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标题: [求助]兴奋性氨基酸对神经细胞的损伤 [打印本页]

作者: lagua123 时间: 2012-2-12 14:10 标题: [求助]兴奋性氨基酸对神经细胞的损伤

请教两个很莱的问题，困惑ing
1 不明白为什么在有的模型中，加兴奋性氨基酸的同时加了甘氨酸，甘氨酸一定要加么？他的作用是什么？
2 用NMDA和谷氨酸制造损伤模型有什么不同？

作者: HP007 时间: 2012-2-12 14:11 标题: 回复 #1 lagua123 的帖子

1。兴奋性氨基酸在和其受体结合时需要甘氨酸的参与，NMDA受体有甘氨酸的结合位点。NMDA受体－通道必须同时结合2个谷氨酸分子和2个甘氨酸分子才能开放。所以甘氨酸是激活NMDA受体的辅助激动剂（co-agonist）。

2。兴奋性氨基酸的受体分为NMDA受体和非NMDA受体，非NMDA受体又分成AMPA和KA受体。NMDA只能激活NMDA受体（特异性激动剂），而谷氨酸则除了NMDA受体外还可以激活非NMDA受体（非特异性激动剂）。

作者: tangxin_80 时间: 2012-2-12 14:11

我的课题与Glu兴奋毒性有关，看了一些有关资料，斗胆妄言几句请高手批评指正。

1、严格的讲，兴奋性谷氨酸受体分为：离子型谷氨酸受体（iGluR)、代谢型谷氨酸受体(mGluR)，后者按其药理学和电生理学特性的不同又分为NMDA受体、AMPA受体、KA受体三种亚型。

必须明白一个问题，NMDA、AMPA、KA等都是体内不存在的化学物质，只是因为它们是某一类受体的强激动剂，故冠以他们的名字。在体内起作用只有谷氨酸。

2、NMDA受体是离子型谷氨酸受体的一种，为配体门控性离子通道（代谢性谷氨酸受体为G蛋白偶联受体），不仅对Na+、K+通透，对Ca2+离子有更高的通透性。这也是它介导兴奋毒性作用的原因。

3、NMDA受体存在有至少5个不同的内源性配基结合位点，影响离子通道的开放，包括两个不同的激动剂（Glu和Gly）结合位点，一个促进受体激活的多胺调制位点和Mg2+、Zn2+识别位点。

4、与其它离子型谷氨酸受体相比，NMDA受体具有三个显著的特点：1）除谷氨酸外，需甘氨酸或D-丝氨酸作为协同激活剂；2）Mg2+对NMDA受体有电压依赖性阻断作用；3）对Ca2+有较高的通透性。

5、NMDA受体是由NR1、NR2和/或NR3组成异源四聚体。主亚基NR1含有Gly结合位点，调节亚基NR2包含Glu结合位点。

6、NR1与NR2之间仅有15%的同源性，但是两种亚基有相同的空间结构。其氨基端位于胞外，羧极端位于胞内，具有三次完整跨膜（M1、M3和M4）及一个面向胞浆的膜内反折环（M2），在M3、M4之间还有一个大的胞外环（M3-M4 loop）。

7、通常，NMDA受体又被分成四个功能结构域：氨基末端结构域（amino-terminal domain，NTD）、配体结合结构域（S1 S2）、离子孔道区和羧基末端结构域（carboxy-terminal domain，CTD）。
１）氨基末端（NTD）
NTD包含约400个氨基酸残基，与亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸结合蛋白（leucine/isoleucine/valine-binding protein, LIVBP）同源。该区可余多种内源物质结合，调节通道的活性。
2）配体结合区（S1 S2区）
配体结合区由S1、S2两部分组成，与赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸结合蛋白（lysine/arginine/ornithine-binding protein, LAOBP）有同源性。S1位于NTD之后，第一跨膜区（M1）之前，S2位于M3-M4 环的羧基端。在空间结构上，配体结合区形成两个相对独立的球形结构域（lobe1和lobe2）组成双叶结构。Lobe1由S1的大部分构成，lobe2包括S2的全部和S1的羧基端，二者之间便是配体Glu或Gly的结合间隙，也是NMDA受体竞争性拮抗剂的作用位点。
3）离子孔道区
M2反折环是组成NMDA受体离子通道的重要部分，与保守序列P-loop同源。M2的顶端N/Q/R位点构成通道狭窄部，决定了通道的电导和选择性，但其中的具体机制还不清楚，可能域改为点氨基酸侧链长度和所带电荷有关。NMDA受体的N/Q/R位点是天冬酰胺（N）。另外，M1和M2也参与了离子通道的构建，并能把配体结合区的信息传递到通道区，从而将配体与受体的结合同通道的开放藕联起来。
4）羧基末端（CTD）
羧基末端是NMDA受体与胞浆蛋白相互作用和磷酸化调节重要功能区域。NR1和 NR2的羧基末端分别由100和 630多个氨基酸残基组成。相比之下，NR2的羧基末端要长的多，具有更多的磷酸化位点。

8、目前认为，NMDA受体介导的兴奋毒作用包括：由Na、Cl和水分子内流引起的早期神经元肿胀、溶解；由Ca内流触发的迟发性神经元坏死。相比之下，后者的作用机制复杂，临床意义更重要。
NMDA受体过度激活引起的细胞内Ca超载是迟发型神经元死亡的始动因素。Ca超载可激活iNOS、PKC、PLC、钙蛋白酶等多种效应酶；损伤线粒体，诱导氧化应激；启动细胞凋亡。

以上是有关NMDA受体的一些皮毛知识，各位见笑。

作者: lagua123 时间: 2012-2-12 14:12

QUOTE:

原帖由 tangxin_80 于 2012-2-12 14:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的课题与Glu兴奋毒性有关，看了一些有关资料，斗胆妄言几句请高手批评指正。

1、严格的讲，兴奋性谷氨酸受体分为：离子型谷氨酸受体（iGluR)、代谢型谷氨酸受体(mGluR)，后者按其药理学和电生理学特性的不同又分为NMDA受体、A ...

讲得很好很全面。
我的算科普读物，
你的是科学研究！

作者: lagua123 时间: 2012-2-12 14:12

谢谢，你的回帖让我受益非浅啊。再请问谷氨酸配成溶液后分解么？当天使用的时候，细胞损伤的特别明显，而过了两天，想重复一下实验结果，结果却天壤之别，配置的时间越久，损伤的程度越差，不明白ing?因为尽量避免PH造成的伤害，所以谷氨酸的PH我调到了7 左右。这对它回有影响么？

作者: tangxin_80 时间: 2012-2-12 14:12

老实说我现在还在养神经元，关于谷氨酸的配制问题我也不太清楚，不过我可以帮助您问问别人。

另外请教一下，您神经元培养的问题如何解决的，您用培养第几天的的神经元做实验？
您培养的神经元纯度能达到多少？

作者: lagua123 时间: 2012-2-12 14:13 标题: 回复 #6 tangxin_80 的帖子

呵呵，我的进度没有那么快，原代神经元的培养还是有问题的，我现在用的是细胞株，想先做一下预实验，如果原代培养的问题解决了，那么进行模型实验可能要快一些吧。至于神经元的培养，我完全按照hzl的流程作了，虽然细胞存活有改善，但低密度种植仍不能存活，我想，还是需要寻找毛病出在那儿。至于采用几天的神经元，应该根据实验的目的来定吧，如果作谷氨酸损伤，是不是要选用12-14天的细胞，这时的细胞谷氨酸受体表达的完善一些。
关于谷氨酸的浓度和配置问题，代烦帮忙问一下吧，在这里我先谢过了。希望以后可以多交流。

作者: sunnyB 时间: 2012-2-12 14:13

谷氨酸用乙醇配制，只要放在-30℃以下，短期内不会太大变化。不放心的话可以一次配制后分装在-70℃保存。最后乙醇的终浓度保证在0.1%内即可

作者: lagua123 时间: 2012-2-12 14:14

谷氨酸在水中或者在PBS中都能溶解，为什么要用乙醇溶解呢？长时间谷氨酸会有什么变化呢？

作者: sunnyB 时间: 2012-2-12 14:14

你用的是谷氨酸盐吧，不是谷氨酸纯品吧。时间长了可能会变构。因为对机体产生作用的是L型，我做过HPLC，时间长了标准液就有双峰了。

作者: lagua123 时间: 2012-2-12 14:15

谢谢。我现在谷氨酸溶解还是有问题，请大家帮忙!我分别用PBS，DMSO和乙醇配置，用PBS配置，并调PH至7.0,虽然谷氨酸溶了,但却没有发现明显的细胞毒性,而它在后两种溶剂中的溶解度也不是很大,要达到0.1%很困难,只能到0.5%,而我除了加谷氨酸外还要加检测药物(也是用DMSO)溶解,这样培养液中的DMSO的终浓度太大,影响实验结果.请大家帮我!非常感谢!

作者: dragonkilly 时间: 2012-2-12 14:15

你好！
前些天我也在为谷氨酸的溶解发愁，经查阅文献终于找到了溶解谷氨酸的方法。
谷氨酸是一种亲水的酸性氨基酸，其等电点为3.08，溶解度为0.86g/100ml,称量0.86g谷氨酸溶解在100ml 双蒸水中，磁力搅拌器搅拌，25度水浴，即可溶解。
但我不知道这样溶解的谷氨酸是否具有明显的细胞毒性。

作者: lagua123 时间: 2012-2-12 14:16

谢谢。按照你的方法我配了谷氨酸溶液，但是没有明显的细胞毒，很困惑。难道是我调PH值出了问题。因为想测谷氨酸对细胞的毒性，所以尽可能排除由于PH的改变对细胞的影响，所以每次都将PH调至中性，然后加到培养液中。不知道园中有没有做过这方面的战友，希望能给我指点迷津，非常感谢！

作者: flower-201 时间: 2012-2-12 14:16

我也是想测药物对Glu对细胞的损伤保护作用，我是把3.8mg的L-Glutamine acid（上海产）直接加入无血清培养液的，然后过滤除菌，终浓度是500微摩/L，但是第一次实验模型组就没有出结果，我还以为是国产Glu的问题呢。今天到这里一看，才知道还有Glu的配制问题呢。楼上的妹妹，你现在有办法了吗？别忘了告诉我一声，谢谢！

你是怎么配的？能告诉我吗？是不是我没有加甘氨酸的原因呢？该加多少甘氨基酸？你测定什么指标来说明？

作者: flower-201 时间: 2012-2-12 14:16

我也想早点知道呢，看有文献说加10微摩/升的甘氨酸，是不是这样啊。

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-2-12 14:17

我也是想测药物对Glu对细胞的损伤保护作用，我是把3.8mg的L-Glutamine acid（上海产）直接加入无血清培养液的，然后过滤除菌，终浓度是500微摩/L，但是第一次实验模型组就没有出结果，我还以为是国产Glu的问题呢。今天到这里一看，才知道还有Glu的配制问题呢。楼上的妹妹，你现在有办法了吗？别忘了告诉我一声，谢谢！

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谢谢，按照你的方法我配了谷氨酸溶液，但是没有明显的细胞毒，很困惑。难道是我调PH值出了问题。因为想测谷氨酸对细胞的毒性，所以尽可能排除由于PH的改变对细胞的影响，所以每次都将PH调至中性，然后加到培养液中。不知道园中有没有做过这方面的战友，希望能给我指点迷津，非常感谢！

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呵呵～～～

你们用的是什么细胞呀，如果是海马神经元，应该效果十分明显（因为海马神经元的GluR表达很高），但是如果是其他细胞，他们没有或较少表达GluR，那么对Glu的敏感性就不是很高！

如果不知道细胞有没有GluR表达，最好的方法就是用细胞免疫化学的方法染色一下。

作者: flower-201 时间: 2012-2-12 14:17

可以确定是有的，因为别人都出文章了。还是上次问的PC12

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-2-12 14:18

可以确定是有的，因为别人都出文章了。还是上次问的PC12

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您的PC12细胞是怎样处理的？？处于什么状态？

如果可能还是应该作一下GluR的免疫细胞化学染色！

作者: lagua123 时间: 2012-2-12 14:18

PC12只表达痕量GluR，用谷氨酸处理是想模拟一种氧化应激损伤。因为谷氨酸和胱氨酸在细胞中有共同的转运体，所以，胞外高浓度的谷氨酸会抑制胱氨酸的摄入，从而使胞内GSH合成受到抑制，影响胞内抗氧化酶的水平，引起细胞损伤。
hwb，如果你选用的也是PC12,加不加甘氨酸应该不是主要问题。我配置谷氨酸溶液就是把谷氨酸溶于PBS中，调PH至中性，然后加到培养基中到所需浓度。但毒性与文献上的差异较大。我现在也在怀疑是不是国产试剂有问题？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-2-12 14:19

GLU是易溶于水的，所以配制的问题应该不是问题，我想没有那么复杂吧。

astra,你加甘氨酸了吗？谷氨酸与受体结合必须有甘氨酸参与才行呀。你也是用的PC12吗？

你用的浓度是多大呢？我还看到有10毫摩尔大的呢，要不咱试试？

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-2-12 14:19

想请教各位做兴奋性氨基酸方面的朋友现在可有什么新的发现。

我看了各位的帖子感觉很有收获，我也即将做这方面的实验。希望能与各位交流交流。

你们说得要同时加甘氨酸，据我看的一些文献都没这方面的叙述。你们实验中是否是如果不加甘氨酸的话，谷氨酸作用的效果就不明显呢？

如果必须同时加甘氨酸，那么能说说如何加法吗（如浓度，加药时间等）？

希望能得到你们的帮助，谢谢

作者: 小糖块 时间: 2012-2-12 14:23

实验室新手，请问兴奋性氨基酸NMDA受体在免疫时用什么抗体啊？？？谢谢！

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