铺板。这样细胞贴壁效果较好。多聚赖氨酸一般用3～4次，就不要了！
16. 蒸馏水溶解聚L-赖氨酸（10mg/l），过滤除菌，培养瓶内加入溶液，覆盖底壁即可；静置15分钟；去除溶液；加入培养液覆盖底壁，孵育2h，即可接种细胞！按照您的配方，您用的浓度应该是0.01mg/ml，比我刚才看的Midas主任推荐的0.02mg/ml还要低，我们实验室用的浓度是0.1mg/ml．而且我们使用时一般是要包被过夜的，我曾经着急用，就包被了两个小时，好像一点作用都没有．请问一下您用的是Poly-l-lysine还是Poly-D-lysine，我们用的是Poly-D-lysine. 是Poly-l-lysine可以适当提高浓度

作者: one 时间: 2012-2-2 17:08

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注意事项：1. 复苏后首次分皿时经消化后尽量用tip头柔和吹打15次，使成单细胞。2. 包被非常重要。PLL要质量好，不要多次回收使用，一般使用两次就丢弃。包被过夜后要彻底用灭菌ddH2O 洗3遍。3. 实验尽量使用同一批号的试剂，以 ...

皿的话容易染菌，没有细胞瓶好养。而且加了EDTA的胰酶做好不要用，对细胞不好。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:09

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原帖由 one 于 2012-2-2 17:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

皿的话容易染菌，没有细胞瓶好养。而且加了EDTA的胰酶做好不要用，对细胞不好。

我想问一下下，马血清是不是要灭火啊？

作者: idea2011 时间: 2012-2-2 17:09

呵呵，我们用的完全培养基是DMEM-F12不完全培养基85%+5%进口血清+10%马血清，培养瓶经过多聚赖氨酸包被

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:10 标题: 回复 #10 idea2011 的帖子

那马血清灭活了吗？我看有的需要灭活，什么原因啊？

作者: one 时间: 2012-2-2 17:10

国产的血清需要灭活吧，进口的应该不用

作者: bananapeople 时间: 2012-2-2 17:11

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那马血清灭活了吗？我看有的需要灭活，什么原因啊？

一般都不要，国内的血清最好灭活一下。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:11

今天传代细胞，没有用胰酶，只吹打了，吹打了好多次也不容易下来，第一次亲自养这个细胞，不知道吹打下来了会有什么特征？路过的帮指点一下啊

作者: one 时间: 2012-2-2 17:12

今天传代细胞，没有用胰酶，只吹打了，吹打了好多次也不容易下来，第一次亲自养这个细胞，不知道吹打下来了会有什么特征？路过的帮指点一下啊

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你养的是分化的还是没分化的？

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:12

你养的是分化的还是没分化的？

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我养的是未分化，不过传完代就都死了我接下来想养未分化的试一试，不知道大家都用分化的还是未分化的做细胞痴呆模型啊

作者: one 时间: 2012-2-2 17:13

我养的是未分化，不过传完代就都死了我接下来想养未分化的试一试，不知道大家都用分化的还是未分化的做细胞痴呆模型啊

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我用的是未分化，你是不是消化过久了所以死了啊

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:13

我用的是未分化，你是不是消化过久了所以死了啊

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开始我没消化怎么吹打也不下来后来消化了我只消化了一分钟然后就加培养液终止消化了接着吹打可是还是有大部分下不来怎么回事啊

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:13

PC12细胞是容易贴壁好呢还是不容易贴壁好呢？我第一批养的细胞贴壁贴的特别严实，很难消化下来，第二批就不贴壁，都不知道改怎么办了，理论和实践距离好大啊！

作者: ladyhuahua 时间: 2012-2-2 17:14

楼主也是要做AD模型吗？我也是要做此方面的实验，为了验证我样品的活性。但是现在我陷入了一个困惑之中，就是细胞选型的问题。之前查看了一些文献，有写到说分化的PC12细胞才具有神经元细胞的功能和结构特性，但我也阅读到了采用未分化的细胞进行造模的文章。所以觉得迷茫的。另外看了这么多大家的交流，发现未分化和分化的细胞在培养方面还是有不少差别的。希望能与楼主多多交流，因为同处实验的初始阶段。不知道楼主现在进行得怎样了？

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:14

楼主也是要做AD模型吗？我也是要做此方面的实验，为了验证我样品的活性。但是现在我陷入了一个困惑之中，就是细胞选型的问题。之前查看了一些文献，有写到说分化的PC12细胞才具有神经元细胞的功能和结构特性，但我也阅读到了采用未分化的细胞进行造模的文章。所以觉得迷茫的。另外看了这么多大家的交流，发现未分化和分化的细胞在培养方面还是有不少差别的。希望能与楼主多多交流，因为同处实验的初始阶段。不知道楼主现在进行得怎样了？

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我现在也处于跟你一样的阶段，在想使用分化的还是未分化的，是低分化的还是高分化的，比较彷徨，问了好多人都说不清楚

作者: ladyhuahua 时间: 2012-2-2 17:15

我现在也处于跟你一样的阶段，在想使用分化的还是未分化的，是低分化的还是高分化的，比较彷徨，问了好多人都说不清楚

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我想两个细胞都养一下。因为中文和外文文献中都有采用未分化和分化的。想问一下你是从哪里获得细胞的？

作者: fei1226com 时间: 2012-2-2 17:15

请问诸位未分化的pc12 需要PLL 包被么？

作者: ALALA 时间: 2012-2-2 17:17

不知道楼主的细胞培养是否已经进入了一切顺利的阶段
关注中
请教一下
诱导PC12 分化的神经生长因子是用的什么
需要买试剂比（很贵的)
可不可以用给人注射的呢？

作者: abc816 时间: 2012-2-2 17:17

我也要开始养pc12了~不知道楼主现在养的咋样了~我忐忑中~~~~

作者: zhenxin 时间: 2012-2-2 17:17

我也是刚开始养这个细胞，买的未分化的贴壁是圆形的，但长得慢，老师那还有东村的低分化的细胞，也拿来养了，大部分是梭形。贴壁快，长得快，大家都做MTT吗，对于药物接种时机和浓度，剂量大家有什么建议啊，还有未分化的半悬浮细胞，在加入MTT之后4小时弃去上清液大家是怎么处理啊？希望大家能给解答，多谢啊！

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:18

我开始养的是未分化的，长得不好，后来改成低分化的，现在长势很好，隔天就得必须传代。我现在也在做MTT，细胞密度调整在10000个/孔，细胞调整密度接种后，如果是早晨铺板的晚上就可以处理，如果是下午铺板的，次日早晨就可以处理了，我先饥饿细胞然后加药，结束后做MTT。半悬浮细胞没做过没什么经验，但据说不太好做，得需要离心吧？知道的分享一下哦

作者: zhenxin 时间: 2012-2-2 17:18

你说的早晨铺板晚上就可以处理了是说到晚上换液和加药还是直接加MTT? 我是要加药，不确定接种后要多长时间再换液加药，我看有的文献是24小时，有些是48小时，那你说的早晨铺板晚上处理是指12个小时左右吗？我还没开始做，现在有些浓度时间都拿不准，希望多指教，还有你说的饥饿细胞然后加药，结束后做MTT是指什么意思？

作者: zhenxin 时间: 2012-2-2 17:18

还有，看你之前的帖子是用胰酶消化传代的，我刚开始传代，未分化第一次是直接吹打的，很难吹下来，好不容易吹下来了，这两天开长得比较慢，而且贴壁也差，我想是不是我吹的太多导致的？你现在还是用胰酶消化吗？浓度选多少，还有需要拍打吗？

作者: zhenxin 时间: 2012-2-2 17:18

刚开始养，有好多不懂，希望学习，你除了做MTT还要检测其他哪些指标吗？我是做PD模型，要做MTT测生存率,流式细胞检测凋亡，免疫荧光检测突触蛋白，还有扫描电镜观察突触超微结构，不知到你还要做哪些啊？貌似我也只能用低分化细胞了，才想到我是要检测突触蛋白和观察突触结构的，未分化貌似没法检测，

作者: qhyu 时间: 2012-2-2 17:19

照片好模糊，看不清细胞。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:19

我说的早晨铺板到晚上细胞就已经完全贴壁进入生长期了，这时候如果符合你需要的细胞密度，就可以加药了，按照实验设计药物作用完毕后就可以做MTT了。你用的实验手段和我的差不多，你不需要做WB看一下蛋白表达吗？未分化细胞贴壁这么好很好啊，我第一次养的经历跟你一样，还是用点胰酶吧，买现成的就行，每次用量大概1ml，能刚好覆盖细胞就行，在显微镜下观察，发现细胞都变圆了马上要脱落了就终止消化，然后轻轻吹几下就可以了

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-2 17:21

低分化的比未分化的还好养，而且增殖很快

作者: any333 时间: 2012-2-2 17:21

想问下养过PC12细胞的各位前辈，不知未分化，低分化，高分化的PC12细胞在形态上有什么区别，有没有图片参考下，谢谢

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