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标题: [讨论帖]起来分享大家在细胞培养中的“独门秘技” [打印本页]

作者: bongte 时间: 2012-2-22 13:34 标题: [讨论帖]起来分享大家在细胞培养中的“独门秘技”

在细胞培养中，除了常规应该注意的问题，每个人都会有自己的“独门秘技”，不妨拿出来一起分享，一起讨论，一起提高。也不限于细胞培养，如果在其他实验中有什么“独门秘技”，也请拿出来分享。

我先来抛砖引玉，有的是老师教的经验，有些是网上学来的别人的经验，也有自己的心得，说得不对的，请大家指正：

1、不要等一瓶细胞培养液完全用完，才启用第二瓶。最好第一瓶还剩一点时，就启用第二瓶，如果第二瓶培养液有问题（如被污染），不致于毁掉你所有的细胞。
2、不要指望让自己的所有细胞“步调一致”，即在准备用来做实验的几瓶细胞较一致的同时，使另几瓶细胞量有多有少，以确保细胞不致于同时长过了死掉，或同时因瓶内细胞太少没长起来。
3、有时候经验上的“多少瓶细胞长多满能接种多少块培养板”，比细胞计算板来得更可靠，毕竟用细胞计算板计算其实夹杂了太多主观因素。
4、有时遇上长假，又不想把细胞都冻起来（毕竟重新复苏的细胞状态还是要差点），可以把吹打过细胞的吸管的头在新培养瓶的培养液中沾一下，继续培养，一般能保持一个星期以上没有问题。各人可以根据自己的细胞摸索一下。
5、关于胰酶消化贴壁细胞，其活力主要在于浓度。所以我消化细胞时喜欢在倒掉旧培养液后将培养瓶立起来几十秒，吸去流下的培养液，吸极少量胰酶润一润，再吸走，再吸入一点点胰酶消化，轻轻摆动培养瓶，让胰酶浸润到所有的细胞。我试过多种细胞，一般这样消化个一两分钟，就可以吹打了。一般1ml胰酶能消化2～3瓶细胞没问题，而且效果强于倒掉旧培养液后直接滴入1ml胰酶消化10分钟（毕竟倒掉旧培养液后瓶内不止残留1ml旧培养液，再入1ml胰酶，其浓度只有原来的一半）。这是我看到别人的经验后试了下，改了下，不全是我自己的。

欢迎大家参与讨论，有说得好的，请版主不要忘了举举小手手。

作者: 911 时间: 2012-2-22 13:34

谢谢LZ的经验分享！请教一下，我现在在养luc-hepa1-6(一种小鼠的肝癌细胞系)前段时间养的挺好，最近越养越差，不知lz有没有养过这种细胞，有什么要注意的，谢谢！
现在实验什么都准备好了，就是没有细胞，急啊！我消化时用的是0.25%的胰酶约1-2min，10%的DMEM

作者: pengke1983 时间: 2012-2-22 13:35

感谢楼主分享，我也来说两句：
1、细胞是有灵性的，养细胞的过程绝对是对耐心和爱心的锻炼。一种细胞养的时间长了，你会熟悉它的生长规律，比如按多少比例接种几天长至百分之多少，一瓶细胞长至多少时大概有多少个及某种细胞喜偏点儿酸还是偏点儿碱等等。而它会熟悉你的操作手法，比如消化后吹打的力度等等。总之，要想实验有好的结果，一定要人等细胞而不可细胞等人。状态再好的细胞，不经心的培养（长过没有及时传代或者消化不足吹打剧烈或消化过头等等）也得玩儿完；
2、任何细胞在短期不用而需常规传代时，最好是两瓶步调不一致的细胞同时养着，以防污染或操作有误，又得重新复苏甚至绝种；
3、如果一瓶细胞是由极少数细胞甚至单个细胞生长起来的，会形成一个或者几个细胞克隆，待克隆长至足够大时（这个因细胞而异）就应该消化下来重新接种，否则会因局部过密，细胞越长越小，状态也会不好；
4、谈到细胞消化，我个人喜欢在显微镜下看着（多看几个视野），待细胞间隙即将打开，细胞有变圆趋势时就迅速拿进超净台，吸出胰酶，用培养基终止消化，消化适度是吸管一吹，细胞呈“流沙状”下来，而不是整片细胞全部脱落。当然，这个过程，这个“流沙状”还得根据不同细胞来摸索具体时间。而且这个时间也是不定的，与细胞代次（老化程度）、上次消化程度等都有关；
5、在均匀铺板方面，6孔板以上呈十字交叉型晃动（动作轻柔、力度一致）。24孔板先加入一定体积培养基，再将高浓度细胞悬液打入孔内，不要太慢。96孔板用排枪将细胞悬液贴壁轻轻慢慢打入就挺匀了。（个人经验，仅供参考）

先想起这么多。多多交流！

作者: bongte 时间: 2012-2-22 13:37

谢谢LZ的经验分享！请教一下，我现在在养luc-hepa1-6(一种小鼠的肝癌细胞系)前段时间养的挺好，最近越养越差，不知lz有没有养过这种细胞，有什么要注意的，谢谢！
现在实验什么都准备好了，就是没有细胞，急啊！我消化时用的是0.25%的胰酶约1-2min，10%的DMEM

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“请教”不敢当，一起交流。您这种细胞我没养过，但细胞株一般都还是比较好养的。既然前段时间养得挺好，又没有污染，只是状态越来越差，我建议先将血清加到15%（甚至20%），过段时间细胞长皮实了，再换回10%。同时注意下培养液的pH，而且再急也不要天天去看它，可以隔天看一眼，视具体情况处理就行。细胞拿出培养箱时不要忘了把盖拧紧，放回去时也不要忘了把盖拧松。不要着急，准备工作本来就很费时费力，同时又很重要，真正上实验也就那么一会儿，从复苏细胞到真正做实验花一两个月时间很正常，如果是原代培养更费时间。
祝好运！

作者: bongte 时间: 2012-2-22 13:37

感谢楼主分享，我也来说两句：
1、细胞是有灵性的，养细胞的过程绝对是对耐心和爱心的锻炼。一种细胞养的时间长了，你会熟悉它的生长规律，比如按多少比例接种几天长至百分之多少，一瓶细胞长至多少时大概有多少个及某种细胞喜偏点儿酸还是偏点儿碱等等。而它会熟悉你的操作手法，比如消化后吹打的力度等等。总之，要想实验有好的结果，一定要人等细胞而不可细胞等人。状态再好的细胞，不经心的培养（长过没有及时传代或者消化不足吹打剧烈或消化过头等等）也得玩儿完；
2、任何细胞在短期不用而需常规传代时，最好是两瓶步调不一致的细胞同时养着，以防污染或操作有误，又得重新复苏甚至绝种；
3、如果一瓶细胞是由极少数细胞甚至单个细胞生长起来的，会形成一个或者几个细胞克隆，待克隆长至足够大时（这个因细胞而异）就应该消化下来重新接种，否则会因局部过密，细胞越长越小，状态也会不好；
4、谈到细胞消化，我个人喜欢在显微镜下看着（多看几个视野），待细胞间隙即将打开，细胞有变圆趋势时就迅速拿进超净台，吸出胰酶，用培养基终止消化，消化适度是吸管一吹，细胞呈“流沙状”下来，而不是整片细胞全部脱落。当然，这个过程，这个“流沙状”还得根据不同细胞来摸索具体时间。而且这个时间也是不定的，与细胞代次（老化程度）、上次消化程度等都有关；
5、在均匀铺板方面，6孔板以上呈十字交叉型晃动（动作轻柔、力度一致）。24孔板先加入一定体积培养基，再将高浓度细胞悬液打入孔内，不要太慢。96孔板用排枪将细胞悬液贴壁轻轻慢慢打入就挺匀了。（个人经验，仅供参考）

先想起这么多。多多交流！

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你说得挺好，“一定要人等细胞而不可细胞等人”和几瓶细胞“步调不要一致”这几点我也深有体会。请问您说的“6孔板以上呈十字交叉型晃动”是指晃动盛细胞悬液的容器吗？我都是在铺板时边用左手拿移液管轻轻吹打，右手种板，铺出来还算均匀，力度掌握好了对细胞状态也影响不大。“24孔板先加入一定体积培养基，再将高浓度细胞悬液打入孔内”这个方法还是第一次听说，下次我也来试试。

作者: one 时间: 2012-2-22 13:38

6孔板以上呈十字交叉型晃动是指晃动盛细胞悬液的容器。这几种铺板方式也是自己经过摸索总结出来的至少是对自己比较适用的方法，呵呵。以前听人说铺完96孔板在4个角磕磕就匀了，结果那叫一个不匀，看来此方法不适合我。

多多交流！

作者: bongte 时间: 2012-2-22 13:38

1、不要等一瓶细胞培养液完全用完，才启用第二瓶。最好第一瓶还剩一点时，就启用第二瓶，如果第二瓶培养液有问题（如被污染），不致于毁掉你所有的细胞。
同意
2、不要指望让自己的所有细胞“步调一致”，即在准备用来做实验的几瓶细胞较一致的同时，使另几瓶细胞量有多有少，以确保细胞不致于同时长过了死掉，或同时因瓶内细胞太少没长起来。
同意
3、有时候经验上的“多少瓶细胞长多满能接种多少块培养板”，比细胞计算板来得更可靠，毕竟用细胞计算板计算其实夹杂了太多主观因素。
不同意。如果计数板夹杂太多主观因素，那你说的主观因素就更多了，细胞也就没法计数了。

不好意思，是我没表达清楚。心里是想说在“多少瓶细胞长多满能接种多少块培养板”的一个经验值基础上再用计数板计数。算是“双保险”吧，哈哈。说得欠妥，多谢指正。

4、有时遇上长假，又不想把细胞都冻起来（毕竟重新复苏的细胞状态还是要差点），可以把吹打过细胞的吸管的头在新培养瓶的培养液中沾一下，继续培养，一般能保持一个星期以上没有问题。各人可以根据自己的细胞摸索一下。
这样看是什么细胞了，vero还可以，其它的，需要高营养的，细胞失去细胞间连接，直接over掉。

当然只适用于部分种类的细胞，所以我说“各人可以根据自己的细胞摸索一下”嘛。

5、关于胰酶消化贴壁细胞，其活力主要在于浓度。所以我消化细胞时喜欢在倒掉旧培养液后将培养瓶立起来几十秒，吸去流下的培养液，吸极少量胰酶润一润，再吸走，再吸入一点点胰酶消化，轻轻摆动培养瓶，让胰酶浸润到所有的细胞。我试过多种细胞，一般这样消化个一两分钟，就可以吹打了。一般1ml胰酶能消化2～3瓶细胞没问题，而且效果强于倒掉旧培养液后直接滴入1ml胰酶消化10分钟（毕竟倒掉旧培养液后瓶内不止残留1ml旧培养液，再入1ml胰酶，其浓度只有原来的一半）。这是我看到别人的经验后试了下，改了下，不全是我自己的。
这么麻烦，你为什么不用PBS、或无血清培养基清洗一遍？这样不就避免残留的含血清培养基影响胰酶的消化能力了吗？（胰酶的消化能力还和pH和温度有关）

胰酶消化能力确实也会受到pH、温度等影响，但我们一般都不会为了消化刻意去改变pH和环境温度。用PBS或无血清培养基清洗后最好还是要把瓶子立起来十来秒，然后吸走残液再加胰酶，不然胰酶的浓度同样要被稀释，因为残液往往都不止1ml，将1ml胰酶加进去，浓度只剩一半了。

多谢参与讨论！

作者: vvmmoy 时间: 2012-2-22 13:39

LZ说到细胞计数板是个相当主观的方法。我也觉得如是。真正又圆又透明的细胞不是经常能遇到，而真正被染蓝了的细胞也不是经常能遇到。常常看到的细胞可能形状不规则，有时会以为它是被吹打过度造成的烂细胞；有时会看到一些细胞不那么透明，细胞膜里好像充满了颗粒一样，但是调一下显微镜的焦距后这些细胞又变得稍微透明了一些，不像被染成蓝色的样子。这些细胞我也会把它规入活细胞内。
不知各位在细胞计数时遇到的情况怎样？

作者: nn255 时间: 2012-2-22 13:39

请教各位！我在六孔板上铺的细胞，细胞贴得可以，但培养液pH值上升很快很高，最后细胞不长都死了，试了几次都这样，但同时分得细胞在细胞培养瓶里好好的，大家有没有遇到这样情况？

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-22 13:39

想请教两个问题：
1、原代神经胶质细胞培养时可不可以用0.25%Trysin-EDTA代替0.25%Trysin+0.1%胶原酶1型？
2、原代神经胶质细胞培养时需要用滤网过滤吗？用多少目的合适？
请有经验的战友不吝赐教！

作者: xingyi08 时间: 2012-2-22 13:40

可是有的细胞如果养得太稀，会因为细胞之间缺少联系而很快就死掉啊！不知道LZ想过没有

作者: bongte 时间: 2012-2-22 13:40

可是有的细胞如果养得太稀，会因为细胞之间缺少联系而很快就死掉啊！不知道LZ想过没有

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不仅想过，我还做了，所以才把它当一个经验。不过我做过的细胞毕竟种类有限，有的细胞行，有的不行，所以各人可以根据自己的细胞摸索一下。马上要过年了，这几天抓紧试试，难说能帮自己过个好年。上两天还看到有个站友要把细胞带回家里养呢，各种尝试都值得鼓励啊。

作者: tianmei001 时间: 2012-2-22 13:41

先加培养基，再加细胞悬液，一边同时振荡，加细胞时转圆圈，这样比较均匀。

作者: 00无名指00 时间: 2012-2-22 13:41

请教一下，有的说细胞稀了不好长，有的说密了怕营养不好，那半悬浮细胞平时换液后要不要把细胞吹均匀还是尽量不动它？谢谢。
我养的骨髓瘤km3细胞，状态一直不佳，着急呀。

作者: bongte 时间: 2012-2-22 13:42

请教一下，有的说细胞稀了不好长，有的说密了怕营养不好，那半悬浮细胞平时换液后要不要把细胞吹均匀还是尽量不动它？谢谢。
我养的骨髓瘤km3细胞，状态一直不佳，着急呀。

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您换液时候离心吗？如果离心了当然要吹打。如果是换液时丢弃部分培养液，我建议您拿准备丢弃的那部分细胞悬液摸索一下，传到两个培养瓶中，一瓶吹打，一瓶不吹打，过两天看状态就行了。如果您的细胞喜欢成团的话，最好吹打一下，单个悬浮应该就不用吹打了。再说，细胞状态不佳的原因很多，不一定是吹不吹打引起的，您可以自己多摸索一下。即使是同种细胞，别实验室的条件到了您这也不一定好使，还有很多未知因素。

祝好运！

作者: gemei0115 时间: 2012-2-22 13:43

1、细胞培养的准备工作一定要做充分，最好准备至少两套高温高压消毒后的物品，做新的操作时先检点所有的东西是否准备齐全，比如配液时的滤器，分装所用的容器是不是足够等等。
2、所有实验物品，包括自己配的液体和购买的产品，都要标记清楚（比如名称，PH值、时间、还有自己的名字，如果是共用一个冰箱的话这一点很重要）。
3、冻存的物品尽量避免反复冻融，如果无法避免，也要尽早分装，一次用完。
4、细胞计数在开始培养时很有必要，但计数次数多了经验估计法也是很好的办法，必竟每次计数也不是那么精确，而细胞培养对计数也不是那么要求严格。

作者: october7 时间: 2012-2-22 13:43

请教各位！我在六孔板上铺的细胞，细胞贴得可以，但培养液pH值上升很快很高，最后细胞不长都死了，试了几次都这样，但同时分得细胞在细胞培养瓶里好好的，大家有没有遇到这样情况？

我有如下疑问，希望对您有帮助：
1 您用的六孔板是新的吗？予试过吗？不同厂家的质量差别很大！
2 您用的是CO2细胞培养箱吗？箱内CO2浓度如何？检测过吗？我的经验是箱内CO2浓度一定要用专门的仪器进行测定。
3 CO2细胞培养箱的门没有关闭。

作者: october7 时间: 2012-2-22 13:43

将我的一点细胞培养方面的经验拿出来与各位讨论：
1 操作细胞的环境应该经过确认是洁净的，特别注意支原体！
2 细胞培养用的所有液体均应证明可用！
3 不同细胞应避免在同一环境同时操作，极易造成污染！
4 无论哪种传代细胞都应在其早代阶段建库，以免绝种！另外，随着细胞代次的升高，其特性是必要发生改变，后果就是影响实验进程！故，选择适宜代次细胞进行试验很重要。
5 一瓶细胞培养用液体尽量不要反复使用，这将增大污染机率。可用的办法即是将其分装成适当规格，一次用1瓶。
6 各种液体的pH最好是现用现调，特别是在密闭培养时，很重要！
7 CO2细胞培养箱内CO2浓度一定要用专门的仪器进行测定。
8 细胞培养板要用质量好的；若重复使用，一定洗刷干净，灭菌彻底！
9 细胞培养板或瓶若要摞在一起的话，注意在箱内不要超过3层，否则，中间的会受热不均，严重影响细胞质量，可造成细胞生长不均匀，可能造成中间稀少，四周密集。
一点经验，但愿有用！

作者: plaa 时间: 2012-2-22 13:44

一博士告诉我铺24孔板的方法：先按自己需要加好细胞及培养基后用移液器垂直于板孔中央轻轻吹打两次即可，我试了一下效果不错，比十字交叉摇的效果好。

作者: vcve 时间: 2012-2-22 13:44

本实验室细胞培养系统5年来未发生重大污染细菌或其他大事故，关键在于成熟而严格的细胞培养操作规范，在此特别提醒战友们注意设备维护（也是与以上战友不同之处），还有很多细节不能一一叙述，欢迎提问：

无菌操作注意事项
1.进入无菌室应脱掉外套和鞋子，换上无菌室的隔离衣和拖鞋。
2.进入无菌室的人员不应过多。没有工作和学习任务者应离开无菌室。
3.进行无菌操作前注意先用新洁尔灭洗手套，然后喷淋75%酒精。物品放入超净台前也应先用新洁尔灭擦拭，再喷淋酒精，玻璃制品还应用酒精灯火焰烧烤。
4.用显微镜观察活细胞前，应该用酒精棉球擦洗载物台。如果观察的细胞培养皿、瓶或板较多，将细胞放在超净台内。不可将细胞培养器皿放在没有防护的台面上，以防细菌污染。
5.活细胞进入或离开无菌室，必须进行包装（可用铝箔、灭过菌的报纸），禁止直接运输裸露的培养器皿。如将培养器皿敞开照相或者裸露拿离无菌室后，不得再放入培养箱。
6.工作结束后应清理超净台，用新洁尔灭擦洗台面，将多余物品取出，打开超净台紫外灯。无菌室内的多余物品应及时取走。
7.培养箱内不用或者污染的细胞要及时清理。
8.培养箱的使用请参考二氧化碳培养箱的使用方法与注意事项。
9.水浴锅内添加的水是桶装三级蒸馏水，添加10ml新洁尔灭，每周值日生应更换水和新洁尔灭。
10.配好的培养液应在一个月内用完(冷藏保存)，PBS应不超过一星期（常温保存）。
11.不清楚的问题，应向其他同学请教，不可擅自处理。

二氧化碳培养箱使用方法与注意事项
1．未经维护人员许可，不得调节培养箱、减压器和钢瓶上的任何设置。
2．使用此培养箱者，请认真阅读此说明。
3．培养箱中托盘内必须有水，如果缺水请加入1000ml常温的已经灭菌的蒸馏水，并加入5ml新洁而灭。缺水会导致CO2浓度偏低，损伤细胞。紧急情况下，可用已经灭菌的常温的PBS代替水，在有水后置换掉PBS。严禁使用温度高于37℃的水，否则可能损伤细胞。
4．CO2读数降为0后请立即关掉培养箱电源，并通知维护人员。在37℃，CO2浓度为0时，细胞在大约20小时内全部死亡。在常温下，CO2浓度为0时，细胞在48小时后仍然存活。因此，在无CO2时，应关闭电源，以降低温度，保护细胞。
5．CO2读数为5.0％，温度为37.0℃，减压器低压表为0.03MP，若发现异常请通知维护人员。
6．培养箱的无菌处理：
（1）每月用新洁而灭（0.1%）擦拭箱内壁和支架一次，每3个月箱内照射紫外线30分钟一次，每年拆除箱内支架包括风扇清洗一次。清洗培养箱时应将细胞转移至超净台，关闭超净台紫外，打开风机。
（2）发现箱内有洒落的培养液后，立即用泡过新洁而灭的抹布擦除。
（3）培养箱内的细胞、无菌实验瓶（皿）应注明使用者姓名、日期，使用期限应不超过7天，否则易长菌。如需超期使用，请提前向值日生说明。值日生有权利和义务检查培养箱内所有的培养器皿，以清除污染源。

维护人员工作参考
1．培养箱的启用
（1）用新洁而灭擦拭箱内壁和支架、风扇
（2）接通电源，设定CO2浓度为5.0，温度37℃，温度应该用高精度温度计校准。参数设置方法请参阅说明书。
（3）在托盘内加1000ml常温的已经灭菌的蒸馏水，并加入5ml新洁而灭
（4）6小时（或更长）后，观察CO2读数是否为0，如果不是0，请将读数设为0。如果读数是0，进行下一步。
（5）接通CO2。
2．CO2减压器和钢瓶的使用
（1）在接收到钢瓶，放在无菌室后，应该用湿抹布将钢瓶外表灰尘擦净。应使用食品级CO2，或高纯级CO2。一般情况下使用食品级CO2就能达到要求，可节约经费。
（2）强力推荐使用上海减压器厂有限公司生成的YQTS-711型双级式CO2减压器，价格约430元，可上网搜索。普通单级减压器在停电后可能会使低压持续上升，造成培养箱胶管爆裂或松脱漏气。
（3）钢瓶的启用：将CO2减压器旋钮逆时针调至无应力的自由旋转状态；将减压器安装在钢瓶上，连接处二者的轴线应该重合（可用左手托住减压器，右手拧紧罗帽），否则易漏气。用扳手拧紧罗帽，如有空间位阻，可暂时拆除钢瓶手动阀，之后重新安装钢瓶手动阀。打开钢瓶阀门，至少要旋转2圈（720°）用肥皂泡检测连接处是否漏气。
（4）启用CO2减压器：顺时针拧动减压器旋钮，使低压表指针上升至0.03MP。在随后的6小时内，低压表压力会持续下降，因此应再次调节旋钮，使之保持在0.03MP。因此应该尽量避免在晚上调节减压器。
（5）工作期间长期监视：随使用时间延长，钢瓶压力（高压表）从约7MP持续下降，这会导致低压表压力持续上升，因此应将低压表压力调低，使之保持在0.03MP。
（6）一瓶气体约用1个月（每天开关门100次左右）-3个月（每天开关门10次左右），如果明显少于此时间，应该检查培养箱内和培养箱外气体管路是否漏气。

作者: newway 时间: 2012-2-22 13:45

谢谢LZ的经验分享！请教一下，我现在在养luc-hepa1-6(一种小鼠的肝癌细胞系)前段时间养的挺好，最近越养越差，不知lz有没有养过这种细胞，有什么要注意的，谢谢！
现在实验什么都准备好了，就是没有细胞，急啊！我消化时用的是0.25%的胰酶约1-2min，10%的DMEM

“ 请教”不敢当，一起交流。您这种细胞我没养过，但细胞株一般都还是比较好养的。既然前段时间养得挺好，又没有污染，只是状态越来越差，我建议先将血清加到 15%（甚至20%），过段时间细胞长皮实了，再换回10%。同时注意下培养液的pH，而且再急也不要天天去看它，可以隔天看一眼，视具体情况处理就行。细胞拿出培养箱时不要忘了把盖拧紧，放回去时也不要忘了把盖拧松。不要着急，准备工作本来就很费时费力，同时又很重要，真正上实验也就那么一会儿，从复苏细胞到真正做实验花一两个月时间很正常，如果是原代培养更费时间。

不太同意加血清的方法，癌细胞系10%一般已经是比较高了，原来长的很好而后来不太好了，很多情况下与培养条件有关，比如培养瓶，是不是一次性的，如果是，可能这一批质量不够好，如果不是，检查一下是不是瓶清洗的不好，如里面是否有残存的细胞渣，或流水清洗不充分；再比如是否是新换的一批培养基，尤其是否新换血清了，这种情况比较多见，如果是建议换一批好点的血清，等等，应该多找找这些方面的原因。再有一种情况就是是否有支原体或酵母菌污染。

作者: newway 时间: 2012-2-22 13:45

说一点细胞消化的经验
1.用EDTA消化对细胞损伤相对较小，尤其是消化较过的时候，因为EDTA只针对细胞间的相互作用，而不针对蛋白。
2.消化时的操作手法也很重要，吹打应尽量轻柔，尽量避免泡沫产生
3.对于难消化的细胞可以EDTA与胰酶合用，比例需要模索

作者: fsdd817 时间: 2012-2-22 13:45

我养过小鼠心肌细胞、人脐血管内皮细胞和肝癌细胞，其中肝癌细胞是从上海买的。其它的是自己做的。感觉内皮细胞不好养，其他都还行。
经验曾经总结过一些，但年头久了，现在已记不起来了。

作者: mickeylin 时间: 2012-2-22 13:46

说得都很有道理啊，每个人所在实验室条件还有惯用的方法都不一样，所以适合自己的就是好方法，大体套路一样，个中细节还得自己体会。
在这里想问各路同仁一下：有没有用组织冻存管冻细胞的啊，我们实验室剩了很多以前师兄师姐们留下的组织冻存管，我拿来试着冻了一下细胞，冻了两个星期之后我拿出来复苏，细胞活性还可以。或者长期冻细胞的话还是用细胞专用的冻存管比较好？

作者: ququer787 时间: 2012-2-22 13:46

不错不错,感谢各位啊,这么好的帖子.
但是,养细胞时细心和耐心也很重要,脾气太急的人一般细胞养不好的.

作者: 8964357 时间: 2012-2-22 13:47

一博士告诉我铺24孔板的方法：先按自己需要加好细胞及培养基后用移液器垂直于板孔中央轻轻吹打两次即可，我试了一下效果不错，比十字交叉摇的效果好。

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先试试看。垂直吹打，不容易污染么？

细胞铺板的时候，如何让细胞铺得均匀些？

我一般都是加好细胞到孔中，然后，水平放在超净台左右前后晃动数下。但是次日后发现，细胞还是四周密，中间稀。

作者: 33号 时间: 2012-2-22 13:47

养细胞2月了，看了这个专版受益很大，我们消化贴壁的细胞时用的是0.25%胰酶+0.04%EDTA，倒掉培养基后用pbs涮一下培养瓶，轻轻甩干，加入2ml胰酶，立刻拿到镜下观察，细胞皱缩，有少量细胞飘起时立刻加入0.5ml血清终止消化，反复吹打使其从壁上脱落，收集到离心管后再镜下观察培养瓶，如果壁上还有少量细胞再加入pbs吹打，刚开始做实验，消化时倒掉培养基后没有用pbs冲洗，也没有把瓶子甩干，直接加入胰酶后，消化很不充分，壁上最后还贴了很多细胞。试验就是这样，慢慢失败慢慢摸索，才能找到适合自己的所谓的真理。

作者: 101010 时间: 2012-2-22 13:48

我原来在国内养细胞，发现戴手套后能大大减少污染的几率。现在我在加拿大做实验，看到这里手套的使用率非常高，任何实验的操作，都要求戴手套，是那种橡胶手套。这里细胞培养间条件一般，也不换大衣和鞋。另外也没有酒精灯，就是不污染。
不过还是有几项需要注意：
1.戴手套拿细胞及进行实验操作。
2.水浴锅内用纯净水，同时加入水浴锅专用的防腐剂（蓝色，国内也有卖的，一次加入可以坚持1-3个月）。
3.不放心的物品用75%酒精喷淋消毒。
4.还有一个是国内不具备的，这里空气相对好些，即使很长时间不打扫卫生也没有多少灰尘。
5. 各种仪器有专人维修检测。

作者: ALALA 时间: 2012-2-22 13:48

推荐一个超净台除废液的小装置。

以前在国内时孤陋寡闻没见过，现在用的超净台都有这个装置，既方便快捷又使废液相对隔离，降低污染几率。

小瓶顶上的管子连出去是个小真空泵。大瓶里的废液定期倒掉并洗净，小瓶起缓冲作用，保护真空泵。铁盒里是高压过的一次性玻璃巴氏吸管作为吸头，也可用其他代替（pipet or tips）。

使用时安个吸头，开真空泵，enjoy it。

图片附件: 22947101.jpg (2012-2-22 13:48, 50.59 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10845

作者: yhz1973 时间: 2012-2-22 13:49

非常好哦看了这个帖子觉得国内现在这个细胞培养水平不是几年前可以比的经费充足的话就尽量用一次性的吧不管是培养液还是培养瓶还是管子重复用的是可以但是很难避免污染有些实验室做病毒比如慢病毒腺病毒啥的这个时候污染就不是很明显了到时候真污染了头大的很
细胞培养多做做就熟了谁都可以做谁都可以成为培养高手哈哈

作者: 831226 时间: 2012-2-22 13:49

不知各位前辈们对以下几个问题有没有心得分享一下啊？
1.我的培养基变碱性变得很快，缓冲加的是碳酸氢钠+HEPES，坚持不了几天，颜色就变了，用这种培养基在培养瓶里呆上4天以上也还是原来的颜色，不过细胞都还在。
2.对于支原体的感染有什么好方法吗？
感谢各位大虾的不吝赐教！！

作者: chuntian1983 时间: 2012-2-22 13:49

我养的是HaCaT细胞，状态总不稳定，经常会长出很多细胞碎片状的东西，细胞长得很慢。有谁碰到过这种情况吗？

作者: S6044 时间: 2012-2-22 13:50

不过我个人来说，到还是比较认同增加血清的看法
就我个人养HEK293的经验看，这个细胞贴壁很慢，也很不牢固。由于要筛选稳转细胞，从一个细胞长起，慢慢扩大，每次扩大的原始细胞数目都很少，所以希望传代扩大的时候细胞尽可能多的活下来。
如果用10%的血清培养刚传代细胞，细胞贴壁要两天以上才完全铺展开，而且贴壁率不高，但如果我额外增加到30%的血清培养，原来不贴壁的细胞基本上都可以很快的贴壁。下一次换培养液的时候，直接换成10%或者5%的血清都没问题，照样活得很好。

作者: bongte 时间: 2012-2-22 13:50

是啊，我在多种细胞上都尝试过增加血清的方法，效果都还不错。当然，boyflour提到的培养瓶的清洗、血清质量、污染等因素确实也应当注意到。

作者: yapuyapu 时间: 2012-2-22 13:51

5、关于胰酶消化贴壁细胞，其活力主要在于浓度。所以我消化细胞时喜欢在倒掉旧培养液后将培养瓶立起来几十秒，吸去流下的培养液，吸极少量胰酶润一润，再吸走，再吸入一点点胰酶消化，轻轻摆动培养瓶，让胰酶浸润到所有的细胞。我试过多种细胞，一般这样消化个一两分钟，就可以吹打了。一般1ml胰酶能消化2～3瓶细胞没问题，而且效果强于倒掉旧培养液后直接滴入1ml胰酶消化10分钟（毕竟倒掉旧培养液后瓶内不止残留1ml旧培养液，再入1ml胰酶，其浓度只有原来的一半）。这是我看到别人的经验后试了下，改了下，不全是我自己的。

欢迎大家参与讨论，有说得好的，请版主不要忘了举举小手手。

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消化时，我一向把旧培养液收在管里，消化完后用它过一下瓶。这样可以终止消化，减少胰酶残留。

作者: qumm1985 时间: 2012-2-22 13:51

感谢楼主分享，我也来说两句：
1.培养细胞需要一定的耐心，本人做了两年多细胞培养的工作，基本上是每天都要去观察它们的生长状态（没有培养时除外），实验操作包括实验前的准备工作也从来不敢懈怠，这样才能把细胞真正养好。
2.关于细胞点板的问题，对于有一定经验的战友来说，可以像楼主说的那样做，但对于新手来说，最好还是用细胞计数板进行计数，等到细胞消化下来吹匀后，将少量细胞悬液吸取到指型管中，台盼蓝染色进行计数，计数时每个大格中的细胞数不宜过多，最好在10-20左右，这样可以保证计数的可靠性。点板的过程中最好一边混匀，96孔板点好后通常不需要混匀，只要适当振摇即可，而24孔板点好后需要对每个孔用移液器吹打几下，显微镜下观察均匀后既可。
3.培养瓶中细胞加药时，最好不要将移液器体部伸入到培养瓶中，可以将药液轻轻加到靠近瓶口的壁上，然后将培养液慢慢回流将药液带下去。
4.细胞复苏时所用的水最好调至37-42度之间，这样可以避免细胞从液氮中取出过程中引起水温下降的影响，本人所在的实验室刚开始没有液氮罐，冻存细胞需要放在别人的实验室，虽然温度调节时也将温度调至37度偏高一些，但细胞还是受到了影响，存活率只要50%左右。
5.贴壁细胞消化传代时，本人不赞成离心这一步，离心的主要目的是去掉胰酶，但本人觉得可以在消化前加入PBS溶液洗涤细胞，再加入胰酶，显微镜下观察细胞消化快完成后吸去胰酶，加入培养液终止消化即可以，我一直按照此方法培养细胞，细胞状态很好。
6.一批实验结束后，培养着的细胞应该弃去，因为代数过多细胞的性状会发生变化，另外，每次实验刚开始时可以将部分细胞冻存起来，这样可以解决细胞的来源问题。
以上只是本人的一些个人观点和实验心得，如有不到之处请各位高手指出！谢谢！

作者: zwsyrt 时间: 2012-2-22 14:18

大家讨论的这么激烈，确实受益匪浅啊！
to 蔓瓜：你好！我种板时情况正好和你的相反，不管是6孔还是12孔都是中间多周围少，严重不均，很是给接、费解，希望多多交流！先谢啦！

作者: wsll 时间: 2012-2-22 14:18

各位师兄师姐大家好作为一个从未养过细胞的新手来说
开始培养细胞前最需要注意的是哪些问题啊
希望各位师兄师姐把自己刚入手的时候的经验教训普及一下
我们这些新手不胜感激！

作者: TNT 时间: 2012-2-22 14:19

学习了，谢谢！
有个问题：配制的RPMI 1640培养基如何分装于-20度冻存，是否还可以使用，可以冻存多久？

作者: 黄花菜 时间: 2012-2-22 14:19

对于新手来说，首先要熟悉培养细胞前的一些准备工作，包括培养液、胰蛋白酶、PBS缓冲盐等溶液的配制，培养器皿的洗涤（下碱以及下酸），高压灭菌的方法等。
其次是在有经验的师兄师姐操作时，认真用心的观摩几次。
最后自己操作时一定要有耐心，不要紧张，在刚开始的一段时间中不要养太多细胞，两到三瓶即可。

作者: 黄花菜 时间: 2012-2-22 14:20

1.将配制好RPMI 1640培养基用量筒进行定量分装于盐水瓶中，定量的目的是便于使用时添加血清。
2.然后放至负20度保存，使用前放至室温下融化，然后过滤，再添加血清。
3.三个月内使用，中间不要反复冻融。

作者: eric930 时间: 2012-2-22 14:21

消化时我是先把培养液倒掉，然后用PBS洗两遍再倒掉，然后加胰酶。这样可以尽量减少血清对胰酶消化能力的影响

作者: fsdd817 时间: 2012-2-22 14:21

想请教两个问题：
1、原代神经胶质细胞培养时可不可以用0.25%Trysin-EDTA代替0.25%Trysin+0.1%胶原酶1型？
2、原代神经胶质细胞培养时需要用滤网过滤吗？用多少目的合适？
请有经验的群友不吝赐教！

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我养的是新生小鼠的原代神经胶质细胞,用的就是0.25%Trysin-EDTA,也有用滤网,用的是200目的.

作者: fsdd817 时间: 2012-2-22 14:23

不仅想过，我还做了，所以才把它当一个经验。不过我做过的细胞毕竟种类有限，有的细胞行，有的不行，所以各人可以根据自己的细胞摸索一下。马上要过年了，这几天抓紧试试，难说能帮自己过个好年。上两天还看到有个站友要把细胞带回家里养呢，各种尝试都值得鼓励啊。

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请教一下，带回家里怎么养细胞啊？不能污染吗？

作者: S6044 时间: 2012-2-22 14:23

推荐一个超净台除废液的小装置。

以前在国内时孤陋寡闻没见过，现在用的超净台都有这个装置，既方便快捷又使废液相对隔离，降低污染几率。

小瓶顶上的管子连出去是个小真空泵。大瓶里的废液定期倒掉并洗净，小瓶起缓冲作用，保护真空泵。铁盒里是高压过的一次性玻璃巴氏吸管作为吸头，也可用其他代替（pipet or tips）。

使用时安个吸头，开真空泵，enjoy it。

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谢谢分享，不过废液瓶放在超净台里有些占地方，看着不大舒服，不知是为了倒液方便还是其它用途~ 国内和现在的美国一实验室都是放在超净台外的地面上，预先倒入一些消毒液，只是吸液管通入超净台内。

作者: bongte 时间: 2012-2-22 14:24

请教一下，带回家里怎么养细胞啊？不能污染吗？

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你可以看看这个贴子的讨论，哈哈
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=13587880&sty=3&keywords=%B4%F8%BB%D8%BC%D2')

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-2-22 14:24

请问有用过DMEM/F12的吗？本人新手，此前看园子里有人说这个培养基比较容易黄，可加HEPES或NaHCO3调一下，买之前问过销售人员，对方说已加HEPES，直接用就行，可是回来一加血清，颜色马上就黄了，用来养细胞也是，第二天颜色就比第一天黄，请问我需要再加点缓冲剂吗？另：我见到的别人都是在配制培养基的时候加，我买的是现成的液体培养基，如果要加HEPES或NaCHO3该怎么加？请高人指点一下，非常感谢！

作者: whitesheep 时间: 2012-2-22 14:24

养小鼠成纤维细胞一段时间了，在这和大家分享一下细胞传代中的消化的经说一点细胞消化的经验
1.我们一般用和胰酶共同消化，这样对细胞损伤相对较小，而且易消化下来。一般加一滴管酶，消化约20秒，就把酶吸掉了，然后让残存的酶继续消化约3分钟（不好把握的话，就在显微镜下观察，等细胞回收变圆时就可以了。）。这样一般不会消化过度，造成细胞死亡。
2.消化时的操作手法也很重要，一般时吹打两三次，然后转动培养瓶混匀冲洗，这样可以避免泡沫产生。
3.EDTA与胰酶合用，用的是0.25% 的胰酶和0.02%的
4.另外我是收集冲洗三四次，再用离心机离心的，个人觉得到细胞更好贴壁。（不离心的也做过，但贴壁没有离心的好，可能是EDTA影响吧！）
经验不足之处，希望大家指出。

作者: lagua123 时间: 2012-2-22 14:25

养细胞有一段时间了，说说我们实验室的一些细节：
1、co2培养箱最底层放一容器加硫酸铜液体，还有在水浴锅里加适量硫酸铜液体，离心用的调节液体中也加适量的硫酸铜，都是为了除菌。
2、我们浙中大细胞室，一般上超净台时先用75%酒精擦一遍双手，然后点上酒精灯，开始准备实验用具。听浙大同学说他们做细胞都是戴上橡胶手套的。我们不戴，细胞污染的几率也是非常稀见的。
3、培养板我们实验室不用国产的，一般是用进口的好。这点是师兄提醒的。
4、在超净台上抽完培养液，一般要将新的培养液入小瓶子里在培养箱培养3天以上，看看有没污染。
5、还有我要对楼上的说一点看法，如果消化液里有加EDTA的，应该要加离心这步，有一次我样大鼠SMC时，用0.15%胰酶+0.02%EDTA消化，没有离心，细胞养几代状态很差。因为血清不能终止EDTA消化，残余EDTA会影响细胞贴壁。所以我建议离心这步。

作者: duoduo 时间: 2012-2-22 14:26

请问有养原代腹膜间皮细胞的吗，我养了2次都没细胞贴壁，请指教一下啊，多谢！

作者: 阿敏 时间: 2012-2-22 14:27

对细胞株有的时候血清多少并不直接影响细胞生长，血清质量也很重要，使用GIBCO胎牛血清和四季青的胎牛血清分别培养HepG2细胞，可能会认为不是同一细胞
（不过四季青的便宜，培养大多数细胞株也都还挺不错的）
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不过我个人来说，到还是比较认同增加血清的看法
就我个人养HEK293的经验看，这个细胞贴壁很慢，也很不牢固。由于要筛选稳转细胞，从一个细胞长起，慢慢扩大，每次扩大的原始细胞数目都很少，所以希望传代扩大的时候细胞尽可能多的活下来。
如果用10%的血清培养刚传代细胞，细胞贴壁要两天以上才完全铺展开，而且贴壁率不高，但如果我额外增加到30%的血清培养，原来不贴壁的细胞基本上都可以很快的贴壁。下一次换培养液的时候，直接换成10%或者5%的血清都没问题，照样活得很好。

作者: dog002 时间: 2012-2-22 14:28

请教各位！我在六孔板上铺的细胞，细胞贴得可以，但培养液pH值上升很快很高，最后细胞不长都死了，试了几次都这样，但同时分得细胞在细胞培养瓶里好好的，大家有没有遇到这样情况？

我有如下疑问，希望对您有帮助：
1 您用的六孔板是新的吗？予试过吗？不同厂家的质量差别很大！
2 您用的是CO2细胞培养箱吗？箱内CO2浓度如何？检测过吗？我的经验是箱内CO2浓度一定要用专门的仪器进行测定。
3 CO2细胞培养箱的门没有关闭。

我也遇到这种情况，培养瓶里养的细胞好好的，可24孔板里养的细胞就不行，养着养着就开始死了，就变成半透明的那种。条件都一样，不知道什么原因造成的?

作者: 二丫头466 时间: 2012-2-22 14:30

防止交叉污染，我们老师一再的强调。
听说现在细胞间的交叉污染很严重，所以如果一个实验室养两种以上的细胞的话就要小心咯……所需的用品最好分开用……

作者: dongdongqiang 时间: 2012-2-22 14:30

在细胞培养中，除了常规应该注意的问题，每个人都会有自己的“独门秘技”，不妨拿出来一起分享，一起讨论，一起提高。也不限于细胞培养，如果在其他实验中有什么“独门秘技”，也请拿出来分享。

我先来抛砖引玉，有的是老师教的经验，有些是网上学来的别人的经验，也有自己的心得，说得不对的，请大家指正：

1、不要等一瓶细胞培养液完全用完，才启用第二瓶。最好第一瓶还剩一点时，就启用第二瓶，如果第二瓶培养液有问题（如被污染），不致于毁掉你所有的细胞。
2、不要指望让自己的所有细胞“步调一致”，即在准备用来做实验的几瓶细胞较一致的同时，使另几瓶细胞量有多有少，以确保细胞不致于同时长过了死掉，或同时因瓶内细胞太少没长起来。
3、有时候经验上的“多少瓶细胞长多满能接种多少块培养板”，比细胞计算板来得更可靠，毕竟用细胞计算板计算其实夹杂了太多主观因素。
4、有时遇上长假，又不想把细胞都冻起来（毕竟重新复苏的细胞状态还是要差点），可以把吹打过细胞的吸管的头在新培养瓶的培养液中沾一下，继续培养，一般能保持一个星期以上没有问题。各人可以根据自己的细胞摸索一下。
5、关于胰酶消化贴壁细胞，其活力主要在于浓度。所以我消化细胞时喜欢在倒掉旧培养液后将培养瓶立起来几十秒，吸去流下的培养液，吸极少量胰酶润一润，再吸走，再吸入一点点胰酶消化，轻轻摆动培养瓶，让胰酶浸润到所有的细胞。我试过多种细胞，一般这样消化个一两分钟，就可以吹打了。一般1ml胰酶能消化2～3瓶细胞没问题，而且效果强于倒掉旧培养液后直接滴入1ml胰酶消化10分钟（毕竟倒掉旧培养液后瓶内不止残留1ml旧培养液，再入1ml胰酶，其浓度只有原来的一半）。这是我看到别人的经验后试了下，改了下，不全是我自己的。

欢迎大家参与讨论，有说得好的，请版主不要忘了举举小手手。

作者: am10 时间: 2012-2-22 14:30

我这周一（090302）进的细胞实验室，到今天整7天，从一无所知，到错误不断，犯了的时候我都不敢说，估计我养的那两瓶MG63早就污染了，到现在有了一点小体会。
1 超净工作台上的物品摆放要合适自己的习惯，取东西的时候老是十字交叉，极易污染，而且不便。但现在还没有找到合适我的方式。
2 一切开口瓶上方不要有东西飘过，可我就是不能避免。
3 吸走培养基的培养瓶我给躺着放（我想不然贴壁的细胞都下来了），后来被批了，极易污染，要立着放。
4 暂时不用的东东往远处放，我的周围都是器械，老觉得没有操作空间。
5 滴管把胶头的时候口儿要冲外，一开始我就冲着别人，被批！
6 一个字一定要记在心头——烧！

看了前辈们的经验收获很多！继续关注中~~~~

作者: whitesheep 时间: 2012-2-22 14:31

标号要标到培养皿底部

作者: pencil菲 时间: 2012-2-22 14:31

上面大家说的都很好！
顶一个！
想问一个简单的问题
胰酶消化细胞
或者单细胞的生物
比如原生动物
可以把细胞完全消化死吗？
如果时间浓度足够的话

作者: skytree 时间: 2012-2-22 14:32

肯定能吧！
不死也是重伤了~
一般胰酶消化一分钟左右的就要终止消化了
我一般的做法是：在加入胰酶后轻轻敲打培养皿底部，加快细胞的收缩，时间差不多了就加入少量含血清的培养基终止消化，仔细吹打，细胞就基本上都能下来。

作者: lagua123 时间: 2012-2-22 14:32

看了大家的讨论，还有前辈们的个人经验总结，我觉得这个形势很好，希望有更多用经验的人来此发言，我是刚刚开始学习培养细胞，我们没有师兄师姐的经验可以拿来参考，但是，可以说，这个开拓养细胞道路的重任，我觉得还是有很多收获的吧。自己体会各种滋味，哪里有困难就往哪里钻。

作者: leifengta 时间: 2012-2-22 14:32

3 吸走培养基的培养瓶我给躺着放（我想不然贴壁的细胞都下来了），后来被批了，极易污染，要立着放？

请教高手是这样的吗？

作者: HPLC使者 时间: 2012-2-22 14:33

我的经验是：
黑胶虫一说纯属胡扯，绝不存在这样的生物
建议所有怀疑自己细胞感染了“黑胶虫”的筒子们都做个支原体检测，很简单设计两对引物做PCR就行。

作者: 3648755 时间: 2012-2-22 14:33

3 吸走培养基的培养瓶我给躺着放（我想不然贴壁的细胞都下来了），后来被批了，极易污染，要立着放？

请教高手是这样的吗？

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如果你的超净台风是从上往下吹的，那绝不能立着放
不要相信超净台的空气过滤器

一定要躺着放，它在培养箱里怎么放，在台子上就怎么放

谁批的你？

作者: moonlight45 时间: 2012-2-22 14:34

因为我是在学习，带我做的学长批我，我就接受了，原来还有风向这个区别在里面啊！那我要再次请教一下我们实验室的大“牛”了，而且要确认一下风向。

近来又犯了一些错误，大家看看是不是哈！
1 细胞传代：一开始的是原代，传一次，标签是一代，不是二代。因为我想一传代不就是第二代了吗！后来说是这样分的，原代细胞，一代，二代~~~~~
2 老是紧张，手总是抖，一定不要怕！吸培养基的滴管不能碰到其他的东西，以免污染整瓶培养基。拿滴管的时候要四指握柄，大拇指摁胶头，这样会稳点。
3 传代时，加了胰酶后放到一边，进行下一瓶的换液，以提高实验的速度。因为有时候老师等那瓶消化，确实浪费时间，如果多的话，时间也不够用。
4 在熟悉操作步骤后，加快速度！

我只是做了细胞的复苏，换液，传代，其他的还没有接触过啊！后面的体验回继续总结的！

作者: am10 时间: 2012-2-22 14:34

我交流一个经验，就是我们实验室在水浴锅旁边放了一打消毒小毛巾（也可以用小纱布代替），温育好的培养基拿出来之后就这个毛巾擦干，这样，避免把水浴锅的水（很容易有菌）带到细胞操作间去，另外这样也避免水流滴答的，把擦干后的培养基瓶子拿到细胞操作间，然后用酒精喷一下，就可以放到操净台上了！

作者: junhun 时间: 2012-2-22 14:35

5、关于胰酶消化贴壁细胞，其活力主要在于浓度。所以我消化细胞时喜欢在倒掉旧培养液后将培养瓶立起来几十秒，吸去流下的培养液，吸极少量胰酶润一润，再吸走，再吸入一点点胰酶消化，轻轻摆动培养瓶，让胰酶浸润到所有的细胞。我试过多种细胞，一般这样消化个一两分钟，就可以吹打了。一般1ml胰酶能消化2～3瓶细胞没问题，而且效果强于倒掉旧培养液后直接滴入1ml胰酶消化10分钟（毕竟倒掉旧培养液后瓶内不止残留1ml旧培养液，再入1ml胰酶，其浓度只有原来的一半）。这是我看到别人的经验后试了下，改了下，不全是我自己的。

看了前辈的经验本人受益匪浅，方法不错，准备下次试一下。养了1个多月的细胞每次传代都消化不好，今天传了两瓶（倒掉培养基，pbs冲洗两遍，1ml0.25%胰酶+0.02%EDTA消化1分30秒中止消化吹打）发现有大量的细胞没有消化下来，最后原来那瓶也没舍得扔加了培养基继续养不知道应该算哪代？

作者: dragonkilly 时间: 2012-2-22 14:35

前天第一次自己给细胞换液，因为怕污染，看到有说在酒精灯火焰上过一下瓶口根本没有杀菌效果，所以死劲地烧瓶口，忘记了培养瓶可是塑料的~~~结果瓶口被我烧变形了~~~（忘记了哲学老师曾经教导过我们：具体问题具体分析）自己第一次独立处理的细胞当然不舍得扔掉，当机立断，拿了新培养瓶，胰酶，准备消化了细胞换培养瓶继续培养，结果消化细胞时消化过度，随胰酶倒掉好些细胞~~~第二天早早地到实验室看我的细胞，发现被我折腾了半天的细胞长势还不错~~~心里一阵窃喜~~~今天中午到了实验室就发现培养基有点浑浊，心里一紧张，结果镜下看到杆状的黑色会动的不知道是何物的鬼东西~~~~~肯定是污染了~~~~~下午换液时加了抗生素，不知道还能不能救得回来~~~~我的第一次操作细胞，以失败告终，好生郁闷~~~~以后一定要潜心专研，关注细节，用心做事。。。
等有了经验再来分享。。。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-2-22 14:36

如何判断培养的细胞长的好坏?在培养细胞时用倒置显微镜观察发现有结晶是什么原因？
谢谢！

作者: plaa 时间: 2012-2-22 14:36

请教：
我培养的是骨髓瘤KM3细胞株，前一段时间状态尚可，成团，但细胞边界不是很清楚（相对我们实验室此细胞来说培养状态已算好了）。
昨日去看的时候发现4瓶细胞突然细胞单散，边界皱缩，好生惊奇和着急。仔细回想有什么可疑之处，唯一不同的就是我那瓶培养基用完了，昨天换液用的别人的，他的培养基只是颜色比我的稍红点(我们用的都是相同的培养基和血清,只是各自分），并且他的细胞没什么很大变化。
不知什么原因导致细胞状态突然变差，个人认为无菌操作应该没有问题。急需细胞做实验，毕业在即，心急如焚！请指教，谢谢！

作者: fqswdzd 时间: 2012-2-22 14:36

做实验一定要细心，严格按照要求做，还要多动脑子。我也要开始实验，准备培养细胞，希望顺利！

作者: duoduo 时间: 2012-2-22 14:37

说一点细胞消化的经验
1.用EDTA消化对细胞损伤相对较小，尤其是消化较过的时候，因为EDTA只针对细胞间的相互作用，而不针对蛋白。
2.消化时的操作手法也很重要，吹打应尽量轻柔，尽量避免泡沫产生
3.对于难消化的细胞可以EDTA与胰酶合用，比例需要模索

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轻柔很了总觉得吹打不均匀。。。

作者: S6044 时间: 2012-2-22 14:37

最近在养MDA-231，细胞状态不好，总有很多圆形的细胞不贴壁，而且细胞生长也很慢。不知道咋回事呀。望高手多给点意见哈。谢谢

作者: 缘yuan 时间: 2012-2-22 14:38

每个实验室的条件很不相同，因此要选择适合自己的方法做，只要实验能做出结果来，有效就可以了啊！方法再好，条件不允许也是没辙啊！

作者: KGZ564 时间: 2012-2-22 14:38

请教各位！我在六孔板上铺的细胞，细胞贴得可以，但培养液pH值上升很快很高，最后细胞不长都死了，试了几次都这样，但同时分得细胞在细胞培养瓶里好好的，大家有没有遇到这样情况？

提出一点自己的看法：
是否在细胞接种板时，接种密度过大，导致细胞生长所需的营养成分不够。

作者: tangxin_80 时间: 2012-2-22 14:39

真高兴遇到这么多高人啊！
我做的是兔的胸主动脉的内皮细胞，用师姐交的方法，用铺盖针把血管翻过来，2型胶原酶37度消化15分钟，但是就是消化不下来细胞啊。加长消化时间到30分钟，还是不行，就是没有细胞。但是师姐说以前她们做的就是这样消化的。真不知道问题在哪儿。

各位高人，我还是个新手，请多多赐教啊！

作者: fklo83 时间: 2012-2-22 14:39

很高兴能和大家一同学习一同进步
我有一小段经历与大家分享
我培养的是脂肪来源的干细胞(有同道中人,请与我多沟通),出现过几次细胞污染,弄的我很恼火,起初以为是培养液或操作的问题,可后来作了几次,还是污染. 后来找了好多专家分析,可能是我的实验动物出了问题,我养的是SD大鼠的脂肪细胞,有可能大鼠全身感染了支原体,起初,镜下培养皿内细胞周围及细胞上可见小黑点,越来越多,最后,变成了长条形,象小蚯蚓,这时,细胞生长特别慢,最终,培养液变浑浊,细胞逐渐死亡。
解决该问题的方法有：1、换动物。
2、如果细胞珍贵，可以用大环内脂类抗生素（如红霉素）或阿奇霉素进行抢救，“死马当活马医”，我救过来几次。

作者: guagua 时间: 2012-2-22 14:40

每个人所在实验室条件还有惯用的方法不一样，所以适合自己的就是好方法，大体套路一样，个中细节要自己体会。

作者: moonlight45 时间: 2012-2-22 14:40

我的培养基用的是RPMI1640干粉配制的，以前没有调过PH，现在测pH居然是8.5，我是否需要调pH呢？能用盐酸调吗？不知道CO2能缓冲多少？请大家指教！

作者: cocacola 时间: 2012-2-22 14:41

细胞培养基如果PH偏碱可以拧开盖子在培养箱里放15~20分钟

作者: ladyhuahua 时间: 2012-2-22 14:41

各位前辈好，都说成纤维细胞好样，但是我养了一个多月了还是不成形。。。目前细胞形态基本是梭型，但体积很小，增值也慢，像请教下可能是什么问题，怎么解决？

作者: wsll 时间: 2012-2-22 14:42

看完了，发个言，
关于培养瓶横着放竖着放的问题，个人认为咋放都行，别管风向，我的超净台是垂直风，我的培养基是垂直放，一旦开盖，直到实验终点都不盖盖子，培养瓶横着竖着放都做过，过灯和不过灯都试过，从来没有污染，当然是有诀窍的：注意瓶口，病从口入，只要瓶口注意了，就不用怕！第一次培养的时候我用了快30根吸管，就因为不小心碰到了不该碰的地方，或者忘记了这根管是干什么呢，幸亏我当时高压的多，现在几根就够了。

一点感慨：下多大功夫，就收获多大；饭不好吃，只是因为没有做好！细胞不好，只因为没养好！

作者: star#room 时间: 2012-2-22 14:42

楼上说的一点没错，各项操作做好了，细胞要想污染也是很难的。

作者: feima+ 时间: 2012-2-22 14:43

谢谢LZ的经验分享！请教一下，我现在在养luc-hepa1-6(一种小鼠的肝癌细胞系)前段时间养的挺好，最近越养越差，不知lz有没有养过这种细胞，有什么要注意的，谢谢！
现在实验什么都准备好了，就是没有细胞，急啊！我消化时用的是0.25%的胰酶约1-2min，10%的DMEM

“ 请教”不敢当，一起交流。您这种细胞我没养过，但细胞株一般都还是比较好养的。既然前段时间养得挺好，又没有污染，只是状态越来越差，我建议先将血清加到 15%（甚至20%），过段时间细胞长皮实了，再换回10%。同时注意下培养液的pH，而且再急也不要天天去看它，可以隔天看一眼，视具体情况处理就行。细胞拿出培养箱时不要忘了把盖拧紧，放回去时也不要忘了把盖拧松。不要着急，准备工作本来就很费时费力，同时又很重要，真正上实验也就那么一会儿，从复苏细胞到真正做实验花一两个月时间很正常，如果是原代培养更费时间。

不太同意加血清的方法，癌细胞系10%一般已经是比较高了，原来长的很好而后来不太好了，很多情况下与培养条件有关，比如培养瓶，是不是一次性的，如果是，可能这一批质量不够好，如果不是，检查一下是不是瓶清洗的不好，如里面是否有残存的细胞渣，或流水清洗不充分；再比如是否是新换的一批培养基，尤其是否新换血清了，这种情况比较多见，如果是建议换一批好点的血清，等等，应该多找找这些方面的原因。再有一种情况就是是否有支原体或酵母菌污染。

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对，我同意楼上的观点，我们现在养的肝癌细胞，用的是5%的血清，细胞生长速度和生长状态都还不错。细胞状态不好了，有可能是培养瓶没洗干净，我们就遇到过着这种情况。再有就是血清的质量问题。这都比较关键。

作者: feima+ 时间: 2012-2-22 14:43

看完了，发个言，
关于培养瓶横着放竖着放的问题，个人认为咋放都行，别管风向，我的超净台是垂直风，我的培养基是垂直放，一旦开盖，直到实验终点都不盖盖子，培养瓶横着竖着放都做过，过灯和不过灯都试过，从来没有污染，当然是有诀窍的：注意瓶口，病从口入，只要瓶口注意了，就不用怕！第一次培养的时候我用了快30根吸管，就因为不小心碰到了不该碰的地方，或者忘记了这根管是干什么呢，幸亏我当时高压的多，现在几根就够了。

一点感慨：下多大功夫，就收获多大；饭不好吃，只是因为没有做好！细胞不好，只因为没养好！

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同意！我们一开始也是用好几根吸管，现在如果换个液什么的都不用吸管，直接口对口倒！也从来没有污染过！关键是操作之前操作之后瓶口都要烧！绝对没问题！

作者: feima+ 时间: 2012-2-22 14:44

3 吸走培养基的培养瓶我给躺着放（我想不然贴壁的细胞都下来了），后来被批了，极易污染，要立着放？

请教高手是这样的吗？

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就是，谁批的你啊？我们超净台的风是由下往上吹的，可以防止灰尘细菌掉落，所以培养瓶躺着放就可以。不过即便是立着放，贴壁细胞也不会掉下来的，没那么容易掉下来的。

作者: xingyi08 时间: 2012-2-22 14:45

都是很好的帖子，受教了，我很快也要开始养A549了，师兄养了一两个月都老出状况，没成功过，搞得我现在蛮紧张的。

作者: mickeylin 时间: 2012-2-22 14:45

都是很好的帖子，受教了，我很快也要开始养A549了，师兄养了一两个月都老出状况，没成功过，搞得我现在蛮紧张的。

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没有那么难的，不用紧张，细心些，耐心些，注意无菌，好好照顾细胞就行。慢慢就会摸出点门道来的。

作者: is2011 时间: 2012-2-22 14:46

看了那么多人都说了自己在细胞培养过程中的心得体会，我也说说我自己的，养细胞快半年了，从师姐、师兄那里学到了一些经验，自己也总结了一些，和大家分享一下：
1、放在四度的培养液、PBS、胰酶等在用之前，都需先放到超净台里照半个小时紫外，我们实验室都将这些东西装在玻璃瓶里，不用担心会被紫外破坏。这样既可以起到杀菌作用，又能让培养液、PBS等升至室温。
2、细胞间一般都会有大紫外，用来给细胞间杀菌，我们实验室大紫外的开关是设在细胞间外面的，所以，每次进去之前都要确定大紫外是否关了。有发生过没关大紫外就进去的情况，我有个同学，是另外一个实验室的，被照了两次，每次都照了超过一个小时，这对身体伤害是十分巨大的。还有就是开大紫外的时候一定要把日光灯给关了，否则，一是杀菌效果大减，二是万一没关大紫外进去，很难发现。
3、细胞间要定期大扫除，保持细胞间的清洁。
4、东西从超净台外面进入超净台都应该喷70%酒精消毒。
5、超净台里面的东西放置要符合自己的习惯，一切以安全，方便为原则。
6、条件好的实验室，手套用一次性的，要穿消毒的衣服。条件不够的实验室，手套可以重复使用，但是，每次都要照紫外杀菌后才能用，没有专门衣服的，最好带一个消毒好的袖套，这样也能减少染菌。
7、关于细胞消化，我用的方法和上面一位战友的差不多，就是将旧培养液倒掉之后，用PBS洗一次，然后加1mL胰酶，将全部细胞浸润后就将胰酶倒掉，这时，如果你不清楚消化时间，可以盖好盖子，拿到显微镜下观察，看到大部分细胞都变圆，细胞间隙逐渐清晰的时候，就说明消化完全了。这时，我们会用手握住瓶子，重拍两三下，细胞就都下来了，也就像前面一位战友说的“流沙状”。再加1mL培养液终止就好了。新的细胞一般最好镜检一下，消化几次后就会知道大致的时间，就可以省掉镜检这一步了。
8、养成好习惯，及时将染菌的细胞或者不要的细胞拿出细胞间，以免贻害无穷。

能想到的暂时只有这些，以后有再想到的再补充。欢迎大家积极讨论，分享大家细胞培养的经验

作者: 兔唇 时间: 2012-2-22 14:46

看到好多战友在说培养瓶的放置问题，我的那两瓶细胞最终都很好！

不过我个人感觉，开口的培养瓶还是竖着放好。到了后来吸管用的越来越少了，培养瓶就充当了放吸管的功能！

我们细胞室养的细胞品种不多，现在我已经能很熟练地养细胞了！

初学者只要多用心，勤总结，做细胞前做足功课！细胞们就会快快活活的生长的！
战友和细胞们！五一快乐！

作者: yueban-1147 时间: 2012-2-22 14:47

我现在养SP2/0细胞，刚拿回来时时用10%小牛血清培养的，拿回来后我用的是胎牛血清。一开始状态还可以，但是最近不知道为什么，有些细胞的形状竟然很奇怪，像伸出伪足一样的，不再很圆很亮，有点类似于贴壁细胞的形态。形状改变的细胞有的变成梭形，有的变成海星状。这样的细胞亮度不高，体积比较大。小声问一句，是不是细胞返祖了？
这是什么原因呢？绝对不是其他的细胞污染，是不是跟培养基PH值，用力吹打有关系？
还有SP2/0细胞是不是很脆弱，拿出来观察其状态，过不了几分钟状态就不好了。大家有这种情况吗？大概要2个半月以后才用这个细胞，我有必要把它冻起来么？谢谢大家！

作者: 987789 时间: 2012-2-22 14:47

我还有一个问题，我养的是半贴壁的细胞，传代后原来的培养瓶仍部分细胞继续培养，但是状态不是很好，是不是细胞培养瓶（玻璃的，不是一次性的）不能用时间太久啊？

作者: 987789 时间: 2012-2-22 14:47

因为我是在学习，带我做的学长批我，我就接受了，原来还有风向这个区别在里面啊！那我要再次请教一下我们实验室的大“牛”了，而且要确认一下风向。

近来又犯了一些错误，大家看看是不是哈！
1 细胞传代：一开始的是原代，传一次，标签是一代，不是二代。因为我想一传代不就是第二代了吗！后来说是这样分的，原代细胞，一代，二代~~~~~
2 老是紧张，手总是抖，一定不要怕！吸培养基的滴管不能碰到其他的东西，以免污染整瓶培养基。拿滴管的时候要四指握柄，大拇指摁胶头，这样会稳点。
3 传代时，加了胰酶后放到一边，进行下一瓶的换液，以提高实验的速度。因为有时候老师等那瓶消化，确实浪费时间，如果多的话，时间也不够用。
4 在熟悉操作步骤后，加快速度！

我只是做了细胞的复苏，换液，传代，其他的还没有接触过啊！后面的体验回继续总结的！

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兄弟，我也是刚开始接触细胞实验，从4月9号到今天已经一个月了，一开始每小时都要被师姐骂，心里很是不服，当然自己确实错了不少，现在渐渐的一天只被师姐骂一次啦，要不断进步，以后两天才被骂一次，再一个礼拜才被骂一次哈哈。共同进步。

作者: DNA 时间: 2012-2-22 14:48

最近又接触了一些养细胞以外的实验，比如制作切片，爬片，染色等，过程太慢了！还没有什么经验可以总结。

由于较长时间没有养细胞，后来发现培养箱里的有几瓶已经污染了，，拿出来甩了！对于那些传代多的细胞不能再传了，也用不到了，有不舍得扔，还要节省经费，就那样放着也不好！还是当初实验的时候没有计划好，造成了现在的情况啊！

作者: DDD 时间: 2012-2-22 14:48

可是有的细胞如果养得太稀，会因为细胞之间缺少联系而很快就死掉啊！不知道LZ想过没有

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LZ说的那个方法，细胞不会太稀，我做单克隆的时候是10cm dish 里中二三十个细胞，要是怕细胞因为太稀死掉，可以用同种细胞的大量培养的培养基与新鲜培养基1：1去培养。

作者: DDD 时间: 2012-2-22 14:49

一博士告诉我铺24孔板的方法：先按自己需要加好细胞及培养基后用移液器垂直于板孔中央轻轻吹打两次即可，我试了一下效果不错，比十字交叉摇的效果好。

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反正十字交叉摇，不适合我，我摇了之后细胞全聚集到中间来了...
下午试一下这个方法。

作者: 中国特色 时间: 2012-2-22 14:49

我养的是滑膜细胞，贴壁，梭形。我发现养了段时间有时候皿底会有白色点点，会不会是细胞团块啊，觉得也不是很像污染，细胞状态和原来差不多。另外，想问问是不是状态好的细胞一定不会有空泡和黑点点，我的细胞常会出现黑点点、空泡。会不会有些细胞本来就是有黑点和空泡？？？谢谢

作者: plaa 时间: 2012-2-22 14:50

消化前，你用不用DPBS洗

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