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标题: [求助]做细胞融合,为何融合率不高? [打印本页]

作者: wmp1234 时间: 2012-2-24 14:16 标题: [求助]做细胞融合,为何融合率不高?

为什么我在做细胞融合时,滴加完PEG,无血甭培养基终止后,会出现小的片状,碎渣子状的东西,是不是杂交瘤细胞与脾细胞破了?而且融合率都不高,大约20-30%,为什么?

作者: tangxin_80 时间: 2012-2-24 14:16

融合率20－30％是什么意思？是说20－30％的孔有杂交瘤长出来吗？如果是的话那可能就太低了。
我们一次融合一般可得到约2800－3200个杂交瘤细胞/小鼠脾,使用的是四季青的胎牛血清(如果用Gibco的结果更多一些).
楼主应该把你的材料和方法详细说出来,大伙才能有的放矢地帮你解决问题呀.

作者: wmp1234 时间: 2012-2-24 14:17

方法是：脾细胞与杂交瘤细胞按2:1-10:1，一般是按4:1的比例，1000转/分，10分钟。然后取PEG1ml 90秒内加入离心管中，边加边轻轻转动，然后在90秒内加完3ml无血清培养基，最后再补加无血清培养至20-30ml。(均在37度水浴中进行)。就在加完3ml培养基后，可以看到液体中成碎渣状，片状的东西，只要出现这种东西融合率肯定不高，甚至没有克隆。
但是以前没出现过这种情况，有时融合率也不高。
我用的血清有四季清的新生牛血清，也用过Hycione的类胎牛血清，也用过Gibco的新生牛血清，均是15%的浓度。

多谢大家的帮助！

作者: tangxin_80 时间: 2012-2-24 14:17

你用的血清可能不行!
你很可能没有做过血清的质量检测(支持极低密度细胞生长的能力).
我也用过Gibco的新生牛血清,结果是长出来的融合细胞很少,四季青的新生牛血清我没用过(不会比Gibco的新生牛血清好吧?),hyclone的产品我是坚决不用的(以前同事用的试用装很不满意).
现在我用的是四季青的胎牛血清,得到的杂交瘤的数量如上贴(其实有时会更多)
另外,加完PEG后用基础培养基稀释时,基础培养基要一滴一滴地加(3秒一滴),这一点很重要,否则细胞会涨破!不知楼主注意了没有?

还有的是,细胞融合后的生长环境对形成的杂交瘤数量也有巨大的影响.我的杂交瘤在液体培养基中长的很快很好(经常有些杂交瘤在5/6天时就可做检测了),但同时做的融合接种在甲基纤维素半固体培养基中的杂交瘤就是长不好,数量也少的多,仅有液体培养基中的四分1左右(接种体积密度相同的条件下)

作者: wmp1234 时间: 2012-2-24 14:17

感谢你的回复！

你用的四季清胎牛血清都是一个批号的吗？血清质量检测怎么做？我是一直头疼用哪个血清的问题，但不知怎么检测，听说挺复杂的。

我在加基础培养时也是一滴一滴地加的，倒不一定是3秒一滴，反正在3分钟内加完。我也怀疑是不是在加PEG时我的手法有问题，我断断续续做了好多次融合，融合率达90%以上的也有几次，融合率20-30%也有，都不稳定，而且有的克隆细胞团长得也不好，不像有的长得亮亮的，看起来很舒服、漂亮。我也不知道是什么原因。

作者: fei1226com 时间: 2012-2-24 14:18

呵呵，血清最好用自己杀牛制备的血清，PEG用液体进口的。融合率可以达到95%以上呀。

作者: eric930 时间: 2012-2-24 15:02

依照我们这里的经验我觉得可以做一下改进：

1。可以适当提高PEG的浓度，这样可以增加融合率。

2。我们这里中和用的都是进口的胎牛血清，杭州四季青的也用过，感觉进

的好一点，关于无血清中止液的问题，我们这里细胞消化用过，感觉不能完

全中止，所以融合是没有用，个人觉得还是改用胎牛血清中止比较好。

作者: wmp1234 时间: 2012-2-24 15:02

谢谢各位的建议!
PEG的浓度不是50%的吗?若要提高,应该提高多少才好呢?

作者: skytree 时间: 2012-2-24 15:04

50％好像已经算高的了，我们这里一般用两个浓度50％和37％。

作者: yueban-1147 时间: 2012-2-24 15:04

对于融合率不高的问题，我觉得最重要的一步是在加入PEG和无血清培养基的这段时间内，其他的只要严格按照普通常规方法应该是问题不打。对于加入PEG后，你可以试着轻轻的用你手中的毛细吸管把细胞团弄散，这个步骤是你加第一滴PEG就开始。在60-90秒中加完PEG后要等带待1分钟左右再终止PEG，起码让他起点作用吗。
对于这个相似问题以前的帖子曾经讨论过，cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=758991&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#758991')
你可以看下，有没有启发。

作者: yueban-1147 时间: 2012-2-24 15:06

对于有碎片的问题，从你描述的看，你可以先判断培养基是否有问题（无论是有血清的还是没有），肉眼观察就行。再就是你所说的转速和时间问题，你的离心机的半径如果大的话，可能低转速也能造成大的离心力，从而破坏细胞，离心力可以控制在500g左右试试。还有就是时间的问题没有必要到10分钟，你可以减半。

作者: wmp1234 时间: 2012-2-24 15:06

谢谢楼上的各位，下个月又要融合了，我按大家的建议，改进一下方法，看看结果怎样。
离心的时间要减半的话，我怕淋巴细胞离不下来。
而且用吸管把细胞团弄散，会不会把已经融在一起的脾细胞和杂交瘤细胞又吹开？

作者: yueban-1147 时间: 2012-2-24 15:07

离心的时间要减半的话，我怕淋巴细胞离不下来。
而且用吸管把细胞团弄散，会不会把已经融在一起的脾细胞和杂交瘤细胞又吹开？

对于你的担心，我是可以理解的。时间减半是在离心力达到一定的情况下缩短的，这样比较不容易损害细胞。而对于融在一起又吹开的问题，你要这样理解，如果是一团的话，单靠你的PEG的渗透而作用于团里面的细胞是不可能的。所以你要让团散开能充分的发挥PEG的作用，而且上面已经提到让PEG作用一段时间再去终止。

作者: wmp1234 时间: 2012-2-24 15:07

我发现有的人做融合时，在事先配好的PEG中加入DMSO，我不明白为什么要加DMSO，对细胞没有副作用吗？

作者: HP007 时间: 2012-2-24 15:08

我们这边试过用含DMSO的PEG来融合，结果基本上融合率不高，换回不含的以后融合率又正常起来了

作者: fsdd817 时间: 2012-2-24 15:08

我也做过几次融合，我们实验室的方法是：制备的骨髓瘤细胞与脾细胞1000rpm离心10min，倒掉上清并要充分弃净，用酒精棉球吸去剩余上清，以免影响PEG的作用。将融合管置于手掌中，轻轻振荡底部，使两种细胞充分混匀。用吸管将1ml 37℃预热的PEG在42-45s内匀速滴加到融合管中，边加边轻轻摇匀，立即滴加37℃预热的基础培养基DMEM(事先准备好)，使PEG稀释而失去作用，具体做法是用吸管在第1分钟内加1ml预热的基础培养基，遵循先慢后快的原则，后面慢慢提高速度。
总体融合率可以达到90%以上。楼主可以参考下。

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