1. 用10ml玻璃离心管收集5 x 107个细胞。
2. PBS洗细胞一次,将细胞在4°C 下,600 g x 5 min 离心一次;
3. 弃上清,细胞沉淀重悬于 1ml冰冷的PBS;
4. 细胞在4°C 下,600 g x 5 min 离心一次;
5. 弃上清,细胞沉淀重悬于1ml 冰冷的RSB缓冲液,冰上孵育10 min;
6. 将细胞重悬液全部转移到合适的已预冷的Dounce匀浆器中,用研杵上下研磨30~50次左右。
注:可在显微镜下检测匀浆的效果。取2~3μl匀浆液滴在载玻片上,显微镜下观察 ,若70~80%的细胞核周围不存在一圈亮环,则说明匀浆效果较好,否则再研磨10次。
7. 立刻加入0.8ml 2.5 X MS缓冲液至终浓度为1XMS,用封口膜封住匀浆器顶端,混匀;
8. 将匀浆液转移到1.5ml离心管中,4°C ,1000 g x10 min 离心一次;
9. 将上清液转移到另一干净的1.5ml离心管中,4°C ,17,000 g x20 min 离心一次;
10. 收集上清液(即细胞浆部分),将离心后的细胞沉淀重悬于0.1ml MS缓冲液;
11. Bradford法测定蛋白浓度。
12. Western Bltoing.
谢谢帮助。作者: 2541 时间: 2012-2-13 10:51