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标题: [求助]人脂肪细胞的培养 [打印本页]

作者: pencil菲 时间: 2012-2-11 08:27 标题: [求助]人脂肪细胞的培养

各位老师：
我是搞临床的，没有细胞培养方面的经验。查文献发现，大多数脂肪细胞的研究是做高糖诱导分化的3T3细胞系，或做原代培养。我想做正常葡萄糖浓度下人脂肪细胞的相关研究，却苦于没有相关资料。司徒镇强老师主编的《细胞培养》一书中提到，从成熟的脂肪组织中很难培养出细胞。是否现在尚无此方面的成熟技术？
如果哪位老师有此方面的经验（包括原代脂肪细胞培养）还望赐教，先行谢过。

作者: sunnyB 时间: 2012-2-11 08:28

我的细胞总是圆形，但是贴壁，生长缓慢，烦劳各位支招

作者: yychen 时间: 2012-2-11 08:28

脂肪基质细胞的培养国外技术已经比较成熟了
我已经做了2年，积累了一些经验，可以交流一下！

作者: nn255 时间: 2012-2-11 08:39

用脂肪组织培养出前脂肪细胞，经诱导后可分化为成熟脂肪细胞，但分化率不是很高。

作者: yychen 时间: 2012-2-11 08:40

你是用的人的还是鼠的细胞？

前脂肪细胞形态如何？

作者: orangecake 时间: 2012-2-11 08:41

我养过，但是是大鼠的，我的实验方法如下：
实验方法：
1．大鼠前脂肪细胞的原代培养：颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精浸泡消毒15min，切取皮下脂肪组织约10g。Hanks液洗涤，分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成份及血管。剪碎成约2mm×2mm的小块，加入消化液，置37℃，空气摇床100rpm消化。2hr后，1000rpm离心5min，去除漂浮的脂肪细胞及培养液，沉积的细胞用红细胞裂解液再次配成细胞悬液，37℃孵育10min，以去除污染的红细胞，150μ尼龙网过滤，Hanks液洗涤并离心2次，每次1000rpm,5min。沉积的细胞用培养基A制成细胞悬液，调节浓度2×105/ml接种于培养瓶中。置37℃，体积分数5%CO2培养箱内孵育72hr后，细胞换液，一周以后可以传代。

2.细胞的分化：细胞贴壁72hr后Hanks轻轻洗去培养瓶内未粘附的物质，换用培养基C诱导和维持脂肪细胞分化，3d以后更换为培养基B，以后每三天换一次液。

培养基A（增殖培养基）： DMEM/F12　11.2g/L
10%小牛血清,
L-Glutamin 0.35g/L
Hepes 15mmol/L
NaHCO3 15mmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml

培养基B（诱脂培养基1）：DMEM/F12　11.2g/L
NaHCO3 15mmol/L
Hepes 15mmol/L
泛酸盐 17µmol/L
生物素 33µmol/L
人转铁蛋白 17µmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
氢化可的松 100nmol/L
胰岛素 60nmol/L
T3 0.2nmol/L

培养基C（诱脂培养基2）：DMEM/F12　11.2g/L
10%小牛血清,
IBMX 0.25mmol/L
L-Glutamin 0.35g/L
Hepes 15mmol/L
NaHCO3 15mmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
0.22µm过滤除菌，-20℃保存。

消化液：胶原酶Ⅰ　　 150mg
　　牛血清白蛋白　　2g
0.01M的PBS定容至100ml

2.2红细胞裂解液：EDTA 0.1 mM
　　　　　　 NH4Cl　　 150mM
　　　 K2HPO4 5.7mM
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

作者: 04906 时间: 2012-2-11 08:41

好激动啊！我用的是小鼠3t3l1细胞，可复苏后半死不活，总是圆形虽然贴壁。我复苏时不离心，第二天换液。方法是否存在不妥，烦劳各位指教。多多感谢。

作者: one 时间: 2012-2-11 08:42

我复苏时不离心

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您这是什么意思？不离心怎么复苏啊？
另外，细胞圆形的说明贴壁没贴上。
复苏后用PBS洗过没？要把冻存液洗干净。

作者: 04906 时间: 2012-2-11 08:42

有报道说复苏只要把细胞直接接种到培养瓶里就ok了，因为离心损伤也大，但是我第二天换液的，洗掉冻存液。
咱养的细胞一样？

作者: pencil菲 时间: 2012-2-11 08:43

非常感谢您所提供的帮助,我计划养人的前脂肪细胞,你的方案对我很有启发。还有几个问题想请教一下。
1 .前脂肪细胞一般传几代以后增殖能力降低？
2. 对内皮细胞污染你是如何处理的？
3. 培养基C（诱脂培养基2）中IBMX的作用是什么？
4. 诱导的成熟脂肪细胞是如何鉴定?凭外观和苏丹3染色可以吗?
5. 10g样本,能获得大概多少成熟脂肪细胞
6. 从取一份样本到诱导分化成功脂肪细胞大概需多少钱,我老板的银子可不多啊.
非常感谢!

作者: yychen 时间: 2012-2-11 08:43

这我也听过这种说法，也试过，但是不把冻存液洗干净，细胞好像就不爱帖壁，至少我的细胞是这样的。我是用鼠胚成纤维细胞试过。

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前脂肪细胞的培养现在多用于软组织工程和减肥药物的研发。不知你是想向哪个方向研究。对于你的问题，我知道的可以告诉你答案：
1、我的经验是五六代以后就增殖力不行了。但是我查文献，看到米国有个牛实验室，一气儿传了二百多代，看他们的实验方法和我也差不多，不知道诀窍在哪里。那篇文章一时找不到了，找到再给你看吧。
2、我是用胰酶消化法。发现内皮细胞污染后，用胰酶和EDTA消化。镜下观察。内皮细胞消化很快，大约一分钟后就可以看细胞缩小，这里把内皮细胞吹下即可。
3、IBMX是甲基异丁基次黄嘌呤。我是在sigma订的，贵，900多100mg。它的作用是促使脂肪细胞分化基因重排。
4、对，这样也可以。其它供参考的指标有：油红O，GPDH，PPAR等。
5、大约一千万左右吧
6、我共计花了二三千块：包括，IBMX 900，胰岛素，T3、转铁蛋白，共计一千多，胶原酶300多，还有就是几只大鼠啦，每只25(8过这笔钱你就不用啦)，再算上那些一次性培养瓶什么的，精打细算三千可以搞定。

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-11 08:44

前天我们复苏的细胞离心了，1000转5分钟，第二天是圆形贴壁，有部分梭形细胞，可今天一看，哇噻，全部崩解了，怎么回事咯？难道培养基的问题，我们用的dmem培养基，原先用的是dmem/f12，请问：
俩者有啥区别？
忽然换培养基影响么？
谢了。

作者: yychen 时间: 2012-2-11 08:44

QUOTE:

原帖由 woshituzhu 于 2012-2-11 08:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
前天我们复苏的细胞离心了，1000转5分钟，第二天是圆形贴壁，有部分梭形细胞，可今天一看，哇噻，全部崩解了，怎么回事咯？难道培养基的问题，我们用的dmem培养基，原先用的是dmem/f12，请问：
俩者有啥区别？
忽然换培养基影响么？
谢了。 ...

F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。

细胞崩解可能是复苏的条件没有掌握好，细胞活性差；或者是培养基的pH等问题，原因很多，不好说

换用DMEM短期影响不会很大

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-11 08:45

你说的崩解是什么意思？浮起来，还是碎裂了？

如果是后者的话，同意楼上的，检查培养液的PH，还有，你的培养液在4度放了多久了，超过二十天就会出问题，里面的gulutamine啦什么的会分解(当然，如果买的是标明含stable glutamine的例外)。

另外，复苏时的原则是慢冻快化，即融化时要快快的，放在37度快化开。不然产生冰晶会损伤细胞(这可能是废话了，你十九知道。)可以再检查一下液氮桶是不是没液氮了？

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-11 08:45

真是高兴这么多朋友帮助我的那些宝贝。他们是碎裂了。我们的过程是
1 上午把在－20度冻存的培养基拿出，放在室温平衡（是不是不该在室温平衡啊）
2 下午加入胎牛血清，调ph到7.2。随后小滤器过滤培养基。
3 液氮中取出38度1－2分钟，离心1000转5分钟。接种到俩个培养瓶中。
此过程如有纰漏，望各位不吝指出
还有，我们的培养基早就配好，放在－20度，但是结冰后可以看见瓶口有发紫红的培养液滴，可瓶子灌的也不是很满啊。大概80％吧。

作者: redbutterfly 时间: 2012-2-11 08:46 标题: 回复 #15 woshituzhu 的帖子

我的疑问是：
为什么你从-20度取出培养基后还要再过滤？？难道在冻之前没有滤过？？如果是这样，我的看法是：冻之前没过滤，即使在-20℃保存，还是会有微量细菌增殖，从而会消耗培养液中的营养物质。所以，是细菌抢掉了你宝贝细胞的营养哦!

作者: redbutterfly 时间: 2012-2-11 08:48

另外，我的习惯是，配完的培养液在六小时内过滤掉(无论如何不要超过24hr)，防止里面细菌增殖，吃我的营养啊。
我看你在室温下还放了大半天，余颇不以为然也，呵呵,开个玩笑啦。
而且，血清最好事先灭活(56℃15min)，然后等培养液过滤好以后再加入。因为血清中有许多成份分子蛮大的，放在滤器里一滤可能就滤没啦。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-2-11 08:49

我们在放到－20度前用大滤器滤过了，为了保险我们在作之前都要用小滤器再过滤一次，还有，小牛血清不过滤就加入不怕污染么？
诶，郁闷之至。我们的细胞今早晨看全部污染，连同一直没有碰过的几瓶。可我们前些日子刚打扫了孵箱啊。孵箱的细胞是不同时间不同人冻的，培养基用的都不是一批，复苏时间也不同，
咋办泥?

作者: redbutterfly 时间: 2012-2-11 08:49

是什么污染，霉菌吗？
如果是的话，那可能是孵箱被霉菌污染啦。
以前看见有人教过的方法，是高锰酸钾：甲醛=30颗：60ml 。熏蒸12小时。
小牛清血制备过程是无菌的，56度灭活即可，不必滤。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-2-11 08:50

我们昨天把俩瓶只有培养基的培养瓶放进去了。有一瓶半开口，另一瓶莲盖都没有盖。可今天看，没有污染啊。

作者: baidukk 时间: 2012-2-11 08:50

有个问题请教一下:
有的文献用的是胶原酶 1型,有的是 2型,有什么区别吗?

谢谢先

作者: owanaka 时间: 2012-2-11 08:50

鸡的脂肪细胞可以用这样的方法吗？

作者: 笑弯了腰 时间: 2012-2-11 08:51

胶原酶要消化2小时阿！那么久！！

作者: 园丁## 时间: 2012-2-11 08:52 标题: 回复 #23 笑弯了腰的帖子

好像是要两个小时。

作者: yueban-1147 时间: 2012-2-11 08:53 标题: 回复 #23 笑弯了腰的帖子

胶原酶消化半个小时足够了

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-11 08:53

好像你在养前脂肪细胞呢，能给点建议么、我们上次做了一回可没长出来。你觉得你有什么最大体会么谢谢^_^

作者: jkobn 时间: 2012-2-11 08:54

我养过，但是是大鼠的，我的实验方法如下：
实验方法：
1．大鼠前脂肪细胞的原代培养：颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精浸泡消毒15min，切取皮下脂肪组织约10g。Hanks液洗涤，分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成份及血管。剪碎成约2mm×2mm的小块，加入消化液，置37℃，空气摇床100rpm消化。2hr后，1000rpm离心5min，去除漂浮的脂肪细胞及培养液，沉积的细胞用红细胞裂解液再次配成细胞悬液，37℃孵育10min，以去除污染的红细胞，150μ尼龙网过滤，Hanks液洗涤并离心2次，每次1000rpm,5min。沉积的细胞用培养基A制成细胞悬液，调节浓度2×105/ml接种于培养瓶中。置37℃，体积分数5%CO2培养箱内孵育72hr后，细胞换液，一周以后可以传代。

2.细胞的分化：细胞贴壁72hr后Hanks轻轻洗去培养瓶内未粘附的物质，换用培养基C诱导和维持脂肪细胞分化，3d以后更换为培养基B，以后每三天换一次液。

培养基A（增殖培养基）： DMEM/F12　11.2g/L
10%小牛血清,
L-Glutamin 0.35g/L
Hepes 15mmol/L
NaHCO3 15mmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml

培养基B（诱脂培养基1）：DMEM/F12　11.2g/L
NaHCO3 15mmol/L
Hepes 15mmol/L
泛酸盐 17µmol/L
生物素 33µmol/L
人转铁蛋白 17µmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
氢化可的松 100nmol/L
胰岛素 60nmol/L
T3 0.2nmol/L

培养基C（诱脂培养基2）：DMEM/F12　11.2g/L
10%小牛血清,
IBMX 0.25mmol/L
L-Glutamin 0.35g/L
Hepes 15mmol/L
NaHCO3 15mmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
0.22µm过滤除菌，-20℃保存。

消化液：胶原酶Ⅰ　　 150mg
　　牛血清白蛋白　　2g
0.01M的PBS定容至100ml

2.2红细胞裂解液：EDTA 0.1 mM
　　　　　　 NH4Cl　　 150mM
　　　 K2HPO4 5.7mM
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

我想问一下如果是3T3L1的话诱脂培养基有什么不同，我看过文献每个人做的都不完全一样！很多人血清浓度还是用的10%但是最新的观点认为分化时无血清较好，请教各位大虾，我的分化培养基该如何配！多谢！新手上路，请多关照！

作者: toy 时间: 2012-2-11 08:55

还有请教各位是离心率的事，有的文献上写的是500g或是800g，而有的写的是1000rpm，这两者在司徒镇强老师的细胞培养书的附录上相对比，发现在500g或是800g的转速应该在2500-3000rpm,不知各位何看待这事，有什么经验给指点一二。谢谢先。

作者: sunnyB 时间: 2012-2-11 08:55

你是如何检测3-GDPH的？能否给予详细的步骤及所需试剂，有无检测GDPH的试剂盒？
PPAR是什么？

作者: 00无名指00 时间: 2012-2-11 08:56

目前临床上使用的格列酮类药物有三种，即：曲格列酮（troglitazone）、罗格列酮（roseglitazone）和匹格列酮（pioglitazone），其中最早使用的曲格列酮因其肝脏毒性已在大多数国家禁用（我国从未进口）。英国史可必成公司生产的罗格列酮（商品名：文迪雅）是第一个在我国被批准用于临床的格列酮类药物。

上述三种格列酮类药物的基本化学结构为噻唑烷二酮，该类药物通过改善胰岛素抵抗而降低血糖和改善其它代谢综合征的表现。其作用机制是通过结合和活化一种在代谢控制中起关键作用的受体—过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体γ（PPARγ)而起作用。 PPARγ主要存在于脂肪细胞中，也少量存在于骨骼肌和肝脏细胞中。因此，格列酮类药物主要作用于脂肪细胞，也作用于骨骼肌和其它胰岛素敏感组织。

作者: 00无名指00 时间: 2012-2-11 08:56

还有请教各位是离心率的事，有的文献上写的是500g或是800g，而有的写的是1000rpm，这两者在司徒镇强老师的细胞培养书的附录上相对比，发现在500g或是800g的转速应该在2500-3000rpm,不知各位何看待这事，有什么经验给指点一二。谢谢先。

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500g或是800g的转速应该在2500-3000rpm,不是把，g和rpm得换算，应该有半径，文献上又没写半径，你怎么能通过 g换算成rpm.我也不太懂，还是高人指点吧

作者: 00无名指00 时间: 2012-2-11 08:57

司徒镇强老师的细胞培养书后面有一个离心率与离心力的图表，各位可以一看。换算公式是：RFC(相对离心力)=1.119x10的负5次方×(rpm)的平方×r。r是离心径。

作者: utt0989 时间: 2012-2-11 08:58

ppar 是过氧化物增殖物激活受体的简称！

作者: gemei0115 时间: 2012-2-11 08:58

还有请教各位是离心率的事，有的文献上写的是500g或是800g，而有的写的是1000rpm，这两者在司徒镇强老师的细胞培养书的附录上相对比，发现在500g或是800g的转速应该在2500-3000rpm,不知各位何看待这事，有什么经验给指点一二。谢谢先。

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1000RPM就行了，太高细胞可能会受影响。

作者: gemei0115 时间: 2012-2-11 08:58

你是如何检测3-GDPH的？能否给予详细的步骤及所需试剂，有无检测GDPH的试剂盒？
PPAR是什么？

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日本的takara公司有试剂盒

作者: hold住 时间: 2012-2-11 08:59

我养过，但是是大鼠的，我的实验方法如下：
实验方法：
1．大鼠前脂肪细胞的原代培养：颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精浸泡消毒15min，切取皮下脂肪组织约10g。Hanks液洗涤，分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成份及血管。剪碎成约2mm×2mm的小块，加入消化液，置37℃，空气摇床100rpm消化。2hr后，1000rpm离心5min，去除漂浮的脂肪细胞及培养液，沉积的细胞用红细胞裂解液再次配成细胞悬液，37℃孵育10min，以去除污染的红细胞，150μ尼龙网过滤，Hanks液洗涤并离心2次，每次1000rpm,5min。沉积的细胞用培养基A制成细胞悬液，调节浓度2×105/ml接种于培养瓶中。置37℃，体积分数5%CO2培养箱内孵育72hr后，细胞换液，一周以后可以传代。

2.细胞的分化：细胞贴壁72hr后Hanks轻轻洗去培养瓶内未粘附的物质，换用培养基C诱导和维持脂肪细胞分化，3d以后更换为培养基B，以后每三天换一次液。

培养基A（增殖培养基）： DMEM/F12　11.2g/L
10%小牛血清,
L-Glutamin 0.35g/L
Hepes 15mmol/L
NaHCO3 15mmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml

培养基B（诱脂培养基1）：DMEM/F12　11.2g/L
NaHCO3 15mmol/L
Hepes 15mmol/L
泛酸盐 17µmol/L
生物素 33µmol/L
人转铁蛋白 17µmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
氢化可的松 100nmol/L
胰岛素 60nmol/L
T3 0.2nmol/L

培养基C（诱脂培养基2）：DMEM/F12　11.2g/L
10%小牛血清,
IBMX 0.25mmol/L
L-Glutamin 0.35g/L
Hepes 15mmol/L
NaHCO3 15mmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
0.22µm过滤除菌，-20℃保存。

消化液：胶原酶Ⅰ　　 150mg
　　牛血清白蛋白　　2g
0.01M的PBS定容至100ml

2.2红细胞裂解液：EDTA 0.1 mM
　　　　　　 NH4Cl　　 150mM
　　　 K2HPO4 5.7mM
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

请问为什么要加泛酸盐 17µmol/L
生物素 33µmol/L？
谢谢！

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-11 08:59

1000RPM就行了，太高细胞可能会受影响

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我们在做前脂肪细胞的培养，按照公式计算下来，大概需要2500－2600转，培养了大概有六回了，没有觉得有什么太大的影响，细胞还好。但是我们师哥是用1000转离心的，没有培养出来前脂肪细胞，我象大概和离心有关吧

作者: BUK 时间: 2012-2-11 09:00

1现在很多文献都说培养前脂肪细胞要加bfgf，好象是10ng ，还有胰岛素，地塞米松。可暂时没有bfgf，只加胰岛素，地塞米松可不可以啊
2还有bfgf，胰岛素，地塞米松都是促进前脂肪细胞转化为脂肪细胞。而培养脂肪细胞需要加吗？？？？？听说脂肪细胞很难贴壁，后天到我培养的时候真不知道会是什么样？？？
真是迷茫啊，drake015你要是养过脂肪细胞就好了。可以向你请教！

作者: yychen 时间: 2012-2-11 09:04 标题: 回复 #38 BUK 的帖子

用“脂肪细胞”搜索一下试试。可以和相关的人私下联系请教，没有要的资料也可以将你的问题发新帖提问

作者: 阿敏 时间: 2012-2-11 09:06

没想到这么多人在谈脂肪细胞,真有点兴奋.我已经和脂肪细胞打了一年的交道,想简单谈一点
看大家的问题,觉得在动手实验前一定要多读文献,比如sun◎flower ,你如果要做脂肪,你必须要了解PPAR,C/REB等转录调空因子,否则....

GDPH的检测方法,据我所知没有试剂盒,但那只是个酶促反映,你买齐了低物,在加上分光光度计就可以了.

对于细胞离心的问题,你应该清楚,不同的离心机g和 rpm是不一样的,你要根据自己的离心几计算,不过我觉得没必要, 一般离心10ml--15ml的<10MIN,1000RPM绝对没问题

至于原代培养的问题,第一,我觉得取样部位很重要,第二,消化法很不稳定,我推荐"植块法",简单高效,至于血清浓度,原代可以稍微高一些,15%甚至20%,中间可以低一些8%,5代后根据细胞状态,可能还需要在高一些!

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-2-11 09:06

脂肪基质细胞的培养国外技术已经比较成熟了

我已经做了2年，积累了一些经验，可以交流一下！

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那请问我培养的前脂肪细胞，总是在24h后有一层油膜，外界条件也没有问题，空培了也没问题，然后我就不知道怎么了，是细胞自己分泌的油脂吗？谢谢，谢谢啦~~~~~~·

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