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标题: [讨论帖]MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结 [打印本页]

作者: TNT 时间: 2012-2-10 11:51 标题: [讨论帖]MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结

由于最近要以MEF为实验材料进行天然免疫相关实验，然后查了一些相关的资料，在这里希望与大家分享，由于大部分并非原创，因此会在醒目的位置注明出处。

作者: TNT 时间: 2012-2-10 11:51

我很希望在这方面曾经做过研究和即将从事这方面研究或有兴趣了解相关知识的朋友，多提自己现实遇到的问题，经验，相互解决问题，共同进步。我首先先将自己不太明白或者还未定论的问题，希望大家集思广益，相互讨论。
（1）关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。
我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。
（2）关于提取MEF的比较好的protocol>
（3）关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。
（4）关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的
AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：
1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。
2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。
3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。

作者: TNT 时间: 2012-2-10 11:51

最新的改进实验方法，抑制hES细胞分化的文献.在培养hES细胞的过程中，如何防止hES的分化是一个很现实的问题。超链接：cuturl('http://www.tissueeng.net/lab/papers/2006-30.pdf')

作者: TNT 时间: 2012-2-10 11:52

希望有养过MEF细胞的群友能提供培养基和血清的选择？
我所用的培养基DMEM高糖型，15%血清是SH30070。03E，HYCLONE感觉状态还不错，但血清太贵了，不知道其它有没有比较适合的血清，可以节省一点，因为实验比较紧张，所以自己不敢盲目试别的产品。

作者: 3648755 时间: 2012-2-10 11:52

我目前也在养MEF 但失败次数多于成功
个人总结如下：
1 我每次取的是16~18天的胚鼠个人觉得无碍我倒更喜欢大一点的胚胎更好操作一点
2 我取的是皮肤然后胰酶4度消化过夜第二天终止消化撕掉表皮留下真皮减碎用的100目滤网过滤这个胰酶消化的时间是个关键时间长了细胞容易死时间少了，表皮不容易揭下来我有此就是这样消化了15个小时结果接种下来的细胞不能贴壁全死了
3 我用的培养液是DMEM+10%小牛血清培养液也是关键因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣但总归是原代可能还是比较娇嫩我前几天就是这样后来发现是培养液出的问题测的PH值都8.3了细胞不死才怪毕竟细胞耐酸不耐碱
4 原代培养的最大天敌还是污染前几次养了满盘都是细菌同学都笑话我时不时巴斯德研究所的。

期待大伙做原代培养的酸甜苦乐。。。

good luck and have fun

作者: loli 时间: 2012-2-10 14:20

看到有人在用检测阴栓的方法检测小鼠是否受孕，我们实验室还没有人做过。我仍旧用的是我自己胡乱摸索的这样就比较废雌鼠，等到最先合笼的一批产崽后，那么后一周合笼的小鼠的胚胎期就是两周左右。还试过直接只合笼一批雌鼠，到13d后取胚胎，效果还不错，观察雌鼠的肚子能看的出来。

作者: TNT 时间: 2012-2-10 14:21

看阴栓还是比较准的
就是比较麻烦每天都要去看然后计天数

作者: TNT 时间: 2012-2-10 14:21

希望有养过MEF细胞的战友能提供培养基和血清的选择？
我所用的培养基DMEM高糖型，15%血清是SH30070。03E，HYCLONE感觉状态还不错，但血清太贵了，不知道其它有没有比较适合的血清，可以节省一点，因为实验比较紧张，所以自己不敢盲目试别的产品。

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用国产的四季青血清就可以了

作者: TNT 时间: 2012-2-10 14:22

看阴栓还是比较准的
就是比较麻烦每天都要去看然后计天数

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恩，我那时也是每天7点左右去看的，蛮累人的，
现在都直接动物房买了

作者: bamboo16 时间: 2012-2-10 14:22

希望有养过MEF细胞的战友能提供培养基和血清的选择？
我所用的培养基DMEM高糖型，15%血清是SH30070。03E，HYCLONE感觉状态还不错，但血清太贵了，不知道其它有没有比较适合的血清，可以节省一点，因为实验比较紧张，所以自己不敢盲目试别的产品。

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我感觉MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。
成纤维细胞尽管都能养活，但是养得好才叫本事，也只有养得好才能保证实验出好的结果，反正我感觉用MEF养胚胎干细胞是这样。

作者: bamboo16 时间: 2012-2-10 14:23

我目前也在养MEF 但失败次数多于成功
个人总结如下：
1 我每次取的是16~18天的胚鼠个人觉得无碍我倒更喜欢大一点的胚胎更好操作一点
2 我取的是皮肤然后胰酶4度消化过夜第二天终止消化撕掉表皮留下真皮减碎用的100目滤网过滤这个胰酶消化的时间是个关键时间长了细胞容易死时间少了，表皮不容易揭下来我有此就是这样消化了15个小时结果接种下来的细胞不能贴壁全死了
3 我用的培养液是DMEM+10%小牛血清培养液也是关键因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣但总归是原代可能还是比较娇嫩我前几天就是这样后来发现是培养液出的问题测的PH值都8.3了细胞不死才怪毕竟细胞耐酸不耐碱
4 原代培养的最大天敌还是污染前几次养了满盘都是细菌同学都笑话我时不时巴斯德研究所的。

期待大伙做原代培养的酸甜苦乐。。。

good luck and have fun

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你说的这种方法还挺新颖的（只取皮肤），我就是按照传统的大家都用的那种去头去四肢、内脏的方法，消化也是热消化，加上胰酶，并且配合吹打，消化上两三次，直接接种完事。比较简单，消化时间也容易掌握。只不过问题是这样养出来的细胞杂细胞很多。
感觉你用的老鼠天数挺大的，是不是因为你要用皮肤的原因呀。我一般用13天左右的。15天左右时分离出来的组织上有好多血丝，除不去，可能因为小鼠那时血液循环系统已经逐渐发育有关。
总体感觉MEF好养活，不好养好！

作者: october7 时间: 2012-2-10 14:23

大家可以说说关于mefs的转染问题，我觉得普通的非病毒的方式不适合它的转染，转染效率不高，而且容易放生分化

作者: shenkunjie 时间: 2012-2-10 14:24

我感觉MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。
成纤维细胞尽管都能养活，但是养得好才叫本事，也只有养得好才能保证实验出好的结果，反正我感觉用MEF养胚胎干细胞是这样。

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你的回复很有用，我老把当成胚胎干细胞来养，生怕养不好，所以用的是hyclone的血清，确实比较贵。还有我也很想看到大家讨论一下MEF转染的问题，就象楼上朋友所提出的问题，大家可以仁者见仁，因为就我感觉，用病毒转染肯定效率比较高些，我以后可能会尝试一下，但是需要优化各种条件。因为毕竟现在还有好多实验室达不到这种做病毒转染的条件，如果能够用电转或者lipo2000来优化，从而达到非常好的转染效率，那就非常好了。请有经验的群友介绍一下自己的心得，分享是一种美德！

作者: kulee 时间: 2012-2-10 14:24

成纤维细胞尽管都能养活，但是养得好才叫本事，也只有养得好才能保证实验出好的结果，反正我感觉用MEF养胚胎干细胞是这样。

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的确说的好。我也在养，成纤维细胞还是比较好样，对血清，培养基要求不高。国产的血清，如天津TBD就养的挺好的，但要把细胞养活力好，状态好，不老化，才能满足做饲养层的需要。还是要勤观察，勤换液，勤传代。

作者: shenkunjie 时间: 2012-2-10 14:25

我目前也在养MEF 但失败次数多于成功
个人总结如下：
1 我每次取的是16~18天的胚鼠个人觉得无碍我倒更喜欢大一点的胚胎更好操作一点
2 我取的是皮肤然后胰酶4度消化过夜第二天终止消化撕掉表皮留下真皮减碎用的100目滤网过滤这个胰酶消化的时间是个关键时间长了细胞容易死时间少了，表皮不容易揭下来我有此就是这样消化了15个小时结果接种下来的细胞不能贴壁全死了
3 我用的培养液是DMEM+10%小牛血清培养液也是关键因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣但总归是原代可能还是比较娇嫩我前几天就是这样后来发现是培养液出的问题测的PH值都8.3了细胞不死才怪毕竟细胞耐酸不耐碱
4 原代培养的最大天敌还是污染前几次养了满盘都是细菌同学都笑话我时不时巴斯德研究所的。

期待大伙做原代培养的酸甜苦乐。。。

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直接取皮肤消化得到的胚胎成纤维细胞是不是会更纯一些，你是参考哪个实验室的protocol啊？

作者: TNT 时间: 2012-2-10 14:25

直接取皮肤消化得到的胚胎成纤维细胞是不是会更纯一些，你是参考哪个实验室的protocol啊？

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可能会纯一些而且我经过滤网过滤
很惭愧这个是我师姐想出来的法子呵呵不知道是不是原创
不过按照一贯的做法也可以啊杂细胞经过两三次传代应该可以清除掉
毕竟成纤维细胞是优势细胞

作者: mimili_901 时间: 2012-2-10 14:26

日本大阪大学的takashi fujiata
教授发表的Cell Type-Specific Involvement of RIG-I in Antiviral Response
是关于MEF的天然免疫识别相关受体的一篇文章，
上面有我也就是从上面找出了我的课题的思路，希望能给人帮助！在GOOGLE或者immunity
上能下到全文.

作者: xueyouzhang 时间: 2012-2-10 14:26

我用的是qiagen 的hieffect 转染试剂,效率为siRNA50%,plasmid 15%,正常吗?有没有人有更高的转染方法或试剂,最好是用转染试剂.

作者: shenkunjie 时间: 2012-2-10 14:27

我用的是qiagen 的hieffect 转染试剂,效率为siRNA50%,plasmid 15%,正常吗?有没有人有更高的转染方法或试剂,最好是用转染试剂.

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我就用lipo2000,转染plasmid,plasmid和lipo2000都只用protocol剂量的一半,转染效率就能够达到40%以上.
(1)我不知道你用的质粒是用什么方法提出来的，我用的是endofree maxi qiagen试剂盒，提出来的质粒质量很高，如果是用小提试剂盒或者大提碱裂解法提出来的质粒，效率就会很低，不会超过20％。
（2）这个转染试剂我们实验室曾经又人用过，包括罗氏fugene转染试剂也用过，单效果都没有想象的好，应该是操作问题，单感觉lipo2000很不错，就是毒性大点，感觉做瞬时转染不够好，但转染试剂琳琅满目，看广告不如看转效，不晓得哪个最好，希望能又用的比较好的战友推荐一下
（3）这个转染试剂也挺贵，我记得是24孔板可用166次（500ul），3000多吧，是这种吗？
（4）不知道有没有人用过qiagen的RNAifect转染试剂，cat.no301605，怎么样啊？有没有更好的？

作者: shenkunjie 时间: 2012-2-10 14:29

有一个专门做RNA的公司——Ambion，他的RNAi的产品非常好，国外用这个公司的产品发文章的比较多。
Ambion AM4510 siPORT™ NeoFX, 0.4 ml 每次转染试剂用量是Qiagen的1/3

听说比Qiagen的效果好,不知道有没人用过.

作者: 66小飞侠 时间: 2012-2-10 14:30

我也想说两句。养MEF有阵子了，觉得这个细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。

我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。因为健康的MEF就是易消化易贴壁。老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。

附带一句，易消化易贴壁是fibroblast的共性，其他的fibroblast复苏传代的时候我们也是这么干的。

作者: bamboo16 时间: 2012-2-10 14:30

学习~~请问取胎鼠时，四肢和尾巴保留否啊？我用的THOMSON LAB protocal。这点怎么每个protocal都不同啊。晕！

作者: jujuba 时间: 2012-2-10 14:30

弱弱地问一句各位养MEF的高手，MEF的接触抑制效果如何？怎么我养的最近感觉老是长成两层。之前是每次都消化下来（0.125%胰酶+0.1%EDTA，消化2分钟左右），可是导师批我消化过头说不用那样的周边的消化不下来没事，结果就悲剧了周边的每次都下不来了而且还层层叠加~~~不知是细胞恶变了还是它本身就这样的

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