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标题: [求助]求助流式细胞仪测定细胞ROS的方法？ [打印本页]

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-2-8 17:15 标题: [求助]求助流式细胞仪测定细胞ROS的方法？

我用流式细胞仪测定SY5Y细胞的ROS？请问有谁做过吗？能告诉我具体方法和注意事项吗？不甚感激！
所加入的荧光探针DCFH-DA，如何配置，需要储存浓度和工作浓度各是多少？

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-2-8 17:17

请教：DCFH-DA需要现配吗？
活性氧应该在外界因素作用后多长时间检测比较合适！既然活性氧化学性质活泼，是不是检测晚了，结果会偏低？
请各位师兄师姐帮帮忙，多谢！

作者: 西子 时间: 2012-2-8 17:17

给药前或造模前半小时加入荧光探针

作者: jrwyyplt 时间: 2012-2-8 17:18

到GOOGLE上收DCFH-DA，你可以进入碧云天的网站，他们有详细的说明书，照着做就行了

作者: bohe221 时间: 2012-2-8 17:18

我用的是碧云天的试剂盒,探针也是DCFH-DA,浓度和阳性对照是按说明书加的,效果不错.一般是探针孵育20mins到３０mins，然后加阳性对照和自己感兴趣的药物刺激细胞，上机检测．

作者: zhezhe 时间: 2012-2-8 17:19

请问：有流式上机检测之前，细胞是要消化成悬浮液吗？还是直接就可以在6孔板上检测吗？谢谢

作者: 西子 时间: 2012-2-8 17:19

介绍一下我的方法：
1.DCFH-DA配制
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而 DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
DCFH-DA分子量：487.29 g/mol，我买的是sigma的，很便宜。文献使用的终浓度为5－50uM，一般用10uM，我使用的是20uM，建议正式做实验前先摸个DCFH-DA的合适浓度。用DMSO配成20mM母液，－20度冻存。
2.方法
加药处理完（我从收细胞到检测需要操作3小时）
1，消化收集细胞，注意连上清一起收集，收集所有的细胞，放入EP管。
2，温PBS洗一遍。
3，用无血清培养液按1000:1配DCFH-DA，每个样本需要1ml工作液，预温。
4，每个样本用1ml工作液重悬
5，将EP管放入培养箱，孵育20min－1h，我孵育30min。每隔3-5分钟颠倒混匀一下。
6，离心收细胞，温PBS洗3遍，注意弃尽上清，因为DCFH-DA本底很高。
7，1ml PBS重悬，上机检测，使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用。
3.注意
1，收集细胞要完全，连同培养液上清一起离心，这是收集细胞的常规操作。
2，预温的试剂室温其实就可以了，不要用冰的，这样会影响DCFH的反应。
3，对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先用DCFH-DA处理，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后用DCFH-DA处理。我处理时间是24h，所以先处理，后用DCFH-DA。
4，由于我的药物会使细胞漂起来，所以采用消化收集细胞的方法，收集所有细胞，但洗细胞的时候很麻烦。如果细胞贴壁很好，就不要这么麻烦了。直接在平皿里洗洗，DCFH-DA处理，再洗洗，再消化收集细胞，上机检测。操作很简单。
5，实验过程不需要避光。

作者: 西子 时间: 2012-2-8 17:22

其实并非一定要用流式来测，DCF是一种绿色荧光，所以只要是能测荧光的方法就可以测。要求不高的话，或只是要定性检测的话，在荧光显微镜下看看就可以了。另外，还可以用荧光读板机来测，也是很好的，不一定非要用流式。
用荧光读板机的话，就可以用专用的96孔板来养细胞，并检测，操作简单，不需要像流式检测那样来收细胞，但结果不如流式精确，因为：1，荧光读板机读值的时候，是取某些点的荧光值，并不是整个底面的荧光值，所以不能准确反应所有细胞的荧光强度；2，每孔的细胞数目有限，所以荧光值不可能太高，有时甚至很低，从而本底的影响就会比较大；3，孔于孔之间如果细胞数有差异，那么也会影响结果，由于流式检测的细胞数目是一定的，所以不存在这个问题。要解决这个问题就需要采用内参矫正。方法有用hochest 33342染色，激发波长为352 nm，发射波长为461 nm，由此测得的值为内参，反应细胞数目，DCF荧光值/ hochest 33342荧光值即为矫正后的实际荧光值。不过据说用hochest 33342来做很贵。我用的是一种很便宜的方法，就是MTT。测完DCF后，加入MTT，再到酶标仪上测个OD，也是内参，简单、方便、便宜。

作者: 西子 时间: 2012-2-8 17:23

为了解决上述荧光读板机存在的局限，我把流式和上面的方法结合起来。
首先，种板加药处理细胞和流式是一样，这样细胞数很多，DCFH-DA处理过程也和流式一样，只是不上流式检测。
取一半细胞，用专用裂解液裂解，我用的这个裂解液是做transwell时，chemicon ECM 554试剂盒里带的，当时没用，现在就用来做这个。配方大家可以去网上查查。取荧光读板机专用的96孔板，先放进机子测一个本底。再拿出来，每空滴上细胞裂解液，检测。这样做的好处是，1，如果直接在孔里种细胞，细胞量比较少，最多2－3×104，而用裂解的方法，细胞量可以增加几十甚至几百倍，本底的影响就很小了。2，裂解液的荧光是很均匀的，从而避免直接种板细胞分布差异带来的影响。
另一半细胞用培养液重悬，加MTT，12000 rpm，5min，离心收集紫色结晶，加DMSO溶解，加入普通96孔板，酶标仪检测。
至于每孔加多少裂解液，或每孔加多少溶解结晶后的DMSO，关系不大，因为最后所得的都是相对值，但不要太少，太少读数太小，也不要太大，超过机器读数的线性范围。

作者: 西子 时间: 2012-2-8 17:24

这么做比流式麻烦，但如果用别人的流式要给钱，那就不妨试试这种方法，呵呵

作者: misswu61 时间: 2012-2-8 17:24

你好，我也要测细胞中的活性氧水平，能不能把相关参考资料发给我，我的邮箱是zmz2005052@126.com 谢谢！
我现在使用南京建成的H2O2检测试剂盒，但结果不理想，有谁使用这种方法吗？能不能传授下经验？
还是有更好的检测细胞产生的活性氧水平的方法？
望请赐教，谢谢

作者: xueyouzhang 时间: 2012-2-8 17:24

请教:
我也要使用DCF测脂多糖(LPS)刺激细胞的ROS产生,但每次处理完后在荧光显微镜下观察,对照组也有很强的荧光,几乎看不出和LPS刺激组的区别,我看文献上别人的对照组都是很弱的荧光,为什么我的就会这么强呢? 我也使用过专门测线粒体内ROS的一个染料(MITO-SOX),同样也是对照组很强的荧光.真是把我头都搞大了,反复了很多次了,没什么变化,所以作过相关实验的高手指点下小弟,不胜感激!!!
我的操作步骤是:LPS组,加1或10μG/ML的LPS;对照组加培养基,一个小时后去掉液体.加20μM的DCF染料,孵育30分钟后用PBS洗三次,然后在荧光显微镜下观察.

作者: 中国特色 时间: 2012-2-8 17:25

我用了碧云天的活性氧试剂盒，严格按照其说明书操作，但无论在荧光显微镜还是流式检测，发现阴性对照（装探针后不加刺激）和阳性对照（用其试剂盒内的阳性刺激1：1000）没有差别，镜下都有绿色荧光（细胞内），流式阳性细胞比例（2.9，3.1），阳性对照浓度提高到1：100，镜下绿色荧光无差别（细胞内），流式阳性细胞比例（2.9，4.1），到细胞点图仍是一团细胞，阳性对照浓度提高到5：100，镜下绿色荧光无差别（细胞内），细胞大部分标器或碎裂或法测流式了。
求高手指点！

作者: hyuu 时间: 2012-2-8 17:25

1、"活着真累"提到的对"阴性对照"的处理是不对的.所谓"阴性对照"是不加探针不加刺激的对照组，目的是检测下细胞本身荧光本底的大小，因为流式给出的荧光数值是相对的，阴性对照的值可以作为一个坐标零点看待；
2、不给刺激只加探针的处理组应为“正常对照”，因为没有接受刺激的细胞也是有ROS产生的，用探针标记后会有荧光显示很正常的。该对照是为了观察你的刺激对细胞ROS产生的影响。
3、“阳性对照”是为了检测整个探针标记系统是否存在问题，就我的经验，只要阳性对照有荧光显示，高与低对实验都没有太大影响。

作者: 中国特色 时间: 2012-2-8 17:25

在正常对照虽然有荧光显示,但应该不是很强啊,我看文献上的就是很弱的荧光.但我的正常对照却有很强的荧光,和刺激组的都看不到什么区别,肯定是哪里出了问题,还请高手指点啊

作者: loli 时间: 2012-2-8 17:27

楼上说的阴性对照我也做过流式，和正常对照仅是数值上的区别（阴性1.9/正常2.9），细胞点图都是一堆，镜下未观察。
现在关键是如何做出阳性对照和正常对照镜下的明显区别以及流式点图的区别，因为我的条件刺激和正常对照、阳性对照无论镜下还是流式都差不多，我不知道是否显著刺激了活性氧的产生。

作者: 中国特色 时间: 2012-2-8 17:27

这是我做的 BV－2细胞，正常对照和刺激组的都有很强的荧光。

图片附件: 39072000.jpg (2012-2-8 17:28, 40.82 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10577

作者: 中国特色 时间: 2012-2-8 17:28

而且很多细胞就是一团荧光，对不准焦，形态不清晰。
以前看过一高手做的不管荧光强弱，都很漂亮。现将他的图片发上来和我的对照一下。
区别实在是太大了，
请各位高手指点啊！！！

图片附件: 32894399.jpg (2012-2-8 17:28, 70.78 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10578

作者: october7 时间: 2012-2-8 17:28

这是我做的 BV－2细胞，正常对照和刺激组的都有很强的荧光。

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你的dcf用的是多大浓度，建议你减低浓度试试~~

作者: dog002 时间: 2012-2-8 17:29

说的阴性对照我也做过流式，和正常对照仅是数值上的区别（阴性1.9/正常2.9），细胞点图都是一堆，镜下未观察。
现在关键是如何做出阳性对照和正常对照镜下的明显区别以及流式点图的区别，因为我的条件刺激和正常对照、阳性对照无论镜下还是流式都差不多，我不知道是否显著刺激了活性氧的产生。

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如果你做了流式，我想知道你的正常对照又没有阳性峰出现~
阴性对照一般只有一个阴性峰，而正常对照等会有阳性细胞出现，各组间阳性率以及峰值会有差异，我不知道你的到底是个什么情况~

作者: 中国特色 时间: 2012-2-8 17:29

我用的是10μM的DCF，先用乙醇稀释DCF粉末，制成10MM的DCF溶液，然后用培养基稀释到使用浓度。
在荧光显微镜下观察，细胞就是一团荧光，对不准焦，形态不清晰。

作者: newway 时间: 2012-2-8 17:30

请教各位大虾，我也作流式定量测定单个核细胞内ROS的含量，买的是碧云天的试剂盒，严格按说明书操作，结果在电脑显示是比较理想的，荧光也很强，但我发现，同一类病人，作出的结果往往相差很大。同一个人的标本，不同批次去测，结果也相差很大。
请问流式测定ROS，最后的结果如何分析。是只需要平均荧光强度吗，还是和细胞数量也有关系。谢谢

作者: TNT 时间: 2012-2-8 17:30

我也用的碧云天的活性氧试剂盒，并且按说明书步骤做的，可是为什么我加了阳性对照后依然看不到绿光呢？而且好像加了阳性对照的细胞死亡的很多，我的细胞是HL-60细胞（一种悬浮细胞），DCFH-DA的浓度是10微摩尔/升，1ml的细胞液中加了阳性对照1微升，用蓝光激发的。希望大家能帮我解答。

作者: orangecake 时间: 2012-2-8 17:30

我最近也打算做活性氧的试验，想找说明书看一看。可是最近碧云天的网站上不去了，给指点一下怎样才能上碧云天的网站吧。或者其它的网站也行。谢谢！

作者: 831226 时间: 2012-2-8 17:31

我也在作活性氧检测，现在还是不太明白阳性对照组如何做，是只加活性氧和探针吗？怎么用流式检测呢

作者: ha111 时间: 2012-2-8 17:35

建议直接购买SIGMA的DCFH-DA，380元左右吧，荧光效果相当好。
我们同一实验分别采用了碧云天的试剂盒和SIGMA的DCFH-DA粉剂，结果碧云天的荧光弱，而且组间无差别，用sigma的粉剂自己配置DCFH-DA溶液，一次出结果。有时图便宜反而更费钱啊。

SIGMA的DCFH-DA粉剂建议合买，一个人根本用不完。
取所需分量（够自己实验用的）直接用无血清培养基溶解即可，勿需任何溶媒处理，溶解性非常好。短期可4度保存。

我实验中是长期刺激细胞（10h），所以干预后才装载探针，终浓度10uM或20uM都可。贴壁状态下直接装载，避光孵育30min，PBS洗2遍，消化至悬，上流式检测。荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。

作者: ha111 时间: 2012-2-8 17:37

如果浓度太大，在荧光显微镜观察时，就会造成没有差别，都是一片强荧光。我稀释到1UM，结果挺好的。可以用点双氧水刺激一下，但注意要充分洗涤，做个对照，就能摸出最佳的浓度了。
至于流式，做起来也很简单的。调好对照就行了。

作者: guagua 时间: 2012-2-8 17:37

大家好，我也准备做这方面的实验，我想咨询一下相关问题。我的细胞也是长期刺激细胞（12h）,所以要干预后才装探针，但是我的阳性对照是买的碧云天的rosup需要在上机前半个小时加入，那我阳性对照组能不能先装探针再加rosup,这个顺序和sample的顺序不同可以吗？还有其他可以解决的途径吗？另外，贴壁细胞消化后需要离心用PBS洗吗？还是可以直接上机啊，我用荧光酶标仪测的话也需要消化后PBS洗吗？

作者: ALALA 时间: 2012-2-8 17:38

看了那么多有个问题不太明白用流式测完以后得到了 mean值，最后如何统计这个数据？
一般采用增加倍数（increase folder）作图，但是怎么算出来呢? 是实际值/阴性对照？

还是都需要减去本底也就是只有染料没有细胞？不太明白求高人指点

作者: 987789 时间: 2012-2-8 17:38

这个是不是不同的刺激时间这个荧光剂加入的时机是不一样的？我的需要刺激24小时

作者: 987789 时间: 2012-2-8 17:38

还有，这个DCFH-DA测ROS的是测的超氧离子还是过氧化物？

作者: 2541 时间: 2012-2-8 17:39

想问下群友，我最近也在用荧光酶标仪测细胞内ROS的含量，我想问下你用来裂解的细胞的专用裂解液可以用做western提取蛋白的裂解液替代吗？我问了一下试剂公司，他们说要测细胞内荧光就用那种非变性的裂解液，上海生工有一种一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒，不知道能不能用来做这个，而且它这个裂解需要震荡5-10分钟，不知道这么长时间裂解对荧光有没有影响，还请你帮我指点迷津啊，谢谢了!

作者: jijuancindy 时间: 2013-3-7 08:45 标题: 回复 #7 西子的帖子

“对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先用DCFH-DA处理，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后用DCFH-DA处理。我处理时间是24h，所以先处理，后用DCFH-DA。
”
请问您上面所说的，因为处理时间是24h，所以先处理后用DCFH-DA，那活性氧阳性对照也是跟自己的样品处理一样的时间吗？例如您的24h。。。

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