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标题: [求助]卵巢颗粒细胞的培养 [打印本页]

作者: hulu呼噜 时间: 2012-2-21 15:29 标题: [求助]卵巢颗粒细胞的培养

有那位高人有养过卵巢颗粒细胞的，请帮帮忙！我的细胞养不活，也不知什么原因，没有污染，请帮帮忙！谢谢了！

作者: one 时间: 2012-2-21 15:30

你是怎样养的细胞啊？
你不说出来，我们怎能来帮你找原因啊？

作者: ffooll 时间: 2012-2-21 15:31

第一：哦，我是从老鼠卵巢提取的，然后计数分孔，每空10的5次方，用的是DMEM/F－12培养基，小牛血清10％，整个操作过程严格按照无菌操作进行的。养了两天就很多死亡了，没有污染的。会不会是，原代细胞要求较高，我的血清含量较低？
第二：颗粒细胞是帖壁细胞嘛？好像没有帖壁。
谢谢了，快帮帮忙吧！

作者: one 时间: 2012-2-21 15:33

我们是用SD大鼠的卵巢，提前注射孕马血清。用注射针头将卵泡在解剖镜下刺破，并挤出颗粒细胞。然后在离心管内吹打分散。
我们用的是15％胎牛血清，DMEM培养基。

颗粒细胞是贴壁细胞。但是死的颗粒细胞是不贴壁的。

我注意到你进行了细胞计数，但是没有用台盘兰染色来进行计数。死细胞被台盘兰染成蓝色，而活细胞不被染色。计数时，只计数活细胞数目。死细胞是不贴壁的，所以活细胞的数量才是用来进行接种的参照。
另外，我们用的是15％胎牛血清。你用的是10％的小牛血清。
我分析：主要问题还是出在计数上，次要的是血清问题。

作者: hulu呼噜 时间: 2012-2-21 15:36 标题: 回复 #4 one 的帖子

哦，谢谢。我取细胞方法和你的是一样的。计数也是用台盼栏计数的。那么我的细胞养不活，会不会是血清少的原因呢？

作者: one 时间: 2012-2-21 15:37

你接种的孔是多大的孔？是24孔板还是6孔板？？
如果是6孔板，接种的有点少啊。因为颗粒细胞不分裂，所以接种时候得按照长满的密度来铺板1×10^6 。
如果是24孔板，得2×10^5，试试。
以上所说的必须是活细胞，没有台盘兰着色的才可以计数。

如果还是不行，可以试试换成15％的胎牛血清。
另外，你用的板子是哪里产的？

作者: hulu呼噜 时间: 2012-2-21 15:37

我用的是24孔板的，好像是coster什么的，记得不太清楚了。
我想试试多加些血清看看，谢谢你，真的非常感谢啊！

作者: hulu呼噜 时间: 2012-2-21 15:42

请问你养的细胞状态是不是很好啊？帖壁嘛？现在有的人说颗粒细胞是帖壁的，有的说是悬浮的，我都不懂呢

作者: one 时间: 2012-2-21 15:43

我们养的是贴壁的。但是死细胞较多。
没有计数的时候，只是凭借倒置显微镜观察密度。结果由于死细胞多，细胞状态不好，没有多少贴壁的。
后来，我们计数活细胞数，到1*10^6，接种到6孔板上。细胞就养出来了。我想是因为细胞是“社会性”的。必须到一定的密度，才可以。

作者: hulu呼噜 时间: 2012-2-21 15:44

那你是先把细胞养一段时间，然后才计数的？养了多久再转移到培养版上的，然后细胞长到一定的密度，才有贴壁的？
那在细胞贴壁之前，是怎么换液的？几天换的？
对了，我还有一个问题请教一下，就是在取细胞的时候，室内的温度有没有要求，比如细胞要在37度生活，但是取的过程是在室温，现在冬天比较冷，会不会影响细胞的存活？

作者: one 时间: 2012-2-21 15:50

我们养的是原代，在培养前计数。原代的时候就可以贴壁啦。
我们在室温的情况下养的。温度低应该对大多数细胞有好处。器官运输的时候不都是在冰里的吗？
你试试吹打的时候轻一些。

作者: hulu呼噜 时间: 2012-2-21 15:53

您做细胞有没有提取RNA，做RT-PCR?

作者: dog002 时间: 2012-2-21 15:54

我也养过小鼠的颗粒细胞，原代时贴壁；但传代后贴壁的减少，再次传代后，贴壁细胞逐渐减少，一般传2－3代后，细胞培养失败。
我现在做牛颗粒细胞的培养，相对简单容易多了，跟成纤维一样，较皮实。
所以，我感觉可能由于物种的不同吧。我看到的国外的资料，成功培养小鼠颗粒细胞的也不多。

作者: hulu呼噜 时间: 2012-2-21 15:54

哦，是啊，我看到国外的也是培养猪的颗粒细胞比较多，大鼠或小鼠的比较少。我这段时间又养了一批，总的来说细胞数量很少的，这次比上次血清多些，15％的，先已经养了三天，不会像前两次两天就死了，现在还是有一些活得。
有的地方说颗粒细胞不能传代，楼上的说可以传代，有没有支持的文献呢？可不可以发给我看看呢？谢谢啊！

作者: hulu呼噜 时间: 2012-2-21 16:09

对了，各位大侠，我还有一个问题，就是再提出颗粒细胞后，要不要纯化？要不要鉴定（如淋巴细胞分离）？

作者: qqq111 时间: 2012-2-21 16:09

请问一下高，大鼠卵巢颗粒细胞的镜下形态如何？

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