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标题: [讨论帖]细胞损伤模型 [打印本页]

作者: 一叶 时间: 2012-2-9 13:02 标题: [讨论帖]细胞损伤模型

现在很多实验都涉及到细胞损伤模型的建立和运用，如CCl4诱导肝细胞损伤模型（体内、体外）、PC12细胞的NO和淀粉样蛋白(Aβ)损伤模型、神经元缺血再灌注损伤模型，以及脉络宁对骨骼肌缺血再灌注损伤保护作用等。
请有相关实验经验者就模型的建立方法、模型评价、注意事项等发表高见，也可就模型建立过程中遇到的具体问题向园内其他群友求助。

作者: 一叶 时间: 2012-2-9 13:02

体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）

　1　大鼠肝细胞的分离和培养　大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105　U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。

　　将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。

　2　CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立　肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16　mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备CCl4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。

　3　H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立　同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1），作用不同时间（0.5～4 h）后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备H2O2诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线，选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。

　4　检测指标

1  AST、ALT的测定　培养的肝细胞经离心（1 800 r·min-1，10 min）后收集上清，按试剂盒说明书步骤测定上清液中AST和(或)ALT活性，结果以U·(106 cell)-1表示。
2  肝细胞增殖试验　采用MTT比色法。

3  肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）活性的测定　先制备GSH标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入0.2％ Triton-100水溶液0.5 ml，混匀，2 min后，离心（2 500 r·min-1，10 min），取上清液（肝细胞样品）0.4 ml，另设样品空白管，非酶反应管和试剂空白管，加入各种试剂。混匀后立即计时，静置12 min后，以样品空白管调零点，于423 nm波长处读得吸光度（A）值。在GSH标准曲线上查出对应的GSH波度。GSHpx酶活力单位是在37℃，pH6.5条件下，每106个肝细胞、每分钟使GSH浓度下降1 μmol为1个酶活力单位。计算公式为：GSHpx活力单位=（［GSH］非酶管-［GSH］样品管-［GSH］试剂空白管）/3。结果以U·(106 cell)-1表示。

4  肝细胞丙二醛（MDA）含量的测定　先制备MDA标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入生理盐水1 ml，混匀，移入离心管中，离心（2 500 r·min-1，10 min），弃上清，加15％ TCA 2 ml，破坏细胞并沉淀蛋白质，加入0.67％ TBA 2 ml，于沸水浴中加热30 min。根据样本的吸光度值在标准曲线上查出对应的浓度，结果以 nmol·(106 cell)-1表示。

5  数据处理　数据以±s表示，计量资料组间比较采用t检验。两变量间相互关系，采用直线相关和回归分析。

作者: 一叶 时间: 2012-2-9 13:04

再发一个体内肝损伤模型（酒精）

一、材料　纯系SD雄性大鼠，体重180g～200 g，由浙江大学医学院实验动物中心提供。食用酒精选用北京酿酒总厂出品的56度红星二锅头。

二、方法　将大鼠随机分成5组，饲养在23℃～25℃室内，自由进食、进水；根据大鼠体重，A、B、C、D组每日用56°红星二锅头白酒以10ml/1Kg分别灌胃 0、4周、8周和12周；E组于酒精灌胃12周后，停止灌胃4周。大鼠通过股动脉采血处死，收集血浆和肝脏标本。

三、主要指标检测

（一）肝功能：应用日立7170自动生化分析仪测定总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、球蛋白（Glb）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）等。

（二）氧化抗氧化物质测定：采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒分别检测丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）。

（三）大鼠肝脏病理检查：大鼠处死后立即取出肝脏，称重后一部分以10%的福尔马林液固定作病理，作常规石蜡切块并HE染色，在光学显微镜下进行观察，用半定量法分别判定脂肪变性、及酒精性肝炎炎症活动度

作者: mamamiya 时间: 2012-2-9 13:04

请教各位大侠一个问题：想做过氧化氢致细胞凋亡的模型，查过一些资料说过氧化氢可以导致细胞凋亡，可是我做出来的流式细胞计数（PI单染色）图形象是坏死峰，亚二倍体峰离G1峰距离太远，老板认为过氧化氢导致细胞死亡就是坏死，与浓度没有一定的关系，肯定不是凋亡，我现在进退两难。
哪位做过这方面的实验啊？过氧化氢致ECV－304凋亡的浓度及作用时间是多少啊，到底能否导致凋亡吗？能否提供一些可以导致凋亡的证据啊，也好帮我说服老板让我继续实验啊！谢谢

作者: 一叶 时间: 2012-2-9 13:07

H2O2当然可以导致细胞凋亡，不过剂量掌握不好就变成细胞坏死了。

检测细胞凋亡还是坏死是有方法的，建议你用pI ；dapi双染，请仔细查看本版的帖子。这样你老板就没话说了。

H2O2导致细胞凋亡的主要原因是氧离子导致细胞损伤，包括DNA损伤。

剂量需要做预实验，增加摸索。

作者: mamamiya 时间: 2012-2-9 13:07

唉！就是不幸啊！老板太固执了！

坚持让我做DNA－ladder，只有出了ladder他才会承认是凋亡

现在我只有拼命在跑ladder啊！

作者: ffooll 时间: 2012-2-9 13:08

想请教各位高人：细胞模拟缺血再灌注诱导凋亡的模型，我们学校的条件有限，只有三箱培养箱，没有那种缺氧罐，而三箱的氧浓度最低为1%，不能降到为0，而我看到许多国内的文献都用的是95%的氮气，5%的CO2，难道他们都有那种缺氧条件吗，并且如果考虑自制的话，还存在氧分压测量的问题，我觉得太复杂了，不知战友们都是怎么做的？不考虑化学缺氧。

作者: qumm1985 时间: 2012-2-9 13:08

参考文献上说H2O2可以诱导凋亡,我用的是NEK52E,已经试过两次了,浓度设置是1-5mM,作用时间是1-2h.1h后观察,H2O25mM的细胞大片坏死,1mM细胞形态学也发生改变,细胞体积增大,很像坏死,用DAPI染色观察凋亡不明显(我照相了,等我拷过来就发上让大家看看).
我想再试验一下,调整一下过氧化氢的浓度和作用时间,再就是用DAPI染色没法区分坏死和凋亡,可能要换一下方法.
很希望与大家交流!

作者: 笑弯了腰 时间: 2012-2-9 13:08

细胞模拟缺血再灌注诱导凋亡的模型其实就是细胞缺氧复氧模型，很有趣咱们遇到了相同的问题，前一段时间我还在研究如何将三孔培养箱用于缺氧实验，直到咨询了专业人士才恍然大悟，三孔培养箱和缺氧培养箱是两个概念，三孔培养箱的氧浓度调节是受限的，氧浓度设置应高于大气氧浓度，一旦氧浓度下降，氧源可以补充，开关培养箱门也不会对氧浓度有多大影响，这就类似于二氧化碳培养箱中二氧化碳浓度的调控。但如果设置的氧浓度很低，用于缺氧实验通常小于1%，三孔培养箱实际上是无法达到这个条件的，设想一下反复开关培养箱门，培养箱内氧浓度肯定升高，但仍低于外界大气的氧浓度，如果没有一个负压抽气泵的话，怎麽可能使氧浓度降下来保持恒定呢？而真正的缺氧培养箱是具有一个抽气泵的，因此价格也要高的多。三孔培养箱则多用于特殊条件的培养，如高氧、高氮。
至于缺氧的简易装置，我以前的帖子详细解释过，你可以看看，不要着急，自己动手尝试一下，祝成功。

作者: fqswdzd 时间: 2012-2-9 13:09

1.四氯化碳体外损伤肝细胞模型
原代培养的正常大鼠肝细胞培养24h（贴壁良好）后，置培养皿于一密闭的塑料盒，内置四氯化碳0.4M容积，37度90min，造成肝细胞损伤的模型，后转入正常培养，进行下一步实验。(即熏蒸法)
肝细胞培养12h后，吸弃上清，更换培养液并加入CCL4 8mM（事先用DMSO溶解，DMSO终浓度1％），作用6h后收集24孔板中培养上清检测AST以及肝细胞MDA含量盒GSHpx活性，评价损伤程度。（常用方法）

2.醋氨酚体外损伤肝细胞模型
肝细胞培养24h后，用清洗液洗2次，培养液洗1次，然后换以20mM醋氨酚的培养液，继续培养12h，取培养液，进行下一步实验。

3.过氧化氢体外损伤肝细胞模型
肝细胞培养24h后，吸弃上清液，更换培养液并加入H2O2 0.6mM，作用1h后，收集24孔板中的培养上清液检测AST活性和MDA含量。

4.氰化钾缺氧肝细胞损伤模型
肝细胞培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入氰化钾2.5mM，继续培养2h，定量检测培养液上清中LDH活性，以及酶的活性反应肝细胞损伤程度。本模型可以更好的模拟缺氧损伤。

5.硫代乙酰胺（TTA）体外肝细胞损伤模型
肝细胞预培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入TTA0.18mM，继续培养48h，肝细胞大量损伤和坏死，上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性升高，造成体外损伤肝细胞模型。

6.内毒素体外损伤肝细胞模型
贴壁生长良好的肝细胞中加入内毒素70uL/mL，置37度，5％CO2培养此时上清LDH活性升高造成肝细胞损伤模型，造成体外肝细胞损伤模型。

7.半乳糖胺（GalN）体外损伤模型
分离肝细胞，预培养12-24h后，待细胞贴壁生长均匀后，加入5mMGalN的肝细胞培养液，继续培养1.5h，测定培养上清液中ALT，ALT显著升高时，肝细胞造模成功。

参考《现代药理学技术》

作者: vivian4123 时间: 2012-2-9 13:10

我现在也需要造大鼠肝细胞体外模型，可惜肝细胞用胶原酶消化下来以后就死了，有没有高手指点呀？我用0.03％胶原酶100毫升消化5分钟，灌流时未充氧气，0.4％台盼兰与细胞悬液1：1染色。用胰酶消化细胞活力倒是很好呀。

作者: loli 时间: 2012-2-9 13:10

研究药物对GalN所致WB细胞损伤保护作用的模型：
1.将传代WB细胞以适宜密度接种于96孔板中，培养过夜。设对照组，给药组，模型组。
2.吸去培养基，对照组加入溶剂对照，其它组加入含不同浓度药物的新鲜培养基培养1小时。
3.模型组加入溶于培养基的GalN，终浓度为40mM。继续培养24h。
4.MTT法测细胞存活率

作者: ero11 时间: 2012-2-9 13:10

求助血管内皮细胞损伤模型

作者: DDD 时间: 2012-2-9 13:11

脊髓星形胶质细胞机械性损伤的体外培养模型
1.材料与方法
取新生的wistar 大鼠脊髓,剪碎,0125 %胰蛋白酶消化1h ,用含血清的DMEM培养液终止胰蛋白酶的作用; 而后吹打成散在的单个细胞,进行细胞计数,按5 ×105 个Pcm2 密度进行接种。培养至第10天时加10mM Leu2methy12ester 除杀小胶质细胞。于16d 时,用塑料吸管头划刮培养皿,产生三条宽约1mm长约1. 5cm 的损伤带,对照组未划伤,每组共分为7 个时间点,分别是划伤后0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h。

2.观察指标：
用免疫组织化学染色的方法分别观察划伤组和对照组星形胶质细胞中GFAP 的表达,进行半定量图像分析,

3.对结果进行方差分析。

4.结果
从损伤后2h ～ 72h , 划伤组星形胶质细胞中GFAP 表达量与未划伤的星形胶质细胞GFAP 的表达量均有极显著性差异

作者: pengke1983 时间: 2012-2-9 13:11

帕金森体外模型

体外培养的中脑多巴胺能神经元MPTP损伤模型
l实验操作：实验采用胚胎龄14一16天的大鼠，剖子宫取胎，取胎鼠中脑腹侧区。可将多个胚胎来源的组织收集在一起，置Fl2培养基（Gibco）至35mm的培养皿中，以细剪刀剪碎。将2ml含0.125％的胰酶的F12加入到组织中，该混合物于37oC孵育10分钟后，加入DNase I（Sigma）至终浓度80ng／m1，继续于37oC孵育10分钟。消化后的组织以尖端被火抛光的移液管轻轻吹打8次。该细胞悬液以种植培养基稀释（种植培养基： MEM，补充以2mm谷氨酰胺，6mg/ml葡萄糖，1mg／ml谷胱甘肽，10 units／ml青霉素，10ul/ml链霉素和7.5％胎牛血清）。细胞然后种植于35mm的预先以10ug／m1 po1y1ysine （Sigma）和2.5ug／ml merosin（Chemicon）铺底的培养皿中，种植密度为50,000细胞／cm2。培养16小时后，培养基换为无血清培养基。该培养基为F12和basa1Eag1e’s medium，补充以33mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺， 15 mM碳酸氢钠，10mM HEPES（pH7.0），1ug／ml谷胱甘肽，20ug/ml胰岛素， 100ug/ml转铁蛋白， 60uM腐胺，20nM孕酮，20nM亚硒酸钠（NaSe），30nM三碘甲状腺原氨酸，0.5 unit/ml青霉素和0.5mg/ml链霉素。
毒物处理：于第4天以1uMMP+处理48小时。然后进行分析。
模型评价：倒置显微镜下观察细胞形态、细胞计数、免疫组化检测TH阳性细胞的数目和形态。

体外培养的中脑多巴胺能神经元6-OHDA损伤模型
采用上述方法选择胎鼠，分离中脑腹侧部，解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管，用高糖T-BSS反复冲洗涤之七遍。并将组织剪碎，移入0.25％胰蛋白酶溶液中，37oC振荡消化30分钟，后加入血清数滴终止消化，用吸管轻轻吹打后，加入不含血清的DMEM培养液混匀，1000rpm，10min离心收集细胞，反复2次，后加入含血清的完全DMEM培养液悬浮细胞，过220目不锈钢筛网使成单细胞悬液，计数后将约3×106个细胞接种人事先涂有多聚赖氨酸的35mm的六孔培养板中，置37oC、5％CO2培养箱中培养。24小时后待细胞完全贴壁时，置换旧培养液，以后每隔2天更换一次培养液。培养至第六天时加入100uM的6-OHDA处理3小时后吸出。在相应备孔中加入完全DMEM培养液洗涤2遍，再加入完全DMEM培养液继续置5％CO2培养箱中培养24小时，采用与上述相同的方法做免疫细胞化学染色，计数TH阳性细胞，确立6-OHDA对体外培养的多已胺能神经元的损伤作用。

作者: pengke1983 时间: 2012-2-9 13:11

Ａβ损伤模型

取出生1-2d的乳鼠，用麻醉剂处死。在D-hanks液中取大脑并分离海马组织，胰蛋白酶消化，获得细胞悬液，胎盘蓝染色进行死活细胞记数，将细胞以5×105/ml的密度接种于预先经L-多聚赖氨酸处理的96孔和24孔培养板,其中24孔板中预先放置有盖玻片。细胞维持在培养液中，置入5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，24h后全换液，接种当天为第一天,每3d半量更换培养液一次，培养第3天时加入阿糖胞苷,终浓度为10μmol/Ｌ,以抑制神经胶质细胞的过度增殖,24ｈ后更换全部培养液继续培养,第10天进行细胞造模，开始实验。

也可以用PC12细胞株,常规培养

Ａβ产物诱导海马神经细胞，建立细胞模型：
选择Ａβ25-35片段,用三蒸水配制成100μmol•Ｌ-1,过滤,分装,-20℃冻存;使用前老化处理并配制成所需浓度。（将Ａβ25-35溶解在DMSO中，在用DMEM稀释，置于37℃下孵育7-14天，即为老化状态）。

细胞模型建立:加入浓度为20µmol/L的Ａβ25-35,接触24h,诱导建立AD细胞模型.

检测指标:MTT LDH 凋亡细胞内钙离子以及SOD等

作者: star#room 时间: 2012-2-9 13:12

人胃粘膜细胞的分离与羟自由基损伤模型的建立??
王刚石王孟薇吴本俨?

中国人民解放军总医院南楼消化科北京市 100853
项目负责人王刚石?中国人民解放军总医院南楼消化科北京市 100853

作者: 黄花菜 时间: 2012-2-9 13:12

建立培养乳鼠心肌细胞的缺氧/复氧(A/R)损伤模型和缺氧预处理(APC)模型:
原代心肌细胞培养及APC模型的制作参照先前报道的方法[2]。即取出生后1－2 d乳鼠心尖部组织, 胰酶消化, 离心后用含20%小牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液, 过滤, 按差速贴壁分离法纯化心肌细胞, 以1×105 cells/cm2接种于24孔板, 每24 h更换培养液。贴壁生长2 d, 于实验前24 h更换为无血清DMEM培养基, 随机分组, 每组双平行孔, 重复4次操作。缺氧/复氧(anoxia/reoxygention, A/R)模型的制作: 首先将培养基用N2在密闭容器中平衡1 h以上制成无氧培养基, 将培养孔中含氧培养基吸出后加入无氧培养基, 随后将培养板置于含5% CO2-95% N2 (V/V)混合气体的密闭容器中(37℃)进行缺氧孵育10 h, 此为缺氧操作, 然后更换为与O2平衡的培养基, 放回培养箱, 复氧孵育1 h。APC模型的制作: 预先给予1次2 h缺氧孵育, 24 h后按A/R操作。

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-9 13:13

抑郁症的体外模型
抑郁等精神疾患的发生可能与过量GC对海马的选择性损伤有关,但机理不明,Heuser和Cosi等报道可能是由于高浓度GC导致神经营养因子表达水平降低造成的,而抗抑郁剂不仅使GC受体上调,HPA轴反馈恢复正常,而且使神经营养因子表达升高,达到治疗目的.PC12细胞株为大鼠嗜铬细胞克隆化细胞株,分化的PC12细胞有典型的神经细胞特征,其胞膜上GC受体表达丰富[6].本文根据文献方法以高浓度皮质酮(corticosterone)模拟抑郁及焦虑症神经细胞损伤状态
实验操作(MTT法测定细胞存活力)
嗜铬细胞瘤株PC12细胞.用含5%胎牛血清及5%马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200kU.L-1,链霉素100mg.L-1pH7.4)调细胞密度为2x108L-1接种于预先用多聚赖氨酸(0.1g.L-1)处理过的96孔培养板,每孔10LL,放入CO2孵箱,培养3~4d,待细胞长满孔底后即可用于实验.参照文献方法,稍加修改,吸去细胞液换上含有相应浓度药物及0.2mmol.L-1皮质酮的无血清DMEM(对照组不含任何药品),培养48h,吸去培养液,用D2Hanks液洗2遍,每孔加入含0.5g#L-1MTT的无血清DMEM培养4h后吸去培养液,每孔加入10%十二烷基硫酸钠100LL,待蓝色颗粒完全溶解(约12~16h),用多孔扫描分光光度计测定标本在570nm波长处的吸光度(A570nm)值,用于定量反映活细胞数.

作者: HP007 时间: 2012-2-9 13:13

关于血管内皮细胞我看过相关的文献，用LPS或是oxLDL都可以。大概的实验方法是：在培养板中培养EC至融合，加入LPS（具体剂量忘记了）或oxLDL（10-50ug/ml）共培养8－24h。

作者: one 时间: 2012-2-9 13:14

求助应用TNF干预人脐静脉内皮细胞损伤模型具体的剂量和方法。

作者: sunnyB 时间: 2012-2-9 13:14

您的关于抑郁症体外模型建立的帖子的参考文献出自哪里?国内有哪家实验室在做这方面的工作?

作者: dog002 时间: 2012-2-9 13:15

请问一下：高糖诱导HUVEC凋亡的模型如何建立？其中实验过程中培养基中 ECGs还有血清的浓度控制在多大较为合适？

作者: wsll 时间: 2012-2-9 13:15

同是天涯沦落人啊
我也在做神经细胞缺氧复氧的模型，用的是乏氧罐，充95%氮气和5%二氧化碳，现在刚养出细胞，订购了混合气体，有几个问题问群友，希望能得到解答：
1.我用六孔板养的原代，缺氧能测什么指标，现在想只有显微镜下看和台盼蓝染色，是否还有别的可以做得指标，反正是预实验，能多做就多做点，希望能有简单的步骤。
2.神经原代能用胰酶消化到96孔板里吗？他们还能贴壁吗？
3.阿糖胞苷-20度能保存多久，我的细胞纯化不好，杂质很多.
先问这几个问题，希望各位大虾能不吝赐教！
万分感谢！

作者: Ao7 时间: 2012-2-9 13:15

h2o2诱导细胞DNA损伤，可否导致细胞增殖，而不是坏死或凋亡，愿听大侠经验

作者: lagua123 时间: 2012-2-9 13:16

请问脊髓DRGn细胞损伤模型如何建立？曾在文献中看到用H2O2损伤测定NO量除此之外有无其他方法呢？

作者: S6044 时间: 2012-2-9 13:16

请问假如是自制的缺氧罐，该如何造成缺氧模型呢？我的实验步骤是：吸除原培养液，加入无糖无血清的培养液，将培养板放在自制的缺氧罐内，通入９５％氮气和５％二氧化碳的混合气体３０分钟，然后夹闭进出气口，放在３７度恒温箱中继续孵育３h，然后将培养板取出，换成原培养液，复氧２１h，可是这样子做的凋亡模型仍然不成功，急切盼望各位专家的解答．

作者: tudou85 时间: 2012-2-9 13:17

急求原代乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型的制作！

作者: remenb 时间: 2012-2-9 13:18

h2o2诱导细胞DNA损伤，可否导致细胞增殖，而不是坏死或凋亡，愿听大侠经验

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H2O2对细胞的影响是具有典型的双面性的,大家知道正常体内细胞的线粒体内就需要一定量的过氧化氢来促细胞代谢和增殖,所以如果你是做过氧化氢诱导凋亡或损伤模型,首先要摸条件,因为不同的细胞有不同的剂量需求,而且同一细胞不同时间,不同人做也是不一样的,得要你自己去确定,另外,据我了解,有文献报道,过氧化氢在0.01mM时是促增殖可以对抗由0.05mM或以上的浓度的过氧化氢的损伤,所以这本身是很微妙的,要细心把握啊!

作者: 伊莎贝拉 时间: 2012-2-9 13:18

各位大侠，有没有人做c2c12的细胞损伤模型啊，用h2o2的，如果做c2c12的话有没有必要检测MDA啊，多谢了。

作者: tangxin_80 时间: 2012-2-9 13:19

关于内皮细胞损伤的模型，国内做的很多，有相关自然科学基金项目
如果找不到可以看看这篇文章：
徐东波等，丹参注射液对血管内皮细胞氧化损伤保护作用的实验研究，天津医科大学学报，2001：7（1）；21-23

作者: zranqi_1 时间: 2012-2-9 13:19

哪位大侠贡献一下原代皮质神经元缺氧诱导凋亡的方法？药物或气体浓度，诱导时间？具体的方法、步骤？有没有用耗氧剂在密闭小室内诱导缺氧的？万分感激您的帮助！现在急等要做，细胞已经两天了。

作者: dragonkilly 时间: 2012-2-9 13:20

请问,有没有角膜内皮及上皮细胞损伤的模型啊

作者: idea2011 时间: 2012-2-9 13:21

各位仁兄大家好！
能否赐教以下UVA诱导的皮肤角质形成细胞的损伤模型的制作方法！

作者: 一叶 时间: 2012-2-9 13:22

各位仁兄大家好！
能否赐教以下UVA诱导的皮肤角质形成细胞的损伤模型的制作方法！

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找到一个UVB致皮肤角质形成细胞的损伤模型的制作方法。

材料和方法

1 试剂:胎牛血清(北京军医兽医防治中心) ,DMEM培养液(GIBCO ,美国) ,碘化丙啶PI(Sigma) ,Triton2X100 (BDH) ,Hoechst33342(Sigma) ,RNase (Sigma) 。

2 细胞及实验分组:人角质形成细胞株Colol6 (由北京师范大学生物系提供) 。分单纯对照、单纯照射、给药后照射、照射后给药4 组。给药后照射组为在照射前24 h 给药,照射后24 h 进行检测,照射后给药组为在照射后立即给药,照射后24 h 进行检测。

3 紫外光源及照射条件:光源为UVB 紫外灯管(上海金光灯具厂,6W) ,剂量率为6J·m- 2·min - 1 (由吉林大学环境卫生教研室进行测量) 。

4 药物种类:人参三醇组甙、Rg1、Rb1 由吉林大学有机化学教研室提供。

5 细胞周期:胰酶消化贴壁细胞,接种于24 孔平底培养皿中(5 ×105 细胞P孔) ,每孔先加300μl DMEM 培养液(含15 %胎牛血清) ,待紫外线照射后,加至1 ml ,置37 ℃、5 %CO2孵箱中。收集细胞, 0101 molPL PBS 洗2 次, 加RNase (011mgPml) 100μl ,100μl PI(含Triton2X100) 单染37 ℃、30 min 避光保存,用流式细胞仪FACScan (Becton Diskinson ,美国,氩离子激光激发,波长488 nm) 检测,每个样品收集1 ×104 个细胞,数据采集分析软件为ModFit LT。

6 细胞凋亡:加入100μl Hoechst33342 ,再加100μl PI(不含Triton2X100) ,0 ℃、阴暗处放置30 min ,用流式细胞仪收集1 ×104个细胞,Cellquest 软件分析结果。

见：
金光辉,人参组甙对紫外辐射致皮肤角质形成细胞损伤的保护作用
另请参见：
夏济平. 宋秀祖. 毕志刚. 茶多酚对紫外线辐射后的角质形成细胞和成纤维细胞增生影响的保护作用.临床皮肤科杂志 2003年05期

作者: 一叶 时间: 2012-2-9 13:22

【原创】125I-UdR致C6胶质瘤细胞损伤的模型

一、材料：125I-UdR购自中科院北京原子能所，放化纯度>95%。脱氧腺苷（AdR）、脱氧鸟苷（GdR）、脱氧胞苷（CdR）、脱氧尿苷（UdR）均为Sigma公司产品。

二、方法
1、细胞培养：当癌细胞贴壁生长超过瓶壁的70%，用胰蛋白酶消化30-40s，传代培养。肿瘤细胞每3-4d传代1次。在50ml培养瓶中，细胞数达2×106个细胞后，取处于对数生长期的细胞进行细胞存活实验。

2、细胞存活实验：将制备好的细胞按1×105个/ml细胞接种于25ml的培养瓶中，培养20小时，实验组加入125I-UdR74KBq/ml及不同浓度的AUCG（10μM、20μM、30μM、50μM、80μM）再共同孵育24h后，100倍的倒置显微镜下观察细胞形态，收集细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度，接种于25ml的培养瓶中，2-3d后换液，8-9d后细胞集落形成，每个剂量点设复瓶4瓶，同时设对照组未加AUCG，另设空白组，均为4个复瓶。计算细胞存活分数，绘制细胞存活曲线。

三、检测方法
1、采用TEM技术观察凋亡细胞超微结构：上述细胞用3%戊二醛固定后，PBS漂洗，1%锇酸固定1h，经包埋处理，超薄切片，在透射电镜（TEM）下观察细胞超微结构。

2、琼脂糖凝胶电泳成像：收集加入125I-UdR74KBq/ml+AUCG30μM后培养24h的C6细胞2×105个，2500rpm离心5min，去上清，加入裂解液，重悬细胞后，再加蛋白酶K消化30min，用等体积的平衡酚抽提两次，加入2倍体积的冰乙醇置-20℃2h，离心去上清，以75%的冰乙醇洗涤两次后，加双蒸水溶解DNA，取8μl DNA溶液及上样缓冲液2μl上样稀释，用1.5%的琼脂糖凝胶，电泳40min，将凝胶板在紫外光下，观察照相。

3、流式细胞分析

作者: jrwyyplt 时间: 2012-2-9 13:22

我看到文献上有用连二亚硫酸钠造人脊静脉内皮细胞缺氧模型的，想问各位高手，这种造模是否是公认的？和我们平常所说的0XLDL以及LPS造模有什么有缺点？谢谢

作者: rxcc33 时间: 2012-2-9 13:54

如果是对肝细胞，我课题就是造了一个肝细胞凋亡的细胞模型，不过我的肝细胞不是原代培养的，而是在上海细胞所买的HL7702正常人的肝细胞株，这种细胞比原代节省，虽然培养起来没有肿瘤细胞那么轻松，但是比起原代培养来说就简单很多了，我用的是放线菌素D这种化学物质来造的肝细胞凋亡的模型，结果放线菌素D诱导肝细胞凋亡作用非常稳定，只要1ug/ml的放线菌素作用肝细胞5h就能够诱导大约30％的肝细胞凋亡，并且从形态来分析，这种出现的基本上都是凋亡而不是坏死。这是我的实验得出来的，希望能够拿出来和大家交流！

作者: rxcc33 时间: 2012-2-9 13:54

想请教各位高人：细胞模拟缺血再灌注诱导凋亡的模型，我们学校的条件有限，只有三箱培养箱，没有那种缺氧罐，而三箱的氧浓度最低为1%，不能降到为0，而我看到许多国内的文献都用的是95%的氮气，5%的CO2，难道他们都有那种缺氧条件吗，并且如果考虑自制的话，还存在氧分压测量的问题，我觉得太复杂了，不知战友们都是怎么做的？不考虑化学缺氧。

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我用的箱子是自己设计作的～～和普通的箱子没什么区别～～关键就是要密闭性好！！作之前把里面的气体抽出来，再充95%的氮气，5%的CO2，使用测氧仪来测氧分压，确定小于5%即可。

作者: rxcc33 时间: 2012-2-9 13:55

同是天涯沦落人啊
我也在做神经细胞缺氧复氧的模型，用的是乏氧罐，充95%氮气和5%二氧化碳，现在刚养出细胞，订购了混合气体，有几个问题问群友，希望能得到解答：
1.我用六孔板养的原代，缺氧能测什么指标，现在想只有显微镜下看和台盼蓝染色，是否还有别的可以做得指标，反正是预实验，能多做就多做点，希望能有简单的步骤。
2.神经原代能用胰酶消化到96孔板里吗？他们还能贴壁吗？
3.阿糖胞苷-20度能保存多久，我的细胞纯化不好，杂质很多.
先问这几个问题，希望各位大虾能不吝赐教！
万分感谢！！！！

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1.还可以测一些酶来鉴定，比如SOD,MDA等，还可以测NO的浓度才鉴定是否缺氧
2.能贴壁，铺敏就行
3.阿糖胞苷4度保存，不污染可以反复使用。半年没问题。

作者: rxcc33 时间: 2012-2-9 13:55

哪位大侠贡献一下原代皮质神经元缺氧诱导凋亡的方法？药物或气体浓度，诱导时间？具体的方法、步骤？有没有用耗氧剂在密闭小室内诱导缺氧的？万分感激您的帮助！现在急等要做，细胞已经两天了。

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关于用耗氧剂在密闭小室内诱导缺氧的实验我看过相关的报道，但是没有作过，老板不同意。我现在使用的仍然是物理缺氧的方法

作者: 小螺号 时间: 2012-2-9 13:57

求助
向各位前辈请教一个问题:用h2o2致pc12凋亡的浓度和时间,另外用含血清与不含学期有何区别?本人摸索了好长时间,还没得到稳定的实验条件,先谢了!

作者: greenbee 时间: 2012-2-9 14:09

我做的是醋氨酚肝损伤模型。我的做法是将肝细胞培养24h后，然后换以5、10、20mM的醋氨酚培养液，培养2、4、12、24h后测定MTT。结果发现，12h和24h时，造模的高中低剂量组的MTT值反而较对照组的要高。我怎么也想不明白，请各位大侠指教。

作者: abc816 时间: 2012-2-9 14:15

请问有那位高人培养了肾小管上皮细胞(NRK52E),现在想制作缺血再灌注模型,文献很少有报道,如有同行麻烦回复,急急!!

谢谢!!

作者: gemei0115 时间: 2012-2-9 14:16

通过改变artificial cerebrospinal fluid(人工脑脊液)成分来造模（培养的皮层或海马神经元）：
ACSF(mmol/l)
NaCL 126
NaHCO3 26
NaH2PO4 1.25
KCL 5
CaCL2 2
MgSO4 1.5
GLUCOSE 10
1.离体缺糖缺氧模型：ACSF中除去葡萄糖并以N2 代替95%O2和5%CO2混合气，造成离体缺糖缺氧模型
2。模拟癫痫模型：ACSF中除去镁离子并加入青霉素或谷氨酸模拟癫痫模型

能否详细些？呵呵
斑竹，其实具体过程我也不是很清楚，这是原来科里一个很强的师姐留下的笔记所记录的，好像是在做膜片钳时所作的模型，仅供大家参考！谢谢

作者: owanaka 时间: 2012-2-9 14:56

双氧水和谷氨酸及天冬氨酸对PC12的损伤模型
H2O2(500μmol/L-1000μmol/L)作用24h,MTT法检测细胞存活率约为40%-70%,Glu(5mmol/L-30mmol/L)作用24h,MTT法检测细胞存活率约为25%-95%,NMDA(100μmol/L-30mmol/L)作用24h,MTT法检测细胞存活率约为30%-80%.仅供参考.

作者: kulee 时间: 2012-2-9 14:58

请问各位战友，有没有取大鼠脑组织，体外培养神经细胞后再制造创伤性脑损伤的模型，以前看过有关的气压，牵拉，机械划伤等模型，但很多都是用胎鼠，如果直接用大鼠的脑组织做，神经元又不具增长生长特性，怎样做模型是不是有可行性，怎么做？谢谢

作者: gogo 时间: 2012-2-9 15:00

内皮细胞损伤模型
一、细胞因子损伤模型
将内皮细胞铺板后待即将单层融合时，换无血清或低血清培养基，加入细胞因子如IL－2，TNF－alpha、IFN等，共同孵育一段时间，或者加入药物与之共孵育，或者加细胞因子之前先加入药物孵育后，再加细胞因子，结束后测一些指标如MTT、LDH、NO、等等看药物对细胞因子损伤的保护作用。也可采用不同的时间、不同的浓度来观察。
二、缺氧－再供氧损伤模型
也是先将内皮细胞铺板后待即将单层融合时，换无血清或低血清培养基，先将细胞置于95％N2和5％的CO2的混合气的缺氧槽环境中注意保持37度的温度，用耗氧仪持续监测缺氧槽中的氧分压，使之保持在0.5 KP左右，细胞在低氧环境中培养一段时间后在移入正常的培养环境，可观察不同的缺氧时间、不同的给氧时间对内皮细胞形态功能的影响，也可结合药物观察，入上所述。
此外，内皮细胞的损伤模型尚有双氧水损伤模型、氧自由基损伤模型、氧化型脂蛋白损伤模型、等等。最后提及一点，楼上说的ox-LDL损伤模型的浓度不是很准确，因为从目前国内外的文献来看，oxLDL（10-50ug/ml）的浓度一般不会损伤内皮细胞尤其是内皮细胞系，如ECV304，恰恰相反，的浓度的ox-LDL会促进细胞的增值，国内有人报道，ox-LDL造成ECV304凋亡的浓度一般为150ug/ml~200ug/ml,也有用100g/ml的。

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-9 15:00

各位大侠：你们用的过氧化氢都是何种制剂呀？从那个公司买的呀？

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-9 15:02

请问各位战友，有没有取大鼠脑组织，体外培养神经细胞后再制造创伤性脑损伤的模型，以前看过有关的气压，牵拉，机械划伤等模型，但很多都是用胎鼠，如果直接用大鼠的脑组织做，神经元又不具增长生长特性，怎样做模型是不是有可行性，怎么做？谢谢

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据我所知，最好还是用胎鼠来做，因为如果直接用成体大鼠做，很难再体外培养，除非是脑片，因成体大鼠神经元已经交织成网络，形成了很牢固的突触联结而且各种细胞交织，那还怎么做体外培养神经细胞啊。所以成体大鼠体外培养神经细胞后再制造创伤性脑损伤的模型的可行性不大！

作者: bananapeople 时间: 2012-2-9 15:08

我以前做培养心肌细胞凋亡模型是用H2O2，SIGMA公司的，用终浓度0.1%，实验很成功的，可以看到凋亡细胞的特征性改变。

作者: 大白菜 时间: 2012-2-9 16:06

请教各位高手，HEK－293人胚肾细胞有什么特性，用镉对它建立氧化损伤可以吗？有什么注意的地方吗？

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-9 16:12

请教：内皮细胞损伤模型中细胞因子损伤模型和缺氧—复氧损伤模型有什么本质上的区别？谢谢！

作者: ritou1985 时间: 2012-2-9 16:13

我也做离体神经元糖氧剥夺模型。
请教：1查到有文献报道说向无糖的ACSF中通入99%氮气，置换出溶液中的氧气，使氧含量几乎接近于零，请问，具体如何操作，如何保证溶液无菌？？
2 OGD的时间控制在多久比较好？
3 OGD后是先复氧，几个小时后再复糖，还是同时复氧复糖？？

作者: greenbee 时间: 2012-2-9 16:13

请教：在血管内皮细胞敢于试验中，选择第几代的细胞有没有什么标准和规定呀？有谁能够指点一下？？

作者: HP007 时间: 2012-2-9 16:39

细胞ATP 耗竭模型的建立
实验中通过无糖培养液加呼吸链阻断剂，加入鱼藤酮和抗霉素A到终浓度分别为10nnml/l 和100nnml/l ,调整PH值至7.4.
具体方法将生长正常的MCDK 细胞按每孔80000和5000细胞每孔分别接种于6孔板和96孔板!生长24 后分别将其分为3组。一为对照组,用正常培养液继续培养，二为耗竭组,ATP 耗竭2h 后换用正常培养液!使恢复能量供应后’分别培养，处理组,ATP 耗竭同时加入相应药物作用2h后复能，继续培养适量时间。

作者: HP007 时间: 2012-2-9 16:40

紫外照射细胞损伤模型：
主要为眼科细胞！
常规培养细胞，传代于平皿，在无菌操作台内，用可调强度的紫外等照射一定时间，距离细胞40cm 辐照。12后提取细胞上清或消化细胞用于实验！

作者: HP007 时间: 2012-2-9 16:41

乙醇诱导肝细胞损伤模型：
乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立:将含肝细胞的培养皿。
置于37 ℃、含5 %CO2 的细胞培养箱中,4 h 后换培养液,
此后每24 h 更换一次培养液,培养48 h 更换新鲜培养液后加入80
mmolPL 的乙醇,继续培养24 h 。用于实验！

作者: yysr238 时间: 2012-2-9 16:42

各位大侠，我刚开始做胎鼠皮层神经元培养，请教有没有比较经典的缺氧复氧模型啊，看了很多文献，缺氧，和复氧的时间都不同。这里的很多战友也在做，有没有好的模型啊，急切盼望中！

作者: 一叶 时间: 2012-2-9 16:42

紫外照射细胞损伤模型：
主要为眼科细胞！
常规培养细胞，传代于平皿，在无菌操作台内，用可调强度的紫外等照射一定时间，距离细胞40cm 辐照。12后提取细胞上清或消化细胞用于实验！

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时间？范围

作者: yysr238 时间: 2012-2-9 16:44

照射的时间很短，8s。
我们主要做的是眼科的rpe细胞。
观察紫外对眼部细胞的损伤作用以及一些药物的保护作用！

作者: guagua 时间: 2012-2-9 16:45

内皮细胞损伤模型
一、细胞因子损伤模型
将内皮细胞铺板后待即将单层融合时，换无血清或低血清培养基，加入细胞因子如IL－2，TNF－alpha、IFN等，共同孵育一段时间，或者加入药物与之共孵育，或者加细胞因子之前先加入药物孵育后，再加细胞因子，结束后测一些指标如MTT、LDH、NO、等等看药物对细胞因子损伤的保护作用。也可采用不同的时间、不同的浓度来观察。
二、缺氧－再供氧损伤模型
也是先将内皮细胞铺板后待即将单层融合时，换无血清或低血清培养基，先将细胞置于95％N2和5％的CO2的混合气的缺氧槽环境中注意保持37度的温度，用耗氧仪持续监测缺氧槽中的氧分压，使之保持在0.5 KP左右，细胞在低氧环境中培养一段时间后在移入正常的培养环境，可观察不同的缺氧时间、不同的给氧时间对内皮细胞形态功能的影响，也可结合药物观察，入上所述。
此外，内皮细胞的损伤模型尚有双氧水损伤模型、氧自由基损伤模型、氧化型脂蛋白损伤模型、等等。最后提及一点，楼上说的ox-LDL损伤模型的浓度不是很准确，因为从目前国内外的文献来看，oxLDL（10-50ug/ml）的浓度一般不会损伤内皮细胞尤其是内皮细胞系，如ECV304，恰恰相反，的浓度的ox-LDL会促进细胞的增值，国内有人报道，ox-LDL造成ECV304凋亡的浓度一般为150ug/ml~200ug/ml,也有用100g/ml的。

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在细胞因子损伤模型中，为什么要无血清和低血清培养呢？有些细胞太娇弱了，在这样的情况下很容易调亡！请问如果在正常培养情况下直接做细胞因子损伤模型可不可以呢？

作者: yes4 时间: 2012-2-9 16:48

神经胶质细胞的制备和培养
1）取新生一周内大鼠，碘酒、酒精浸泡消毒后快速断头；
2）用眼科剪和镊剪除皮肤和颅骨，分离皮肤和颅骨时用不同的器具，弯剪剪取部分大脑皮层至60mm培养皿，培养皿内提前放置D-Hanks溶液；
3）解剖镜下取出脑膜及血管，转移组织至另一盛有D-Hanks溶液的器皿，将组织剪碎为1mm3左右的小块，然后小心转移至带螺帽的离心管内；
4）0.125%胰酶消化15-30分钟，以含10%胎（小）牛血清的DMEM培养基终止消化，巴氏吸管吹打，100目筛网机械过滤，制备混合细胞悬液；
5）计数，调整细胞密度，根据需求按适当密度种植于培养瓶或皿内；
6）放置于含5%CO2的37℃恒温培养箱，2-3天后换液，去除死亡及未贴壁细胞，以后每3-4日换液一次；
7）约两周后当细胞基本铺满时可在培养液中加用二丁酸环腺苷（dBcAMP，0.25mmol/L），该物质被认为有促进细胞分化和抑制小胶质细胞生长等作用；
8）根据细胞生长状况对培养细胞进行传代，多数文献建议用传代3-5次的星形胶质细胞进行实验，但一般不在换液或传代的当天；
少突胶质细胞和小胶质细胞的培养尚需在星形胶质细胞培养基础上进一步纯化，具体可参阅McCarthy和Giulian等的方法。

作者: dongdongqiang 时间: 2012-2-9 16:48

请教：在血管内皮细胞敢于试验中，选择第几代的细胞有没有什么标准和规定呀？有谁能够指点一下？？

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原代细胞在传代、培养过程中，会改变细胞的某些特性。
所以用于实验的细胞最好不要超过5代，并且全部实验都用同一代的细胞。

作者: is2011 时间: 2012-2-9 16:48

2型糖尿病大鼠动物模型

1. 高脂＋STZ法：

ＳＤ大鼠购进后,适应环境2周。随机分为3组:正常对照组、高脂饮食组和高脂饮食+ＳＴＺ组,每组10只。
正常对照组:喂以普通饮食,其中碳水化合物60%,蛋白质22%,脂肪10%,其他8%。高脂饮食组及糖尿病组:喂以高脂饮食,其中碳水化合物40%,蛋白质13%,脂肪40%,其他7%。糖尿病组高脂饮食喂养4个月后,一次性腹腔注射ＳＴＺ15ｍｇ (ｋｇ·ｂｗ),其他两组腹腔注射柠檬酸缓冲液,并继续高脂喂养。注射ＳＴＺ前及注射后10ｄ,分别测体重(ＢＷ)、空腹血糖(ＦＢＧ)、甘油三脂(ＴＧ)、胆固醇(ＣＨ)、胰岛素(ＦＳＩ),注射前给予口服葡萄糖耐量及胰岛素释放试验:大鼠空腹10～12ｈ,尾静脉取血后(0ｈ),给予葡萄糖2ｇ (ｋｇ·ｂｗ)灌胃,然后0.5、1及2ｈ尾静脉取血,分别测血糖及胰岛素。

2. 脂肪乳＋四氧嘧啶法：

脂肪乳的制备　猪油占20 g ,甲基硫氧嘧啶1 g ,胆固醇5 g ,谷氨酸钠1 g ,蔗糖5 g ,果糖5 g ,吐温80 20 ml ,丙二醇30 ml ,加水定容至100 ml , 配成脂肪乳。

将灌胃脂肪乳10 d 的Wistar 大鼠,腹腔注射四氧嘧啶（两次给药
法成模率较高,第一次腹腔注射四氧嘧啶120 mg·kg - 1 ,第二次腹腔注
射四氧嘧啶100 mg·kg - 1）。注射容积为0.2 ml·kg - 1 。

作者: is2011 时间: 2012-2-9 16:49

2型糖尿病大鼠动物模型

1. 高脂＋STZ法：

ＳＤ大鼠购进后,适应环境2周。随机分为3组:正常对照组、高脂饮食组和高脂饮食+ＳＴＺ组,每组10只。
正常对照组:喂以普通饮食,其中碳水化合物60%,蛋白质22%,脂肪10%,其他8%。高脂饮食组及糖尿病组:喂以高脂饮食,其中碳水化合物40%,蛋白质13%,脂肪40%,其他7%。糖尿病组高脂饮食喂养4个月后,一次性腹腔注射ＳＴＺ15ｍｇ (ｋｇ·ｂｗ),其他两组腹腔注射柠檬酸缓冲液,并继续高脂喂养。注射ＳＴＺ前及注射后10ｄ,分别测体重(ＢＷ)、空腹血糖(ＦＢＧ)、甘油三脂(ＴＧ)、胆固醇(ＣＨ)、胰岛素(ＦＳＩ),注射前给予口服葡萄糖耐量及胰岛素释放试验:大鼠空腹10～12ｈ,尾静脉取血后(0ｈ),给予葡萄糖2ｇ (ｋｇ·ｂｗ)灌胃,然后0.5、1及2ｈ尾静脉取血,分别测血糖及胰岛素。

2. 脂肪乳＋四氧嘧啶法：

脂肪乳的制备　猪油占20 g ,甲基硫氧嘧啶1 g ,胆固醇5 g ,谷氨酸钠1 g ,蔗糖5 g ,果糖5 g ,吐温80 20 ml ,丙二醇30 ml ,加水定容至100 ml , 配成脂肪乳。

将灌胃脂肪乳10 d 的Wistar 大鼠,腹腔注射四氧嘧啶（两次给药
法成模率较高,第一次腹腔注射四氧嘧啶120 mg·kg - 1 ,第二次腹腔注
射四氧嘧啶100 mg·kg - 1）。注射容积为0.2 ml·kg - 1 。

作者: pencil菲 时间: 2012-2-9 16:50

请教一下缺氧罐的简易制法是？
另外，由于阿糖胞苷要3个星期才能到，所以选择了Neurobasal/B27无血清培养，不知这样选择对于新手来说是不是把成功率降低了？

作者: ALALA 时间: 2012-2-9 16:50

Langendorff离体心脏缺血再灌注方案
采用美国Radnoti公司Langendorff离体心脏灌流系统，观察离体心脏功能变化，可排除其它组织器官、循环代谢产物的干扰。
实验步骤：
A.  配制37℃ K-H液（1.25 CaCl2，130 NaCl，5.4 KCl，11 葡萄糖，0.5 MgCl2，0.5 NaH2PO4及25 NaHCO3），向K-H液中通入95％O2-5% CO2气体，缓冲液PH 值为7.4，并取部分K-H液放入冰箱中，使其温度降到4℃。
B.  清洁Langendorff管路，每次使用前先用1000ml蒸馏水冲洗，打开水浴循环，再用K-H液将整个管路系统进行冲洗。
C.  鲁米钠腹腔注射麻醉动物（100mg/kg），并向肝静脉注射100IU肝素，颈动脉放血处死动物，同时快速分离心脏，放入4℃K-H液中挤净血液并称重。
D.  将心脏迅速固定在Langendorff 灌流系统中，通过主动脉以85cmH2O压力逆行灌注，通过肺静脉插入导管至左心房。
E.  心脏复跳后，将一个球囊插入心脏左心室，球囊和压力换能器相连，在电脑上记录左室内压，调整左室舒张内压（LVEDP）在4～10mmHg之间。待心脏左室收缩压（LVESP）稳定后且大于80mmHg，心率大于200次/分，可继续实验，并记录心电图（ECG）、主动脉流量（AF）、冠脉流量（CF）、左室收缩末压（LVESP）等指标。
F.  缺血再灌注方案：关闭灌流液，停灌心脏45min后，打开灌流液进行复灌90min（复灌起始15min通过肺静脉给予一定的压力辅助），同时记录相关指标。
G.  实验结束后，用蒸馏水冲洗整个管路系统，防止K-H液残留在管路中。

作者: join 时间: 2012-2-9 16:51

血吸虫型肝硬化模型制备
因为我在武汉，所以我们导师和实验室对血吸虫导致的肝损伤有研究，现详述成熟的肝硬化模型制备方法

所选动物：大耳白兔，体重1－3KG。

复制方法：采用腹部敷贴法感染采自钉螺的血吸虫尾蚴。兔腹部剪毛，约1CM2，滴以含尾蚴液，使每只兔感染180－200只尾蚴，玻片覆盖15MIN,形成机型感染，3个月后形成血吸虫性肝纤维化。

模型特点：肝内门静脉分支与门脉区纤维增生，门脉周围硬化产生门脉阻塞。该模型门静脉系统血流动力学改变明显，故非常适用于门静脉高压症的研究。但是不适用于其他类型人类肝纤维化。

作者: join 时间: 2012-2-9 16:52

再介绍一种消化道溃疡的动物模型制作方法吧，与大家共同学习！
胃溃疡，以前也是普通外科常见疾病，自从发现HP后，现在基本在消化内科住院治疗了，治疗和预后都很好。
组胺性胃溃疡

所选动物：大鼠

复制方法：禁食24H，于腹部皮下注射磷酸组胺50MG/KG，2H后再重复注射一次，3H后处死动物。打开腹腔，结扎幽门和贲门，胃内注射8ML的1％甲醛溶液；将胃取出浸入甲醛溶液，30MIN后沿胃大弯切开，记录溃疡指数。

模型特点：此法也可以同时诱发食管、十二指肠的溃疡，可以用于溃疡发病机制和治疗药物的研究。

作者: join 时间: 2012-2-9 16:52

老年痴呆的动物模型
目前,尽管Alzheimer病(AD)的分子遗传学和分子生物学的研究中发现了4种与AD有关的基因,如APP的突变、AD3、STM2、ApoE等，但导致AD发病的关键机理尚不很清楚,而建立与之互为因果的真正AD模型尤为重要。
本实验采用MR I、γ2刀立体定位射频热凝损毁老年猴脑的穹隆2海马伞,并通过检测其tau及APP蛋白、乙酰胆碱酯酶( acethyl2cholinesterase,AchE) 、胆碱乙酰转移酶( choline acetyltransferas,ChAT)的方法进行验证,为今后研究AD发病机理和有效治疗奠定基础。
材料与方法
1.1　动物　健康的恒河猴5 只,均为雄性,年龄14～16岁;
1.2　方法
1.2.1 　仪器及试剂　核磁共振(MR I) 、γ2刀立体定位系统、ASA2601 T射频热凝器(均为以色列ELSCIN公司) ;光学显微镜(Olympus) ;冰冻切片机(Leica) 。抗APPA4 单抗购自德国BoehringerMannheim公司;抗Tau蛋白单抗、抗ChAT单抗购自美国Sigma Chemical Co1ABC试剂盒购自北京中山生物技术公司。
1.2.2　AD动物模型的建立　采用MR I、γ2刀立体定位系统及射频热凝方法毁损猴脑右侧的穹隆2海马伞。

作者: join 时间: 2012-2-9 16:53

一种新型阿尔茨海默病动物模型的建立

实验动物及分组：
选用健康SD 雄性大鼠32只,体重280～330 g ,将其随机分成A 、B、C、D 4 个组,A 组即对照组,鞘内注射( IT) 生理盐水。
模型组:B 组鞘内注射0. 5 % AlCl3 ,C 组鞘内注射1. 0 % AlCl3 ,D 组鞘内注射1. 5 % AlCl3 ,5 d 后拔管,单笼饲养28 d。

AD 动物模型建立方法及判定
蛛网膜下腔插管及给药方法采用Yaksh 法[ 1 ] 。
AD 动物模型成功标准的判定:采用一次性避暗回避试验行为学测试大鼠近期学习记忆能力,判断AD 模型建立是否成功;病理学观察判断AD 模型建立是否成功。

作者: join 时间: 2012-2-9 16:54

几种休克动物模型得建立
1.Hypovolemic shock（MODS Multiple organ dysfunction syndrome）：低血容量性休克模型
Wistar大鼠，4. 5 %异戊巴比妥(80 mg/ kg )？在25 ℃室温下腹腔内给药麻醉?,
右股动脉插入套管针 ,连接多导生理记录仪,监测血压;左颈静脉插入套管针给予甘氨酸、生理盐水和自体血(复苏通路) ;右颈动脉插入套管针,另一端连接肝素化玻璃注射器中, 进行放血诱导休克(休克模型建立)在5min 内使血压下降并维持平均动脉压30～35 mmHg。通过输、抽少量血维持低血压状态55 min。低血压60 min 后用60 %自体血回输5 min 和2 倍回输血量的生理盐水回输55 min 进行复苏。（出血性休克基础上, 通过复苏引发缺血- 再灌注损伤模拟MODS）

2.Septic shock:感染性休克
Wistar大鼠,随机分为正常对照组(n=6),大剂量(LPS10mg/kg)内毒素组(n=9),小剂量(LPS5mg/kg)内毒素组(n=9),对照组注射生理盐水4ml/kg。
戊巴比妥钠(36mg/kg)腹腔注射麻醉,行右侧股动脉插管,连接四导生理记录仪监测平均动脉压(meanarterialpressure,MAP),四肢插皮下电极连接生理记录仪描记心电图并记录心率变化。左侧股静脉注射LPS(注射时间5min),注射LPS前,注射LPS后30,60,90min,2,3,4,6h自左侧股动脉插管采血0.5ml,采血后补等量生理盐水以保证血容量,高速低温离心机3000r/min离心15min,吸取上清保存于-70e冰箱中（TNF测定）
感染性休克目前公认的动物模型有内毒素诱导、细菌注射、腹膜炎模型即盲肠结扎穿孔模型。
内毒素诱导模型具有制模方便、快捷、模型稳定、易于评定等优点，而且动物的血流动力学改变与内毒素的剂量直接相关

3.Cardiogenic shock:（结扎犬冠状动脉左前降支(LAD)复制心源性休克模型）
健康成年杂种犬20只,以戊巴比妥钠30mg·kg-1静脉注射麻醉后,背位固定, 切开颈部皮肤,分离气管后插入插管,连接人工呼吸机。分离右侧颈总动脉,插管,连接AP-601G放大器,测定血压(BP)。于左侧第四肋间施开胸术暴露心脏,剪开心包,做心包术。分离主动脉根部,放置电磁流量计探头,测量主动脉流量(CO)。于冠状动脉左前降支末梢、中部、根部下方,分别用小圆针穿入细丝线,以备结扎。上述手术完成后,稳定15~30min,10mi顺次结扎冠状动脉左前降支末梢、中部、根部,待平均动脉压(MAP)下降至原血压的70%以下,CO减少30%以下者视为休克。如达不到休克指标,再结扎冠脉左回旋支第1、2分支。心源性休克模型复制时间为(124.49±18.42)min,持续观察10min,如血压不回升者进行给药观察。

4.Allergic shock:过敏性休克
健康小白鼠,(变应原)采用鸡蛋清或天花粉8mg/ml并加入等量的氢氧化铝凝胶，氢氧化铝凝胶作为佐剂。第1日致敏注射：1:2稀释鸡蛋清, 佐剂，皮下注射0.2ml 第15日发敏注射：1:2稀释鸡蛋血清，静脉注射0.5ml 小白鼠发敏注射半分钟至数分钟后即出现呼吸急促，抓鼻，不安，耸毛，弓背，继而出现紫绀，呼吸困难，分钟后逐渐精神萎靡，平衡失调，大小便失禁甚至死亡。但多数小白鼠可在半小时后逐渐恢复正常.

5.Nervonic shock ?神经性休克没有找到相关得文献

作者: am10 时间: 2012-2-9 16:58

在体肝损伤修复模型：
SD大鼠，2-乙酰氨基芴（2-AAF，Sigma公司产品）20mg/kg灌胃，每日1次，连续4d，第5日在戊巴比妥全身麻醉下行三分之二肝切除（手术当日不灌喂2-AAF），第6日继续灌喂，连续1周。
首先2-AAF持续有力地抑制肝细胞增殖，随后肝大部切除诱导强烈再生需要，导致深层次的肝脏干细胞得以增殖分化发挥修复作用。
（陈耀凯等，中华肝脏病杂志，2002，10：185-188）

作者: am10 时间: 2012-2-9 16:58

我以前做培养心肌细胞凋亡模型是用H2O2，SIGMA公司的，用终浓度0.1%，实验很成功的，可以看到凋亡细胞的特征性改变。

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能否告知，您具体用多大浓度，多长时间来处理细胞的。谢谢了！

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-2-9 17:00

评价一下离体模型：

离体模型具有许多整体动物模型所不具备的优点：
①可对活细胞进行观察；
②实验条件标准化；
③研究样本较均一，减少了个体差异的干扰；
④便于观察、检测和记录研究的内容，利用离体模型研究者可以运用更多的技术检测更多的指标；
⑤制作离体模型的费用相对较少。离体模型有可能在同一时期利用较少的动物提供大量条件相同、性状相似的实验标本，因而比整体动物模型经济的多；
⑥来源于人体的离体标本相对而言较为容易获得。

作者: BOSS2011 时间: 2012-2-9 17:01

H2O2是引起细胞凋亡或坏死主要取决于：1过氧化氢的浓度；2过氧化氢作用的时间。一般来说，低浓度的过氧化氢多引起细胞的凋亡，而高浓度的过氧化氢多引起细胞的坏死。在非常低的浓度下，过氧化氢亦可引起细胞的增殖反应，这需要在具体试验中去摸索!

作者: 一叶 时间: 2012-2-9 17:01

参考文献上说H2O2可以诱导凋亡,我用的是NEK52E,已经试过两次了,浓度设置是1-5mM,作用时间是1-2h.1h后观察,H2O25mM的细胞大片坏死,1mM细胞形态学也发生改变,细胞体积增大,很像坏死,用DAPI染色观察凋亡不明显(我照相了,等我拷过来就发上让大家看看).
我想再试验一下,调整一下过氧化氢的浓度和作用时间,再就是用DAPI染色没法区分坏死和凋亡,可能要换一下方法.
很希望与大家交流!

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我不清楚你用的什么细胞，但是我觉得你的双氧水浓度有点大，我在成纤维细胞上用的浓度是0.2mM，细胞存活率大概在70%，只是一点建议。

作者: 一叶 时间: 2012-2-9 17:03

再补充一点，作用2到3个小时

作者: redbutterfly 时间: 2012-2-9 17:04

求助周围神经元培养后的损伤模型的制作方法

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-9 17:04

请问如果想做红细胞的体外损伤造模，有什么建议？谢谢

作者: duoduo 时间: 2012-2-9 17:05

我们实验室有一流的检测设备和很普通的细胞室，惆怅着不知该如何着手细胞的研究，望各位指点！

作者: loli 时间: 2012-2-9 17:05

慢性压迫性神经损伤(chronic constriction nerve injury，CCI)模型

用1％戊巴比妥钠以40 mg／kg的剂量腹腔注射麻醉动物，在左侧大腿中部暴露坐骨神经约1 cm。在三叉上方用4-0号铬制羊肠线每隔1 mm做轻度结扎，共4个结扎点。将肌肉层层缝合，最后缝合皮肤，并注射15万U／只的青霉素。

作者: loli 时间: 2012-2-9 17:06

血管内皮细胞（VEC）冷损伤模型的建立
培养4 d的VEC，采用WKL—V型速率冷冻仪冷冻细胞。先以2 ℃/min 的速率从37℃降至4℃并恒温5 min，再以4℃作为起始温度，在不加任何低温保护剂的情况下，以1℃/min的冷冻速率分别冻至0℃、一10℃、一20℃ 和一40℃。
其中冷冻至0 ℃的为轻度冷损伤模型、冷冻至一10℃的为中度冷损伤模型和冷冻至一20℃或一40℃的为重度冷损伤模型。对冷冻损伤反应较为适宜的细胞冷冻模型是中度冷损伤模型或重度中的一20℃冷损伤模型。

作者: loli 时间: 2012-2-9 17:06

肾小管细胞氧化性损伤模型
材料：DMEM培养基(Gibco BRL Co生产)，无糖DMEM培养基(Gibco BRL Co生产)，NRKSIE 鼠。肾小管细胞株(购于华西医科大学内科实验室)，乳酸钠(国产分析纯试剂)。
方法肾小管细胞培养 NRKSIE鼠肾小管细胞用0．25% 胰蛋白酶消化，将小管细胞分离成单个细胞悬液，用含100 mL/L 胎牛血清的DMEM培养基，于37℃5%(体积分数)CO2 孵箱中培养。每 24 h更换培养液一次，培养2～3 d，待细胞生长成片备用。
实验将细胞转种于96孑L板，细胞密度为lO ·mL ，孵育24 h。培养液中加入 H 20 2，浓度为5mmol/L ，作用 30 min。
讨论：
肾小管氧化性损伤在肾脏的缺血一再灌注损伤和中毒性损伤中起着重要作用。为了从细胞水平阐明活性氧自由基对。肾小管细胞的作用，本实验用5 mmol/L H2 0 2建立了肾小管氧化性损伤模型。H2 0 2虽不是自由基，但它属活性氧类，有高反应性，可促进自由基的生成，引发生物膜的脂质过氧化反应，导致细胞的坏死和凋亡。一般情况下，生物体内H 20 2常被酶系统所清除，如过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶。在过氧化氢复制的肾小管氧化性损伤的模型中，细胞的损伤非常明显，表现为细胞存活率降低，细胞膜完整性破坏，LDH释放增加，线粒体肿大，溶解明显增多，数目减少，细胞的脂质过氧化产物MDA含量增高。利用培养。肾小管细胞复制氧化性损伤模型避免了全身神经体液、激素水平及局部不同类型细胞间的相互影响，为更深入地从细胞水平研究。肾脏疾患提供了良好的模型。但由于实验所用的肾小管细胞株，在体外培养的过程，其膜表面结构、细胞器(如线粒体)、酶活性等与原代培养的人肾小管细胞可能存在一些差异，且该模型不能从血流动力学的角度反映。肾小管细胞的功能。因此，培养的肾小管细胞氧化性损伤模型必须与在体模型结合起来，相互补充。

作者: zhenxin 时间: 2012-2-9 17:07

本人想做PC12细胞在过氧化氢的作用下凋亡的试验，我看到上面的帖子说过氧化氢需要买sigma公司的，我不知道这种东西贵不贵，也不知道这种东西买的时候需要买什么样规格的，所以请各位大侠给点意见！谢谢

作者: zhenxin 时间: 2012-2-9 17:07

找到血管内皮损伤大鼠动物模型的制作
1　药品与试剂　盐酸肾上腺素(福州嘉华制药股份有限公司) , 氯胺酮(江苏恒瑞医药股份有限公司) , 内皮素-1 (ET -1) 浓度试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免研究所)。
2　仪器　HU -12A 透射电镜(***日立电子公司) , FJ-2011 型r免疫计数器(西安国营262 厂)。
3　实验方法
3. 1　动物分组　健康成年SD 大鼠44 只, 雌雄不拘, 体重300±20 g, 由浙江省实验动物中心提供。适应性饲养1 周, 随机分成2 组: 对照组6 只; 血管内皮损伤模型制作组38 只, 其中单纯模型制作组(模型组) 10 只, 另28 只(治疗组) 在模型制作过程中进行高压氧或高压空气干预。
3. 2　模型制作　用生理盐水将1 m g/m l 的盐酸肾上腺素稀释115 倍, 于每天的8: 00、12: 00、16: 00于相同部位皮下注射33.3 Lg (0.05 m l)/100 g, 连续5 天。对照组在同一时间、同一部位注射等量的生理盐水。
3. 3　标本采集　两组动物均于模型制作第6 天晨8: 00, 用氯胺酮按2 m g/100 g (体重) 肌肉注射麻醉, 开胸取降主动脉约1～ 2 mm 3 留作电镜标本, 自心脏取血1.5 m l 测定血浆中ET 21 浓度。
3. 4　电镜观察　SD 大鼠降主动脉标本经3% 戊二醛-1.5% 多聚甲醛固定4 h 以上(4 ℃) , 磷酸缓冲液(PBS) 漂洗后, 1% 锇酸后固定2 h (4 ℃) , 逐级乙醇2丙酮脱水, 环氧树脂618 浸透, 包埋, 超薄切片经枸橼酸铅、醋酸铀双染色各10 m in, 用HU -12A 透射电镜观察降主动脉内皮细胞结构等变化。
3. 5　血浆ET -1 浓度测定　放射免疫分析法。
附电镜图一张

图片附件: 37815227.jpg (2012-2-9 17:07, 40.59 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10594

作者: zhenxin 时间: 2012-2-9 17:09

还有
骨骼肌细胞损伤模型的建立
1 　材料　地塞米松磷酸钠注射液(江苏第三制药厂,批号000706) ;RPMI - 1640 培养基(GIBCO ,USA)(每升含10 %小牛血清、L-谷氨酰胺0. 33mg、青霉素100u、链霉素100u、pH-7. 4) ; 胰蛋白酶(Difco ,Lot :12885655) ; 四甲基氮唑盐(MTT) ( FLUKA , Switzerland) ;FLUO-3/ AM(CALBIOCHEM,Ca) ; 二甲基亚砜(DMSO) (MERCK,USA) ; SOD 与MDA 试剂盒(南京建成生物工程研究所) ;吖啶橙(AO) 、溴乙啶( EB )(FLUKA ,Switzerland) ;酶标仪(BIO-RAD ,USA) ;荧光显微镜(OLYPUS ,Japan) ; 激光共聚焦显微镜(BIO-RAD 公司MRC-1024 型,USA) 。SD 大鼠(南京中医药大学,动物合格证号:SCXK(苏) 2002-0012) 。
2 　骨骼肌细胞原代培养　取出生1d 的SD 大鼠四肢肌肉,切碎后用37 ℃的消化液(0. 05 %胶原酶和0. 25 %的胰蛋白酶) 消化两次,每次15min。经Percoll 密度梯度离心后,收集细胞,用Hank′s 液洗两次,199 细胞培养液(10 %胎牛血清) 悬浮细胞,接种入细胞培养皿。37 ℃培养12h 后收集未贴壁细胞并计数,种入细胞培养板,37 ℃培养。待细胞生长并融合进行如下实验。
3 　细胞增殖测定(MTT 比色) 　设地塞米松大(5mmol/L) 、中(1mmol/L) 、小(0. 2mmol/L) 剂量组,于加药培养后的第24h 从96 孔培养板中吸取100μl 培养上清液,每孔加入25μl 浓度为5mg/mlMTT溶液后,继续培养4h ,吸去旧培养液,再向各孔加入100μl 的二甲基亚砜(DMSO) 100μl ,振荡5min ,等细胞代谢MTT后所形成Formosan 充分溶解后,用酶联免疫检测仪测定490nm 处的吸收度值。
4 　SOD MDA 测定　于加药培养后的第24h 从96孔培养板中吸取的100μl 培养上清液,按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明进行测定。
5 　形态学方法　将骨骼肌细胞接种于处理过的载玻片上,以1mmol/L地塞米松作用24h 后,分别收集上清细胞及贴壁细胞,加吖啶橙和溴乙锭(AO/E 染液,在荧光显微镜下观察活细胞(VN) ,核染色质着绿色并呈正常结构;早期凋亡细胞(VA) ,核染色质着绿色呈固缩状或碎裂状; 晚期凋亡细胞(NVA) ,核染色质着橘红色呈固缩状或碎裂状;坏死细胞(NVN) ,核染色质着橘红色并呈正常结构。并计算损伤率:
损伤率= [ (VA + NVA + NVN) / 总细胞数] ×100 %。
6 　钙离子动态变化的测定　用敏感性钙指示剂FLUO-3/ AM,结合激光共聚焦显微镜(Laser ScanningConfocal Microscopy ,LSCM) 检测技术,分析细胞内钙离子的动态变化。储备的FLUO-3/ AM用D-Hanks液稀释至5μmol/L ,取10μl 加于培养的骨骼肌样品上,置5 %CO2 孵箱中孵育30min。然后用D-Hanks 液洗1 次,再用激光扫描共聚焦显微镜观察FLUO-3/ AM染色的骨骼肌某一层面的萤光图像。取地塞米松10μl 轻轻加入孔中,使终浓度达到1mmol/L,迅速以间隔4s 的速度扫描,计算机记录储存扫描结果, 使用软件为Time Course ( Kinetic ImagingSoftware for MRC-1024 and MRC-1024UV Confocal Imaging Systems) 及Lasersharp 数据处理软件。

作者: is2011 时间: 2012-2-9 17:09

由于最近要开始做瘢痕组织中成纤维细胞培养
所以整理了一些其培养方法
as follows：
瘢痕组织中成纤维细胞培养
方案1
1．细胞培养材料：取病人手术切下的病理性瘢痕组织及其周围正常组织。
2.取材部位：前胸、四肢等，病人年龄从3到35岁，瘢痕生长时间为6个月到1.5年。
3.采取组织块贴壁法进行成纤维细胞培养。
4．过程：在手术室无菌条件下将手术切下的病理性瘢痕及周围正常组织小心去除表皮及皮下脂肪组织，然后在超净工作台上用眼科剪刀将组织剪成大小约 0.5-1mm3的小块，加入少量小牛血清，接种于培养瓶中，在95%空气,5%CO2, 37°C, 饱和湿度条件下培养24小时，使组织块牢固贴附于瓶壁。然后加入适量含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养液继续培养，每周两次换液。
约3-4周，原代培养细胞生长成细胞单层。用0.25%胰蛋白酶消化以后，以1：2的比例传代培养。每隔两天用含10%小牛血清的DMEM培养液换液一次，待细胞铺满瓶底后传代。实验选用3-10代细胞。

方案2
1. 1 　材料　瘢痕组织:医院整形或烧伤科或烧伤科提供。DMEM 培养液(美国Gibco 公司产) ;小牛血清
1. 2 　方法　手术切取病人的瘢痕组织,在无菌条件下立即置入DMEM 培养液(含10 %FCS、青霉素100 U/ ml ,链霉素100μg/ ml) 的培养瓶中,于4 h 内在净化工作台内取出标本,放入加有青- 链霉素的DMEM 基础培养液中清洗2 次,尽量去除血污及表皮与基底层,将清洗干净的瘢痕组织用眼科剪剪成0. 5～1 mm3 的小块,分别转入2 支试管内,然后分步消化培养: ①单细胞培养法:将试管内组织用Hanks’液洗2 次,吸出上清,加入5 ml 0. 25 %胰蛋白酶液,置37 ℃消化20～30 min (或加入5ml 0. 1 %胰蛋白酶液,置4 ℃冷消化过夜) ,加入2 ml 小牛血清终止消化,去上清液,加入10 ml DMEM 完全培养液,用吸管将组织吹打成单个细胞悬液,200 目不锈钢筛过滤,离心去上清,Hanks’液洗2 次,加入DMEM 完全培养液,将细胞充分打匀,以5 ×105 细胞接种于50 ml 培养瓶内,置37 ℃、含5 %CO2 、饱和湿度的培养箱中培养,2～3 d 更换一次培养液; ②组织块贴壁培养法:分胰蛋白酶消化组及未消化组,消化组用0. 15 %胰蛋白酶液将组织块消化5～10 min ,去消化液, Hanks’液洗2次,去上清,加入含20 %FCS 的完全DMEM 培养液4～6 ml (视组织块量多少而定) ,混匀,静置数分钟,弃上清,然后用弯头吸管将消化或未消化的组织块移入用FCS 湿润过的培养瓶底部,均匀散在贴壁,滴加少量的完全培养液,置37 ℃、含5 %CO2 、饱和湿度的培养箱中培养,3 d 以后再补救加2 ml 完全培养液,此后3～4 d 更换一次培养液,待纤维细胞长满瓶底时作传代培养。

作者: plaa 时间: 2012-2-9 17:09

求助：我现在做心肌细胞培养，制造心肌细胞凋亡模型，想用过氧化氢，但不知道浓度和作用时间，还有买哪家公司的过氧化氢？各位战友请帮忙啊!谢谢！

作者: pencil菲 时间: 2012-2-9 17:10

请问高浓度氧细胞损伤模型如何建立?
哪位老师给给办法?谢谢!

作者: 987789 时间: 2012-2-9 17:14

求助一下大家:
过氧化氢细胞损伤模型主要的用途是什么呢!
抗氧化物质抗氧化活性的检测是不是可以用该模型呢?而且我发现做该模型好像很麻烦啊!我想现在检测一下我得到的物质的抗氧化活力!想用细胞损伤来检测一下!希望高手能够指点!我对于细胞培养方面的技能很欠缺!谢谢大家!急等!

作者: ququer787 时间: 2012-2-9 17:14

那位仁兄在做肠上皮细胞的缺氧复氧模型，告诉我模型的制作方法和注意事项！谢谢！

作者: utt0989 时间: 2012-2-9 17:14

请问有谁做过软骨藻酸细胞损伤模型啊？

作者: 一叶 时间: 2012-2-9 17:16

各位好:
我是一个从来没做过细胞培养的新手,现在我要做肝细胞损伤的药物实验,现在我想请教高手一个问题,用四氯化碳损伤肝细胞的浓度和时间如何来确定,是要同时培养很多板细胞吗?急需帮助! 先感谢大家了!

作者: Ao7 时间: 2012-2-9 17:17

有没有体外的肝纤维化模型？

作者: zhezhe 时间: 2012-2-9 17:17

看了几位高手关于缺氧-复氧模型的制作都用了乏氧罐，不知哪里有卖这种设备，如果没有，怎样制作？谢谢！

作者: greenbee 时间: 2012-2-9 17:18

ECV304过氧化氢损伤浓度和时间稳定了么?我用MTT法确定的浓度无法跑出DNAladder啊

作者: pencil菲 时间: 2012-2-9 17:18

我也想自制缺氧罐用于大脑神经元细胞缺氧复氧模型的制备,但始终有几个问题不知道如何解决:1.密闭问题2.混合气体输气管与自制设备输气管的连接3.自制设备的消毒及如何放于孵箱中4.通气流量及氧浓度的测定.我是新手,希望得到大家的帮助,谢谢!

作者: windy+++ 时间: 2012-2-9 17:18

请问如果是自制缺氧罐怎样解决如下问题
1密封问题,是用蜡，凡士林,还是胶带?
2同混合气体时,其是否放入孵箱内
3通气流量和缺氧罐中氧浓度的测定及测定部位
谢谢!!!

作者: eric930 时间: 2012-2-9 17:19

自制缺氧罐用玻璃干燥器充当.用凡士林密封.通完混合气体后立即放入孵箱内.通气流量用自制压力表检测, 缺氧罐中氧浓度的测定可抽气进行血气分析.
另: 有进口的低氧孵箱买, 如果专门做缺氧, 最好建议实验室买一个, 可自动控制氧气浓度到2%.

作者: zsxan1990 时间: 2012-2-9 17:19

我是位新手, 我目前所做的工作主要是缺氧后凋亡检测, 很不顺利. 在实验中我用过自制的干燥器缺氧罐, 但这种缺氧罐肯定不如进口的低氧孵箱好.我们实验室目前用的低氧孵箱是美国NuAire公司生产的, 据有关老师讲价格也不是很贵.

作者: zsxan1990 时间: 2012-2-9 17:19

唉！就是不幸啊！老板太固执了！

坚持让我做DNA－ladder，只有出了ladder他才会承认是凋亡

现在我只有拼命在跑ladder啊！

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你老板的坚持有道理,只有Ladder才能断定凋亡与否.其余的方法均不能很好地区分凋亡与坏死.
推荐以下文章做参考:
An integrative procedure for apoptosis identification and measurement. Nature Protocols doi:10.1038/nprot.2006.192

作者: greenbee 时间: 2012-2-9 17:20

"我用的箱子是自己设计作的～～和普通的箱子没什么区别～～关键就是要密闭性好！！作之前把里面的气体抽出来，再充95%的氮气，5%的CO2，使用测氧仪来测氧分压，确定小于5%即可。 "

普通的箱子是什么样的箱子？通入的Ｎ２和ＣＯ２是怎样保证无菌的？具体是怎样设计的？

作者: orangecake 时间: 2012-2-9 17:20

H2O2是引起细胞凋亡或坏死主要取决于：1过氧化氢的浓度；2过氧化氢作用的时间。一般来说，低浓度的过氧化氢多引起细胞的凋亡，而高浓度的过氧化氢多引起细胞的坏死。在非常低的浓度下，过氧化氢亦可引起细胞的增殖反应，这需要在具体试验中去摸索!

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你好！打扰了！在论坛上看到你的有关过氧化氢损伤的帖子。我现在在做药物对过氧化氢对SY5Y细胞的保护作用，想请教你有关过氧化氢损伤的问题。
我已经测了MTT，在96孔板中测定，损伤条件是200微摩尔损伤2h，大概损伤40%，测得的结果还可以。
现在我用相同的损伤条件测定细胞内GSH、MDA、SOD，因为需要大量细胞，所以在90mm的培养皿中培养细胞，可是在200微摩尔损伤2h的损伤条件下，细胞并没有被损伤，模型的值一直没有出结果。
请问你做过这些指标吗？你知道原因吗？能建仪以下合适的损伤浓度和时间吗？不甚感激！
过氧化氢损伤对GSH、MDA、SOD，有影响吗?

作者: 131415 时间: 2012-2-9 17:21

急求原代乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型的制作！

作者: am10 时间: 2012-2-9 17:21

我也是做低氧的
制备无氧培养基有必要吗
即使制备好了，他的储存，换培养液操作等等任何
一部只要存在氧都会通过扩散作用等一下子就破坏
了氧浓度的平衡吧
所以觉得没有这个必要吧

作者: wu11998866 时间: 2012-2-9 17:21

血管内皮细胞损伤模型可以有高糖.高脂,高半胱氨酸,你可以从两个方面着手:不同时间和不同剂量,做一曲线,指标选择一般有ICAM-1.VCAM-1,MAP.

作者: loli 时间: 2012-2-9 17:22

体外SD大鼠骨骼肌细胞损伤模型的制作，谁能提供一些方法啊？

作者: kswl870 时间: 2012-2-9 17:22

本人想做PC12细胞在过氧化氢的作用下凋亡的试验，我看到上面的帖子说过氧化氢需要买sigma公司的，我不知道这种东西贵不贵，也不知道这种东西买的时候需要买什么样规格的，所以请各位大侠给点意见！！！谢谢

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普通的刚买的过氧化氢完全可以做了，不需要sigma的。

作者: kswl870 时间: 2012-2-9 17:23

H2O2是引起细胞凋亡或坏死主要取决于：1过氧化氢的浓度；2过氧化氢作用的时间。一般来说，低浓度的过氧化氢多引起细胞的凋亡，而高浓度的过氧化氢多引起细胞的坏死。在非常低的浓度下，过氧化氢亦可引起细胞的增殖反应，这需要在具体试验中去摸索!

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的确是这样。而且做的过程中还要注意，随着细胞状态的不同，很可以同样的作用浓度，效果会相差很大。我曾经发现有时候200UM一点反应都没有，有时候全部死光了。

作者: 铜雀 时间: 2012-2-9 17:23

Ａβ产物诱导海马神经细胞，建立细胞模型：老化以后如何保存，老化是指Ａβ变成聚集状态吗？Ａβ25-35溶解在DMSO中，再用DMEM稀释，（那么稀释后浓度是多少）置于37℃下孵育7-14天，即为老化状态，又如何判断老化呢？

作者: remenb 时间: 2012-2-9 17:23

我也有同楼上一样的问题，还有就是检测指标里SOD是什么意思？谢谢

作者: 911 时间: 2012-2-9 17:26

请问楼上的我的ＡＤ模型打算用ＰＣ１２做，请问是不是得用分化的ＰＣ１２啊？
还有我打算从上海中科院买细胞，但那里的ＰＣ１２又分为易分化和高分化的，你说我该买哪个啊　？谢谢

作者: 911 时间: 2012-2-9 17:26

请问各位：过氧化氢和Aβ对PC12所产生的调亡程度是一样的吗？

作者: ha111 时间: 2012-2-9 17:27

近日，我也做过用50mg/L浓度的oxLDL（用含2%和0.4%血清的高糖型DMEM配置）来损伤ECV304，通过形态和MTT来检测细胞损伤情况，均没有见细胞受损的表现，结果还显示出oxLDL组比对照组细胞生长还好?这是不是楼上说的oxLDL促细胞增殖呢？很是头痛啊。
看来只有用无血清的培养基来作用试试看了，大家对于用oxLDL损伤内皮有什么意见和建议阿，用药物干预之后再换液时，需不需要清洗一下这也是个问题；另外，在内皮细胞选用上，不是有人说ECV304更趋于上皮细胞特性，不能代表内皮细胞来实验了么。希望有经验的老师多多参与讨论，给与点帮助阿。

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-9 17:39

有没人做氯化钴诱导的心肌缺氧损伤模型啊

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-9 17:40

这学期开始给肝星状细胞造模，用的是次氮基三乙酸铁（Fe-NTA）。请问有没有站友用过这种试剂造肝纤维化的模型，效果如何？我的实验结果总是很不稳定，期待与大家的探讨。

作者: ending 时间: 2012-2-9 17:41

有没人做氯化钴诱导心肌缺氧损伤的模型呢,考虑到物理缺氧不稳定,看到别人用氯化钴作用于神经细胞造成化学缺氧的损伤模型的,请问有人用氯化钴制造心肌缺氧模型么, 用的氯化钴浓度是多少呢我模浓度测出来一个峰值,郁闷中

作者: 2541 时间: 2012-2-9 17:41

请问大侠们有用过皮质酮损伤ＰＣ１２细胞的吗　　我怎么也溶解不了皮质酮　加了ＤＭＳＯ助溶也不行

作者: zranqi_1 时间: 2012-2-9 17:41

紧急求助求助变应性鼻炎的鼻粘膜的细胞模型，我想做这方面的动物试验，但是不知道怎么制备这样的鼻粘膜细胞模型，那位前辈知道，或者给一些建议，马上就要做实验了，还没有头绪，谢谢

作者: bananapeople 时间: 2012-2-9 17:42

有没人知道在A beta作用PC12细胞或皮质神经元的时候，a beta 25-25，abeta 1-40，a beta 1-42三者的作用有什么差别？仅仅是浓度与作用时间的差别吗？谢谢啊。

作者: vera+ 时间: 2012-2-9 17:42

有人知道如何做小鼠骨髓基质细胞损伤的模型吗？

作者: newway 时间: 2012-2-9 17:42

大家好！按照你们做凋亡的经验，用MTT值测得的用诱导剂作用细胞的存活率大概的范围是多少的时候可以算是比较成功的？40-60%？我还有一个问题就是在初筛这个诱导剂或者说这个模型有没有成功的话，你们用哪个指标来测？MTT，LDH?用流式固然好，但是如果实验室没有这个仪器的话，初步设计这个初筛指标，你们一般选择什么？

作者: 北风那个吹 时间: 2012-2-9 17:43

求助：哪位大侠做过紫外线诱导皮肤光老化的细胞模型？我用的是人成纤维细胞HDF
时间？紫外波段？
我想研究一下培养基中添加维生素C对光老化的保护作用
请赐教~~~谢谢各位！

作者: ladyhuahua 时间: 2012-2-9 17:44

请问做过帕金森体外模型的各位仁兄，用MPTP损伤和6-OHDA损伤有什么区别呢？不胜感激

作者: utt0989 时间: 2012-2-9 17:44

请教一下各位大侠，肝细胞体外进行缺氧复氧，缺氧多长时间有没有比较好的文献支持？查了好多文献，每个人缺氧时间都不一样呀。

作者: 987789 时间: 2012-2-9 17:45

你好！打扰了！在论坛上看到你的有关过氧化氢损伤的帖子。我现在在做药物对过氧化氢对SY5Y细胞的保护作用，想请教你有关过氧化氢损伤的问题。
我已经测了MTT，在96孔板中测定，损伤条件是200微摩尔损伤2h，大概损伤40%，测得的结果还可以。
现在我用相同的损伤条件测定细胞内GSH、MDA、SOD，因为需要大量细胞，所以在90mm的培养皿中培养细胞，可是在200微摩尔损伤2h的损伤条件下，细胞并没有被损伤，模型的值一直没有出结果。
请问你做过这些指标吗？你知道原因吗？能建仪以下合适的损伤浓度和时间吗？不甚感激！
过氧化氢损伤对GSH、MDA、SOD，有影响吗?

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我也是遇到这种情况，用96孔板缺氧CCK-8测生存率，大概70%。换成六孔板细胞几乎没怎么死。愁死了。咋回事啊。

作者: tangxin_80 时间: 2012-2-9 17:45

大家都是从哪里买的abeta1-42啊？查文献算下来20微摩尔每升，买的0.5mg装的怕都不够处理一瓶细胞，不对啊......《分子量4000多》......

作者: 春风十里WWW 时间: 2023-3-30 11:00 标题: 回复 #75 am10 的帖子

你好啊，十年后看见了您这个回复，想着您当年的疑问也得到了解决，所以想给你发消息询问一些经验，我想请问您用过氧化氢进行氧化损伤造模时是用什么浓度呢？作用时间是多久呢？我目前想用过氧化氢对AC16心肌细胞进行氧化损伤的造模，目的是为了找到一个最佳的过氧化氢浓度和作用时间能使线粒体膜电位发生变化但是细胞存活率较高的模型，您看能否给我一些建议呢？非常感谢，期待您的回复！

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