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标题: [求助]3T3-L1诱导分化遇到困难! [打印本页]

作者: loli 时间: 2012-2-18 16:25 标题: [求助]3T3-L1诱导分化遇到困难!

养了有半年的3T3-L1,最近做诱导分化实验,可总是失败,到分化后第4天,细胞不少死亡,而且周围有大量黑点,还有脱壁情况发生.
这使我对细胞本身产生了怀疑,因为这细胞是别人送给我的,也没有什么方法对其进行鉴定,因此不知道它到底是不是3T3-L1?
另外其它几个失败原因分析一下可能有:
1, 细胞隔天换液, PH迅速降低, 培养基颜色近似白色,低PH值导致细胞死亡.或者营养物质耗尽,导致细胞死亡.
2,不知用乙醇溶解Dex和IBMX是否恰当，担心乙醇会对细胞产生毒性作用！

作者: yes4 时间: 2012-2-18 16:27

我也在养3T3-L1细胞,还没做到诱导分化,希望和你共同学习,不知你是哪里的,我在武汉.

作者: dragonkilly 时间: 2012-2-18 16:27

我在大连，我养的3T3是别人送的细胞，最近诱导老是失败，因此对我的细胞真实性产生怀疑，但又不知3T3-L1的鉴定方法，所以挺郁闷的

作者: dragonkilly 时间: 2012-2-18 16:30

细胞confluent2天后加IBMX+Dex+insulin，2天后发现细胞形态明显变圆，然后

加只含胰岛素的培养基，可是一天后发现细胞有去分化现象，即从形态上看

细胞由圆形变回梭形，郁闷，不知是不是胰岛素问题，我准备再用IBMX+Dex

+insulin诱导2天，看行不行！

作者: S6044 时间: 2012-2-18 16:30

晕，那很正常啊，接触抑制两天后加诱导剂，细胞就是收缩变圆的，然后D3天只加insulin，细胞就重新变回梭形，诱导后要注意加液要特别轻缓，因为分化时细胞贴壁不牢，加液一下子加进去细胞会被冲起来。

作者: daod 时间: 2012-2-18 16:31

我也在养3T3-L1,希望和大家交流.新手.现在正在左诱导分化试验,诱导两天后,细胞开始变园,第三天只加胰岛素,好像没有看到细胞变化,不知道大家诱导剂配方和浓度如何?我也适用的乙醇配的地米和IBMX,担心分化不了?
另外我想知道第四天后换用dmem培养基后,也是隔一天一换液吗?

作者: xueyouzhang 时间: 2012-2-18 16:31

请问：你诱导细胞分化大约需要多少天？
“然后D3天只加insulin，细胞就重新变回梭形”，我较难理解！那到第几天细胞又重新变回圆形呢？
我还以为是脂肪细胞去分化呢？能否给我解释一下其中的缘由？多谢l！

作者: 131415 时间: 2012-2-18 16:32

接触抑制两天，MDI两天，insulin两天，只medium两天，再只medium两天，从诱导剂开始一共八天，一般到了第六天脂肪滴就全出来了，剩下两天就是积聚的过程。也有过分化效果很好的，第四天脂肪滴就全出来了。
就是MDI两天细胞变圆，insulin两天的时候细胞就是恢复梭形，至于为什么，大概就像为什么一定要接触抑制两天一样的理由，我也不知道^_^，一直做分化都是这样的。
而且对于“变圆就是分化，变梭形就是去分化”这个观点不晓得是从哪里看到，能否告诉一下？我做细胞分化有两年了，似乎还没有听说过这种判定标准，也么有看到相关文献，师兄师姐们还有俺们的大boss都没有告诉过细胞形态与分化的关系，所以这点想请教呢。先谢了^_^

作者: xueyouzhang 时间: 2012-2-18 16:32

谢谢你提供的一些宝贵意见，我只是从一篇综述（张崇本，2004，脂肪细胞的分化及调控）上看到 “有人认为细胞形态的变化是分化过程中必须经历的一步，而不仅仅是脂类积累的结果。” “细胞形态的变化是脂肪细胞分化的早期标记之一”。也许我的判断太过武断！

作者: xueyouzhang 时间: 2012-2-18 16:32

再上传几张图片，由于没装摄像头，在倒置显微镜下用数码相机照得，效果不好，这是细胞诱导分化d3的照片。希望各位高手能否给点指导！
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作者: xueyouzhang 时间: 2012-2-18 16:33

再来一张！

图片附件: 18360603.jpg (2012-2-18 16:33, 33.32 KB) / 该附件被下载次数 14
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作者: tuuu2 时间: 2012-2-18 16:33

你的图片看不清楚啊，怎么回事！
请问楼上，做了染色并拍照后效果不是很好！
能不能传两张你们染色后的图片借鉴一下，谢谢先！

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-2-18 16:34

油红染色的

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作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-2-18 16:35

油红染色的3.5cm dish图片啊,你看不到吗?很faint,油红染色很粗的,是我用扫描仪扫的,就是比较颜色深浅,难道你要看显微镜下那种很邪恶的脂肪滴啊.

图片附件: 74377804.snap.jpg (2012-2-18 16:35, 65.84 KB) / 该附件被下载次数 8
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作者: yychen 时间: 2012-2-18 16:35

图片实在太酷了！你能否把你的诱导液配制过程给我们大家说说，也就是IBMX，DEX，和insulin的溶解方法及浓度，谢谢了！

作者: guagua 时间: 2012-2-18 16:36

我也很想知道你的诱导液配制过程，也就是IBMX，DEX，和insulin的溶解方法及浓度，谢谢了！现在诱导分化遇到麻烦！

作者: 66+77 时间: 2012-2-18 16:36

这是我分化的细胞，直接在镜下拍的照片。

作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:37

我和前面的人的方法有点不同，我是IBMX＋DEX＋insulin处理3天，然后insulin处理三天，最后无insulin处理两天就可以分化好了。但我认为也和细胞株有很大关系，如果细胞株不好的话，分化很难做。但因为分化剂处理三天，所以三天后去分化剂要特别小心，细胞收缩比较厉害容易掉。

作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:39

我配时，IBMX和insulin用水溶解，DEX用酒精溶解。

作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:39

我配IBMX和insulin直接用水，DEX用酒精

作者: tudou85 时间: 2012-2-18 16:39

请问楼上，你这张图片是第几天，八天？
另外ins 我也用水溶过，但是融解效果不是很好，所以换成DMSO了！
其实分化剂的使用，主要也和细胞状态有关，我还用ins IBMX dex 诱导过四天，每两天换液！效果也还行！

作者: fsdd817 时间: 2012-2-18 16:40

群友，你的照片好漂亮。请问你配试剂时,IBMX和insulin用水溶解，DEX用酒精溶解，你使用的浓度多大？配成多少浓度的母液？是否过滤？ins用水配不易溶，能否加盐酸助溶？要培养几天才能出现你照片上的效果？急需帮助，谢谢！

作者: dragonkilly 时间: 2012-2-18 16:40

另外还有个问题就是，你们的细胞大慨传了多少代，听园子里的人说，3T3-L1传到20代就不分化了，有这回事吗？期盼回复！

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-18 16:40

我也听说T3T－L1传代数有限，不知道是真的假的！

作者: hyuu 时间: 2012-2-18 16:41

3T3-L1 超过20代基本就很难分化出来了，我一般做到17－18代就不要了。
我这张照片是第八天的照片，
insulin用水比较好溶解，IBMX用水不容易溶解，要加入很少量的KOH助溶。
insulin和IBMX用水配所以要过滤，DEX就没必要了。

作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:41

“3T3-L1 超过20代基本就很难分化出来了” 有没有什么依据？为什么超过20代就分化不了？

作者: hyuu 时间: 2012-2-18 16:42

属于个人经验，没什么特别的依据，据我所知道的实验室，都没有20代后还能分化得很好的，当然这是我个人的看法，不一定正确啊。因为分化的时间和成本都很高，所以大家都不愿意冒这个风险，也可能是原因之一吧。但我以前分化时，到20代左右就不太行了。

作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:43

谢谢答复，那么你们的细胞是不是冻了一大批，到诱导分化时再复苏，这样

是不是很麻烦，因为有个细胞冻存、复苏过程，复苏不好很容易失败。

作者: hyuu 时间: 2012-2-18 16:43

对的，我们的细胞最初代数少的时候冻了一批。复苏也不困难啊，就和别的细胞一样就可以了，我一般是手上的细胞传到15代时就开始复苏新的细胞，这样实验就不用停下来等细胞了。

作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:43

不知你的细胞是冻在液氮中还是低温冰箱中，我们的细胞放在低温冰箱中冻，但过了3个月后，复苏很难成功，液氮中也许还好一点，但液氮需定期灌取，比较麻烦，弄不好液氮挥发了，细胞就呜呼了！
希望能够给个联系方式，希望和你能够交流交流！最近细胞分化不了，很是郁闷！

作者: tianmei001 时间: 2012-2-18 16:50

我买的是sigma的，为什么用水一直溶解效果不是很好，可以用DMSO吗！

作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:50

按sigma的说明书上，最好用PH 2~3的稀盐酸或稀醋酸溶解！

作者: pencil菲 时间: 2012-2-18 16:51

任何培养的细胞代数多了都要重新复苏的，随代数增加细胞会逐渐衰老，所以代数限制不单单是3T3－L1分化要注意的问题。

作者: hyuu 时间: 2012-2-18 16:52

大家讨论的非常热烈,本人进行3T3-L1的分化3个多月了,一直还不错,至于细胞代数的影响,我个人认为没有太硬性的规定,我最多时使用到了26代,分化率80%以上吧. MDI 的2天,细胞会出现明显的收缩, 主要是因为IBMX的促进细胞收缩的作用, 只有INSULIN的2天,细胞形态恢复正常,但是已经发生了些改变. 本人发现DAY3是非常重要的一天, 细胞如果出现问题,这一天会体现的非常明显.所以,DAY2的配液和换液很关键. 到了DAY4, 虽然细胞内还没有脂滴,但是形态已经不是成纤维状了. DAY6以后小脂滴慢慢出现, DAY8-10 小脂滴融合成大脂滴, 一般实验时间在DAY8-14. 以上是本人实验过程中一点小经验,愿于大家交流.

作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:52

你的经验很不错，我经过了几周的努力，现在终于见到曙光了，这是我的一张诱导照片。

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作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:53

群友的经验很不错，我经过了几周的努力，现在终于见到曙光了，这是我的一张诱导照片（第7天），只是分化率偏低。

图片附件: 77076615.snap.jpg (2012-2-18 16:53, 23.53 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10820

作者: Ao7 时间: 2012-2-18 16:53

我的细胞是师姐赠送的，她告诉我是南京过来的，具体的公司我不是很清楚。那个细胞已经全部死掉了，现在我买了一个新的细胞株，是在协和买的，差不多有十天了，细胞刚刚来的时候很漂亮，瓶子里很干净，但是现在镜下感觉有很多小黑点，很脏的样子，细胞来了以后也长得比较慢，要十来天才能传代，可是那边的人告诉我这个细胞长得很快，两三天就传代，一次要传五六瓶。不知道是怎么回事啊？？？

作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:54 标题: 回复 #37 Ao7 的帖子

3T3-L1细胞长的很快，就是状态不好的情况下，长的也挺快的，你说十天传一次代，如果细胞没有染菌的话，我估计是你的血清（一些质量较差的国产NCS）或培养基（PH值偏高，放置时间长了导致里面的谷氨酰胺降解了）出了问题！

作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:54

另外3T3-L1培养过程中还有二点值得注意的是

1，Never allow culture to become completely confluent
2，The cells should be grown in plastic flasks, they do not grow well on some types
of glass surfaces

作者: Ao7 时间: 2012-2-18 16:56

我现在用的是hyclone的液体培养基,不知道要不要加谷胺酰氨.奇怪的是我有一瓶细胞用的是那边配的培基,也长得很慢,细胞长得慢,培基的颜色也变得慢,可以几天换一次培基,经常是第二天看细胞,发现与前一天没有什么很大的变化.我们所里细胞培养的环境不是很好,据说有很多细胞被黑胶虫污染.

作者: plaa 时间: 2012-2-18 16:56

现在我用新买的细胞，在第三天就可以看到脂肪颗粒了。第四天较为明显，看来细胞的状态与分化情况有较显著的相关性，在加药的时候，发现乙醇溶剂（0.25%）有促进脂肪沉积的作用（相关文献也有报道）！
所以在这提示一些战友：一些脂溶性分化诱导剂最好用DMSO或其他方法溶解，以除去乙醇对实验结果的干扰。

作者: cocacola 时间: 2012-2-18 16:57

各位群友，俺这里有点配方，供大家参考
胰岛素，用０.０１Ｎ盐酸溶解
ＤＭＸ：用无水乙醇溶
IBMX:用溶液A(1.22ml 14.8N氨水+18ml甲醇+16.98ml水)溶
氨水实为浓氨水

作者: 04906 时间: 2012-2-18 16:57

大家好！
我养3T3-L1细胞一个多月，细胞生长一直非常招人喜爱，但是诱导分化将近一个月一直没有成功，甚是苦恼，希望各位有成功经验的XDJM不吝赐教，先谢了！

作者: 04906 时间: 2012-2-18 16:58

首先，我到现在还未把握“接触抑制”在镜下观察到底是什么样子？是指细胞和细胞之间生长到完全没有间隙还是指细胞的触角接触在一起呢？我曾试过在细胞生长到完全没有间隙之后两天开始促分化，但这时在低倍镜下只看到密密麻麻的一片，细胞的轮廓都不好辨别了，高倍镜下观察细胞似乎还有重叠现象。

作者: 04906 时间: 2012-2-18 16:58

其次，刚进行诱导分化时细胞脱落现象明显，曾怀疑过是否胰岛素浓度过高，所以1、2、5、10微克/毫升的胰岛素都试过（IBMX均为0.5mM，Dex均为1.0微摩尔/升），均未能成功出现可爱的脂滴。

作者: 04906 时间: 2012-2-18 16:59

我的3T3-L1购自上海，6月初开始养的，传代绝对没到20代，所以促不成功的原因中应该可以排除“20代后”的可能；促分化我一直是在corning的25cm2塑料培养瓶或六孔板中进行，不知大家都是在什么器皿中做的？促分化时的细胞器皿是否对促分化有影响？

作者: 04906 时间: 2012-2-18 17:00

还有，我用的IBMX是sigma的，用DMSO溶解，但在4度冰箱里会凝固，室温下溶解后加入六孔板中它就直接贴在板底形成结晶，将六孔板放入培养箱5分钟左右结晶溶解，但此时镜下观察结晶处没有细胞了。地塞米松和胰岛素都不是在sigma购买而是在病房拿的，不知促分化不成功是否与这二者的来源有关？另外，大家都是把这三种物质配好在培养基里还是直接加呢？

作者: plaa 时间: 2012-2-18 17:00

根据我的经验，提供以下几点参考意见：
1，一定要在细胞状态好的情况下诱导分化，3T3-L1长得非常快，如果长满以后不换液，会有大批细胞死亡，判断细胞好坏的标准是cell confluent 后，培养基中很少有漂浮的死亡细胞。所以诱导前传代的细胞在接种时数量不要太大，最好在10*4数量级，这样让细胞长3天后铺满，再换液，再让细胞长2-3天，这时的细胞会退出生长周期，进入growth arrest状态。
2，IBMX的溶解方法有多种，不同文献有不同方法，DMSO，乙醇，浓盐酸，KOH溶液都可，针对你所说的出现结晶问题建议你用1M KOH试试，即0.0115 gIBMX + 940 ul ddh H2O + 60 ul KOH，
3，胰岛素浓度大一点只会促进分化，不会有抑制作用，因为Preadiopocyte细胞膜上胰岛素受体很少，所以需加超过生理浓度的insulin，以其激活细胞膜上的IGF1受体，通过IGF1通路来诱导分化。

作者: 04906 时间: 2012-2-18 17:01

我的细胞尽管长得很快，但我也在怀疑它的状态问题。当细胞长到80－90％是就有一部分细胞变成圆形，轮廓变得不很清楚，而且细胞胞浆里有一些颗粒样的东西使得细胞整个看上去都不十分干净清晰，不知这是不是细胞状态不好的表现？

作者: tudou85 时间: 2012-2-18 17:01

大家的分化现在都做的很好啊！只是这个诱导分化剂的溶解配制好像还是不清楚啊！大家再讨论一下吧！

作者: plaa 时间: 2012-2-18 17:01

我的细胞是从医科院基础细胞中心买的，具体情况可以看一看它的网页：cuturl('http://222.28.160.220/xibaozhongxin/index.htm')。
细胞质量还不错，服务也好，只是价格稍贵了点，而且运费也得自己付！

作者: 小糖块 时间: 2012-2-18 17:02

各位高手，请问为什么3T3-L1加诱导分化液后第2天或第3天会飘起来？我两次诱导后都出现这种情况，应该是怎样的？怎样预防飘浮呢？
整个细胞飘起来后，是否就意味着实验失败？细胞应该不能在继续做了？很着急，急着毕业啊！请各位帮帮忙！

作者: 小糖块 时间: 2012-2-18 17:02

请问大家做诱导时，诱导液浓度应该是什么？我用的是胰岛素1.7微摩（双蒸水配），DEX是1微摩（无水乙醇配），IBMX是0.5mmol/l,用DMSO配，这样配的方法和浓度对吗？为什么又到两次都飘起来呢？
镜下观察细胞接触抑制应该呈现什么特征？我的细胞等接触抑制后好像出现叠层现象，不是单层的。请各位尽快指导！好郁闷啊！

作者: qumm1985 时间: 2012-2-18 17:03

因为3T3-L1加入诱导剂以后，收缩得很厉害，比较脆弱，很容易就飘起来。所以加诱导剂的时候，手法要特别轻，最好用枪头加，不要用移液管，因为移液管家的时候很难控制流速，力度大。用枪头加诱导剂的时候，一定要贴壁加，让液体慢慢留下，这样对细胞的冲击小。我正在做诱导分化，感觉细胞飘起来一小部分的话，还是能用，没有什么大的影响，如果范围比较大的话最好重新诱导。
你的诱导剂的浓度与一般人用的浓度不太一样。IBMX大家一般都是用0.5mmol/L，胰岛素一般都是1-10ug/ml，dex有用0.25，1，10umol/L的。另外，不知道你买的胰岛素是水溶性的吗？因为一般的胰岛素是不溶于水的，但是在酸性环境中溶于水，所以配液时需要加一点稀盐酸使胰岛素溶解。其他两种诱导剂你的配液方法没有问题。
镜下观察细胞接触抑制什么形态？这有什么可说的吗，不就是长满了吗，互相接触在一起了，如果你的细胞出现叠丛现象了，那么就是接触抑制过度了，那细胞就更容易飘起来了。这就需要你自己把握好时机，因为要使接触抑制时间不够的话，细胞没有退出生长周期，诱导剂就不会起作用；如果接触抑制过度的话，细胞很容易就飘起来。你自己需要自己摸索。
祝实验顺利

作者: 小糖块 时间: 2012-2-18 17:03

谢谢，看了您的指导意见，我心理踏实多了。
我的胰岛素浓度时根据两片外文文献上所得，1.7umol,第一次诱导，胰岛素浓度用的是10ug/ml,结果也飘起来了。买的胰岛素 sigma的，可以水溶解，用双蒸水溶的。
那我就重来一次，总结以前的经验教训，试试吧！

作者: 小糖块 时间: 2012-2-18 17:03

请问各位高手，我的细胞诱导后，虽然诱分成脂肪细胞，但好像诱导率并不高，脂肪细胞和成纤维细胞都有，我还要在此基础上给脂肪细胞造模，因细胞不纯，所以不知该怎么办？请问有必要将成纤维细胞和脂肪细胞分离吗？用什么方法分离呢？如何提高其诱导率呢？
还有，如果部分脂肪细胞诱导成功后，就只是隔天换液等待其长满吗？大约多长时间？我发现因其中夹杂前脂肪细胞，所以脂肪细胞还没长满，前脂肪细胞（成纤维细胞）就长得很满了，脂肪细胞长得很慢，应该如何处理？
在既有脂肪细胞又有成纤维细胞时，好像消化时，脂肪细胞不容易消化下来，请问诱导后的脂肪细胞消化条件是什么？有什么特点吗？
期望高手们尽快指点迷津，给我指出方向！！非常感谢！！！！我好着急啊！

作者: 小糖块 时间: 2012-2-18 17:04

请问大鼠关节周长如何测量？用何器具？如何操作？
我带一个同学问问大家，她做实验也很着急，谢谢各位了！

作者: c86v 时间: 2012-2-18 17:04

用10umol盐酸溶解

作者: 社会主义好 时间: 2012-2-18 17:05

Sigma销售的用于细胞培养的胰岛素还有能用双蒸水溶的？我看的资料都说胰岛素不溶于水，只有在酸性环境下才溶
另外，不知各位能否告诉我溶解胰岛素的具体步骤，近几天急需用，多谢帮忙！

作者: shenkunjie 时间: 2012-2-18 17:05

各位前辈，我现在在诱导3T3-L1细胞时遇到一些困难，比如说诱导该细胞分化是在24孔板中好呢还是在六孔板中好一些呢？如何解决在IBMX诱导后细胞脱落悬浮问题等等，另外在实验时选取什么药作为阳性药物，请各位指教，谢谢！

作者: 831226 时间: 2012-2-18 17:07

3T3-L1细胞的诱导分化，在前两天的融合期的时候，确定你用的是DMEM高糖+小牛血清，在细胞高度融合以后才能开始进行第一阶段的诱导（MDI诱导，DMEM高糖+胎牛血清），第一阶段后，细胞中可以观察到细胞已经开始变圆，第二阶段的诱导（insulin诱导，DMEM高糖+胎牛血清），细胞中就可以观察到脂肪滴，进入第三个阶段的诱导的时候，脂肪滴的聚集更加明显。诱导剂如地塞米松是需要乙醇溶解的，IBMX是在一定浓度的KOH溶解的，insulin是在一定浓度的HCL中溶解的，诱导分化的程度也和细胞有关，同为3T3-L1细胞，但是每种细胞的分化能力有很大的差异，在没有进入分化诱导的时候，一定不能用胎牛血清来养细胞！在分化期有少量的细胞出现死亡是正常的！两天进行一次换液，因此一定要小心被污染！祝各位实验顺利！共同学习！

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