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标题: [求助]transwell 做体外侵袭实验膜上没有细胞 [打印本页]

作者: redbutterfly 时间: 2012-2-18 17:08 标题: [求助]transwell 做体外侵袭实验膜上没有细胞

我在用transwell做肿瘤细胞体外侵袭实验,做完后细胞没有穿过胶,膜上没有细胞.
我的实验步骤是
1.将胶和无血气培养基1:4稀释备用
2.将胶4度液化后加75ul铺到小室的膜上.
3.将铺好的小室放到37度培养箱中8小时.
4.消化好细胞,将密度调整到10^5/100ul,加到小室上室.下室加
条件培养液.孵育18 -20 小时.
5.固定,染色.
显微镜下观察发现膜上没有细胞,有哪位大虾做过这个实验的,请帮忙指教啊!

作者: windy+++ 时间: 2012-2-18 17:08

产生这个结果有多种的可能性：
1、可能你的Matrigel的浓度用的有点大了，可以参考文献中别人做你这个细胞时一般用的多少浓度，有的细胞侵袭能力不是很强，浓度大了就过不去，如果没有人做过就只好自己做梯度了；
2、培养时间不够，我将从10h－48h的都有，不同的细胞时间会有所不同；
3、其实是过去了，你没有看到？这个实验做完后是要染色的，不知你有没有做这一步？一般用结晶紫染效果会好一些，染色后把没有穿过的细胞擦掉，再观察穿过膜的细胞。

作者: 园丁## 时间: 2012-2-18 17:09

楼上的朋友讲的很好，我再补充一下：
4。有些细胞本身是没有侵袭力或者侵袭力非常若，即使是肿瘤细胞。建议用酶谱法检测一下MMP-2的活性，或者加用PGE2等明确可以增强侵袭力的药物处理一下。排除细胞本身的原因。这一点很重要，而往往被大家忽视。
5。多重复几次。我有时候用同样的条件，就是没细胞穿过去，真是活见鬼。
6。条件培养液的成分。是否有足够的趋化因子？可以增加浓度或者换用其他趋化因子。建议用浓度高点的血清试试。
7。染色。我用的是结晶紫染色。染色前要将膜风干，不然难以染上颜色。染一次没颜色，可以在风干后再染一次，并延长时间。
8。可以先在镜下看看，如果膜上有细胞的话，镜下是可以看到的，以排除染色的问题。

作者: redbutterfly 时间: 2012-2-18 17:09

我已经将胶的浓度调整了一下。我现在在用1：6的胶40ul试试，结果还没有出来。我准备孵育24小时，甚至更长一点。到时候把结果向大家汇报啊，谢谢大家。

作者: 麦丽素1986 时间: 2012-2-18 17:10

我做的也是这个结果啊，我的Matrigel已经1：10稀释了啊，但是我板底是用Gelatin或者胶原，是不是用FN更好点啊。
顺便问一下，如果用FN的话，包板的浓度是多少啊。

作者: flower-201 时间: 2012-2-18 17:11

the pore size on the transwell is important. Some tumor cells are very big. SO you should choose the approperate pore size. And the attration has to be strong enough. Cell density should not too high.

作者: 麦丽素1986 时间: 2012-2-18 17:11

我用的HMEC-1内皮细胞株，我看了一下，应该不是很大（当然我不能确定），不知道为什么？

作者: 麦丽素1986 时间: 2012-2-18 17:11

另外我还想问一下，一般我们用的transwell孔径是8um的，那有没有12um孔径的transwell板呢，如果有请告知货号，谢谢。

作者: bananapeople 时间: 2012-2-18 17:12

有谁做过粘附抑制实验呢?
MTT法检测还是直接计数粘附细胞比较好呢?另外,也对包被板的Matrigel浓度及时间不大清楚哪,包被后到底是在二氧化碳箱里还是4度冰箱?
请各位大侠多指教!

作者: redbutterfly 时间: 2012-2-18 17:12

谢谢楼上的大侠
我用1：6的胶40ul试了24小时。显微镜下可以看到细胞已经穿过了胶附着在没的小室内表面，但没有穿透到下表面。
我用的是胆管癌细胞，侵袭能力应该还可以。24小时后我发现在小室没面的膜上的细胞都聚成堆，5－10 各一群，细胞和细胞之间有连接。我怀疑是由于细胞聚集后穿膜的能力下降了。有可能是我的细胞的量加的有点多。我之前加的是2×10^5。我准备再用低密度的细胞做一次。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-2-18 17:13

请问楼上,你用的条件培养液是什么?加趋化因子了吗?膜下面有没有涂Fn?

作者: redbutterfly 时间: 2012-2-18 17:13

急～～～
transwell实验怎么都做不出来，没有细胞到小室外膜。请高人指教啊！
我前几次都没有做出来，我最近做了一次没有加胶的，直接加细胞，上室用无血清培养基悬浮细胞，细胞数量为 10^5。下室的诱导因子为 40％的胎牛血清培养基，孵育24小时后看到下室有百来个细胞，但小室的外膜上就是没有细胞。内室用棉签一擦细胞全没有了，不知到什么原因啊！急死人啦。。。。

作者: 吴才子 时间: 2012-2-18 17:14

millipore公司有12微米的我刚定了100个

作者: 吴才子 时间: 2012-2-18 17:14

我现在还没定matrigel BD公司有但想问各位搂主他的浓度是多少(...mg/ml) 我要每膜100微克说明书上没说但matrigel 铺的的厚度说可以是0.5--10mm.

作者: redbutterfly 时间: 2012-2-18 17:14

BD公司的胶是12mg/5ml

作者: BUK 时间: 2012-2-18 17:15 标题: 回复 #15 redbutterfly 的帖子

BD公司的Matrigel应该是是9mg/5ml吧！

作者: mimili_901 时间: 2012-2-18 17:16

我也在做侵袭实验，遇到的问题很相似，就是擦胶的时候会发现，稍一用力，就会把细胞完全擦掉，不知道楼主后来是怎么解决这个问题的呢？有没有什么比较好的，擦胶的方法

作者: 分子式 时间: 2012-2-18 17:16

我用的sigma的ECM，稀释两倍，共50u。8h就很多细胞传过去了。1*10e5. 我准备加大细胞量，这样穿过去的细胞就少一点（不过一直想不通为什么细胞数越少反而穿过去越多？）

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