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标题: [讨论帖]细胞划痕实验 [打印本页]

作者: 一叶 时间: 2012-2-2 17:23 标题: [讨论帖]细胞划痕实验

很多群友肯定现在都做过关于细胞迁移的实验。
其中划痕法以其材料廉价，操作简单而多年来一直深受大家的欢迎。

我这里介绍一下我自己的操作过程和结果图。希望能给新来的战友们以帮助。

材料：
6 孔板（其他的也可以，但感觉6孔比较好，大小适中）
marker笔
直尺
20微升枪头（灭菌）
无血清培养基
PBS

准备：
所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）

流程：
1。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。
2。在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。
3。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。
4。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。
5。放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。

下面是照片，细胞NIH3T3
0h

图片附件: 30351423.snap.jpg (2012-2-2 17:23, 31.8 KB) / 该附件被下载次数 52
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10496

作者: 一叶 时间: 2012-2-2 17:23

6h NIH3T3

图片附件: 58775614.snap.jpg (2012-2-2 17:23, 35.92 KB) / 该附件被下载次数 30
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10497

作者: 一叶 时间: 2012-2-2 17:24

12h NIH3T3

图片附件: 94070374.snap.jpg (2012-2-2 17:24, 51.83 KB) / 该附件被下载次数 39
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10498

作者: 一叶 时间: 2012-2-2 17:25

24h NIH3T3

图片附件: 40542852.snap.jpg (2012-2-2 17:25, 51.32 KB) / 该附件被下载次数 35
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10499

作者: misswu61 时间: 2012-2-2 17:26

楼主的照片很漂亮但是用六孔板我觉得有些浪费，我们实验室常用的是96孔板，可以同时做很多平行复孔。不知你照片拍完了之后用什么软件统计划痕的宽度呢，我们一般使用共聚焦显微镜自带的软件。你能把统计方法介绍一下吗？

作者: HPLC使者 时间: 2012-2-2 17:26

老实说，我们实验室没有什么好的软件。所以一般只作定性，不作定量。
如果楼上有好的软件能否共享一下，不胜感谢。
6空板可以保证有相当距离的平直划痕，我觉得挺不错的。而且因为有5条定位线，与划痕相交，这样就有10个可固定监测点，不作重复，误差也很小。

作者: hyuu 时间: 2012-2-2 17:27

谢谢楼主，照片很漂亮，实验步骤也很清楚。

需要提醒楼主的是：如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。

照片拍完之后，可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。

作者: 一叶 时间: 2012-2-2 17:27 标题: 回复 #7 hyuu 的帖子

谢谢。无血清的话，应该一个细胞周期内，增殖可以忽略吧。而且我定点监测的话，差不多可以对应到每个细胞。好像没有看见很明显的增殖现象。丝裂霉素貌似很贵的说。。。如果用这个还不如直接用transwell呢。
另，image J 哪里有下载么？谢谢。

作者: TAT 时间: 2012-2-2 17:28

ImageJ 下载网址：cuturl('http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html')

无血清培养，确实细胞增殖可以忽略了，不过由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。不知道是不是大多数文献都用无血清培养状态下作划痕实验呢？你这不是“又叫马儿跑，又叫马儿不吃草么“。呵呵

作者: kulee 时间: 2012-2-2 17:28

谢谢，群友的提醒，确实存在这个问题。所以目前最好的方法还是transwell法。
一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（《2%）否则细胞增殖就不能忽略。一般认为细胞周期是24小时，但对于一些特殊的细胞系来说，生长可能会快一点。因此好像还没看见用带血清培养，短时间检测的。不过我会去试试看。可能是个好方法。
划痕法的意义在于，价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。（比如做加药的，可能会和血清的组分有反映，而且受血清批次的影响，造成误差。如果是铺了ECM物质的，组分就更复杂了。）
划痕法的不足也很明显，适用的细胞系很窄，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为
1。这些细胞本身有迁移能力，且较强。
2。细胞有极性，方便测量，观察。
3。细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的最大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。

另：在此贴出的图片都是本人实验数据，非将本人同意不得转载，引用。如需要引用者，请同本人联系协商。

一下是一种上皮样细胞的48小时监测图。可以看到划痕已近弥合。

图片附件: 18405297.snap.jpg (2012-2-2 17:28, 50.55 KB) / 该附件被下载次数 31
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10500

作者: gogo 时间: 2012-2-2 17:29

现在好多SCI杂志都不认这个实验了，
要求做transwell了。
这个方法无法进行精确定量，前期做起来容易，后期数据处理比较麻烦，还得附图，SCI杂志照片之昂贵，远超过了transwell的价格。

作者: Ao7 时间: 2012-2-2 17:29

Photoshop 6.0以前的版本有个直方图的功能可以直接反映选择区域的象素多少，用来做面积分析应当很好用，用于做划痕修复的实验应当也很好用，当然，有更专业的Image Pro Plus的话PS就没必要了。

作者: Ao7 时间: 2012-2-2 17:30

现在好多SCI杂志都不认这个实验了，
要求做transwell了。
这个方法无法进行精确定量，前期做起来容易，后期数据处理比较麻烦，还得附图，SCI杂志照片之昂贵，远超过了transwell的价格。

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本人正打算投稿呢，其中就包括划痕实验，能否请wuushark 指点一下哪些SCI杂志不认这个实验呢？

我个人认为选择scratch assay 或者是 transwell assay 是根据所研究的细胞系的特点来决定的。
上皮细胞，癌细胞，角质细胞，在生理状态下，形成单层或者复层上皮，当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，scratch assay 很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。
neutrophil, monocyte/macrophage, mesenchymal stem cell, 这类细胞在生理状态下并不形成monolayer, 病理状态下的细胞迁移是在细胞因子或趋化因子的影响下在基质中纵向运动，transwell assay 模拟了这种运动形式，是适合的模型。

作者: 00无名指00 时间: 2012-2-2 17:30

本人正打算投稿呢，其中就包括划痕实验，能否请wuushark 指点一下哪些SCI杂志不认这个实验呢？

我个人认为选择scratch assay 或者是 transwell assay 是根据所研究的细胞系的特点来决定的。
上皮细胞，癌细胞，角质细胞，在生理状态下，形成单层或者复层上皮，当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，scratch assay 很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。
neutrophil, monocyte/macrophage, mesenchymal stem cell, 这类细胞在生理状态下并不形成monolayer, 病理状态下的细胞迁移是在细胞因子或趋化因子的影响下在基质中纵向运动，transwell assay 模拟了这种运动形式，是适合的模型。

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非常同意。其实在伤口弥合中，fibroblast的向创口处迁移就是典型的侧向爬行。但是其实癌细胞的迁移倒不是侧向爬行那么简单，我觉得应该是综合效应，而且要看是什么类型的肿瘤。因为对于远端病灶的转移，显然是通过血液运输的。这是一个细胞去黏附和再黏附的过程。其实transwell也不能很好的模仿这个过程。只是transwell+matrigel可以模仿肿瘤细胞融解基质，侵入到正常组织的这个过程。也就是侵袭。所以对于做cancer的来说，可能transwell会更好些。但我觉得并不能就简单否定scar assay。细胞的迁移作为细胞的一个正常生理活动，是表征细胞生理变化的一个重要指标。这点是很主要的意义。

作者: eric930 时间: 2012-2-2 17:31

请教一个细节问题，在细胞划痕之前，加入无血清培养基24小时，然后再进行划痕，划痕后，加入药物进行观察，此时也需要无血清培养基，对吗？但如果这样的话，要观察加药后48小时，就相当于细胞处于饥饿状态长达72小时，这可行吗？

作者: greenbee 时间: 2012-2-2 17:32

请教一个细节问题，在细胞划痕之前，加入无血清培养基24小时，然后再进行划痕，划痕后，加入药物进行观察，此时也需要无血清培养基，对吗？但如果这样的话，要观察加药后48小时，就相当于细胞处于饥饿状态长达72小时，这可行吗？

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划痕法，只要是超过一个细胞周期的时间都是要无血清的，防止增值的结果影响迁移实验。如果是在12左右的观察，可以用有血清的。如果细胞不能忍受长期饥饿，你可以加药以后再测迁移率。

作者: wsll 时间: 2012-2-2 17:33

可否解释得详细些，如何在加药以后再测迁移率？是指加药前仍用10%血清，加药时改为无血清吗？另外，再请教，如何测量迁移率？目前我所做的只是观察细胞迁移的情况，无法进行定量测量，上面提到的Image Pro Plus，我未找到，不知如何使用？多谢指教！

作者: pencil菲 时间: 2012-2-2 17:34

对，加药时用完全培养基，处理以后，再改用无血清做划痕。划痕法，只能测迁移平均距离，不能测迁移率。测迁移率要用transwell。迁移距离可以拍照后，用Image J来处理。

作者: sunnyB 时间: 2012-2-2 17:34

最近做细胞迁移模型，划痕效果总是不好，拍出的的照片很难看。我是先用单面刀片在6孔板孔里划出一道痕，再用细胞刮刀刮去一边细胞的。要不是划痕深度难把握，要不就是划痕边缘细胞刮不干净，我看文献上很多人都这么做过的。请教各位，有什么方法造的迁移模型比较漂亮。

作者: 园丁## 时间: 2012-2-2 17:34

最近做细胞迁移模型，划痕效果总是不好，拍出的的照片很难看。我是先用单面刀片在6孔板孔里划出一道痕，再用细胞刮刀刮去一边细胞的。要不是划痕深度难把握，要不就是划痕边缘细胞刮不干净，我看文献上很多人都这么做过的。请教各位，有什么方法造的迁移模型比较漂亮。

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刀片是不行的，会把板子划坏的。用枪头划痕，然后可以用细胞刮刮去另一半。还有要看什么细胞系，有的细胞系是很难划得漂亮，因为黏贴不牢，容易带起来，比如293，Hela，都不能得到很直的划痕。最好用上皮类型的细胞，这种细胞贴壁很牢，梭形的，但长密了又可以呈铺路石状，很容易划出漂亮的直线。次之，纤维型细胞也可以，这种细胞贴壁也很牢，但是长密了以后像纤维般纠结在一起，划痕的话，很容易造成很多细胞残片，和漂浮细胞，一定要洗干净。

作者: tangxin_80 时间: 2012-2-2 17:35

maker笔是不是可以用记号笔代替？我总觉得做实验的用品和器材最好是都准备齐，这样做起来会顺利些

作者: qqq111 时间: 2012-2-2 17:35

为什么这个实验不能测迁移率，我们就是一个孔里在划的十字周围拍照，然后数迁过细胞的个数。最后和control的对比啊。另外我们划线的时候枪头用的是进口的那种枪头，并且划的时候会倾斜一定的角度，垂直的话，在划过的区域中会有残留细胞的。

作者: rxcc33 时间: 2012-2-2 17:36

关于划痕我最近也在尝试，参考了国外的一些书，自己弄了定量模型，不知道到时候发文章的时候外国认不认。

其实划痕很大一个问题就是前后拍照的位置不固定，给药前后的视野固定式一个问题。后来经过指点，发现在板后面标记是个好方法，试验几次后用很小的注射器针头，沿直尺划三条平行线。然后待细胞长满后，划痕同样用直尺比对着与原来板后的先垂直做划痕，一般做三道。这样就会存在内外交叉的9个交点。然后每次拍照的时候用4倍物镜下拍照，取9个交点处。这样最后的图像通过处理可以把两张图重叠，以板后的小针划痕的黑影为基准线。这样就可以得出具体出现迁移的面积。

最后定量就是沿着划痕的方向取义个定长的矩形所框定的里面的迁移面积，这样可以排除不平行的问题，而且这个平均面积也可以等同于迁移的平均距离。有张作好的图，为摸索实验的，做的不漂亮，后面好点，先给大家参考下。

具体图像处理是先用photo shop 将图像合成，再用IPP6.或是DT2000等处理并计算面积。

图片附件: 96509257.snap.jpg (2012-2-2 17:36, 25.5 KB) / 该附件被下载次数 41
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10501

作者: 66+77 时间: 2012-2-2 17:37

关于划痕我最近也在尝试，参考了国外的一些书，自己弄了定量模型，不知道到时候发文章的时候外国认不认。

其实划痕很大一个问题就是前后拍照的位置不固定，给药前后的视野固定式一个问题。后来经过指点，发现在板后面标记是个好方法，试验几次后用很小的注射器针头，沿直尺划三条平行线。然后待细胞长满后，划痕同样用直尺比对着与原来板后的先垂直做划痕，一般做三道。这样就会存在内外交叉的9个交点。然后每次拍照的时候用4倍物镜下拍照，取9个交点处。这样最后的图像通过处理可以把两张图重叠，以板后的小针划痕的黑影为基准线。这样就可以得出具体出现迁移的面积。

最后定量就是沿着划痕的方向取义个定长的矩形所框定的里面的迁移面积，这样可以排除不平行的问题，而且这个平均面积也可以等同于迁移的平均距离。有张作好的图，为摸索实验的，做的不漂亮，后面好点，先给大家参考下。

具体图像处理是先用photo shop 将图像合成，再用IPP6.或是DT2000等处理并计算面积。

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这位群友，能否提供：
IPP6.或是DT2000的安装程序，谢谢。

作者: duoduo 时间: 2012-2-2 17:37

真是不错！想问一下，时间点的选择是否一定要在24小时内，以12个小时为单位是否可以？

作者: 2541 时间: 2012-2-2 17:38

我有个问题想请问各位大虾：就是为什么要非要将细胞刮掉再来测定它的迁移率呢？为什么不能一开始就限定细胞的生长的面积？我的意思是说刚开始的时候为什么不能用琼脂糖加到PBS里面或者D-HANKS里面，直接做成胶状，待其凝固后，将一部分给刮掉，然后将细胞传到里面，这样不久可以不用划痕了嘛？不知道这样做有什么不对？请各位指教！
看到有老外是这么做的，不知道可不可行？

作者: 66小飞侠 时间: 2012-2-2 17:38

谢谢楼主，照片很漂亮，实验步骤也很清楚。

需要提醒楼主的是：如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。

照片拍完之后，可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。

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请问一下丝裂霉素的浓度是多少？

作者: pengke1983 时间: 2012-2-2 17:39

能提供丝裂霉素的应用浓度吗?

作者: langlang 时间: 2012-2-2 17:39

mitomycin C 5~20ug/ml for 1 h at 37C

J Biol Chem. 2003 Jun 20;278(25):22555-62.

Clin Oral Implants Res. 2006 Jun;17(3):321-7.

其他的自己去PubMed 查 keyword : mitomycin C, migration, 100多篇原文。

作者: zranqi_1 时间: 2012-2-2 17:40

个人认为还是transwell是目前公认的,但划痕法操作简单并且价格低廉,可以应用于抗血管药物的筛选,特别是中药的筛选,比起CAM筛选可能还要方便些.试验的话,条件允许还是用transwell吧.

作者: october7 时间: 2012-2-2 17:40

楼主和各位战友关于细胞划痕实验探讨了很多问题，我受益匪浅，不知能否就transwell实验提供相应的实验方案以及相应的实验注意事项！！以供大家学习！谢谢了！

作者: wu11998866 时间: 2012-2-2 17:41

感谢楼主的介绍，我也在做相关的实验，由于考虑到将来投稿的问题，所以老板让做transwell实验，下面这个链接是总结Transwell实验的，各位可以参考：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7506372&sty=2')

作者: loli 时间: 2012-2-2 17:42

细胞划痕实验可以用来诱导Hela细胞伪足形成吗

作者: loli 时间: 2012-2-2 17:42

我有个问题想请问各位大虾：就是为什么要非要将细胞刮掉再来测定它的迁移率呢？为什么不能一开始就限定细胞的生长的面积？我的意思是说刚开始的时候为什么不能用琼脂糖加到PBS里面或者D-HANKS里面，直接做成胶状，待其凝固后，将一部分给刮掉，然后将细胞传到里面，这样不久可以不用划痕了嘛？不知道这样做有什么不对？请各位指教！
看到有老外是这么做的，不知道可不可行？

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老兄，这个我试过。结果是。。。失败。几个问题。
1。细胞会趋向于琼脂那面，造成不均匀。这个可能和表面吸附有关。
2。低浓度琼脂很软不行，高浓度琼脂不知道为什么会让培养基迅速变黄。可能是琼脂不纯。
3。琼脂很不好切割，高浓度琼脂（2%）因为比较硬，在切的时候，会和地面脱离，这样种细胞的时候，细胞就会渗到琼脂下面去。

我也看到老外做过，但自己总是做不出来。

作者: idea2011 时间: 2012-2-2 17:44

老兄，这个我试过。结果是。。。失败。几个问题。
1。细胞会趋向于琼脂那面，造成不均匀。这个可能和表面吸附有关。
2。低浓度琼脂很软不行，高浓度琼脂不知道为什么会让培养基迅速变黄。可能是琼脂不纯。
3。琼脂很不好切割，高浓度琼脂（2%）因为比较硬，在切的时候，会和地面脱离，这样种细胞的时候，细胞就会渗到琼脂下面去。

我也看到老外做过，但自己总是做不出来。

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这个问题我当时也遇到过，我是这样处理的：
1、首先澄清一下我用的是琼脂糖，而不是琼脂，第一：琼脂没有琼脂糖干净，第二：琼脂的孔径存在问题，用琼脂糖可以大大减少这个细胞趋向这个问题。
2、我用的是0.8%的琼脂糖，这个浓度很好，不硬不软，当然我刚开始也有黄的现象出现，这样：当琼脂糖凝固之后，你先加一定量的完全培养基，等到24小时之后，再将这个培养基吸掉，这个时候再将细胞传进去，可以解决这个问题。
3、切的时候叫个女生来切，说实话，女生干这个比男生好
这样的话，我感觉就可以了，照片我就不上传了。当然，楼主的方法也不错，我也可以试着做一做。

作者: greenbee 时间: 2012-2-2 17:49

这个问题我当时也遇到过，我是这样处理的：
1、首先澄清一下我用的是琼脂糖，而不是琼脂，第一：琼脂没有琼脂糖干净，第二：琼脂的孔径存在问题，用琼脂糖可以大大减少这个细胞趋向这个问题。
2、我用的是0.8%的琼脂糖，这个浓度很好，不硬不软，当然我刚开始也有黄的现象出现，这样：当琼脂糖凝固之后，你先加一定量的完全培养基，等到24小时之后，再将这个培养基吸掉，这个时候再将细胞传进去，可以解决这个问题。
3、切的时候叫个女生来切，说实话，女生干这个比男生好
这样的话，我感觉就可以了，照片我就不上传了。当然，楼主的方法也不错，我也可以试着做一做。

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谢谢楼上的回答，我还有个问题。就是你铺玩细胞之后，把琼脂去掉的时候，你怎么处理的？很难弄得，我觉得

作者: greenbee 时间: 2012-2-2 17:52

这个问题我当时也遇到过，我是这样处理的：
1、首先澄清一下我用的是琼脂糖，而不是琼脂，第一：琼脂没有琼脂糖干净，第二：琼脂的孔径存在问题，用琼脂糖可以大大减少这个细胞趋向这个问题。
2、我用的是0.8%的琼脂糖，这个浓度很好，不硬不软，当然我刚开始也有黄的现象出现，这样：当琼脂糖凝固之后，你先加一定量的完全培养基，等到24小时之后，再将这个培养基吸掉，这个时候再将细胞传进去，可以解决这个问题。
3、切的时候叫个女生来切，说实话，女生干这个比男生好
这样的话，我感觉就可以了，照片我就不上传了。当然，楼主的方法也不错，我也可以试着做一做。

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这个琼脂糖怎么灭菌的？直径是多少，大侠指点一下啊!

作者: greenbee 时间: 2012-2-2 17:56

这个琼脂糖怎么灭菌的？直径是多少，大侠指点一下啊!

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直接称取一定量的琼脂糖，用PBS或者D-HANNKS液调整浓度，放入一个大体积的烧瓶里面，包扎，灭菌即可。用的时候在微波炉里熔化即可用。

作者: greenbee 时间: 2012-2-2 17:58

我想知道你们在拍照片的时候需要染色吗，不然拍出来的照片会不好看啊，如果染色用什么染色好些，知道的告诉下，谢谢拉！

作者: sunnyB 时间: 2012-2-2 17:59

Gut. 2007 Jan;56(1):95-106. (sci Impact Factor 9.002 )
Thompson CC, Ashcroft FJ, Patel S, Saraga G, Vimalachandran D, Prime W, Campbell F, Dodson A, Jenkins RE, Lemoine NR, Crnogorac-Jurcevic T, Yin HL, Costello E.Pancreatic cancer cells overexpress gelsolin family-capping proteins, which contribute to their cell motility. Gut. 2007 Jan;56(1):95-106. (sci Impact Factor 9.002 )

方法：In vitro wound-healing assay
Panc-1 and Suit-2 cells were treated with siRNA as described above. After incubation for 72 (CapG) or 48 (Gelsolin) h, the cells were removed by trypsinisation, counted and plated at 400000 cells/ml in 12-well dishes. Cells were incubated overnight yielding confluent monolayers for wounding. Wounds were made using a pipette tip and photographs taken immediately (time zero) and 12 or 16 h after wounding for Suit-2 and Panc-1 cells, respectively. The distance migrated by the cell monolayer to close the wounded area during this time period was measured. Results were expressed as a migration
index—that is, the distance migrated by siRNA treated (control or targeted) relative to the distance migrated by RISC-free control RNA treated cells. Experiments were carried out in triplicate and repeated at least five times.

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10502

图片附件: 78003761.jpg (2012-2-2 17:59, 69.13 KB) / 该附件被下载次数 112
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10503

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-2-2 18:00

我做的是药物血浆，我想知道划痕实验什么时候加药物血浆最好，是不是先用全培培养，待铺满单层后再用药物血浆培养干预，再划痕，换成无血清培养观察是吗？

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-2-2 18:01

这个问题我当时也遇到过，我是这样处理的：
1、首先澄清一下我用的是琼脂糖，而不是琼脂，第一：琼脂没有琼脂糖干净，第二：琼脂的孔径存在问题，用琼脂糖可以大大减少这个细胞趋向这个问题。
2、我用的是0.8%的琼脂糖，这个浓度很好，不硬不软，当然我刚开始也有黄的现象出现，这样：当琼脂糖凝固之后，你先加一定量的完全培养基，等到24小时之后，再将这个培养基吸掉，这个时候再将细胞传进去，可以解决这个问题。
3、切的时候叫个女生来切，说实话，女生干这个比男生好
这样的话，我感觉就可以了，照片我就不上传了。当然，楼主的方法也不错，我也可以试着做一做。

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我想在转染后再划痕，请问您有什么建议吗？多谢多谢

作者: langlang 时间: 2012-2-2 18:02

我最近也想做划痕,楼主的照片很漂亮,请问你说的在背后划5条线是不是横着划,然后划痕是竖着划,这样就相交,然后分别测五条线之间缩进的距离,再平均一下??? 还有,为什么图片会有桔黄色和粉色,我照出来的只是培养基的粉色.麻烦帮我解答一下,多谢了!

图片附件: 36874342.jpg (2012-2-2 18:02, 12.63 KB) / 该附件被下载次数 47
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10504

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-2 18:03

请问哈划痕实验结果怎样分析
最后那步可以直接拍照吗?不用染色或采用其他什么措施让照片看起来更清晰吗?

作者: kswl870 时间: 2012-2-2 18:03

如果将细胞种在六孔板内，用枪头划痕时，可以将六孔板的的长轴垂直于自己，划横线那样就会比划竖线力道更均匀，线划得更直更好一些。

作者: 8s5g 时间: 2012-2-2 18:04

很多战友肯定现在都做过关于细胞迁移的实验。
其中划痕法以其材料廉价，操作简单而多年来一直深受大家的欢迎。

我这里介绍一下我自己的操作过程和结果图。希望能给新来的战友们以帮助。

材料：
6 孔板（其他的也可以，但感觉6孔比较好，大小适中）
marker笔
直尺
20微升枪头（灭菌）
无血清培养基
PBS

准备：
所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）

流程：
1。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。
2。在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。
3。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。
4。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。
5。放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。

下面是照片，细胞NIH3T3
0h

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请问划痕的宽度有什么要求吗，一般宽度是多少？

作者: okhaha 时间: 2012-2-2 18:05

请问划痕后如何定点监测呢？怎么找之前拍照的那个位置？

作者: misswu61 时间: 2012-2-2 18:09

请问是20微升的枪头还是200枪头？

作者: viviwang1987 时间: 2012-2-2 18:10

很好，目前我也正在做这个实验，有那位有具体的实验步骤吗？不胜感谢！

作者: kewanqi2011 时间: 2012-2-2 18:11

我最近也想做划痕,楼主的照片很漂亮,请问你说的在背后划5条线是不是横着划,然后划痕是竖着划,这样就相交,然后分别测五条线之间缩进的距离,再平均一下??? 还有,为什么图片会有桔黄色和粉色,我照出来的只是培养基的粉色.麻烦帮我解答一下,多谢了!

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我也有同样的问题，楼主照片的颜色是调出来的吗？

作者: kewanqi2011 时间: 2012-2-2 18:12

请问一下丝裂霉素的浓度是多少？

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1ug/ml

作者: utt0989 时间: 2012-2-2 18:12

请问计数迁移的细胞，IPP软件应该具体怎么操作呢

作者: tieshazhang 时间: 2012-2-2 18:12

这个时间主要是考虑细胞饿得增殖，要控制细胞的增殖，否则划痕的愈合可能不是由于细胞的迁移造成，而是增殖造成。

作者: 白白的 时间: 2012-2-2 18:14

我最近也想做划痕,楼主的照片很漂亮,请问你说的在背后划5条线是不是横着划,然后划痕是竖着划,这样就相交,然后分别测五条线之间缩进的距离,再平均一下??? 还有,为什么图片会有桔黄色和粉色,我照出来的只是培养基的粉色.麻烦帮我解答一下,多谢了!!!!!

我也有同样的问题，楼主照片的颜色是调出来的吗？

我是将照相时候的色彩饱和度调到最低
这样就是黑白的了

作者: abc816 时间: 2012-2-2 18:15

很好的贴，学到了很多。我们实验室最近在做这个实验，但是效果不是很理想。我们只要做的是药物对血管上皮细胞迁移的影响，是划痕后加药，这个药物浓度的设定有没有什么讲究呢？虚心请教各位战友~

作者: yueban-1147 时间: 2012-2-2 18:15

很好的贴，学到了很多。我们实验室最近在做这个实验，但是效果不是很理想。我们只要做的是药物对血管上皮细胞迁移的影响，是划痕后加药，这个药物浓度的设定有没有什么讲究呢？虚心请教各位战友~

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要排除药物对细胞增殖的影响！

作者: summerxx 时间: 2012-2-2 18:17

oncogen (2010) 29, 2130-2141
BAX inhibitor 1 enhances cancer metastasis by altering glucose metabolism and activating the sodium-hydrogen exchanger the alteration of mitochondrial function.
文章里同时做了transwell和划痕，也有介绍划痕结果的统计方法，大家看看吧。

作者: ququer787 时间: 2012-2-2 18:17

请问各位战友，如果想转染后再做细胞划痕实验，那么要不要先把转染好了的细胞收集起来然后再重新铺板，划线？抑或直接在转染平板上划线？

第二种做法的平板上，细胞的分布会不会不够均匀？

作者: xue258 时间: 2012-2-2 18:19

关于划痕我最近也在尝试，参考了国外的一些书，自己弄了定量模型，不知道到时候发文章的时候外国认不认。

其实划痕很大一个问题就是前后拍照的位置不固定，给药前后的视野固定式一个问题。后来经过指点，发现在板后面标记是个好方法，试验几次后用很小的注射器针头，沿直尺划三条平行线。然后待细胞长满后，划痕同样用直尺比对着与原来板后的先垂直做划痕，一般做三道。这样就会存在内外交叉的9个交点。然后每次拍照的时候用4倍物镜下拍照，取9个交点处。这样最后的图像通过处理可以把两张图重叠，以板后的小针划痕的黑影为基准线。这样就可以得出具体出现迁移的面积。

最后定量就是沿着划痕的方向取义个定长的矩形所框定的里面的迁移面积，这样可以排除不平行的问题，而且这个平均面积也可以等同于迁移的平均距离。有张作好的图，为摸索实验的，做的不漂亮，后面好点，先给大家参考下。

具体图像处理是先用photo shop 将图像合成，再用IPP6.或是DT2000等处理并计算面积。

本人眼拙，没大看懂，请赐教！

作者: gogo 时间: 2012-2-2 18:19

很受益，最近一直在做，但是做出的结果不太理想，我是划痕加药24h后将细胞固定，然后W-G染色，可是染色效果不理想，请问需要染色吗，不染色是不是也可以，另外如何确认划痕宽度呢，一直没想明白，图像处理也不会，还得学习下IPP软件

作者: 04906 时间: 2012-2-2 18:20

关于划痕我最近也在尝试，参考了国外的一些书，自己弄了定量模型，不知道到时候发文章的时候外国认不认。

其实划痕很大一个问题就是前后拍照的位置不固定，给药前后的视野固定式一个问题。后来经过指点，发现在板后面标记是个好方法，试验几次后用很小的注射器针头，沿直尺划三条平行线。然后待细胞长满后，划痕同样用直尺比对着与原来板后的先垂直做划痕，一般做三道。这样就会存在内外交叉的9个交点。然后每次拍照的时候用4倍物镜下拍照，取9个交点处。这样最后的图像通过处理可以把两张图重叠，以板后的小针划痕的黑影为基准线。这样就可以得出具体出现迁移的面积。

最后定量就是沿着划痕的方向取义个定长的矩形所框定的里面的迁移面积，这样可以排除不平行的问题，而且这个平均面积也可以等同于迁移的平均距离。有张作好的图，为摸索实验的，做的不漂亮，后面好点，先给大家参考下。

具体图像处理是先用photo shop 将图像合成，再用IPP6.或是DT2000等处理并计算面积。

请问可否提供IPP具体分析步骤？谢谢

图片附件: 96509257.snap.jpg (2012-2-2 18:20, 25.5 KB) / 该附件被下载次数 36
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10505

作者: 8s5g 时间: 2012-2-2 18:21

我想做放射对肿瘤细胞侵袭能力的影响，想现在做划痕实验，应该先划痕还是先照射？谢谢

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