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标题: [求助]DCFH-DA测定胞内ROS背景高 [打印本页]

作者: bohe221 时间: 2012-2-12 13:16 标题: [求助]DCFH-DA测定胞内ROS背景高

如题，最近在使用DCFH-DA荧光标记细胞内活性氧ROS的含量，使用的是碧云天的试剂盒，配有ROS的刺激标准物ROSup。
我按照说明书操作，96孔板养细胞24小时后，吸取培养液，加50微升10uM的DCFH-DA，37度抚育15min，之后取出，PBS洗3遍，加1mg/L的ROSup，15min后观察荧光（蓝光激发，发的光为绿色）。
我出现的问题是：加了ROSup刺激后的细胞荧光和只加了DCFH-DA 的细胞都有荧光，但是都很弱，甚至刺激组比对照还弱，怎么回事啊？求助各位大侠~~~~

作者: ha111 时间: 2012-2-12 13:17

（1）测定ROS完全可以不用试剂盒。直接从sigma购买DCFDA后回来溶解就行。

（2）你即使使用试剂盒，特别是中国的试剂盒，也需要进行条件摸索。我的经验是DCFDA的浓度要加到50uM才有荧光。你的浓度可能太低了。

（3）我测定ROS时根本没有用什么ROS up，测得也很好。

（4）你的DCFDA使用什么溶解的？我一般用无血清的培养基。

（5）加DCFDA之后需要避光孵育。

（6）你的药物刺激时间也需要摸索，因此在初次实验时需要设置阳性对照。

作者: bohe221 时间: 2012-2-12 13:18

（1）测定ROS完全可以不用试剂盒。直接从sigma购买DCFDA后回来溶解就行。

（2）你即使使用试剂盒，特别是中国的试剂盒，也需要进行条件摸索。我的经验是DCFDA的浓度要加到50uM才有荧光。你的浓度可能太低了。

（3）我测定ROS时根本没有用什么ROS up，测得也很好。

（4）你的DCFDA使用什么溶解的？我一般用无血清的培养基。

（5）加DCFDA之后需要避光孵育。

（6）你的药物刺激时间也需要摸索，因此在初次实验时需要设置阳性对照。

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谢谢你的关注！
1，使用试剂盒只是因为直接从sigma购买，量太多我用不了，价钱也贵~试剂盒里东西都是一样的；
2，可能是我DCFH-DA用量不够。期间我还用过24孔板，加DCFH-DA的量为10uM的300ul，但是空白和阳性对照同样有荧光，而且都很强。
3，我那个Rosup其实就是做阳性对照的，装载探针后加Rosup，激发细胞内活性氧的增加，不是什么添加剂；
4，我用pbs稀释的，不知道这两种操作有无差别~
5，避光的话需要到什么程度？拿铝箔把整个96孔板都遮住吗？

附图为我24孔板的阳性对照，即加了rosup刺激产生活性氧的细胞荧光。
后一个是空白，即只加入了DCFH-DA作为空白对照的，没调好焦距，不过可以看出荧光也很强

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作者: bohe221 时间: 2012-2-12 13:18

这一个是空白，即只加入了DCFH-DA作为空白对照的，没调好焦距，不过可以看出荧光也很强

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作者: ha111 时间: 2012-2-12 13:19

（1）我觉得你的检测不能只通过眼睛观察荧光的强度。你必须要用荧光仪测定荧光吸收强度，做量化检测。

（2）另外，如果你的细胞是可以消化的话，最好采用流式检测，结果是最准确的。

（3）荧光照片只能作为support evidence。并不重要。

作者: bohe221 时间: 2012-2-12 13:23

（1）我觉得你的检测不能只通过眼睛观察荧光的强度。你必须要用荧光仪测定荧光吸收强度，做量化检测。

（2）另外，如果你的细胞是可以消化的话，最好采用流式检测，结果是最准确的。

（3）荧光照片只能作为support evidence。并不重要。

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明白了~看来还有好多要做的涅~麻烦...
ps：我们是化学实验室，木有流式...

作者: yes4 时间: 2012-2-12 13:23

后来你们怎么解决了？我们也碰到类似情况。我们是用流式检测，按照说明书操作，只加DCFH-DA的空白对照比阳性对照的荧光还要强。

作者: wsll 时间: 2012-2-12 13:24

大家看看我做的图片吧！我的DCFH-DA浓度加到20uM，孵育20分钟，但是荧光强度很低，不知道怎么回事？大家给点建议

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10700

作者: junjie05 时间: 2012-2-12 13:25

请问ROSUP在装探针之前还是之后加呢？

作者: baidukk 时间: 2012-2-12 13:26

我们实验室作的比较多，一般用流氏和cofocal检测。关于浓度，10uM浓度足以，抚育时间20-30分钟就足够了，避光，37度。由于是活细胞检测，所以细胞状态非常重要，所以处理后要尽快检测，如果时间隔过长，可能会导致ROS增高，我一般最多一次做6个样，一次做多了，后面的样ROS就不怎么准了，做完后我会再把第一个回头再做一次，如果和开始检测时差不多，说明还可以。
关于阳性对照，H2O2 500uM常见，但并不是很好做，时间上要早，5分，10分钟的反应时间，再长可能就没了。还有胰岛素，也在早期有ROS产生，这些对照做起来其实很难，时间一耽搁，就做不出来了。
至于ROS 过低，可能和细胞有关，细胞本身本地的ROS不一样，一般癌细胞的本底高，检测起来好出，有些细胞可能低了，我们实验室做癌细胞还都能出来。还跟你的反应药物有关，可能真的没有ROS产生呢？这样的话，必须把阳性对照做出来才能说明模型正确。

关于活细胞检测，有一点经验很简单，但很有用，就是不要用PBS来当缓冲液，PBS成分太少，细胞很容易挂，我们用含糖的KRP，有人也用HANKS,这些都对细胞更好有些，就这些了，供参考。

作者: chuntian1983 时间: 2012-2-12 13:28

请问一下，我看到有说DCFH-DA需要用无酚红的培养基稀释，也有说用无血清的培养基，我的培养基是含酚红的，不知道行不行啊？有木有人知道啊？

作者: jiao19941025 时间: 2021-3-30 00:51

请问大家DCFH都是用什么稀释到10uM的呀？

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