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标题: [求助]]关于PI单染！ [打印本页]

作者: 00无名指00 时间: 2012-2-9 11:54 标题: [求助]]关于PI单染！

我第一次接触流式细胞仪，准备用PI单染法检测悬浮的细胞周期和晚期凋亡率，现有几个关于流式PI单染的问题向各位高手请教！
１）－２０度７０％乙醇固定细胞时是过夜好还是２小时好，固定后可以放在－20度冰箱么，还是放在4度冰箱，最长能保存多长时间，时间太长对检测结果会产生怎样的影响；
２）有的书上提到染色前要用DNA抽提缓冲液作用５分钟，这个缓冲液是不是就是所谓的PC液，因为我看两者的成分是一样的，能用0.5%TritonX-100 的PBS代替么；如果配置的ＰＩ染液内含有TritonX-100,还要加ＰＣ液么；
３）加ＰＩ的量是根据什么来计算的；
４）书上说加PI 30分钟后即可上机检测，但有的人说加PI后只要避光能保存１－２天，是这样么？
5）细胞的前期处理需要使细胞同步化么？
多谢！

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-9 11:55

1，过夜！－20度！几个月没问题，超过半年没试过！
2，就是PC buffer！不能代替！抽提和破膜是两个概念！抽提时间30min，有的书上要冰浴，有的不要，我的经验是：都可以！
3，1×PI，10的6次方个细胞5ul ！
4，我们实验室是室温，避光，1h！可以保存，但不是必须保存，保存时间长了后，cv值不好！
5，根据试验要求定！

好运！

作者: 00无名指00 时间: 2012-2-9 11:55

非常感谢园丁##！在此之前Search过的，因为对有些问题还很模糊，所以还是想确定一下！我还想请教一下，亚G1峰检测、晚期细胞凋亡率及细胞周期检测用的都是PI单染法，这几项指标对细胞的处理有何不同？我在书上看到的是前者需要DNA抽提，但是后两项检测则要破膜，师姐则说不需要破膜，她自己做的效果也不错！我今天第一次去做流式，没有用破膜剂，那老师也没有说什么，是不是说破膜不是必须的？

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-2-9 11:56

我们实验室流式技术应该说是很强的，而我们的试验也主要是根据流式而展开！用PC buffer的目的主要是使凋亡细胞内的低分子量的DNA抽提得更加充分，使凋亡细胞与非凋亡细胞在大量存在的同时不出现重叠！

我个人建议使用！

作者: 00无名指00 时间: 2012-2-9 12:07

又有几个很菜的问题要请教：
７０％乙醇怎么配制，可以用纯水么，有人说用专用的盐水，这个盐水又是什么？园子里有的说可以直接用７５％乙醇，是医用酒精么，还是要用无水乙醇另外配制，还有的说用８０％的！

作者: 园丁## 时间: 2012-2-9 12:07

可以告诉您的是：
70～80％的冰乙醇！
您看看75％的冰乙醇的物质含量！就是瓶子上贴的标签，一大堆乱七八糟的东西，能用吗？

作者: 00无名指00 时间: 2012-2-9 12:08

我已经在司徒镇强的细胞培养书内找到了盐水G及70％乙醇的配置方法了，师姐说用盐水G配置的目的是保持一定的渗透压，以免照成细胞破裂，但我仍然很奇怪，我就是用95％乙醇加蒸馏水配的80％乙醇，昨天固定的，今天取一滴细胞悬液观察，细胞形态很好，前天那一次也一样！是不是不一定要用盐水G配也可以？

作者: 园丁## 时间: 2012-2-9 12:09

的确有这样的现象，按道理应该是用PBS这样的等渗液体配置，但是实际上配置后渗透压也会变化！？我的化学没有学好，不知哪位可以帮忙解答一下！
您说的现象我也见过，而且自己也试过，用PBS配置和用双蒸水配置的在试验结果上看不出固定效果的差别，但是我并没有往下想，故不知何故。现在猜想：冰乙醇固定迅速，所以细胞来不及因为渗透压的变化而破裂就被固定？

作者: 园丁## 时间: 2012-2-9 12:10

最后讨论结果为：
1，用PBS和双蒸水都可以，因为结果证明可以！
2，原理就是我上面猜想的，酒精迅速固定造成渗透压对细胞影响很小或没有影响。
3，另外由于冰乙醇的脱脂作用，膜出现空隙造成渗透压对细胞的影响消失！

作者: 49888 时间: 2012-2-9 12:10

我也想做流式来检测细胞的凋亡，是Hoechest和PI双染好还是单用PI单染？不知道流式测凋亡好检测吗。

作者: 园丁## 时间: 2012-2-9 12:11

用Hoechest-PI双染，正常细胞对染料有拒染性，萤光着色浅，凋亡细胞主要摄取Hoechest染料呈现强兰光，而坏死细胞主要摄取PI呈红色荧光。

作者: HP007 时间: 2012-2-9 12:12

请教前辈：做PI染色之前的细胞可以用4％多聚甲醛固定吗？我有一次该种固定方法的结果图，仅能看到一个峰，不知是固定的方法不对或者是别的因素造成。请指教。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10592

作者: chuntian1983 时间: 2012-2-9 12:13

您好，我也是第一次接触流式细胞仪，算是同一样的战友，我现在也准备用PI单染作试验，但是我是好多东西不明白。而且做单染的时候方法好多步骤都不同，请问你用的步骤是什么样子的。

作者: chuntian1983 时间: 2012-2-9 12:14

还有我配置70% 的乙醇作为固定细胞用，可不可以用无水乙醇过滤后直接配置

作者: 131415 时间: 2012-2-9 12:14

我综合了好多的PI染色protocol，形成了我认为简单可行的流程，如下：
流程如下：
1．  收集细胞，数量需1－2×10E6个（悬浮细胞直接吹起即可，对于贴壁细胞用胰酶消化时，最好用DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子，防止消化所形成的细胞团影响后面的染色及分析），离心，11,000rpm，5min。
2．  用1ml 冰冷的PBS重悬后，离心：11,000rpm，5min。
3．  用200μl冰冷的PBS重悬后，用加样器混匀后，缓慢的加入含有4ml冰冷的70％乙醇的10ml离心管中，边加边摇匀。－20℃，过夜。（或者置4℃，1h后进行下一步）
4．  1,500rpm，10min，小心弃上清后，用1ml冰冷的PBS重悬，1,500rpm，5min。小心弃上清。
5．  加入含有40μg/ml 的PI，100μg/ml的RNase的PBS溶液500μl，37℃，培养30－1h。
混匀。
溶液配方：PBS 910μl
PI 80μl
RNase 10μl
共1ml
6．过滤，供流式检测。
PS1：这个Protocal里我想离心的转速是否太高，据我们一位老师说，离心力太高了，会把细胞弄死的或者说状态不好？我没有求证过。心里面却是认为这是可以的。你可以再找一下。
我用的PI：鼎国 500μg/ml
PS2：请有经验的人对此Protocal提点问题或建议，谢谢

作者: xueyouzhang 时间: 2012-2-9 12:14

请教，第5步加RNase的目的是什么？培养30－1h是在培养箱吗？整个操作过程需要无菌吗？我想用PI单染检测细胞凋亡率，可以吗？多谢

作者: 131415 时间: 2012-2-9 12:15

加RNAase是为了消化RNA，以免影响DNA分析的结果。
培养30min（不好意思，忘记写了）－1h，我是放在37度培养箱里的。
操作过程，不用一定强调无菌，但是我总觉得做什么实验，干净点没错的。
PI单染检测凋亡，就我所看的资料，不同的细胞不一样，而且现在基本上不用单染，而用双染的方法，比如Annexin V和PI，比如Hoechst 与PI。可能这样更准确些？

不知道对不对，供你参考吧！

作者: chuntian1983 时间: 2012-2-9 12:15

6．过滤，供流式检测。这个步骤
还有就是过滤的问题，是用筛网过滤还是用滤膜过滤

作者: 园丁## 时间: 2012-2-9 12:16

请教：做PI染色之前的细胞可以用4％多聚甲醛固定吗？我有一次该种固定方法的结果图，仅能看到一个峰，不知是固定的方法不对或者是别的因素造成。请指教。

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用70～80％乙醇固定！

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