分析测试百科

标题: [求助]请教细胞线粒体分离方法． [打印本页]

作者: pencil菲 时间: 2012-2-7 17:18 标题: [求助]请教细胞线粒体分离方法．

我想做的实验是观察培养细胞被某种药物作用后，细胞线粒体内细胞色素C向细胞质的释放情况．因此，需要在药物作用一段时间后，收集细胞，分离线粒体和细胞质两部分，分别进行Western，对各自细胞色素C含量进行检测．可是一直没有找到分离线粒体和细胞质的方法及步骤，有哪位老师明白，最好是曾经做过的，教一下．谢谢

作者: is2011 时间: 2012-2-7 17:18

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1625415&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1625415')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=648137&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#648137')

作者: pencil菲 时间: 2012-2-7 17:19

您提供的帖子里的方法分离了线粒体，可线粒体的完整性没有被破坏。
对于western来说，我要分析线粒体里面的蛋白，是不是要把线粒体破碎才可以呀？直接用帖子里的方法提取的完好线粒体能直接做western检测线粒体里面的蛋白么？

作者: is2011 时间: 2012-2-7 17:20

说清楚了就好了，这方面的实验我也没有做过，呵呵！还好旁边一个同学做过。
那首先您得分离线粒体(这步很重要的 )，也可以咨询一下这个公司。
cuturl('http://www.perbio.com.cn/PIERCE/Molecular%20Biology/mis%20islo.htm')
再用细胞裂解液或者超声破碎线粒体。
cuturl('http://www.cella.cn/book/07/01.htm')
前面帖子的方法来自冷泉港的《细胞实验指南》上册，您可以找本书参考一下。
文献两篇参考一下吧。

作者: pencil菲 时间: 2012-2-7 17:20

因为我的实验要分离并得到同一瓶细胞的线粒体蛋白质和胞浆蛋白，两者都得收集，以比较两者内某种蛋白的差别。在国内一篇文献我找到了简单的方法，可是真的不知道他介绍的方法对不对，他这样做真的很简单喔，还是中华牌的杂志啊。
文章剪辑部分如下：
免疫蛋白印迹检测细胞色素Ｃ:细胞培养于Ｐ100培养皿,浓度1.5×106/皿。不同时相点用ＰＢＳ冲洗培养皿2次,将细胞从皿中刮出置匀浆管中,800×ｇ离心10ｍｉｎ,小心移去上清液。加入0 5ｍｌ细胞裂解液(20ｍｍｏｌ/ＬＨＥＰＥＳ,ＰＨ7.5;10ｍｍｏｌ/ＬＫＣｌ;1.5ｍｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ2;1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ;1ｍｍｏｌ/ＬＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ;1ｍｍｏｌ/ＬＰＭＳＦ)冰浴3ｍｉｎ;转速为2000ｒ/ｍｉｎ匀浆3ｍｉｎ;将裂解液移至ＥＰ管中750×ｇ4℃离心25ｍｉｎ,上清液为细胞浆成分,沉积物为线粒体成分,溶解于50ｍｌ细胞裂解液中。
然后作者就对细胞浆成分和线粒体成分进行western了，呵呵。
我不会在网上发caj.的全文，否则就整个发上来了。有作过的站友么？帮一下。谢了。

作者: pencil菲 时间: 2012-2-7 17:21

他这样做可以分离细胞浆和线粒体么？

作者: is2011 时间: 2012-2-7 17:21

是这篇吧？《线粒体细胞色素C释放在H_2O_2诱导内皮细胞凋亡中的作用》。不可行的，找个高手回答你，一会就来了！呵呵！

作者: flower-201 时间: 2012-2-7 17:23

其实分离线粒体没有你想象中的那么难，主要还是通过差速离心来实现

作者: flower-201 时间: 2012-2-7 17:25

使用dounce上下数十次。次数视细胞种类而定，最好十次取匀浆若干做台盼蓝染色，细胞蓝染在50-70%即可，进行差速离心分离，按上面的推荐。注意：次数太少细胞不会破裂，太多线立体也会破裂。力道和次数一定要掌握好，否则不会有好的结果。可以先做预实验，取未做任何处理细胞一瓶，匀浆后差速离心分离胞浆和线立体分别做western

作者: flower-201 时间: 2012-2-7 17:25

就是黄培堂翻译的那本细胞实验指南呀！司徒镇强的是细胞培养！

作者: pencil菲 时间: 2012-2-7 17:26

线立体是在哪步被破碎的呢？完整的线立体可以做western么 ?

作者: flower-201 时间: 2012-2-7 17:27

在整个线粒体的提取过程中都要尽可能保证线粒体不被破坏!当然要用完整的线粒体来做Western!作Western时加入裂解液后线粒体就破碎了!

作者: pencil菲 时间: 2012-2-7 17:27

提取到完整的线粒体后，用MS缓冲液悬浮。此时线粒体还是完整的，怎么测定蛋白浓度呢？
是不是MS缓冲液就可以把线粒体破碎呢？
还是线粒体沉淀不要用MS悬？而是用另外的裂解液呢？最后悬线粒体的不是MS缓冲液吧？裂解液应该和平时提取细胞总蛋白的一样才对吧？

作者: pencil菲 时间: 2012-2-7 17:28

我也是检测细胞色素C啊！
1、你用的蛋白酶抑制剂是“胃蛋白酶抑制剂”还是“胰蛋白酶抑制剂” 呀？都一样么？
2、甘露醇临床用的不行啊，有哪家试剂公司卖？
3、没有dounce匀浆器怎么办？
我怎么这么惨？什么都没有？在我们这里当研究生真是太郁闷啦！！

作者: flower-201 时间: 2012-2-7 17:28

1.两个都加了；
2.随便找个试剂公司，买一瓶至少是分析纯的甘露醇。临床用的没试过；
3.只好问别人借了，我用的是2ml的匀浆器，不过现在不在我手上了～～
4.提完线粒体后如果马上进行Western，可以不用MS缓冲液，直接用Western蛋白裂解液裂解；如果不能马上进行试验，最好还是保存在MS缓冲液中。
5.用Bradford法或福啉酚法测定蛋白浓度，一般的生化试验指导书上都应该有的！

作者: pencil菲 时间: 2012-2-7 17:28

请问两种蛋白酶抑制剂都加，是每种1微升么？

作者: pencil菲 时间: 2012-2-7 17:29

还有，如果不马上做western。那蛋白质都包在完整的线粒体里，怎么能测定蛋白质浓度呢？

作者: flower-201 时间: 2012-2-7 17:30

两种抑制剂我是按照分子克隆第二版Western裂解液配方中的浓度加的，其实过量一点好像关系也不大！
一般我在作Western之前测蛋白的浓度；

作者: pencil菲 时间: 2012-2-7 17:30

蛋白质不是可以保存在-20度么？为什么偏偏不能将线粒体裂解后保存其蛋白，而一定要完整的保存？
每次做western前都要裂解一次线粒体，然后测定蛋白质浓度，不是既麻烦又没必要吗？

作者: flower-201 时间: 2012-2-7 17:30

将线粒体裂解后保存其蛋白也可以,不过还是尽快作Western,时间长了蛋白还是会降解的;
如果嫌麻烦,可以测定同一批次的线粒体蛋白浓度,然后保存;我觉得每次做western前测一下蛋白浓度更好一些.
以上为个人意见,仅供参考.

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)