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标题: [讨论帖]细胞活性测定方法专题讨论 [打印本页]
作者: 蒲公英    时间: 2012-2-13 13:20     标题: [讨论帖]细胞活性测定方法专题讨论

细胞活性测定方法专题讨论




我们在实验过程中很多时候都要用到细胞活性测定技术，现在常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。对于CCK-8，本版前阶段曾开展过免费试用活动，相信很多战友已使用过此种方法。

现在本版开展细胞活性测定方法专题讨论活动，请您以自己实验过程中的亲身经历对目前使用的细胞活性测定方法做一客观评价，可以介绍自己对各种细胞活性测定方法的理解，每种方法的优缺点，自己实验过程中的小技巧，实验中的经验教训，您所知的其它细胞活性测定方法等等，另外，鼓励对论坛中已有相关讨论整理总结，每个总结需要有个相对独立的主题。有可能的情况下，有理有据地加上一些自己的评价。
作者: xueyouzhang    时间: 2012-2-13 13:21


用流式细胞仪测定细胞活性的方法
细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等

核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。而
PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。

代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。

正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。

用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。 缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高，而且没有流式细胞仪的地方没法采用这种方法。
作者: caihong    时间: 2012-2-13 13:21

我最常用的就是台酚蓝法，就台酚蓝进行染色，死细胞着色，活细胞不着色，在显微镜下观察，数200个细胞。看其中染色的和不染色的，就可以求出细胞活性了。
作者: 伊莎贝拉    时间: 2012-2-13 13:22

前几天刚做了MTT，可能是新手的原因，经验不足，做的不是很好，很苦恼，准备再做几次。下面就我实验当中遇到的一些问题给大家交流一下：我感觉MTT法受外界因素干绕挺大，我用的模型中有亚铁离子，药物是中药，两者都有颜色，而且还很重，单纯这两者没有细胞时 OD值就有很大的变化，所以我认为我的实验失败的原因与此有关（尽管试验当中要清洗）。试验当中还遇到一些其它的问题，我还没有找到原因，暂不叙述。我是刚刚做实验的新手，很多东西不懂，上面的观点也不知道对不对，但MTT法较简便宜行是很正确的，适合大众使用。就说这些吧，欢迎批评指正！
作者: mamamiya    时间: 2012-2-13 13:22

MTT法显色的条件是很重要的,这一点容易被我们所忽视,我总结了一下MTT显色反应的一些合适条件, 与大家一览.
1 　pH 值对MTT 实验结果的影响:MTT 实验体系的pH 值是影响实验结果的另一重要因素。在偏碱性的环境中本底偏高,稳定性较差。随放置时间延长而升高;偏酸性试液 的实验结果比较稳定。
2 　酚红和血清对MTT 实验方法的影响:酚红是一种pH 中性指示剂,血清是细胞生长必需的营养成份,两者都是细胞培养液的基本成份。酚红在pH7.0
以上试液中呈紫红色,在570 nm 有较大光吸收值。血清蛋白在有机溶剂中容易变性形成絮状沉淀,影响透光度。
3 　异丙醇等用作Formazan 溶剂,无须酸化也能消除酚红的影响: 为了消除酚红对MTT 实验结果的影响,Mosmann (1983) 提出用酸化异丙醇作Formazan 溶
剂,酸化异丙醇可将酚红显示的紫红色转变为无色。Francois (1986) 认为酸化异丙醇溶解Formazan 改变了原光谱特性,降低灵敏度,提出改用无酚红的培养基。未经酸化的异丙醇在一定条件下也可以消除酚红的影响。异丙醇等有机溶剂本身为弱酸性 ,能够中和中性和弱碱性试剂,如RPMI21640 (pH7. 3) 。当异丙醇与RPMI - 1640 的溶量比达到1∶1 以上时即可将酚红的紫红色转变成无色。
4 　细胞代谢酶存在部位对MTT 实验结果的影响:细胞线粒体产生的琥珀酸脱氢酶是细胞生长代谢产物,这种酶裂解MTT形成Formazan 是MTT实验方法的理论基础。琥珀酸脱氢酶的产生和分布规律与MTT检验方法的灵敏度和稳定性有很大关系
5 　MTT使用浓度选择:在不饱和状态下,或是细胞密度一定,MTT 不饱和;或是MTT一定,细胞密度不饱和,Formazan 的生成量分别与MTT浓度和细胞分泌的酶活性量呈线性关系。达到饱和状态以后,两者为非线性关系。为了提高MTT 实验方法的灵敏度,在细胞密度一定的条件下,应该使用MTT饱和浓度。MTT的饱和浓度与细胞种类、细胞活力状态有关因此MTT 最佳使用浓度要视情况而定。
6 　MTT的酶裂解反应时间选择:MTT 在细胞培养体系中被细胞内线粒体产生的琥珀酸脱氢酶裂解生成Formazan ,完成这一反应需要一定时间。MTT 裂解反应2.5h 反应已基本完成,3 h 反应相当完全,通常MTT实验应选择3 小时的反应时间。

附注(对MTT性质做一些补充说明,它的理化性质对其条件影响很大):
　MTT是一种黄色粉状物,溶于水性溶剂,也溶于有机溶剂,但在有机溶剂中的溶解力低于水性溶剂,常温下需要较长时间才能溶解。MTT 水溶液在pH 7.0 以下稳定,3～5周内不变性,在pH7.0 以上溶液中不太稳定 ,在异丙醇溶液中1 周内变色,2～3 周内变成兰紫色。MTT 溶液呈黄色,在410 nm 波长处有最大吸收峰,随波长增大吸收值很快下降,至500 nm处趋于最低值。MTT由酶裂解生成Formazan。Formazan 不溶于水性溶剂,易溶于有机溶剂。乙醇,丙醇,异丙醇,乙二醇甲醚,DMSO 等都是比较好的溶剂,Formazan 的有机溶液呈兰紫色 。细胞
增殖实验通常在聚苯乙烯培养板上进行,四氯化碳、10 %SDS 和二氧六环对培养板有溶蚀性,不宜使用。
DMSO 和SDS 对Formazan 也有较好的溶解性,但凝固点太高,10 ℃以下不能用; 丁醇等长碳链醇溶解Formazan 后与水相不混溶,呈分层液,不适合作Formazan溶剂。
作者: 小鱼鱼    时间: 2012-2-13 13:29

我讲讲我用过的几种方法：
LDH释放法
酸脱氢酶（LDH）在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤%。本法操作简便快捷，自然释放率低，可用于CTL及NK细胞活性测定及药物、化学物质或放射引起的细胞毒性，现已有LDH法测定CTL活性试剂盒（promega）。应注意较高浓度FCS中所含LDH可能干扰结果。

51铬（Cr）释放法，本法结果准确、重复性好，但也存在以下不足：①使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；②51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；③51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验；④细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。

荧光测定法：
如： alamarBlue一步荧光测定法
alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。具体测定方法是：在靶细胞孔（T）、效应细胞孔（E）和实验孔（T+E）各加alamarBlue,共育6~24h后用板式荧光测定仪测530nm（发射）/590nm（散射）波长荧光强度，将T及E孔荧光均值相加后减去实验孔（T+E）荧光均值，与T孔荧光均值比较即可计算CTL对靶细胞的溶解%。本法与51Cr释放法纺织厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤，适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果。
作者: HP007    时间: 2012-2-13 13:29

我说说自己在用MTT法中的一些体会：
1、细胞数要尽可能的多，在细胞数足够多的情况下，可以避免一些上述园友提及的一些误差。
2、要有足够多的复孔，我一般每个剂量设8个复孔。我做了100多块板子后发现只要有足够的细胞数和复孔数，MTT法的重复性还是可以的。前几天测了几种物质对细胞活性的影响，基本上和我在2年前测得结果一致。
总之，我觉得统计学中关于试验设计中要有足够的样本数很重要，大样本数可以极大降低实验中的误差，增强实验结果的可靠性和重复性。
以上是我个人的实验体会，不对之处请大家批评指正。
作者: duoduo    时间: 2012-2-13 13:30

MTT的原理、步骤、技巧大家或许都已掌握。
MTT在国外的许多药物研发机构中，仍被用于大量药物的粗筛。
因为MTT法有许多优点：简便、快速、重复性好、价格低、所需细胞少、无放射性等等。在国内更是被大量应用于抗肿瘤药物的筛选，放疗、化疗敏感性的考察等方面，MTT的确是一种不错的实验方法。
我想说的是：但是如果想提高文章的档次，如果想投sci，还是建议大家不怕多花钱，采用灵敏的实验方法BrdU。
作者: 3648755    时间: 2012-2-13 13:30

我们课体组是在2004年使用的CCK-8试剂盒，检测原代分离的小鼠T淋巴细胞增殖。之前也使用过[3H]-TdR和MTT法，但由于原代T细胞的特点：1.细胞为悬浮;2.细胞体积小;3.原代细胞存活和增殖较细胞系困难。并且实验中涉及功能阻断，所以我用MTT的精确性不够高，多次用[3H]-TdR考虑到安全性不够好。就改用了CCK-8检测增殖。

我使用96孔细胞培养板，每孔4×105 个T细胞，PHA或ConA加入活化细胞后检测，每孔20μl，注意不要产生气泡，防止影响读板，因为这些小泡即使用针尖也无法消除。放回培养箱，4 h后取出，酶标仪550nm读板，虽然要求的是450nm，但我室没有安装这一波长的滤光片，所以就用了550nm，从结果上看趋势还是很好的。
保存：由于买的量大，所以为维持产品稳定性，先将不用的都保存在－20℃，并且使用过程中尽量避光，用完立即放回4℃。

另外，在培养贴壁细胞（如星形胶质细胞）的过程中，加CCK-8之前可先用水平式离心机去除培养基，加入含10％CCK-8的培养基,培养30 min后检测。这种方法在没有多道移液器，可能导致加入的CCK-8量不同的情况下可供使用。在加入CCK-8后不同时间检测，数值会有所升高，但总的趋势不会变。另外，要像做ELISA一样，在培养板上设立各种严格的对照组，每组3孔，以便去除本底，做出准确的变化曲线。
但所有细胞的活力要求必须要好，否则不增殖，测不出太大的变化。
作者: 969    时间: 2012-2-13 13:31


我做过的MTT 实验过程中，实验结果的稳定性及重复性较好，我主要是观察药物对肿瘤细胞的抑制作用，我做之前曾看了不少关于MTT的文章，有些文章就指出， 做MTT之前，要首先就你所要做的细胞，不加药的情况下，测定细胞作用的时间以及不同细胞数情况下，检测出其OD值，使你的OD值在0.75－－1.25之间，也就是找出最优的时间点和细胞数。同样在实验过程中还要注意MTT避光，避免污染，培养基污染，以及细胞数过高过低现象及复孔（我实验过程中每浓度设置了10复孔），好多的细节需要注意，尽管是一个不太杂的实验。
作者: BUK    时间: 2012-2-13 13:31


1、感觉MTT方法所得出的结果重复性不太好，虽然多次试验的总体趋势是一致的，但每次得出的IC50值相差挺大，结果标准差也相差很大。
2、改用CCK-8，感觉操作步骤简单，这样就减少了操作产生误差的机会。结果也稳定了许多。
3、我个在使用CCK-8中得出的很重要的经验是：如果待测培养系统（如药物）本身是有色的，特别是黄色，那么一定要注意设好对照。因为CCK-8生成的产物也是黄色的，这样会干扰实验结果。设立对照方法如下：
细胞对照孔：细胞+培养液
药物对照孔：药物+培养液 各浓度组药物都要分别设立
培养液对照孔：用于整块培养板调零
4、如果想发SCI的文章，还是选用国际上承认的方法，现在好像MTT发SCI有点悬。
以上是我的一家之言。
作者: kulee    时间: 2012-2-13 13:32

大家有没有听说过Giemsa染色比色法？好像也可以的，不过文献不多，不知如何究竟，呵呵
作者: 中国特色    时间: 2012-2-13 13:32


说句实在话，我做MTT 做了很多，只要你每次的条件摸的差不多，MTT 的准确率还是可以的，虽然每次测得同一个孔的值，都不一样，但是IC50值，差别不大的，，，。我的经验就是要把，孔的倍数拉开，这样就容易形成剃度，IC50值就比较稳定了，，。之后在在大致的范围内，缩小倍数 ，多次测，可以得到一个可靠的IC50值
作者: eric930    时间: 2012-2-13 13:32

低浓度台盼兰是一种细胞内弱氧化剂，能通过细胞核膜进入细胞核内，使无还原能力的有核死细胞被染成兰色，而无核细胞核有核活细胞则不变色。所以我们的实验室采用的是台盼兰染色。
作者: 笑弯了腰    时间: 2012-2-13 13:33


我用CCK-8检测原代大鼠肝脏细胞.
实验方法：
1.分离原代大鼠肝脏细胞，以3×105/ml浓度将细胞铺于96孔细胞培养板中，贴壁培养。
2.贴壁培养4小时后，加入待测药物，作用相应时间。
3.每孔加入10ul CCK-8溶液，放入细胞培养箱中继续培养3－4小时，450nm读取吸光值。

注意事项：
由于是贴壁培养的细胞，在读吸光值时细胞培养板底部附着的细胞可能会对数值有一定的影响，因此建议在加入CCK-8 3－4小时后，将上清液重新吸取到另一干净的酶标板中进行读值，保证检测的准确性。
要防止反复使用同一瓶试剂后可能造成的试剂污染。

该试剂盒灵敏度较高，在细胞数较少的情况下也能区别出不同浓度药物作用后的细胞活性差别，比传统的MTT法要灵敏许多，同时，其操作比较简单，节省实验操作时间。
作者: owanaka    时间: 2012-2-13 13:33

怎么大家都好象不用SRB方法测定细胞毒活性呢。SRB，也叫磺基罗丹明B，是在酸性条件下可特异性地与细胞内蛋白结合的染料，SRB染色后不象MTT那样很容易变色，染色后干燥的板子可以放置较长时间，而后再用Tris碱液溶解SRB，比色测定，对结果没有影响。所以，不同时间测试的板子可以同一时间测定，即使溶解后，较长时间测定也没有明显影响。
测定方法：
细胞加药培养48小时后，取出培养板，于每孔加入50ul预冷的50%三氯醋酸，静置5分钟后移入4℃冰箱中静置1小时，取出用去离子水洗5遍，空气中干燥，待完全干燥后每孔加入1%的乙酸配制的0.4%的SRB 100ul，染色20分钟后倒掉染液，用1%乙酸洗5次，去除未结合的染料。空气中干燥后用pH 10.5的10mmol/L的非缓冲Tris碱液150ul溶解，在平板振荡器上振荡5分钟，在BioRad酶标仪上测定各孔在490nm的光吸收。本底对照板的细胞同样处理测定OD490。
有关专家透露，新的抗肿瘤药指导原则中将选用此方法作为细胞毒活性测定的最佳方法。
有关文献可于CNKI上搜索得到。
作者: am10    时间: 2012-2-13 13:34

看到好多站友用MTT，本人没做过，但看师姐和同学做经常出现一个问题--
可能是细胞长得很好，吸光值经常就超过1.0，因为用的是多孔板，无法进行稀释等操作。这样的数值一般是不能用的，请问各位站友有没遇到这种情况，如何解决？（改用无血清培养基后，数值虽有降低，但仍有不少数据超出1.0）
作者: yapuyapu    时间: 2012-2-13 13:34

看到好多站友用MTT，本人没做过，但看师姐和同学做经常出现一个问题--
可能是细胞长得很好，吸光值经常就超过1.0，因为用的是多孔板，无法进行稀释等操作。这样的数值一般是不能用的，请问各位站友有没遇到这种情况，如何解决？（改用无血清培养基后，数值虽有降低，但仍有不少数据超出1.0）

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我认为可以缩短孵育时间，必竟MTT反应是一个酶反应，在一定的时间内，反应产物产生的量与酶活性和底物的量呈线性关系，而这个时间越短越好。我们的实验表明，反应1小时，MTT也能充分反映出细胞量的多少。另外在1.0以上MTT本身的颜色测定结果也是在线性范围之内的，但不知道细胞产生MTT是否在线性范围之内，我还没有研究。
作者: 101010    时间: 2012-2-13 13:35


最近做过些细胞活性的测定，用过MTT，也用过CCK-8，有些心得，也有疑问。先说说心得吧：
MTT：步骤有点烦琐，中间有吸液的步骤会造成不可避免发误差，特别是加DMOS前的一步，会吸走不少的结晶，后来改进了方法，用2%SDS-HCL溶结晶，不需要去培养基，但是必须37度过夜，耗时比较长。另外MTT反应，这一步，至少需要3小时，如果要做某个药物的急性作用，用这个方法就不太好了。
CCK-8：是MTT的改进，步骤简单，中间不需要吸出孔内的培养基，这样就减小了误差，另外CCK-8反应时间也短，最短1个小时就够了，特别适合做急性作用。缺点是，有点贵。

我的疑问是：
1.不管是MTT还是CCK-8，原理基本是一样的，都是发生反应生成有色物，只不过一个是难溶于水的晶体，一个是直接溶于水的。我的问题是，如果做急性作用，是不是可以再缩短反应时间（当然OD值不能太小）？比如，缩短至半小时？另外，最后所测得OD值应该是MTT或CCK-8反应时间内细胞活性的综合反映吧？
2.平行孔的OD值，最科学的分析方法是怎样的？ 有的人把平行孔相差很大的值去掉，只保留比较接近的值，理由是：相差很大的值，很可能是操作带来的较大的误差，不可信。我个人觉得，这样做不科学，但是也找不到很好的解决办法。还希望各位给点意见。多谢！
作者: toy    时间: 2012-2-13 13:35

看前面的前辈已经总结了好多，我也来说一点自己的体会吧！我做得不多，MTT的结果并不很满意，大家见笑了！
首先感觉MTT最好现用现配，使用时避光，虽然有资料说可以长期4度存放，但觉得时间久了还是很容易出问题！另外就是最后一次加药或换液要用无血清的培养基，我的经验就是血清对结果的干扰还是很大的！
还有就是做实验的复孔要尽可能的多！我的每次都要做几十个复孔才能保证实验结果！
总之自我感觉这个实验方法虽然很简单，但要出好的结果还是蛮难的！对照组一定要设置全！这个才能出了好点的结果！
作者: newway    时间: 2012-2-13 13:36

做过alamar blue ，MTT，台盼蓝，感觉上，台盼蓝可以分辨出死细胞，但是计数不如其他两种精确；MTT反应产物停留在细胞内，必须破坏细胞膜才能检测，可以用DMSO＋SDS＋HCL或醋酸 配置破膜溶液，效果一直很好，但是由于细胞死亡，无法进行后续检测，最多只能同时测培养基里面的物质如ALP等，所以要求很多样品数才能做完其他检测方法，还有一点就是，MTT的反应产物总是同时存在于细胞内和培养基中，这对实验结果有一定影响，造成MTT的可重复性不佳。alamar blue，则对样品数要求相对少，因为alamar blue 的产物resorufin是可溶的，可以检测培养基里面的resorufin而不必破坏细胞，但是由于resorufin是偏红色的，所以只能用无酚红培养基，对培养的时间要求也相对MTT来说要苛刻，还有一点就是alamar blue的花费也较高。
以上是个人经验，大家参考
作者: baidukk    时间: 2012-2-13 13:36


我以前用MTT，结果重现性差，还不如用细胞计数来的准。用过CCK－8后好多了，方法简单，只要加一次试剂就行了，而且重现性也好，不过细胞不能太密，否则会颜色太深而超过线性范围。
作者: 04906    时间: 2012-2-13 13:37

我以前曾参与研究开发一种天然来源的免疫抑制剂。该物质被证明主要是由多肽类物质组成。我们以3H-TdR参入法测定免疫抑制剂对PHA诱导的人外周血淋巴细胞（PBL）转化的影响，组分活性以对PHA诱导的人PBL转化的抑制率表示。

具体步骤是：

将待测样品用RPMI-1640培养液稀释成一定浓度。以无菌手续采集3人份静脉血，每1ml加10u的肝素钠抗凝。取24孔培养板，向每孔内加人外周血0.1ml，对于每个人的血样做3个重复孔。向每孔内加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液1ml、PHA应用液0.1ml。试验孔加样品液0.1ml，对照孔加RPMI-1640培养液0.1ml，加盖后在CO2培养箱中于5% CO2、37C条件下培养48h，加入浓度为3.7×105Bq/ml (10uCi/ml)的3H-TdR 0.1ml，混匀后继续培养24h，用49#玻璃纤维膜收集淋巴细胞，用液体闪烁计数器计数每分钟的闪烁次数（cpm）。将每个人3个重复试验孔cpm的平均值作为试验样品作用于该人血样后的cpm值，按下式分别计算样品对PHA诱导的每个人PBL转化的抑制率：
抑制率（%）=（1－实验组cpm/对照组cpm）×100%
以3个人血样抑制率的平均值作为样品的活性。

该试验重现性很好，结果也较为可靠。
但是个人感受是“都快怕了”做这个试验了。
首先是放射性，莫名。
然后是细胞试验本身（细胞是人源原代，本人当然首当其冲是第一个志愿者，呵呵；原代培养本身也有点），当然，这与该测定细胞活力方法本身无关。
其次是时间较长。
还有在自己单位不能独立完成，需要很多特殊设备。
作者: 黄花菜    时间: 2012-2-13 13:37

对细胞增殖实验来说，MTT、CCK-8和3H-TdR 我都做过。感觉是前者便宜、步骤烦琐、对实验技能要求大，否则误差较大、敏感度在三者中最低。CCK-8稍贵一点、步骤简单、稳定性不错、敏感度介于两者之间。3H-TdR 敏感性最好、但步骤较多、需要特殊设备，最大的问题是有放射线。 所以综合评价，我们觉得CCK-8简单、稳定、敏感性好、安全、价钱还能接受，所以现在细胞增殖实验主要用CCK-8来做，敏感性要求特别高的就用3H-TdR （没有小孩的、女性的一般还是避免用3H-TdR ），而MTT主要用来做学生实验。

希望对大家有用！
作者: cj_mondy    时间: 2012-2-13 13:38

问个问题

做CCK-8的时候，

要先把原来的培养基去掉，

再加CCK-8吗？
作者: guagua    时间: 2012-2-13 13:38

不需要的。可以直接加入cck-8 1-4个小时左右，可以检测
作者: toy    时间: 2012-2-13 13:39

问个问题

做CCK-8的时候，

要先把原来的培养基去掉，

再加CCK-8吗？

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一般不需要！如果你要求高，可以去掉培养基后，用PBS稀释CCK-8后，每孔100ul加进去，培养30分钟后上机检测。
作者: langlang    时间: 2012-2-13 13:39

我的实验用过台盼蓝染色、MTT、CCK-8．我分离的是病人的淋巴细胞，经不同浓度的药物处理后，检测细胞增殖变化，台盼兰染色可以发现药物抑制细胞增殖是因为药物作用还是浓度大引起的毒性反应．可以发现较大的浓度药物经台盼兰染色后活细胞比例低．大部分文献对淋巴细胞增殖测定方法，用的是3H-TdR．我们实验室的这种仪器坏了，我查阅做淋巴细胞也有人用过ＭＴＴ法，所以一开始我用ＭＴＴ算是一个预实验，测定细胞增殖能力如下：培养的淋巴细胞浓度为1×106/ml、200μl/孔加入平底96孔板，设三个复孔，再加浓度为5mg/ml的MTT，25μl/孔， ％CO2下孵育4小时；1500r/min离心后轻轻吸出150μl/孔上清，再加入150μl/孔的二甲基亚砜，静置10分钟后在酶联检测仪上（570nm）测定吸光度（A，曾称光密度OD）；用每组三个复孔A值的平均值来比较，A值高，则增殖快。但是结果不理想，可能淋巴细胞为悬浮生长，ＭＴＴ中间环节多，容易吸出细胞，结果不稳定．后来看过ＣＣＫ－８的资料，就试着用用，跟ＭＴＴ相比，步骤简单，省时省力，缺点当然是比ＭＴＴ贵多了．每次的结果稍有不同，统计学还是有意义的，主要经验体会是：细胞量要够大．至少每孔保证１０５的量，其次要充分混匀，最好在摇床上摇荡几分钟．孵育时间要摸索，淋巴细胞在４８小时的结果最好．
作者: yueban-1147    时间: 2012-2-13 13:40

看了 前面的帖子，我觉得很多人都在谈增殖的检测，将增殖和活性的检测混淆了。其实MTT是活性的检测，我前些天做了MTT，虽然结果还好，但每次之间的波动还是比较大，因此希望用更精确的流式检测来证实。但是很少人提起PI染色进行流式检测还检测细胞活性，希望有这方法经验的能够提供详细的步骤，和所需物品及PI配置方法。
作者: idea2011    时间: 2012-2-13 13:40

XTT法
XTT{2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulphenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide}是MTT的一种衍生物,可被活细胞线粒体的脱氢酶还原产生水溶非细胞毒性的Formazan产物而显色,显色程度与活细胞数成正相关.主要有点是反应产物为水溶性,对贴壁和悬浮生长的细胞均适用,检测时间缩短和处理步骤减少,但本底较高,重复性受pH的影响,其它与MTT法相同
此外还有MTS法
MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,inner salt]为新一代四氮唑蓝盐化合物,其被还原形成的Formazan产物水溶性和稳定性更高,显色更快

参考<抗肿瘤药物研究与开发> 甄永苏 主编
作者: ffooll    时间: 2012-2-13 13:41


其实直接计数法也是一种非常好的方法，至少比MTT来得准确。
首先在10cm的Dish中接种1000-10000个细胞，然后培养1周至2周，消化后，进行计数。此法简单易操作，也非常公认，主要是依靠时间来放大不同处理组的差异，原理与clone formation assay 差不多。
此外，BrdU掺入法也是不错的检测细胞增殖的好方法，原理3H放射性同位素掺入法一样，但可以不接触同位素，用荧光显微镜或FACS即可检测。
作者: jujuba    时间: 2012-2-13 13:41

加入CCK-8，再培养数小时后，还要终止 显色反应 吗？

有的方法是放到4度冰箱终止，有的是加SDS终止，哪种好 ？

还有为什么要终止，不终止直接测结果不行吗？
作者: idea2011    时间: 2012-2-13 13:41


台盼兰染色的方法很简单，首先配置台盼兰染液，通常用的浓度是0.4％的，可以先用双蒸水配成4％的，然后用的时候用PBS稀释成0.4％。细胞培养到一定时间，按照一比一的比例加入台盼兰染液，我做悬浮细胞通常是100ul含细胞培养液，加100ul台盼兰，也可以吸10ul细胞液加10ul台盼兰，但要注意，吸细胞的时候一定要混匀，如果只吸上面的就会导致细胞过少。通常染色2分钟，到血细胞计数板上计数即可，看染色和没有染色的。
个人觉得，台盼兰染色法是一个很不准确的实验，像我做的药对细胞有杀伤作用，但是细胞数量少了，却很少看到有被染色的细胞。另外，显微镜下是否被染色也是不太容易看出来的，有的细胞看上去是染成蓝色的了，但是调一下焦距又变成亮亮的和正常细胞一个样子了。还希望有经验的XDJM指点一下。我还曾经遇到，台盼兰染液是澄清的，计数板是干净的，但是染色后的细胞液滴到计数板，镜下看却又很多蓝色碎片一样，视野十分浑浊，不知是什么原因，而且实验组和对照组这种浑浊并没有很大区别，不知道是怎么回事，请指点一二，谢谢!
作者: 33号    时间: 2012-2-13 13:42

加入CCK-8，再培养数小时后，还要终止 显色反应 吗？

有的方法是放到4度冰箱终止，有的是加SDS终止，哪种好 ？

还有为什么要终止，不终止直接测结果不行吗？
回答：一，不需要中止反应
二，您提要的“放到4度冰箱终止，有的是加SDS终止“这种是针对，如果有急事要去处理不得不放下手中的实验，而提供的方法，一般没有必要不需要使用，如果要使用不建议使用加SDS终止这种方法！！
作者: misswu61    时间: 2012-2-13 13:42

H3掺入试验、MTT比色法、XTT比色法都属于测定淋巴细胞体外增殖反应的方法吧。我最近也要做关于这方面的实验，就把师兄介绍的测细胞增殖反应时应注意的问题说一下吧：
（1）丝裂原的质量和活性是测定淋巴细胞增殖反应的关键因素。因此在实验前，应确定其最佳刺激量。
（2）检测T细胞增殖反应，丝裂原用PHA或ConA；B细胞增殖反应用LPS或SPA；T、B细胞增殖反应用PWM
（3）增殖反应的细胞应保持高活性，一般应〉=95%。应用单抗分离制备的反应细胞因保存剂（如NaN3）或抗体的直接作用可抑制细胞的增殖。此外，增殖细胞的浓度过高或过低均不利于细胞生长。
（4）细胞培养液应无菌、无支原体污染，特别是小牛血清加热灭活补体，避免LPS或其他能促进细胞增殖物的污染。因此，实验前应选择本底低的小牛血清。用人“AB“型血清或自体血清也应加热灭火补体。
作者: 8princess8    时间: 2012-2-13 13:43

自我感觉比起传统的MTT法，新试剂确实操作简单，灵敏度高。
经过繁琐忙乱的一段时间的试验操作之后,回过头来再看看基础
知识和文献有种豁然开朗的感觉.原来如此.原本如此.
作者: 8princess8    时间: 2012-2-13 13:43


做细胞毒性加药设计和操作一直觉得是个可大可小的问题 ，估计结果重复性差可能有这方面的原因，总结一点自己的惯用手法：
1。首先用培养基将细胞毒性药物(待测药物)5倍 系列稀释,共制备8个浓度.选择浓度时应以最高浓度下多数细胞被杀死,而最低浓度下不会杀死细胞为标准.只要对药物的毒性有所了解,便可采用较小的浓度范围.一般情况下,我每种药物使用三块培养板,这样一次试验中可以有三个平行测定结果.
2.对于贴壁生长的细胞,去除第2-11列个孔中的培养基,这样可以通过将注射器针连在吸引管上来完成.
3.在第2列和第11列共8个孔中,加入200ul新鲜配置的培养基,这些细胞作为对照.
4.在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物.每个药物浓度仅需4个孔,这样A-D 用于一种药物,E-H用于另一种药物.
5.将药物溶液向每组的4个孔中各加入200ul
6.温育
作者: loli    时间: 2012-2-13 13:44


大家用的是哪个公司的CCK-8试剂盒呀
作者: ha111    时间: 2012-2-13 13:44

MTT法测定样品的生物活性, 我也曾经做过不少实验

前期的细胞铺板,样品处理都是很常规的实验室操作.

染色阶段: 我们一般是 将MTT用细胞培养液(1640或DMEM)稀释成5%的溶液, 过滤除菌, 于96孔板中加入10-20ul/孔, 再于孵箱中放置4-6hr.

溶解: 可以使用10%SDS或者DMSO.

10%SDS可以直接加入96孔板50-100ul/孔(依据不同实验来确定),再在孵箱中放置过夜, 并于酶标仪上在一定波长(570nm左右)下读数. 该96孔板在随后的2-3天内的读数不会有太大的变化.

使用DMSO时, 一般需要将96孔板中的上清夜除去, 然后加入100-200ul/孔的DMSO. 静置20-30mins, 于酶标仪上在一定波长(570nm左右)下读数.
DMSO的优点是: 仅仅需要30分钟就可以读取数据, 实验时间大大缩短.
DMSO的缺点是: 加入DMSO时,先要除去96孔板内的上清夜, 可能会造成细胞的损失,给实验 结果带来不必要的误差.

以上是本人的愚见.
作者: 131415    时间: 2012-2-13 13:45


为什么没有人提到酸性磷酸酶（Acid phosphotase assay）法呢？
我们和旁边的实验室一直在用，干净又方便。
原理是这样的：
将一种底物（硝基苯磷酸盐）与细胞一起孵育（就是加到96孔板的孔里），细胞溶酶体里面的酸性磷酸酶将底物水解生成另外一种可以显色的物质，用酶标仪在405nm处测量就可以。显色程度反映了细胞里酸性磷酸酶的活性，进而反映了细胞的活力。
这个方法大约十年前外国人发现的，同H3掺入以及MTT也作了比较，提示完全可以代替。而且非常干净。而且很便宜，只需要买底物就可以（5g大约400元 Fluka）。
原始文献下一次附给大家。
作者: vera+    时间: 2012-2-13 13:45

我没有用过MTT法，使用的是WST－1法。理论上，WST－1法显色原理与MTT法相似，但是WST－1是水溶性的，MTT是脂溶性的，因此WST－1法比MTT法处理过程要简便，受影响因素少，只需将种好板的细胞的培养基从孔板中弃去，然后加上200微升PBS和20微升WST－1溶液（自己配制的,用PMS和WST－1按一定比例加PBS涡旋混合后，在－4摄氏度保存，避光。），同时加上空白对照。置二氧化碳孵箱中约3小时后，直接在酶标仪下测定OD值，450nm/650（690）nm，然后将值减去空白对照后，对比差值即可。
作者: hold住    时间: 2012-2-13 13:45

大家用的是哪个公司的CCK-8试剂盒呀

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我用的是同仁化学研究所的
作者: dongdongqiang    时间: 2012-2-13 13:46

mtt法以上说得已经很多了，但是细胞密度是在10的4次方是最合适的，当然这只是量的检测，最近我做的是用细胞活力测定仪来测可以得到绝对值，可以同时打出100张图片，死细胞和活细胞可以看见，我觉得很好，在还有用激光共聚焦测，比较准确，但花费很贵，要求较高，它比mtt及台盼兰好的多，台盼兰可以杀死部分活细胞而影响结果，我下次将要用激光共聚焦测，但分析软件比较贵。
作者: 8964357    时间: 2012-2-13 13:46


近期我做过一些MTT，总的感觉不稳定，同组间OD值相差较大。考虑可能与弃掉培养基再加DMSO这一步有关。我用的贴壁细胞，做药物抑制实验。以前听人讲，贴壁细胞去除培养基直接翻板倒液就行。我在镜下观察发现倒板后会倒掉一些着色细胞。以前在园子里有人提过，MTT也可抑制细胞活性，使其贴壁不牢。后来我采用96孔板离心后直接倒掉培养基或小心吸弃培养基，实验结果较前理想些。
今看过楼上多位老师提到CCK-8试剂盒，我想试试。谁能否提供操作步骤、哪家试剂公司的好些，价格多少？多谢了！
作者: ladyhuahua    时间: 2012-2-13 13:47


MTT法作了很多细胞，感觉对于贴壁细胞效果好，对于悬浮细胞，因要吸弃培养液，很容易造成formazan流失，因而导致实验结果偏差。SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在490nm~520nm波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于MTT法。除此之外SRB法还有以下优点：　(1)操作时间短，细胞固定和染色仅需90分钟左右，而MTT加样后还需培养4小时。(2)没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过2％[8]。（3）可以测定悬浮细胞，采用16% 的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之MTT法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。因此选用SRB法对于测定不易贴壁的PC12细胞存活率，结果更灵敏准确，重复性更好。
建议大家可以试一下SRB法，SRB价格也便宜。
作者: dragonkilly    时间: 2012-2-13 13:48

我最近也在做MTT，确实很不稳定，组间差异就很大。前面大家已经说了很多了，我觉得还应注意的是：
1，培养基中酚红、人血清蛋白、免疫球蛋白、小牛血清、胎牛血清或马血清和某些添加剂可使OD值增高，影响结果。因此这类物质在进行MTT时应先洗去。
2，加入DMSO后应及时检测，OD值受作用时间的影响较大，颜色会随时间变深。
3，接种细胞数要合适。在应用一种新细胞株时，首先要知道该细胞株的细胞倍增时间，而在应用非分裂的原代细胞（如神经元或肝细胞培养）时，首先要知道该细胞在培养过程中细胞丢失的数量。根据这些信息选择合适的接种细胞数量。在MTT法进行时，96孔板中每孔的细胞数量宜控制在5*10的2次~5*10的4次范围。
4，每孔内各区的细胞生长不均匀可直接影响实验结果。当加药液或换营养液时，药液或营养液沿孔边缓慢加入，但不能直接加在细胞上。细胞培养的每一步操作时尽量避免产生细胞生长不均匀的各种因素。
呵呵，希望能对大家有帮助！
作者: zhezhe    时间: 2012-2-13 13:48

前面有位前辈提到PI染色检测细胞活性，我也是做细胞培养测药物作用后细胞活性的，前一段时间在网上查到一点PI方面的资料，希望有帮助。
流式细胞仪检测细胞凋亡——Heochst 33342/PI双染色法
来源：生命经纬
基本原理
　　经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。

试剂与仪器
 Heochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保存；
 PI染液 ：用PBS配成5ug/ml浓度，4℃避光保存。
 400目的筛网
 流式细胞仪

实验步骤
1. 悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ，终浓度为1ug/ml； 37℃孵育7—10min。
2. 低温500 ~ 1000r/min离心5min弃去染液。
3. 加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。
4. 400目的筛网过滤1次。
5. 流式细胞仪分析：Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400 ~ 500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。
6. 结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。

注意事项
1. 在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。
2. 用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。
作者: milkdog    时间: 2012-2-13 13:48


我用过MTT、台盼兰拒染法，也试用过CCk。MTT方便快捷，但影响因素较多，用来做筛选还是不错的。台盼兰拒染法，我认为不太客观，最好是双盲。CCk方便、准确，悬浮细胞也可以用，我想除了有点贵没有别的缺点了。还是根据各自的情况选择合适的方法吧。
作者: any333    时间: 2012-2-13 13:49

大家有没有试过ATP检测，实际上ATP的含量也是可以对细胞的活力进行表示的。死亡的细胞是没有ATP的，有损伤，但还没有死亡的细胞其ATP含量是下降的。因此，用ATP是完全可以代表细胞活力的，并且用荧光素酶法检测试验比较稳定，而且可重复性好，比MTT稳定多了，我最近刚刚作了一次。大家可以探讨一下这一方面的体会
作者: any333    时间: 2012-2-13 13:49

ATP含量测定，目前已经被大家接受为一种细胞活力检测指标，国外的相关文献已经有不少，我也是从文献知道的。目前国外已经有几家公司专门卖这中试剂盒了，国内也有，好象是壁云天公司。其原理是荧光素酶与荧光素反应时需要ATP，当用饱和浓度的荧光素酶和荧光素反应是，其发光量于ATP之间是存在定量关系的，具体来讲是它们的LOG值呈线性相关，这样就可以通过荧光值得到ATP　的含量了。一般来讲，样品中的ATP量是不大的，因此一般情况下是不需要荧光素酶的饱和剂量，这样太浪费试剂，但个别情况下ATP含量奇高，就需要这样作了。我做过几次，实验的可重复性明显好于MTT。在作MTT时由于它的变异度较大，不得不加大样本量，但ATP含量测定其稳定性较好，样本量一般不需要很大，我一般每一个分组有四，五个样品足够了。
作者: xingyi08    时间: 2012-2-13 13:49


请教：悬浮细胞怎么做MTT，一定要离心吗？离心的速率是多少？请教孔板怎么离心？新手还是实验准备阶段，望大家不吝赐教！！
作者: langlang    时间: 2012-2-13 13:50

我做MTT 做了很多，现将一些体会与大家讨论：
1.结合本实验条件，摸出最佳培养时间。
2.设置复孔最少3，有梯度最好，这样才科研精神！
3.结果重现性差？主要是因为不一致，体现在1.没有合适的对照或没有对照。2.培养时间、加入mtt时间不一致或mtt作用时间相差太大3.出现紫色结晶后，加入dmso后，微型摇床作用时间不一致，最好是结晶完全溶解。
4.尽量减少影响因素（如：mtt配置的方法，溶解剂等。
作者: langlang    时间: 2012-2-13 13:50


请教：悬浮细胞怎么做MTT，一定要离心吗？离心的速率是多少？请教孔板怎么离心？
答：这要看你的悬浮细胞中残存的培养基是不是对你的实验有很大影响， 一 般你可以更换培养皿就可以避免因离心造成的不必要的细胞丢失。
作者: dotaaa    时间: 2012-2-13 13:51


我最近做了几次MTT,结果很不理想,感觉是干扰因素太多.加药作用后再加MTT，细胞量少的孔显色倒深都成紫色了,可能是药物的影响。后来我在药物作用后用不含血清的培养液洗了两次，再加MTT，结果依然这样。酶标仪测的结果跟显微镜下观察的结果正好相反 。肯请各位做过MTT实验的前辈指点。
作者: tianmei001    时间: 2012-2-13 13:51


如果是测定细胞在一段时间内的活性，则可以用微量热法，直接监测细胞代谢的热效应。代谢活性强则当然放热量大。可以定量表示为细胞的代谢焓变，甚至可以计算出单个细胞的代谢焓变，测定精度高，重现性好。不过这个方法需要微量热仪，最便宜的也要30多万，贵的100-200万。
作者: redbutterfly    时间: 2012-2-13 13:52


我做MTT来测定药物对肿瘤细胞的作用,发现药物浓度越高OD值也越高,不得其解,而在显微镜下明明看到药物浓度高的细胞形状明显改变,请高手们多多指点迷津.
作者: 969    时间: 2012-2-13 13:58

总感觉MTT法存在太多的误差。可能是因为我还没掌握要领吧。

首先有一个问题想请教一下：

对于不同的细胞是不是都要做一个细胞数和OD值的线性曲线，具体实验方法，哪位有文献可以上传吗？

细胞中加完药物3天-5天后取样，这期间培养液会变黄，因为细胞仍在生长，但些时也没有办法去补培养液，除非补加含相同药物浓度的培养基，不知大家是怎样做的。如不补加培养液，细胞会因为营养不充分而部分死亡，当然阳性对照也是这样，不知这对实验会不会有不可接受的影响？

加完MTT，4小时后需将MTT吸走，再加入DMSO，该步骤极易将形成的结晶吸走，有没有好的办法，我只能用MTT。

想研究病毒、药物的协同作用，大家在实验设计上是否有好的办法。做了几个月实验，感觉没什么收获。狂郁闷·
作者: 泡泡    时间: 2012-2-13 14:09

楼上的问题也是偶想知道的，
1）在做MTT之前是否需要做每一种细胞的生长曲线？？？
2）使用MTT法筛选药物对肿瘤细胞的抑制作用，在药物与细胞作用结束之后，是否需要将药物连同培养基吸除，再加入新鲜培养基培养24h后再加入MTT液测量呢？有人说这样可以评价细胞的增殖能力，但很可能细胞在培养一天后也就长到了与对照组差不多的状态。
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-2-13 14:10

我也是遇到这个问题,发觉药物作用过的细胞OD值比对照的要高,但在光镜下看到药物作用过的细胞明显变少好多,唉,百思不得其解,请各位高手指点迷津!
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-2-13 14:10


我曾经尝试过用PBS稀释CCK-8, 好象效果不如用培养基稀释好. 怕培养液对读数有影响,可以做空白对照.
作者: TNT    时间: 2012-2-13 14:10


我做过MTT对海洋动物细胞的活性监测：
MTT法优点是简便，设备要求不高，检测样品量要求不高；
孵育至少4~6小时，好像并不快；
如果培养液中有庆大霉素，加MTT，庆大霉素浓度大于标准两倍就会出白色沉淀，有一年元旦加班就是这个原因，通宵白忙；
检测波长一定要慎重选择，扣除本底的影响，不是文献上的都能用；
标准曲线有上限，超过上限就会不呈线性，虽然是大多数人都知道，可是实际应用常常忘掉；
作者: TNT    时间: 2012-2-13 14:12


"总感觉MTT法存在太多的误差。可能是因为我还没掌握要领吧。"
——这也不一定，小心注意每个容易出错的环节，注意标准化和连续性，结果才能稳定；

首先有一个问题想请教一下：
对于不同的细胞是不是都要做一个细胞数和OD值的线性曲线，具体实验方法，哪位有文献可以上传吗？
——是要做的，不同的细胞差别很大；就是将一定浓度细胞（以后检测细胞浓度也在范围内），做检测，看是否符合线性；

加完MTT，4小时后需将MTT吸走，再加入DMSO，该步骤极易将形成的结晶吸走，有没有好的办法，我只能用MTT。
——需离心！

想研究病毒、药物的协同作用，大家在实验设计上是否有好的办法。做了几个月实验，感觉没什么收获。狂郁闷·
——正交设计，均匀设计都可以；
作者: utt0989    时间: 2012-2-13 14:12


最近做了几次MTT，结果都很不好，看到大家的帖子真是信心大增。
想尝试用一下CCK-8.
请问CCK-8在哪能买到呢，如何稀释!!
作者: ladyhuahua    时间: 2012-2-13 14:13

我的实验体会：
1。台盼蓝染色法，对于悬浮细胞来说，还比较方便，对贴壁细胞来说，较为繁琐。因为要消化，有时，96孔板不一定能消化干净。而且，该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液的体积有关，加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说，该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰。
2.克隆（集落）形成法，对贴壁细胞来说，较为方便，也较客观。但要注意（1）一定要将细胞充分分散，边摇边加入孔板中；（2）用枪加到孔板时，用力柔和，避免细胞冲到孔板的壁而沉下，导致细胞克隆在孔板的四周较多，中间较少，细胞克隆集中于四周，导致计数误差。
3.MTT法，测定的是细胞浓度，要注意细胞悬液的体积。血清蛋白对实验测定有干扰，要弃上清，加入一定量的SDS或DMSO溶解沉淀物，这两步都会给实验带来误差。而且在96孔上操作，实验孔较多时，加样次数越少越好。所以，该法如斑竹所说，会有误差。
4.CCK－8的实验，只加样一次，实验比MTT法简单，比台盼蓝染色法客观，它的缺点有两方面：（1）比较贵；（2）加入CCK8试剂后，一般要放入CO2箱1-2.5小时，保温时间越长，测定A值越高，虽然每一孔的A值都增加了，但不同的孵育时间，测定的IC50还是不同的，但IC50改变不大。本来细胞浓度测定，测定的细胞浓度是相对值，无论台盼蓝染色法，MTT法，CCK8法都是相对准确的实验，在此意义上，CCK8可以说是比较方便，准确，客观的方法。我们小组的经验是（1）酚红的颜色可能影响实验结果（都是橙黄色），若实验的试剂空白组A大于0.2，则实验体系用无酚红的1640（有售），否则，则不怕/忽略酚红的影响。（2）每次实验，不同孵育时间，A值不一样，以“细胞对照组A＝1.0左右”为最佳孵育时间，每次实验与此统一。
作者: viviwang1987    时间: 2012-2-13 14:13

提问：
谁能提供关于mtt实验前测定细胞贴壁率、倍增时间和不同细胞数条件下的生长曲线的方法？？谢谢！
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-2-13 14:13

看了一圈，有人提到了我想提的PI（碘化吡啶）染色，主要是根据死细胞磷脂酰丝氨酸外翻的原理在流式机器上操作完成，结合Annix-5染料进行双染，可直接识别死细胞及凋亡细胞，操作简便，结果观察更为直观、准确。为临床及科研广泛采用。
作者: is2011    时间: 2012-2-13 14:14


台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。我都用过，你的方法没用过，如果可能的话，能否给点样品，我们实验室学生很多，经常做细胞活性检测。
作者: jujuba    时间: 2012-2-13 14:14

给大家介绍一种测定细胞活性的方法,大家可以自己跟MTT比较一下
原理：Sulforhodamine B (SR是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的OD读数与细胞数呈良好的线形关系，故可用做细胞数的定量。
材料与方法：1。其细胞接种与MTT相同。
2．SRB用1%醋酸配成0.4%溶液。细胞在加药培养结束后用三氯醋酸（TCA）固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50%TCA液50ul（终浓度为10%）固定；悬浮细胞每孔加预冷的80%TCA50ul固定，加TCA时必须轻轻加在培养液表面，静置5分钟后再将平板移至4度放置1小时，这样可使悬浮细胞固定在培养孔的底部。
3．倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。
4 每孔加如100ulSRB液，在室温放置10分钟。未与蛋白结合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空气干燥。
5．结合的SRB用150ul 10mmol/l非缓冲Tris碱液（ph10.5）溶解
6 用自动化分光光度平板读数计在515nm波长处测定每个小孔的OD值
本法用TCA固定细胞后，可随时用SRB作蛋白含量测定，不受测定时间的影响。SRB用tris溶解后也可稳定一个较长的时期。OD与SRB浓度作图时，在OD 单位1.5-2.0间为线性，当超出线形范围时，必须稀释后重新读数。
MTT操作过程中必须吸出细胞培养的上清液，使之比较费时及增加可能的误差，大量使用DMSO也不受欢迎。此外，OD值随时间变化也是一个较大的缺点.当然SRB法操作比MTT复杂一点,呵呵,但是时间可以自己掌握,不受测试时间的限制
作者: 8princess8    时间: 2012-2-13 14:14

Trypan Blue 台盼蓝排斥试验
我做的 感觉很简单 比较适合原代培养的细胞
原理：
细胞损伤或死亡时1，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。还有其他燃料，如伊红Y和苯胺黑等。
用品：
1. 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。
2. 吸管、血细胞计数板、显微镜
步骤：
1. 制备单细胞悬液。并作适当稀释（10 *6 细胞/ml）
2. 染色：取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液，混匀。
3. 计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞
结果：
镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。
根据下式求细胞活力：
活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100

注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。

台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。
作者: DDD    时间: 2012-2-13 14:15

提问：
谁能提供关于mtt实验前测定细胞贴壁率、倍增时间和不同细胞数条件下的生长曲线的方法？？谢谢！
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我不知你提这个问题是不是看了司徙先生的《细胞培养》一书中关于MTT试验的方法，因为它上面是要求先做这些，但这本书 上就介绍了这几个参数的测定方法。
另外，我也是准备做MTT，我在站内找了很多关于MTT试验的贴子，还有就是司徙先生的《细胞培养》一书，看后还是有些困惑：1.关于空白对照孔(兼调零孔)加液，书上和一部分人说是只加培养基，也有和我一样理解为应加培养基、MTT、DMSO，一起相同步骤后对照，从我预试验的情况看，培养基(我的是DMEM/F12)是红带黄色的，而加了DMSO后的试验孔的液体是呈蓝色，我想两种明显颜色不同的液体怎能设为对照？所以我理解空白对照(兼调零孔)应为一同加入MTT，DMSO；2.对于测定波长，为什么不同的资料会没个一致的看法：书上说是490、Roche公司(ATCC公司也是)产品说明上说是550-600/>650,还有说是570/630(nm)，我预试验的情况是用490/630nm,结果对照兼调零孔的值比试验孔的还高!
再有，看了这楼战友的高见，我想改用CCK-8了，我养 的是星形胶质细胞。
希望高手指点一二。
作者: 盼盼    时间: 2012-2-13 14:15

我购买的是国产的试剂，后按这个方法配制（5mM WST-8, 0.2mM 1-methoxy-PMS, 150mM NaCl）但是实验结果总是不理想。我做的是原代细胞DC，过几个小时后会加入自制的混合淋巴细胞（也是原代）培养三天后加入cck-8溶液，过1-3小时450nm检测，但是结果总是不好，看了各位的指导，想请教这里面的问题。1：培养基含有酚红，并且培养三天后直接加的cck8，这里问题在哪？2：我配制的培养基或者是CCK8有无问题？3：加入CCK8后无培养时间越长，无论是对照还是空白的值都超过0.6。
问题实在是太多了，真的希望能尽快帮小妹解决。谢谢！
作者: fklo83    时间: 2012-2-13 14:16

我不知你提这个问题是不是看了司徙先生的《细胞培养》一书中关于MTT试验的方法，因为它上面是要求先做这些，但这本书 上就介绍了这几个参数的测定方法。
另外，我也是准备做MTT，我在站内找了很多关于MTT试验的贴子，还有就是司徙先生的《细胞培养》一书，看后还是有些困惑：1.关于空白对照孔(兼调零孔)加液，书上和一部分人说是只加培养基，也有和我一样理解为应加培养基、MTT、DMSO，一起相同步骤后对照，从我预试验的情况看，培养基(我的是DMEM/F12)是红带黄色的，而加了DMSO后的试验孔的液体是呈蓝色，我想两种明显颜色不同的液体怎能设为对照？所以我理解空白对照(兼调零孔)应为一同加入MTT，DMSO；2.对于测定波长，为什么不同的资料会没个一致的看法：书上说是490、Roche公司(ATCC公司也是)产品说明上说是550-600/>650,还有说是570/630(nm)，我预试验的情况是用490/630nm,结果对照兼调零孔的值比试验孔的还高!
再有，看了这楼战友的高见，我想改用CCK-8了，我养 的是星形胶质细胞。
希望高手指点一二。
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1,我觉得空白加不加培养基,主要看你的培养基对最后的数值影响大不大,我门用的1640,加了之后和只加DMSO,MTT的OD值差的并不 多,而且我觉得最后你的所有值都要减去这个空白对照,所以影响应该不是很大吧.
2,我们用的酶标仪#3的时候就是490nm#4的时候是630nm,我们一直都 是用#3
我觉得#4肯定不行吧,差太远了!你的结果"对照兼调零孔的值比试验孔的还高"是不是因为你倒MTT的时候把细胞都倒掉了??或者其他原因??
作者: fklo83    时间: 2012-2-13 14:16


补充一点,刚忘了:因为加MTT试剂孵育产生了甲赞沉淀后，都是把原来的培养基和药物全部清除，只留下沉淀，然后再加DMSO溶解沉淀，上酶标仪。如果在吸弃上清的那一步做得好的话，那空白对照里加的什么对OD值的影响应该是微乎其微的。
一般做MTT的调零孔是用DMSO，空白对照是用单纯的培养基
作者: yychen    时间: 2012-2-13 14:16


最近也在做MTT，用的是贴壁细胞，发觉细胞数为10000个/孔时效果较好。
作者: pengke1983    时间: 2012-2-13 14:17

我做过的台盼蓝和MTT 实验：

台盼兰染色法价格低廉，操作简单，又不用无菌操作，做这个实验只要是把显微镜调好了，细胞浓度调好了就不会有问题，是一个养细胞的入门实验，所以很适合初学者做。我做这个实验主要是用来确定抑制细胞增殖的药物浓度，排除浓度过大引起的毒性反应。

MTT性价比最高，操作上也不复杂但是也要注意一些地方：
1. 刚开始做MTT 实验的时候，结果的稳定性及重复性不好，后来查资料发现，MTT实验的最后OD值要控制在0.75－－1.25之间，这样才能保证数据有线性关系。在先控制好了合适的培养时间和细胞数后，所得到的数据还是令人满意的。
2. 一定要保证每孔细胞数相同，这一点很重要，所以一定要充分混匀，边加边吹打，尽快加完。
3. 尽量用新的96孔板，同时加样时注意准确，吸弃上清时，尽量小心，不要吸起沉淀，以减小误差。
4. 血清浓度对MTT实验也有影响，尽量不高于5％，因为如果蛋白质含量高了，加入MTT反应后会有蛋白沉淀出现，最后的沉淀很难溶。
5. MTT试剂一定要注意避光，如果变绿了，就绝不能用了。
作者: ROSE李    时间: 2012-2-13 14:17


楼上各位，

台盼蓝 如果用孔板来做，那不是很麻烦吗？

每组孔都要消化，染色~~
作者: nn255    时间: 2012-2-13 14:18

请教各位老师，我在细胞活性检测方面刚起步，不知道有人做过刃天青检测法没有？我现在想用这个做。谢谢！
作者: bananapeople    时间: 2012-2-13 14:18


我也做过不少MTT的实验，感觉重复性不好，我上半年做的实验结果跟我下半年重复做的结果相差很大，光静下明显看到细胞死亡很多，MTT测出来却和没有多少细胞死亡的相差很小，实验结果根本就没法用。感觉干扰因素太多。听老板说要发国外的文章是不能用MTT的。
作者: zzzz    时间: 2012-2-13 14:18


不知能否提供SRB方法的原始文献？我最近也在使用这个方法，发现接种细胞数目在6000时测得的空白组和药物组的OD值仍然大于2，是否应该继续降低接种细胞的数目？另外也想看下原始文献了解下实验原理。谢谢，不胜感激！
作者: yysr238    时间: 2012-2-13 14:18


有谁用MTT测过脂肪吗？具体步骤是怎么样的？我做了几次但是最后一步不管是加DMSO还是加异丙醇或是加SDS，都发现已经变成紫色的脂肪细胞还是成团地浮在上层。这样的话怎么用酶标仪测吸光度呢？高手们有什么建议吗？讨教了。
作者: 盼盼    时间: 2012-2-13 14:19


我是个新手．我检测的是一种有荧光性的物质对细胞的毒性实验．请问有什么方法呀．设立对照，连续几天作单纯的细胞记数　绘制细胞曲线可以不呢各位前辈指教
作者: 盼盼    时间: 2012-2-13 14:19


我做的是细胞毒性实验，待测的物质有荧光性．怎么办啊，可不可以设立对照组，连续两三周作单纯的细胞记数然后绘制细胞曲线呢．我是个新手请各位前辈指教
作者: HPLC使者    时间: 2012-2-13 14:19

目前我做的细胞活性测定，用的最多的是MTT，正如上面各位所说，MTT有很多缺点，而且重复性比较差，但是多做几次，还是可以得到比较满意的结果的。我现在也在尝试结晶紫染色法检测细胞活性，可能是由于条件还没优化，得出来的结果不是太好，不知道有没有战友做相关方面的实验。另外，中性红染色法也是检测细胞毒性的方法，SRB方法也挺好的，总之几种方法结合起来应该更能反映问题，得出的结果也比较可靠。
作者: sunnyB    时间: 2012-2-13 14:20

请问 各位 ：
我 要测CTL活力 ，是不是 一定要分离出纯T细胞，若测NK的杀伤作用也必须分离出纯NK吗？有便宜 点的方法分离吗？请指教 ！
作者: cocacola    时间: 2012-2-13 14:21

改良MTT法在细胞活性测定中的应用：
原来的MTT法操作起来比较烦琐，要求技术熟练，但是结果的重复性比较差，因此我们在细胞增殖试验中采用了改良的MTT法，具体步骤如下：
1.细胞接种（96孔板），每孔100μl，细胞量2~5×104个（细胞数量将决定加入裂解液之后的孵育时间），。
2.根据聚体要求进行处理，处理物的量一般为10μl。
3.处理完之后直接加入10μlMTT，继续培养4小时。
4.直接加入裂解液100μl，裂解的时间由接种的细胞量决定，2~5×104个细胞，4小时可充分裂解，如果细胞数目比较大，就要延长孵育的时间。
（裂解液的配比：100ml的N,N-二甲基甲酰胺，100ml蒸馏水，30gSDS（十二烷基硫酸钠）；搅拌待SDS充分溶解之后过滤，过滤得到的液体即可直接应用）
5.裂解完毕之后在振荡器上振荡10min，酶标仪测定。
本方法的方便之处是不要反复吸出液体，减少了操作不当影响结果，每次操作只要直接加入液体就可以了，但是加入的量要按上述说过的量，要不就会溢出孔外，重点是裂解液的配比。
如果要了解的更加聚体，可以参考“改良MTT法检测HEPG-2细胞的增殖”，发表在今年6月份这一期的《卫生毒理学杂志》。
作者: 爱老虎游tt    时间: 2012-2-13 14:21


我们现在都用结晶紫染色，重复性还不错.而且相对于MTT来说，成本很低，反应时间也很短。
作者: zsxan1990    时间: 2012-2-13 14:21

我最常用的就是台酚蓝法，就台酚蓝进行染色，死细胞着色，活细胞不着色，在显微镜下观察，数200个细胞。看其中染色的和不染色的，就可以求出细胞活性了。

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您好：能详细说下您的操作步骤吗？如果有图片也发一张上来看看，我一直染不上色，还有染色一般在多长时间可以看到死细胞被染色，我放置约10分钟也没见到被染色，不是说活细胞可以时间久能被染上色吗，我放置一小时也没看到视野中有被染色的细胞，谢谢请指教
作者: am10    时间: 2012-2-13 14:23

MTT法显色的条件是很重要的,这一点容易被我们所忽视,我总结了一下MTT显色反应的一些合适条件, 与大家一览.
1 　pH 值对MTT 实验结果的影响:MTT 实验体系的pH 值是影响实验结果的另一重要因素。在偏碱性的环境中本底偏高,稳定性较差。随放置时间延长而升高;偏酸性试液 的实验结果比较稳定。
2 　酚红和血清对MTT 实验方法的影响:酚红是一种pH 中性指示剂,血清是细胞生长必需的营养成份,两者都是细胞培养液的基本成份。酚红在pH7.0
以上试液中呈紫红色,在570 nm 有较大光吸收值。血清蛋白在有机溶剂中容易变性形成絮状沉淀,影响透光度。
3 　异丙醇等用作Formazan 溶剂,无须酸化也能消除酚红的影响: 为了消除酚红对MTT 实验结果的影响,Mosmann (1983) 提出用酸化异丙醇作Formazan 溶
剂,酸化异丙醇可将酚红显示的紫红色转变为无色。Francois (1986) 认为酸化异丙醇溶解Formazan 改变了原光谱特性,降低灵敏度,提出改用无酚红的培养基。未经酸化的异丙醇在一定条件下也可以消除酚红的影响。异丙醇等有机溶剂本身为弱酸性 ,能够中和中性和弱碱性试剂,如RPMI21640 (pH7. 3) 。当异丙醇与RPMI - 1640 的溶量比达到1∶1 以上时即可将酚红的紫红色转变成无色。
4 　细胞代谢酶存在部位对MTT 实验结果的影响:细胞线粒体产生的琥珀酸脱氢酶是细胞生长代谢产物,这种酶裂解MTT形成Formazan 是MTT实验方法的理论基础。琥珀酸脱氢酶的产生和分布规律与MTT检验方法的灵敏度和稳定性有很大关系
5 　MTT使用浓度选择:在不饱和状态下,或是细胞密度一定,MTT 不饱和;或是MTT一定,细胞密度不饱和,Formazan 的生成量分别与MTT浓度和细胞分泌的酶活性量呈线性关系。达到饱和状态以后,两者为非线性关系。为了提高MTT 实验方法的灵敏度,在细胞密度一定的条件下,应该使用MTT饱和浓度。MTT的饱和浓度与细胞种类、细胞活力状态有关因此MTT 最佳使用浓度要视情况而定。
6 　MTT的酶裂解反应时间选择:MTT 在细胞培养体系中被细胞内线粒体产生的琥珀酸脱氢酶裂解生成Formazan ,完成这一反应需要一定时间。MTT 裂解反应2.5h 反应已基本完成,3 h 反应相当完全,通常MTT实验应选择3 小时的反应时间。

附注(对MTT性质做一些补充说明,它的理化性质对其条件影响很大):
　MTT是一种黄色粉状物,溶于水性溶剂,也溶于有机溶剂,但在有机溶剂中的溶解力低于水性溶剂,常温下需要较长时间才能溶解。MTT 水溶液在pH 7.0 以下稳定,3～5周内不变性,在pH7.0 以上溶液中不太稳定 ,在异丙醇溶液中1 周内变色,2～3 周内变成兰紫色。MTT 溶液呈黄色,在410 nm 波长处有最大吸收峰,随波长增大吸收值很快下降,至500 nm处趋于最低值。MTT由酶裂解生成Formazan。Formazan 不溶于水性溶剂,易溶于有机溶剂。乙醇,丙醇,异丙醇,乙二醇甲醚,DMSO 等都是比较好的溶剂,Formazan 的有机溶液呈兰紫色 。细胞
增殖实验通常在聚苯乙烯培养板上进行,四氯化碳、10 %SDS 和二氧六环对培养板有溶蚀性,不宜使用。
DMSO 和SDS 对Formazan 也有较好的溶解性,但凝固点太高,10 ℃以下不能用; 丁醇等长碳链醇溶解Formazan 后与水相不混溶,呈分层液,不适合作Formazan溶剂。
作者: BUK    时间: 2012-2-13 16:10


胎盘蓝和结晶紫是一种试剂吗？结晶紫做细胞活性实验，浓度是多少呢，谢谢！



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