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标题: [讨论帖]做树突状细胞的同行们请进 [打印本页]

作者: utt0989 时间: 2012-2-24 13:04 标题: [讨论帖]做树突状细胞的同行们请进

大家好，我是研二的学生，我要做的课题与DC有关，欢迎大家到这里进行交流，呵呵，主要是想向大学多多学习！

作者: 小野花 时间: 2012-2-24 13:04

我也在养,如何分离是关键,我快没有脾气了!
用骨髓培养成功的请来一下,救命!

作者: yychen 时间: 2012-2-24 13:05

大家好，我也是做树突状细胞培养，上周预定的白介素4和树突状细胞相关抗体刚到货，不知被谁动了手脚，一夜间毁于一旦，几千块的试剂全毁了，好心痛，目前实验无法开展，课题经费有限，再预定时间上也紧迫，不知哪位好心人有富裕试剂可购买，不胜感谢！

作者: flower-201 时间: 2012-2-24 13:05

我也是做DC的，人外周血来源的单核诱导DC。我也遇到一些麻烦

作者: gemei0115 时间: 2012-2-24 13:06

把老照片翻出来

图片附件: 127800-7-embed.JPG (2012-2-24 13:06, 24.78 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10880

作者: gemei0115 时间: 2012-2-24 13:06

2

图片附件: 128172-DC3-embed.JPG (2012-2-24 13:06, 27.49 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10881

作者: orangecake 时间: 2012-2-24 13:06

不好意思,请教一个问题,第三张照片是不是树突状细胞的免疫荧光照片,其中绿的红的,哪个才是树突状细胞?

作者: dotaaa 时间: 2012-2-24 13:07

我也是做DC的，分离骨髓单个核细胞，我用胎牛血清培养，不过成纤维细胞较多，无血清培养很不成功。希望交流经验。不知各位用何种细胞因子，剂量如何，可否交流一下

作者: dotaaa 时间: 2012-2-24 13:08

我觉得用骨髓培养，选择病人也比较重要，若骨髓细胞过多、过稠，不易分离，我一般用10ml-15ml骨髓，加入淋巴细胞分离液时，一定要注意分离液的温度，不能过低，分离时间可以稍长一些，15-20分钟2000转/分。

作者: woshituzhu 时间: 2012-2-24 13:08

我也培养DC细胞，从外周血分离单个核细胞，在细胞因子的作用下分化诱导DC，才刚刚开始就遇到麻烦，分离的东西杂质太多，根本都找不到细胞了，艾，这是什么原因？希望各位多多指点！

作者: TNT 时间: 2012-2-24 13:09

我也做ＤＣ，请问国内哪里体外培养ＤＣ比较成功？

作者: join 时间: 2012-2-24 13:09

你遇到和我相同的问题啊^^
你说的杂质是不是有很多比iDC小的细胞？我初步怀疑它们是血小板。。。
拿到monocytes后，用PBS洗时可以尝试减小离心速度（我用的1200 rpm，不过还得看具体的离心机^^）；即使这样做，虽然干净很多，但好像还是很难除净（也可能是我还没找到合适的速度）。。。导师建议我下次做的时候，先让monocytes贴壁4小时，然后洗去不贴的细胞，说不定会更好^^

作者: TNT 时间: 2012-2-24 13:15

谢谢你！我今天再看看，发现那些杂质形态不规则，好像细胞碎片，我想大概也是血小板之类的东西，下次我一定试试你的方法。不过我今天又发现了一个新的问题，我培养了两孔，但是有一孔好像污染掉了，早上看的时候还好好的，下午再看就什么也没有了，只有一片片针尖大小的小点，真是好事多磨啊，又没有人给我做指导，请问一下你们见到此情况没有？到底是怎么回事？有何解决方法？

作者: junhun 时间: 2012-2-24 13:15

如果是细菌污染的话，培养基会变浑；真菌污染的话，显微镜下会看到大量团状的东东；支原体污染的话，看不出来，只是细胞会长得不好，应该可以用某种染色的方法检测（不记得了^^）。这些都是导师说的，我运气好，还没碰到过^^

作者: xue258 时间: 2012-2-24 13:15

各位好！我也是养DC的。从人外周血来源的单核诱导DC，养了两次都不成功，希望得到大家的帮助。我找了下原因：1.细胞杂质多，2.树突状形态不典型。急死人！

作者: viviwang1987 时间: 2012-2-24 13:16

虚惊一场，可能是显微镜没有调好，今天看还好，碎片太多，看起来就像真菌污染！可能太紧张，有点风吹草动就着急！

作者: ha111 时间: 2012-2-24 13:16

昨天又从外周血（直接从血站拿的浓缩白细胞）里分了一批monocytes，清洗的离心速度降到1000 rpm，在倒置显微镜下已经看不到杂细胞了；用流式测得纯度有78.84%。然后贴一下壁，洗一遍，消化下贴壁的细胞，再测它的纯度为81.25%。不知道这样的纯度是否合适？还请大家多多指教：）

作者: 北风那个吹 时间: 2012-2-24 13:17

我想问一下，从浓缩白细胞里分出PBMC的步骤和直接从外周血分离一样吗？

作者: 北风那个吹 时间: 2012-2-24 13:17

最近看了一篇最初用外周血提取PBMC，然后在GM-CSF和IL-4的作用下诱导分化为成熟的DC的文章，他提到这样DC的纯度可达到60－80％，所以我觉得你那个纯度应该差不多吧！至于以后报道的纯度可达到95％以上，我不知道是不是真的！

作者: ha111 时间: 2012-2-24 13:18

我分离出小鼠骨髓细胞，用细胞因子诱导培养DC时遇到一个现象：我把细胞均匀分在24孔板里，几天培养下来，细胞数量没有明显增加，有些孔干脆就找不到细胞了。请问这是怎么回事？

作者: gemei0115 时间: 2012-2-24 13:18

不好意思，我不是原代培养的，我养可传代的DC细胞株，不过对DC的分离还是有一点了解的，毕竟我差点就原代培养了。

作者: baidukk 时间: 2012-2-24 13:19

不好意思，我不是原代培养的，我养可传代的DC细胞株，不过对DC的分离还是有一点了解的，毕竟我差点就原代培养了。

请问，你的DC细胞系是什么名字？小鼠的还是人的？还有一个问题想请教，DC细胞建系后的状态是成熟的还是未成熟的？谢谢！

作者: baidukk 时间: 2012-2-24 13:19

给大家介绍一个能够更好的分离高纯度单核细胞的方法，简单步骤如下：
Step 1: 取回抗凝白膜,用等体积的DPBS稀释;10ml/份置于15mlFicoll之上,400g,20分钟;
Step 2: 吸出white band,15ml/份,稀释在35mlDPBS(含1Mmedta,PH值7.2)或者生理盐水中,150g离心10分钟,移走上清中的血小板;反复两次
Step 3: 细胞重悬在完全培养基(IMDM)中,计数;
Step 4: 细胞被进一步稀释为1-2×10^6PBMC/ml, 25ml/份,轻轻的置于
46%的Percoll [46ml等渗Percoll (9.25mlpercoll/0.75ml 10×DPBS) +54ml含酚红的完全培养基]上, 不间断离心550g, 30分钟;
Step 5: 离心后,单核细胞在上下两层的中间,淋巴细胞在最下面.

这样得到的单核细胞纯度较高，而且Step1的稀释和step2的洗涤可以大大减少血小板的污染，尤其是step1！

作者: cocacola 时间: 2012-2-24 13:19

我的是小鼠的，不过穿了几代后被我养死了，我都不知道出了什么问题，下次复苏我再试试，有没有人对DC2.4有培养经验的啊，***求知道啊？

作者: mickeylin 时间: 2012-2-24 13:20

我做的是脐带血分离诱导培养DC，但是也是发现有好多杂细胞，其中有些贴壁，有些较小悬浮，而且诱导出来的细胞大小相差较大，大的细胞在光镜和电镜下都发现线粒体较肿胀。不知道如何解释？

作者: jkobn 时间: 2012-2-24 13:20

用正常外周血和浓白的分离步骤是一样的。只是第一步离心时用的梯度离心液的量不一样，因为同体积浓白中的细胞更多，离心液用得也多（15 mL in 50 mL tube）。我的目的只是要拿到DC，所以用浓白效率较高；有人是为了研究患者的DC，所以是采外周血。
我后来又分离培养了4次DC，只要离心速度（尤其是清洗时）合适，不会有问题。还有，我不知道你的DC养在哪里，我是养在24孔板里。据说是1~2 * 10（6）/孔的密度，但我觉得用0.5 * 10（6）/孔更好，后来收的DC更多。
那个贴壁再洗的方法不知道你试过没，我算了一下，洗一次大概损失15%的细胞（心疼啊~~~），不过为了纯度，只好忍了：）

作者: jkobn 时间: 2012-2-24 13:21

请问Step1中的的抗凝白膜是不是就是直接从血站拿的浓白？
我感觉血小板比较“轻”，梯度离心似乎很难除掉，倒是Step2的清洗很重要。
另外Step4中的细胞需要严格调整浓度吗？因为我没调过，而暂时也没出问题~~~
还有就是血小板和细胞碎片在光镜下看有什么区别呢？用多少放大倍数能看出来？我一直对这个比较晕：）

作者: jkobn 时间: 2012-2-24 13:22

你说的传代是什么意思？我是把DC分出来之后养一周，然后刺激两天，收获成熟DC，中间再第三、五、七天的时候半量替换培养基。
还有请问什么是DC2.4？

作者: jkobn 时间: 2012-2-24 13:22

不知道你发现细胞贴壁和悬浮是在养了几天之后？
较大的贴壁的细胞形状是不是扁的，伸出长的“触角” （不好意思，非专业描述^^）？如果是的话，就是巨噬细胞。
较小的悬浮的细胞是不是圆形的？如果是的话，应该是DC。除了刚开始的几个小时，DC在培养过程中是悬浮的。
另外，你能把DC的照片传上来不？我们这儿的光镜不能拍照~~~
还有我最近也想试试做DC切片，然后看电镜，不知道具体应该怎么操作，还请你多多指教！
多谢啦：）

作者: jkobn 时间: 2012-2-24 13:22

请问大家是用什么方法鉴定成熟DC的？
我是用CD86-FITC和CD83-PE联合标记，然后用流式鉴定。但我做的流式中CD83-PE的荧光强度总是偏低，不知道是怎么回事？

作者: october7 时间: 2012-2-24 13:23

大家谁用过dynal的单核细胞阴选试剂盒，我试了几次，流式结果都不好，还没有我以前用贴壁法得到的单核细胞纯度高。我最近几次养的DC都不是很纯，养至3－4天，发现细胞大小不均一，依形状分为两类，一类圆形，体积小，大部分贴壁，另一类就体积大，有突起，大部分聚集成簇，做流式，散点图显示有两群细胞，实验老师说有一群可能是淋巴，我推测可能是T淋巴细胞在自身DC的作用下增殖，不知大家是什么意见？希望能给个好的建议，谢谢！

作者: october7 时间: 2012-2-24 13:23 标题: 回复 #30 jkobn 的帖子

不知道，你的检测的样品是否加过刺激因子，入TNF-@,PGE2,或是LPS，一般的成熟Dc的CD83才会上调。

作者: jkobn 时间: 2012-2-24 13:24

QUOTE:

原帖由 october7 于 2012-2-24 13:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不知道，你的检测的样品是否加过刺激因子，入TNF-@,PGE2,或是LPS，一般的成熟Dc的CD83才会上调。

我加过LPS刺激，从10 ng/mL 到 1 ug/mL都试过了，CD83-PE的强度总是不够。虽然有上调，但上调的幅度不够大。如下图所示：
依次是同型对照、CD86-FITC单阳、CD83-PE单阳、CD83+CD86双阳。

图片附件: 60584000.gif (2012-2-24 13:24, 26.61 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10882

作者: 911 时间: 2012-2-24 13:25

我也碰到这个情况，很可能是污染了。这些小黑点可能是细菌（排除其它培养液的原因的话）。可多换液，加抗菌素，看是否能挽救。

作者: Ao7 时间: 2012-2-24 13:25

我是做从外周血提取DC的，希望与大家交流QQ337416

请教大家一个问题：电镜下DC的大小应该有多大？哪位能给我看一下作出来的电镜照片我做了之后发现和巨噬细胞不太好区分

小女在此谢过了！

另外，培养基里的小黑点不是血小板的话会不会是黑胶虫？

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:26

我想问一下，大家都用多大的细胞浓度？我用常规的淋巴细胞分离液，每20ml血中就是分离出2*10/7个单核，用1*10/7个种入24孔板，贴壁4到6小时，然后加常量的因子，养10-12天，收下的细胞不到1*10/5，不知道原因何在？你们收的细胞一般可以达到多少？
还有就是请问用血站的白细胞培养的同学，血站的白细胞中加了一些东西嘛？还是新鲜分离的？一袋大概需要多钱？谢谢

作者: jkobn 时间: 2012-2-24 13:27 标题: 回复 #36 glass 的帖子

24孔板中，我是每孔加 0.5 * 10^6 个monocytes，养9天，收获的细胞直接分管作流式，所以不知道有多少 >< 。感觉挺多的~
血站的浓白是新鲜分离的，需要预约，随用随分。北京红十字血液中心的售价是 190元/袋。一袋 30~40 ml，细胞较多，一般分两管做梯度离心。

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:27

你的细胞只作流式，不行其他关于DC功能测定了嘛？我用24孔养的，细胞浓度比你的大10倍，计数时细胞少的很。我用的因子：GM-csf 1000,IL-4 500，隔三天换液，不知道你如何用的？

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:27

你的浓白是自己去血站定的吗？我们这里的血站不能以个人的名义定，不知你是如何定的？

作者: 大尾巴 时间: 2012-2-24 13:28

一、
1、采集外周血15ml，0.2%EDTA抗凝。
2、0.2%EDTA抗凝血100μl ，加入10ul FITC-anti-lin mAbs, anti-HLA-DR mAb,PE- anti-CD11c mAb or PE- anti-CD123 mAb，充分混匀，避光冰浴30min。
3、加入1x红细胞裂解液1ml,振摇2min。
4、2000rpm、6min、200C离心，弃上液。PBA(2.5%FCS) 500ul重悬。
5、2000rpm、6min、200C离心，弃上液。PBA(2.5%FCS)重悬。
6、调整细胞浓度 ( >5x104/sample),上机检测。
7、计算pDC:mDC

二、
1、分离PBMC
2、10ul FITC-anti-lin mAbs, anti-HLA-DR mAb,PE- anti-CD11c mAb or PE- anti-CD123 mAb ，避光冰浴30min.
3、2000rpm、200C离心6min，弃上液。PBA(2.5%FCS) 500ul重悬。
4、 2000rpm、200C离心6min，弃上液。PBA(2.5%FCS)重悬
5、上FACs分选pDC and mDC
6、分别用pDC or mDC 体外做MLR。

问题：
1、上述的实验步骤是否正确？
2、分离PBMC 后是否需要培养过夜，再做pDC or mDC 的分选？培养过夜对pDC or mDC 会有影响吗？如成熟度，活性等。
3、分选后的DC是否应该马上做MLR？还是要培养一段时间再做？
（因为要看病人和正常人外周血DC的不同，所以担心体外培养会改变DC性状）
4、完成上述实验，一般要多少血？即1ml外周血能分离多少DC？
5、MLR要做几个复孔？
6、上FACS分选，一般多少细胞数加多少ul荧光标记抗体？每管细胞数为多少比较合适？

不好意思，我是新手，我们实验室有没人做过免疫方面的实验，因此有些问题可能会很幼稚，请不要介意。但是我真的很着急。

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:28

我做了几例正常人的，20ML外周血养过10-14天后，镜下看细胞很漂亮，但是用10mL1640重悬后基本上数不出DC
1。上流式的细胞数说明上都有，我用的B&D公司的，是1*10^6个细胞20UL2。文献报道10ML可得到10^6DC，我没培养出来。
3。MLR一般作3个孔

作者: jkobn 时间: 2012-2-24 13:29

我暂时只做到流式。。。做DC的成熟测定。
我不知道你有没有在显微镜下看过24孔板里的细胞。如果太浓的话，细胞层叠非常严重，会导致营养不良。我以前曾用两倍于现在的密度养过，感觉收获的细胞反而不如现在的多。
因子和你用的一样，不过我都用的 50 ng/mL。第一次换液是在第三天，其他是隔两天，每次都是半量替换。
订血是以学校的名义订的，还得开证明什么的~ 个人肯定不行。

作者: pencil菲 时间: 2012-2-24 13:29

我也是养小鼠DC的，目前GM-CSF还没有到，但试验处于进行中，试剂需要得比较急，不知哪位同仁有富余试剂可购买，不甚感激！

作者: toy 时间: 2012-2-24 13:30

对不起，好久没有来看了，试验也停了好一段时间了！来了也总是忘了要把这篇文章带过来。不管怎样，我今天带来了，希望能弥补一下！
title : Proliferating Dendritic Cell Progenitors in Human Blood
autheror:Romani N
J.Exp.Med 1994,180:83-93

作者: yhz1973 时间: 2012-2-24 13:30

我是从人外周血分离、扩增DC，文献报道成熟DC悬浮生长，但我培养的DC却大部分贴壁生长，不知为什么？
在鉴别成熟DC时，我用的是FITC-80，83，86标记，流式细胞仪检测，结果80表达偏低，83几乎不表达，这是为什么?

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:30

我也是从外周血分离、诱导扩增DC，但都是悬浮生长的，有时候有簇集现象，我不知道你能否确定你得到的细胞就是DC,有典型的树枝状突起吗？
至于成熟的监测，我还没有做过，我想如果是正常人来源的DC,成熟后一定不会不表达CD83，这可是DC成熟的主要标志啊！

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:31

因为试验对DC分离、纯化的要求很高，所以最近我们想采用磁珠的方法分离培养人DC，希望能和有经验或者有经历的同行交流交流！

作者: 8princess8 时间: 2012-2-24 13:31

我最近在培养未成熟DC细胞，我的方案是从脐带血中分离单核细胞，GM-CSF和IL-4诱导分化，但是做了很多次结果都不理想，主要是CD1a的表达率太低（30%左右），而且培养的细胞背景不是很干净，总是混的有一些小碎片（可能是细胞崩解的碎片或者血小板）。大家在培养DC过程中用的细胞因子的量和比率是多少，培养基是什么，如何在分离MNC的过程中避免血小板的混入？

作者: 8princess8 时间: 2012-2-24 13:32

大家在细胞换液时是全量换液、半量换液还是半量添加呢？我是半量添加的，但是感觉细胞开始增值还比较明显，后来就长得很慢了，而且有很多细胞萎缩、有一些细胞偏蓝，很圆，内部有活动的小点，不知道是什么东西，污染吗？

作者: DDD 时间: 2012-2-24 13:32

我也是做dc的，上2周刚完成了dc的培养，不是很理想，好多瓶的细胞不纯，其它的杂质细胞太多，很快决定再养一批，不过养这个细胞，确实是有点贵呀。

作者: misswu61 时间: 2012-2-24 13:33

我分离出小鼠骨髓细胞，用细胞因子诱导培养DC时遇到一个现象：我把细胞均匀分在24孔板里，几天培养下来，细胞数量没有明显增加，有些孔干脆就找不到细胞了。请问这是怎么回事？

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培养期间是否进行换液（含细胞因子），最好初始浓度在2＊106左右。

作者: one 时间: 2012-2-24 13:33

我是培养小鼠骨髓源树突状细胞，
感觉是一个漫长的过程，
先是如何分离得到小鼠骨髓就花了很长一段时间。
由于细胞因子贵，开始没加任何因子培养，
观察贴壁和悬浮细胞。
这是导师叫我练练手，熟练了再加各种因子。

作者: whitesheep 时间: 2012-2-24 13:33

不好意思,请教一个问题,第三张照片是不是树突状细胞的免疫荧光照片,其中绿的红的,哪个才是树突状
应该是红色荧光的才是树突状细胞。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-2-24 13:34

我做DCs已经半年了，现在养的DCs性状非常典型。用的是从血站买的浓白诱导的。具体的方法如下：
1.  将浓缩白细胞用PBS稀释至总体积50ml,分两管（50ml离心管）加至Ficoll上，第一管血加完后尽量把泡沫打进去，以增加缓冲力。
2.  2000rpm离心，30min,不能有刹车。
3.  吸取白膜层，交替多次吸取，尽量吸干净，用PBS补齐体积至50ml.
4.  1500rpm离心，15min, 以去掉Ficoll。
5.  弃掉上清，留少许液体，轻弹管底，以使细胞松散，加入PBS至50ml.
6.  800rpm离心，10min,以洗掉血小板。
7.  重复上述操作2次。
8.  在第三次加入PBS（总体积50ml）后，稀释5倍进行细胞计数，
9.  离心结束后，按细胞数目铺板，通常一份血铺两块六孔板，每孔细胞数1x107，培养液为无血清1640+DNA酶（10U/ml）+三抗。
10.  贴壁两小时后，轻晃培养板，PBS洗板2-3次，加入完全培养基培养。
11.  三天后换液，每孔加入2ml完全培养基。

作者: tangxin_80 时间: 2012-2-24 13:34

我们用CD209(DC-SIGN)和CD14来鉴定DCs的纯度。CD209在DCs表面的表达高于95%。其实目前还没有DCs特异性的鉴定标志，一般用组合的方法来鉴定

作者: ququer787 时间: 2012-2-24 13:35

DNA酶和三抗的作用?傻傻地问。

作者: ququer787 时间: 2012-2-24 13:35

何时加GM-CSF和IL-4?是贴壁两小时后还是三天后？

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:35 标题: 回复 #57 ququer787 的帖子

贴壁两小时后两小时后，洗净淋巴细胞后加。三天后换液。

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:36

请问大家：
有没有出现过板中间形态大小均一的圆形细胞？那是什末东西？请帮忙解答，谢谢。

作者: ququer787 时间: 2012-2-24 13:36

GM-CSF和IL-4的浓度多少，如何确定的？必须加CD40L吗？为什么？如何确定成熟与未成熟的DC——流式是唯一的吗？

作者: toy 时间: 2012-2-24 13:37

我觉得板中央均一的圆形细胞是PBMC，因为在培养的过程中细胞会向中央聚集。

作者: toy 时间: 2012-2-24 13:37

楼上的DC培养的真不错啊，背景也象图中所示嘛？我在培养的时候总是背景比较差，不干净，细胞的量很少啊，不知道有没有什么经验啊，希望能交流一下！

作者: toy 时间: 2012-2-24 13:37

我做人的DC，GM-CSF100ng/ml,IL-4100ng/ml,用的培养基是RPMI－1640

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:38 标题: 回复 #63 toy 的帖子

可是我已经培养六天了。绝大多数仍是均一的圆形细胞，我在开始时已经洗掉了淋巴细胞，单核会一直不向巨噬或树突分化，而一直保持它的形态吗？

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:38

各个公司的因子用浓度不一样，建议你看好公司再买试剂，具体的量还是看看外文文献。

作者: sunnyB 时间: 2012-2-24 13:38

怎么能够更好交流呢?我也样这个东西,小黑点多是血小板.可以低速离心.多洗涤几遍.一般能去掉,但个体有差异.有的人要多些.
我的细胞养得很好,增殖很明显,但是流式结果总是不满意.CD1a表达低.cd14
表达较高.我需要的是相反(imDC). 怀疑细胞因子组合不对gm1000u/ml,il-4 500u/ml.请各位指教

作者: hold住 时间: 2012-2-24 13:39

培养DC时，gm1000u/ml,il-4 500u/ml对的。
我也是这么养的。

作者: HPLC使者 时间: 2012-2-24 13:39

刚开始准备实验，请问OX是什么

作者: glass 时间: 2012-2-24 13:40

我再想问一下大家，有人用临床的试剂吗？我用的GM-CSF是吉姆欣，TNF也是临床用药。有人知道大概的浓度用量吗？

作者: 66+77 时间: 2012-2-24 13:41

你做出来的流式结果如何

作者: nn255 时间: 2012-2-24 13:41

从人脐血单核细胞诱导DC，所需的GM-CSF及IL-4的合适浓度是多少？他们的U及ng的换算关系是怎样的？恳切希望不吝指教。

作者: nn255 时间: 2012-2-24 13:41

GM-CSF及IL-4的合适浓度,很多文献都不一样,具体该用多少我也不能把握.换算应该参考说明书.
我发现:培养几天后的细胞,取出悬浮细胞到另外一个干净的培养瓶后,仍可以见较多紧密贴壁的巨噬细胞.怎样才能更好控制单个核细胞不向巨噬细胞等其它细胞分化呢

作者: utt0989 时间: 2012-2-24 13:42

大家好，文献上的剂量是gm1000u/ml,il-4 500u/ml，不过现在的细胞因子说明书是活性，单位可以自己换算。
我前一段时间做DC用的细胞因子的剂量是上面的，但不知怎的，DC越来越少，我自己做，师姐做也一样，后来，另一个硕士做也一样，不知是出在淋巴细胞分层液还是细胞因子的问题上。最近我有做了一次，（因为淋巴细胞分层液暂时买不到其他厂家的）将细胞因子的量用的稍微多点，半量换液时，加总量的3/4，感觉这次的DC数量还可以。
TO忧愁风雨
换算是按说明书上做的，如IL-4
活性单位是5×106units/mg，你可以据此换算的，从mg算指u。
不知说的是否明白，也不知是否对，请大家指正。

作者: milkdog 时间: 2012-2-24 13:42

我看到有的文献上说，GM-CSF的作用是诱导单核细胞向DC 及巨噬细胞转化，而IL-4的作用是阻止单核细胞向巨噬细胞转化，使更多的单核细胞向DC转化。这一点你可能早就清楚了。

作者: milkdog 时间: 2012-2-24 13:43

还有，告诉大家，淋巴细胞分层液在没开封之前要放在室温下，开封后放在4度冰箱中。以前没注意到，影响了分离效果，当时估计是淋巴细胞分层液的问题，但不知道是与此有关！

作者: fqswdzd 时间: 2012-2-24 13:43

，能说说你培养DC的方法吗？用什么方法照的像1，2，3张?

作者: fqswdzd 时间: 2012-2-24 13:43

你好，你是在什么时间分离的DC，用什么方法检测的?抗体是什么？

作者: eric930 时间: 2012-2-24 13:44

大家看看我的问题，哪位站友知道的望赐教！
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3962675&sty=1&tpg=1&age=0')

作者: fsdd817 时间: 2012-2-24 13:44

想问一下半量换液是不是比较浪费DC

作者: gogo 时间: 2012-2-24 13:45

分离单个核细胞时，淋巴分离液的温度一定要把握好，否则很影响分离效果

作者: ladyhuahua 时间: 2012-2-24 13:45

半量换液前要先离心的.如果细胞浓度过大,也可以一孔变两孔,所以不会浪费.

作者: kulee 时间: 2012-2-24 13:46

大家好，我刚开始做人外周血DC的分离培养，遇到了很大的困难，希望有高手予以指点。做了几次，每次分离不是取不到细胞，就是细胞太少。我快要晕菜了，请指点啊！

作者: 8s5g 时间: 2012-2-24 13:46

求助：
不知道为什么加了200ng/ml的gm-csf, 或大浓度500的gm-csf一天后细胞均悬起，请高人指点。我用的gm-csf是吉姆欣。

作者: duoduo 时间: 2012-2-24 13:47

从小鼠骨髓培养的Dc是不是这样的啊？

图片附件: 43548392.snap.jpg (2012-2-24 13:47, 35.22 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10884

作者: is2011 时间: 2012-2-24 13:47

我是做大鼠脾脏DC分离培养的，不知道培养液中加多少GM-CSF、IL-4，各个文献描述不一样，有的说250微克/升GM-CSF,有的说0.5微克/升，真没办法，请各位同道指点，谢谢

作者: is2011 时间: 2012-2-24 13:48

我也培养大鼠肝脾DC，分离的细胞数量较多，但细胞培养时发现细胞贴壁的少，绝大多数细胞为半游离状态，形态上为圆形，大小一致，不知道是不是真的分离到DC。望指教

作者: abc816 时间: 2012-2-24 13:48

我有DC培养用的无血清培养基！比较好的哦！

作者: jujuba 时间: 2012-2-24 13:49

我做诱导单核细胞向DC分化，不知道加的细胞因子是否少了，总之是参考文献上的，而且用了相同厂家的因子，DC诱导很不成功，希望大家多多指教。

作者: yes4 时间: 2012-2-24 13:49

我在做从小鼠骨髓培养DC，从杀老鼠到培养出matured DC要两周的时间，而且培养过程中还有出现污染的可能。请问哪位有关于DC细胞系的信息？不胜感激

作者: 131415 时间: 2012-2-24 14:05

我也在做人外周血单核细胞诱导的DC，看了战友们发的图片，感觉自己做的还算可以，但是养出来的DC不太典型，而且也遇到了战友们提出的相同问题，如血小板多，DC培养数量少，纯度低等问题，希望与大家交流。

作者: lixi559 时间: 2012-2-24 14:05

我也做人外周血培养DC，24孔板，但感觉DC生长状态不太好，CD83表达率低。做流式时应用FS SS做图细胞分散，多颗粒的大细胞好象也粘附鼠同型对照，使阴性对照范围很大，阳性的细胞也显不来了。不知是什么原因，希望有经验的群友给予指导

作者: lixi559 时间: 2012-2-24 14:06

昨天又从外周血（直接从血站拿的浓缩白细胞）里分了一批monocytes，清洗的离心速度降到1000 rpm，在倒置显微镜下已经看不到杂细胞了；用流式测得纯度有78.84%。然后贴一下壁，洗一遍，消化下贴壁的细胞，再测它的纯度为81.25%。不知道这样的纯度是否合适？还请大家多多指教：）

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您好!不知您使用的浓缩白细胞是血站手工分离的还是机采的?这两种方法采的浓缩白细胞对分离DC有区别吗?初次分DC,望指教,谢谢!

作者: bluelake 时间: 2012-2-24 14:06

我要做大鼠的DC，取材是骨髓，谁测过MHC II 在DC的表达，我的邮箱

希望与大家交流

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我目前培养小鼠和大鼠DC,目前暂且培养良好,我做过流式,测过,不知道,你有什么问题?

作者: ending 时间: 2012-2-24 14:07

我是做小鼠骨髓的DC,刚刚开始,不懂的地方很多,希望能多与大家沟通交流,我的qq是123956757
请大家帮我看看,给点意见
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7474444&tpg=1&ppg=1&sty=1#7509597')

作者: cj_mondy 时间: 2012-2-24 14:07

我的硕士课题是有关小鼠树突状细胞的，养了2年半的DC，有一定的经验和教训，而且为了培养DC，自己重组了rmGM-CSF，活性相当不错（经Nature上发表小鼠DC的作者试用，评价良好），如果各位有兴趣，讨论培养技术或需要rmGM-CSF的，都可来邮件商量探讨（我没有QQ，邮箱经常查看）。无论经费不足的，还是新手，如果有需要，可增rmGM-CSF5ug免费试用。
附我培养的DC：

图片附件: 12707483.jpg (2012-2-24 14:07, 21.88 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10885

作者: cj_mondy 时间: 2012-2-24 14:08

附DC图2：

图片附件: 57574504.jpg (2012-2-24 14:08, 48.02 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10886

作者: cj_mondy 时间: 2012-2-24 14:08

再发一幅图（聚焦不好，请谅解）：

图片附件: 69683625.jpg (2012-2-24 14:08, 66.24 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10887

作者: jujuba 时间: 2012-2-24 14:08

终于找到组织了，请各位看看我养的DC的照片。

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=9915049&sty=1&tpg=1&age=0')

明天就该收获了，想用胰酶消化下来，然后还要用流式分选，我们实验室里都没有人做过，请大家给我点建议吧。

作者: pengke1983 时间: 2012-2-24 14:09

大家觉得PBMC贴壁后，悬浮细胞和贴壁细胞各占多少呢，是一半一半吗？DC培养七天后会增殖吗，感觉我自己培养的树突细胞数量没什么变化，吸吸洗洗的反而减少了。

作者: join 时间: 2012-2-24 14:09

QUOTE:

原帖由 pengke1983 于 2012-2-24 14:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

大家觉得PBMC贴壁后，悬浮细胞和贴壁细胞各占多少呢，是一半一半吗？DC培养七天后会增殖吗，感觉我自己培养的树突细胞数量没什么变化，吸吸洗洗的反而减少了。 ...

我是从骨髓单个核细胞培养的DC, 几天后感觉细胞总数是多了一些，但是不知道是不是因为DC传代了。

作者: cj_mondy 时间: 2012-2-24 14:10

培养至第6、7天的DC，用不着用胰酶消化，此时的DC贴壁很疏松，只要轻轻吹打就下来了，用胰酶消化，反而回混经杂细胞。悬浮细胞和贴壁细胞的说法太笼统了。培养早期，悬浮细胞主要是淋巴细胞，而DC或DC的前体细胞和巨噬细胞等是贴壁的；晚期，淋巴细胞应该已经清楚了，此时DC已疏松贴壁了，悬浮细胞应该主要是DC。因此，在培养中笼统地以贴壁和悬浮来区分细胞很不科学，也指导意义和实验意义。如果单纯讲DC的比例，影响因素也很多如：培养技术、细胞因子（特别是GM-CSF )的活性、培养过程中处理等都会严重影响DC的数量和状态的。DC培养第7 天后，细胞数肯定不会大量的增加了，因为，此时DC已接近成熟，即将进入凋亡阶段了。

作者: 中国特色 时间: 2012-2-24 14:10

我从小鼠脾脏分离细胞，然后用BD公司的PAN DC分离磁珠分离树突状细胞。培养后发现有不少带有较大突出的细胞，我觉得应该是巨噬细胞，怎样才能提高分离的纯度呢？我的实验只需要用树突状细胞和B细胞共同培养几天而已，只是用了10%FCS的RPMI1640，没有加GM-CSF等其他因子；原来看文献大都用96孔板做10个孔，我嫌麻烦，直接用了24孔板；这些有影响吗？还有哪些需要注意的事项？我对树突状细胞懂得很少，刚开始这方面试验，希望各位大侠能指教一二，多谢啦！

作者: cj_mondy 时间: 2012-2-24 14:10

我以前培养DC都是用24well或6well板的，很少有人用96well的。如果从骨髓细胞中诱导培养DC不加GM-CSF是肯定培养不出DC的，不知你的实验目的是什么？如果只是测试脾脏中的DC对B细胞的作用，那就不用GM了。如果是测试小鼠体内的总DC群，为什么不取骨髓细胞来诱导培养呢？脾脏DC的数量是很少的。如果没有没有rmGM-CSF或嫌贵，我可以赠送5ug（自己重组的，效果绝对良好）。邮箱：ivy_1968@126.com。另外，DC是没有绝对特异性标志的，我不明白如何用磁珠分离？如不嫌麻烦望将说明书或原理发给我看看，以提高我的认识。

作者: 中国特色 时间: 2012-2-24 14:11

多谢指教，我只是看DC对B细胞的作用，养几天就行了。问了前辈，看了一点文献就照着做了。很多东西都不懂，正在边做边学习原理，DC的原理实在是很复杂，我原来是做临床的对免疫几乎一窍不通，真是很难。我用的是Miltenyi Biotec公司的PAN DC磁珠分离，它好像是用了CD11c 和 Anti-mPDCA-1的抗体磁珠。具体资料可以查看网页cuturl('http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_643_Pan_DC_MicroBeads.aspx')。很抱歉我的电脑现在没法正常下载pdf文件，无法把说明书下载发给你，要麻烦您自己去下载了。我不太懂用磁珠分离得到的DC和诱导得到的DC到底有什么区别？看了这里的一些帖子发现大家都用GM-CSF诱导培养，是因为细胞太少才需要这么做吗？(很抱歉我的问题大概很无知)，做了几次发现脾脏中分离到的细胞大概只有1%左右，而且感觉纯度不高。显微镜下看觉得有巨噬细胞，不知道对B细胞的影响会不会是巨噬细胞造成的，希望能提高纯度。

作者: cj_mondy 时间: 2012-2-24 14:11

DC是很复杂的，其实任何真核细胞都是很复杂的，如果我们人类能完全研究清楚一个细胞，也就完全解开生命的全部奥妙了。毕竟，任何多细胞生物都是由一个受精卵细胞分化发育而成的。
DC是没有特异性表面标志的。许多DC表面高表达的分子在巨噬细胞、单核细胞也有表达。至于CD11c在其他细胞上的表达我也不清楚，但我看过不少关于DC的文献，印象中没有人用磁珠分离DC的。至于现在是否有新进展，可用磁珠分离，我也不敢轻易否定。
DC在外周血中也有存在，1％？我记不太清了。我想脾脏中的比例也大致差不多。用如此少的细胞来做实验，而且分离时又不纯，估计实验是有困难的，实验过程中稍有误差，结果就不可信了。我想这也许是人们要诱导培养的原因。

作者: 中国特色 时间: 2012-2-24 14:11

谢谢啦，看来还需要多读文献。我们这里好像习惯用磁珠分离各种细胞，T细胞，B细胞等等，不知道是不是因此也用磁珠分离DC了。

作者: cj_mondy 时间: 2012-2-24 14:12

T细胞、B细胞包括CD34＋的骨髓干细胞都是可以用磁珠分离的，因为它们都有特异性的表面分子，而DC是没有特异性的表面分子的，而且本身也是异质性很高的细胞群，所以很听说用磁珠分离的。

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