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标题: [求助]PBMC分离后有大量红细胞和细胞碎片 [打印本页]

作者: feima+ 时间: 2012-2-24 12:55 标题: [求助]PBMC分离后有大量红细胞和细胞碎片

不知道是最近血库的buffy coat质量不好还是别的什么原因，每次用ficoll 或biocoll分离PBMC后总有大量的红细胞和细胞碎片。
我要从pbmc再用磁珠分离CD4T细胞培养24小时，有人说CD4T细胞里面混点红细胞和碎片不要紧。不知道是不是这样。
不过更麻烦的是如此大量的红细胞和碎片令我用台盼蓝计数时很麻烦，很难分别红细胞和PBMC。有人说用乙酸可以去掉红细胞，不知道有没有用过类似的方法？

先谢谢了

作者: HP007 时间: 2012-2-24 12:55

我想你所说的混杂的红细胞和细胞碎片会不会就是血小板，因为用密度梯度离心得到PBMC是无法去除其中的血小板的，血小板的量非常大，可以用低速离心的方法去除。

如果混杂的是红细胞的话离心后细胞会呈现红色，不知道你的细胞是不是呈现红色？

作者: xueyouzhang 时间: 2012-2-24 12:56

估计不想血小板，血小板应该更细吧。

如果用buffy coat提取PBMC的话基本上细胞都是有红色的（单如果用新鲜全血的话就不会），但以前没出现过如此多的红细胞和碎片。

作者: HP007 时间: 2012-2-24 12:56

那用破红剂再破红不行吗？

当然如果量不是很多的话，也可以不处理，对磁性分选影响不会很大。

作者: feima+ 时间: 2012-2-24 12:59

量时多时少。
用破红剂的话是在PBMC分离之后用吗？这样会不会对PBMC损伤太大。毕竟buffy coat 的质量本来就不好，而且由于时间原因，buffy 一般下午到，所以我只能前一天分离PBMC，第二天才磁珠分选。

作者: lagua123 时间: 2012-2-24 12:59

碎片，溶血？排除溶血的话，采用低速离心的方法，收集的细胞中的红细胞在无核情况下用红细胞裂解液裂解。密度梯度离心像2楼说的，有大量血小板的。

作者: mamamiya 时间: 2012-2-24 12:59

我也遇见同样的问题，特别是当血量大的时候，使用ficoll分离的时候，就会发现其PBMC下面有许多红细胞。分离之后的10ml血分离的PBMC，我加入3ml的红细胞裂解液，3min冰上孵化之后，可以裂解完红细胞，但是PBMC上流式细胞效果很差，无法分群。

作者: feima+ 时间: 2012-2-24 13:00

我就是怕用裂红后影响细胞活力，因为我PBMC之后还要磁珠分选CD4+，再接着培养24小时。

作者: toy 时间: 2012-2-24 13:00

昨天晚上试了下，10*7个细胞用1.5ml的裂解液，2min之后的细胞量最多，流式还可以。需要冰上操作。

作者: vvmmoy 时间: 2012-2-24 13:01

我想你所说的混杂的红细胞和细胞碎片会不会就是血小板，因为用密度梯度离心得到PBMC是无法去除其中的血小板的，血小板的量非常大，可以用低速离心的方法去除。

如果混杂的是红细胞的话离心后细胞会呈现红色，不知道你的细胞是不是呈现红色？

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1、血小板是红色的？

2、低速离心是指多大离心力？转速？

3、说明书里洗细胞的时候用的离心力是前后一致的：提取PBMC后稀释，第一次离心用250g;得到细胞后重悬，再用250g离心。没有离心力的

作者: Ao7 时间: 2012-2-24 13:01

其实你分离PBMC后要做磁珠分选里面的红细胞或是血小板分选后都会没有的不需要特地去掉吧

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:01

磁选并不标记红细胞和血小板，而且这两者会把column 阻塞掉

作者: toy 时间: 2012-2-24 13:02

不是，因为我做流式分选，所以很多红细胞的话会影响我细胞分群，还有就是染色效果。我现在改用15ml的离心管，效果比50ml离心管好得多。而且现在分PBMC中混的红细胞少。还有就是加大了分离液的用量

作者: nn255 时间: 2012-2-24 13:02

我想,加大分离液的用量,适当减少一次分离的全血稀释液量,可能红细胞会少些

作者: nn255 时间: 2012-2-24 13:03

如果红细胞过多,分选是红细胞也会掺杂在里面的,最好还是减少红细胞

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