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标题: [求助]这个SKOV3怎么了？感觉在一层细沙上生长 [打印本页]

作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:36 标题: [求助]这个SKOV3怎么了？感觉在一层细沙上生长

这个细胞之前是师兄在养的，感觉是生长的很快，但是他6月冻存之后，我9月从低温冰箱，液氮罐中都有复苏，但是发现复苏之后的细胞贴壁的很少，于是我只好把几瓶的放在一起，离心之后重新加入培养液，才勉强好一点，但是接下来就是噩梦啊……

生长很缓慢，以前是3--4天就可以传代的，可是现在就连1一个月都可能不能消化。好不容易终于可以传代了，发现细胞半天都消化不下来，甚至都放到培养箱内10分钟，20分钟了，还是消化不下来，那些能消化下来的那些，冻存起来后，在复苏，也几乎不贴壁。

细胞背景内的黑点越来越多，感觉好像是细沙一样，使用PBS洗，消化，离心之后，换了新的培养瓶养，能好转一点，但是过不留了几天，情况还是样子，而且悦来越糟糕，细胞慢慢开始变得很奇形怪状，然后就开始裂解。然后就死了……

细胞的说明书上写着是要McCoy's 5a 来培养的，但是师兄是使用的1640+10%新生牛血清+双抗（青霉素+链霉素---终浓度100u/ml）来培养，他们说那时候也挺好的，可是不知道现在是怎么了，复苏之后变这样半死不活了。

打电话问细胞公司，他们说培养液有影响，可是也有别的师兄说没有影响，所以到底是怎么会是呢？？

有哪位也遇到过这样的情况吗？
使细胞老了？
培养液的关系？？？
还是污染了？？？？

着急啊！！！！请各位帮帮忙！

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作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:36

有没有谁养过这个细胞的？能不能传一下照片啊，我找不到这个细胞的照片，包括在ATCC 上。这样我好对比一下啊！！谢谢

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作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:37

细胞的形状也奇奇怪怪

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作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:37

我已经不知道怎样才是正常的样子了

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作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:38

这个应该是已经裂解了吧

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作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:38

整个背景都是沙沙的，很脏的，但是培养液却没有看到什么浑浊，基本上算是干净的，只是偏黄

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作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:39

这个也刚从细沙状的那个细胞里消化下来的细胞，一两天之后也开始了裂解……

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作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:40

没有人遇到过这样的问题吗？到底是怎么了？是细胞的问题？污染？还是血清的问题啊？？

请各位高手支招啊！谢谢了

作者: 831226 时间: 2012-2-22 15:40

可能是支原体污染；细胞交叉污染；血清质量不好。

需要检测。我们这里的SKOV3状态很好。背景很清晰，没有一个小黑点。

作者: pencil菲 时间: 2012-2-22 15:41

我前一阵遭遇了一场污染，估计是培养液的问题，当时细胞本来很正常，后来发现镜下看到培养液中有一层细沙样的沉淀，移动培养瓶时可以看到像水中的沙子一样飘动，稍微晃一下有肉眼可见的白色细沙洋沉淀在瓶底，用PBS洗了两次可以了，可是次日又出现了，大概是第3天吧，高倍镜下可以观察到细胞核碎裂脱出（头1、2天看不出细胞的变化），后来就彻底不行了，而且可怕的是会影响到培养箱里的其他细胞的，你仔细观察一下，特别是细胞核，如果和我的情况很像，那就是污染了，赶紧把细胞扔了，绝对不要舍不得，原则上同一培养箱里所有细胞都要放弃，彻底灭菌的。我第一次就彻底灭菌了一次，后来误用了原来的培养液又有2瓶出现，第一时间扔了，还好目前其他细胞没有发现污染。一般这种污染培养液出问题的可能性稍大一点。当然，我还是希望你的细胞不要和我的悲惨经历一样，呵呵

作者: pencil菲 时间: 2012-2-22 15:41

你的照片和描述不太清楚，细胞状态不好有小黑点还要和黑胶虫鉴别一下，丁香园上有很多关于黑胶虫的讨论，你可以看一下。如果细胞在培养瓶里长了1个月还没有传代，那细胞肯定会老化的，老化的细胞形态会发生一定的变化。我还是怀疑污染的可能性大一点。

作者: xingyi08 时间: 2012-2-22 15:41

我现在也在养SKOV3，暂时没有照片，感觉形态差不多，我也出现过这种情况，是污染了，你在高倍下看，这些细沙状的黑点动不动呢？

作者: 大白菜 时间: 2012-2-22 15:42

你用的培养基是自己配的还是买的液体啊？
检查过培养基么？

作者: hold住 时间: 2012-2-22 15:42

可能是支原体污染我现在和你遇到的问题很像细胞突然之间就长成这样了据说可以试试用环丙沙星如果可以把黑点去掉就可以确定是污染

作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:43

培养液是使用干粉配制的，使用之前都检测过的。

细沙状的黑点在高倍镜下好像也没有看到运动。不过我的另一个帖子里面的7404 的是运动的黑点。

我不知道要怎么和黑胶虫来鉴别，我之前看了在论坛关于黑胶虫的帖子了，但是没有图片，很难辨别的。

支原体的话，可能是什么原因造成的呢？之前看到论坛里有人说，血清内可能含有支原体，那时血清中很常见的，而且是无法透过滤膜来过滤的，如果真的是的话，我们就麻烦了，而且每次买来的血清都会因为批次不同而有影响，这样的话，该怎么办呢？目前我们这里一般是使用杭州四季青的啊，我听说过外国进口的血清也有出现过类似情况的。所以实在是不知道该怎么办？还有那里的血清的质量好一点的吗？

作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:43

可能是支原体污染我现在和你遇到的问题很像细胞突然之间就长成这样了据说可以试试用环丙沙星如果可以把黑点去掉就可以确定是污染

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环丙沙星的剂量是多少？会对一一般的肿瘤细胞有影响吗？？？你们使用的双抗是什么呢？？？？多大浓度啊？

作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:43

我前一阵遭遇了一场污染，估计是培养液的问题，当时细胞本来很正常，后来发现镜下看到培养液中有一层细沙样的沉淀，移动培养瓶时可以看到像水中的沙子一样飘动，稍微晃一下有肉眼可见的白色细沙洋沉淀在瓶底，用PBS洗了两次可以了，可是次日又出现了，大概是第3天吧，高倍镜下可以观察到细胞核碎裂脱出（头1、2天看不出细胞的变化），后来就彻底不行了，而且可怕的是会影响到培养箱里的其他细胞的，你仔细观察一下，特别是细胞核，如果和我的情况很像，那就是污染了，赶紧把细胞扔了，绝对不要舍不得，原则上同一培养箱里所有细胞都要放弃，彻底灭菌的。我第一次就彻底灭菌了一次，后来误用了原来的培养液又有2瓶出现，第一时间扔了，还好目前其他细胞没有发现污染。一般这种污染培养液出问题的可能性稍大一点。当然，我还是希望你的细胞不要和我的悲惨经历一样，呵呵

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细胞已经扔了，因为已经坏死了，郁闷啊，情况和你说的很像，不过有没有白色沙洋沉淀，我就没有太留意，印象中没有看到培养液的混浊，而且情况的恶化早期不很明显，只是长的慢了，才引起我的注意，不够最近就看到镜下的细胞如图所示，变得有黑点，脏，就算换液也是当时好一点，第二天照旧，俄日且细胞变得很难消化下来。细胞慢慢裂解，惨不忍睹！

这个情况会影响别的细胞吗？我的别的细胞生长好像也慢了，背景倒是没有细沙状，但是黑点似乎也很多……尤其是细胞核上，看到的总有黑点，然后细胞出现空泡，不知道是细胞老了，还是因为污染导致的细胞的变化。

请问你是怎样彻底灭菌的？我说的是包括培养箱在内的所有的灭菌，希望可以分享一下，一般我只是使用75%的酒精来擦拭，或者喷培养箱和超净台，超净台实验之前还紫外消毒半小时……所有的清洗，消毒瓶子都是我一手来操作，就是担心别人不认真，结果还是这样啊……

作者: qqq111 时间: 2012-2-22 15:44

我们学校基础和临床养细胞纷纷出现这种情况，曾经怀疑是血清的问题，但用同一个牌子的血清，人家有养的好的。据师姐说，用环丙沙星对细胞没有太大影响，估计和我们培养基中加双抗是一样的。我还没有尝试过，正准备尝试一下，量差不多每毫升1微克，你可以少量的尝试一下，我这也没有经验，只是一点建议而已，哈哈。双抗就是普通的青霉素和链霉素，浓度我记得是100单位每毫升吧，我们买的成品所以我不是很确定。另外，我个人觉得如果黑点是动的可能是细菌污染，如果不动，且细胞生长速度变慢，很可能是支原体感染。哎我的细胞命运也很惨

作者: junjie05 时间: 2012-2-22 15:44

我们实验室的细胞也出现了这种状况,有黑点在下面,和楼主一样,非常的郁闷,希望各位高手给给指点啊,多谢了!

作者: yes4 时间: 2012-2-22 15:45

图片为4倍，背景清晰。

培养条件：McCoy’s 5A+10%FBS ，不含双抗。我的细胞包括原代培养一律不加双抗。血清就是国产的。

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作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:45

谢谢楼上的朋友，请问还有放大倍数大些的照片吗？我想看清楚的还有细胞本身上有没有黑点，我看到买来的细胞上就有黑点，背景也是，所以我想知道这个细胞本来是什么样子的，你们的细胞上呢？

就像我发的照片的第三张就有看到在细胞的核上看到有黑点，不知道是原来就有的还是因为是污染就有的呢？？？？？

请楼上的朋友告知，谢谢了

作者: gemei0115 时间: 2012-2-22 15:45

一般情况下，细胞出现像你图片描述的样子，都要扔掉。

处理意见：
1. 支原体检测，两种方法：PCR法和DNA荧光法。
2. 细胞培养建议不加双抗。
3. 查找原因，主要3个方面：1）环境：多检查一下培养箱（水盘，滤膜）。超净台尽可能少放物品，彻底消毒。2）培养液：多检查血清，水质。3）操作。

我这里的细胞目前不在养，暂时手里没有高倍数的照片。

作者: dongdongqiang 时间: 2012-2-22 15:46

上传的图片经过处理，原始图片较大，无法上传。
但是从原始图片中可以看出，细胞与细胞间隙是没有小黑点的，一个都没有。

培养的时候2-3天传代一次（1：3），增殖较快。我想起来了，培养液我写错了用的是McCoy’s 5A+10%FBS

作者: vvmmoy 时间: 2012-2-22 15:46

因为没有做污染细菌的鉴定，所以不知道具体是哪种污染，当时配置的过氧乙酸把细胞室桌子、地面全部擦洗了一遍，差点没被熏死，眼泪鼻涕的，太惨了！！培养箱里的无菌水吸出来，用过氧乙酸擦一遍，又用75%酒精擦一遍，再按照培养箱消毒过程的说明执行一遍，重新放上无菌水。超净台也用过氧乙酸擦一遍，又用75%酒精擦一遍，整个超净台和细胞室紫外线照射2小时以上，所有重复使用的耗材（包括隔离衣）高压蒸汽灭菌，培养液、PBS重新配置，总之，可以想到的都折腾一遍，真是挺麻烦的。好像过氧乙酸时间长的话会对金属有一定腐蚀，所以金属的我一般都是再用酒精擦一遍，尽快晾干，记住水浴锅的水也要注意清洁，要常换，我现在一般也用灭菌水。
希望能够帮到你，祝好运！

作者: nn255 时间: 2012-2-22 15:47

我们也在养这种细胞，也出现了这种状况，我感觉是支原体污染，虽然细胞培养与培养液有关，可是以前我们公司的阿姨用DMEM也能养好，可是现在不知道怎么了会这样，培养也清晰，但也有细沙的感觉，不知道怎么办很急

作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:47

一般情况下，细胞出现像你图片描述的样子，都要扔掉。

处理意见：
1. 支原体检测，两种方法：PCR法和DNA荧光法。
2. 细胞培养建议不加双抗。
3. 查找原因，主要3个方面：1）环境：多检查一下培养箱（水盘，滤膜）。超净台尽可能少放物品，彻底消毒。2）培养液：多检查血清，水质。3）操作。

我这里的细胞目前不在养，暂时手里没有高倍数的照片。

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细胞扔了，不仍也死了……
条件不允许做支原体检测

其他细胞也加双抗，但是没有影响，加是为了安心……
培养箱的滤膜，好像不久前换过，一般多久换一次？水盘使用的是超纯水，倒了旧的，一般会使用75%的酒精喷过，然后再接新的水……

实验前都会紫外消毒半小时以上……实验完都会酒精擦拭。

加入血清的培养液会现在干净的培养瓶内培养过，确认没有问题在使用，
水质要怎么检查？你说的是PH 吗？不需要吧？
看到网上有人说要使用饱和的硫酸铜来装载在水盘里，为什么，有什么作用？

作者: cocacola 时间: 2012-2-22 15:48

我养的也是这个细胞，复苏以后不贴壁很多，然后长的很慢，和楼主差不多，也有过同样的情况，师姐说是支原体污染了，它的发现很慢，培养基也不浑浊，不过在高倍镜下可以看到那些黑色的东西有在动，建议扔掉吧，我已经扔了好多瓶了。

作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:48

謝謝，看來我只能是從新買這個細胞了。
不过最近买回来的细胞不知道怎么了，来得当天看就看到细胞上有黑色的点,不知道这个是细胞正常的时候就会有的,还是因为细胞公司的细胞也有问题呢? 因为在ATCC 上找不到这个细胞的照片,别的一些照片的倍数或者背景颜色设置的关系，所以看的也不是很清楚，所以不知道你们能不能发一下这个细胞的照片呢?

还有就是一般你们买细胞是在什么地方购买? 那里的质量好一点,最近来得细胞,来得时候就看到背景上有一些很大,很奇形怪状的细胞了,总是让我觉得不安心.
谢谢各位了

作者: wmp1234 时间: 2012-2-22 15:48

你好！我的SKOV3细胞出现了和你一模一样的问题，我想问问你，你后来是怎么解决的，我现在也是着急得很，细胞不长起来，没法往下做啊。先谢谢了！

作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:49

你好！我的SKOV3细胞出现了和你一模一样的问题，我想问问你，你后来是怎么解决的，我现在也是着急得很，细胞不长起来，没法往下做啊。先谢谢了！

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使用了抗生素来清洗~~然后换了培养基，细胞长的很慢很慢~~每次换液都是用PBS冲洗~~~勉强靠着有两个细胞长起来的~~~过程很漫长~~~如果你是着急试验，最好找别人要~~~~或者还有库存就好就是重新复苏，我的是在是什么都没有了，只好那样~~~~说真的，细胞这样了，都不知道是什么原因导致的，最后也没有找到原因·~~所以用它来做的结果也不很可靠，还好最后我不是使用这个细胞做的后续试验~~~

作者: viviwang1987 时间: 2012-2-22 15:49

当时严重怀疑是血清的问题~~~所以后来也没有好的办法了~~~不过时至今日还是很希望知道到底是感染了支原体?
还是别的什么东西~

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