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标题: [资助]分离外周血淋巴细胞---方法＋心得 [打印本页]

作者: mickeylin 时间: 2012-3-7 15:11 标题: [资助]分离外周血淋巴细胞---方法＋心得

分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。现在大多数用的密度梯度离心法。一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。

我的经验
1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释
2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！）
3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。
4. 离心 .转速：1500/分
温度20c －28c
时间：20分钟
no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)
5。取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞
6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！
7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。还有办法的。
8 离心。转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！)
时间：10分钟
温度：4c
9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你）
10.细胞计数＋洗涤细胞。刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。这样是不是很节省时间？？
11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.
a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）
b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞
c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形
d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度
e 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？）
12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2
25－50u/孔后，放入培养箱.

建议;
不同厂家生产的淋巴细胞分离液，密度不同。所以第一步离心的转速也会有所不同。最好是按照说明书摸出最合适的转速，这是分离成败的关键！！！！！！。
我用的是eppendorf离心机，上海xx所的淋巴细胞分离液（名字忘记了）效果比较好。不推荐使用北京夏斯的细胞分离液，连个说明书都没有，而且分离得到的细胞中，血小板会很多.

作者: mickeylin 时间: 2012-3-7 15:11

图1 发亮的为刚分离的pbmc
黑点为血小板
（分离的结果很不好，全是因为该死的“吓死”的分离液

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作者: mickeylin 时间: 2012-3-7 15:11

还有一张

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=10985

作者: 131415 时间: 2012-3-7 15:12

看了pbmc 的经验很受启发，我不是做pbmc分离的，但曾经用过淋巴细胞分离液，谈几点体会，希望能共同提高！
1、因为吸取上层血浆的时候很容易打乱层次结构，离心后我一般直接用吸管伸入中间层吸出所需细胞，然后再吸血浆，如果与淋巴细胞分离液交界处变混浊，少吸一点就是了，反正血浆多得是
2、吸取细胞的时候尽量不要吸到下层的淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液的比重比淋巴细胞大，用离心的方法是不可能去除的
3、重悬细胞的时候不要用含血清的培养基，因会使细胞粘附成团

作者: summerxx 时间: 2012-3-7 15:12

1.等倍稀释血液的目的是什么?要获取血浆,在分离后的最上层是血浆和稀释液;
2 是否可以考虑把抗凝血直接加到淋巴细胞分离液;或先离心获取血浆后,再等倍稀释后分离!哪个方法更好?

作者: mickeylin 时间: 2012-3-7 15:13

看了pbmc 的经验很受启发，我不是做pbmc分离的，但曾经用过淋巴细胞分离液，谈几点体会，希望能共同提高！
1、因为吸取上层血浆的时候很容易打乱层次结构，离心后我一般直接用吸管伸入中间层吸出所需细胞，然后再吸血浆，如果与淋巴细胞分离液交界处变混浊，少吸一点就是了，反正血浆多得是
2、吸取细胞的时候尽量不要吸到下层的淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液的比重比淋巴细胞大，用离心的方法是不可能去除的
3、重悬细胞的时候不要用含血清的培养基，因会使细胞粘附成团

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非常感谢主任的建议，但是小弟这样做证明
利用离心是可以把细胞与分离液体分开的。我也培养结核杆菌，它门就是漂浮在培养液的上面，膜状生长，但是我通过离心，就能把细菌集结到管底，当然这就需要很高的转速和较长的时间。实践证明我这样做是有用的。还有个明显的证明就是，你把第一步离心的速度加大试试看，到2500以上，可能所有的pbmc都会沉到分离液的下面。
至于吸取血浆，我是这样考虑的：少吸取一点，不要为了吸取血浆把层次搞乱了。这样吸血浆内就不会混有pbmc。

作者: redbutterfly 时间: 2012-3-7 15:13

我分离的细胞好象数量不太好，生长也不好，怎么回事？？

作者: lixi559 时间: 2012-3-7 15:14

1 发亮的为刚分离的pbmc
黑点为血小板
（分离的结果很不好，全是因为该死的“吓死”的分离液

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首先想请教一个问题，“吓死”的分离液？源何称‘吓死’？
其次，你这两张图片放大倍数是多少呢？4X10 ？并且好象有点不是很清楚，我记得我拍的一些PBMC亮度感比你的好象好一些，细胞与非细胞的对比度也清楚一些，所以我想知道是你仪器问题还是操作问题呢，比如，细胞悬液中有泡漠还是其他？
最后，你判断黑点为血小板依据是什么？通过离心和其他办法能否将以上这些小黑点尽可能的去除呢？

作者: whitesheep 时间: 2012-3-7 15:14

我也有分离过pbmc,觉得分离液的品质很重要，我用过三种牌子的（具体记不得了），但是差别的确很大。

有的一边加抗凝全血，一边就有大量红细胞“哗哗”往下掉，这种分离的结果必定很差：大量的红细胞“穿越”分离层，等于打通了一条“隧道”，让所有的细胞通畅无阻的沉到管底，自然达不到依据细胞密度不同，分离pbmc的目的。

好的分离液，应该是加3－4ml后，才有少量红细胞，“一粒粒"，慢慢往下落。红细胞比重大于分离液，“着个"沉到管底，这样不会打破分离层的完整性，分离效果自然很好。

至于，血小板多的问题，如果pbmc得率差别不大，是不是个体差异呢（有些人血小板就是多一些），换个人再试试吧。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-3-7 15:15

有没有在继续分离T细胞和B细胞的方法？

作者: lixi559 时间: 2012-3-7 15:15

当然有，还很多，其中我做的比较熟练的并且条件摸的也比较成熟的是：免疫磁珠的分选方法，如果你有机会或条件使用它，很乐意和你讨论、交流。
下面我贴了一张照片，是我用这种技术分选CD4+T细胞的效果图。

作者: lixi559 时间: 2012-3-7 15:16

20031106 放大倍数 10X10
诠释：红亮亮——磁珠
黄澄澄——CD4+T细胞

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作者: lixi559 时间: 2012-3-7 15:16

继续！

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作者: lixi559 时间: 2012-3-7 15:16

GO ，GO！

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作者: mickeylin 时间: 2012-3-7 15:18

hehelixi559兄把老家底子都拿出来了吧？磁珠分选确实是一种效率很高的分选方法，分选率在95％以上，但是代价太大，我们这里早几年也做磁珠分选。由于试剂比较昂贵，所以现在只有分离用的磁架还在（也是比较贵的，20000多），要是哪个有兴趣，可以和我们合作啊，只要您提供磁珠抗体就行了。嘿嘿，我也能沾点光。
目前，有很多人都采用流式细胞仪做分选，代价要比磁珠分选小，效果却也很好。我们这里也曾经做过这种分选，分选的阳性率在90%以上，呵呵，效果也是不错的，不过我们只做了死细胞（既荧光染色后固定的细胞），至于活细胞，操作要更复杂。首先的一点，就是要对整个流式管道系统的消毒清洗，由于操作复杂且所需要的人鲜血量比较大，一直就没有做，所以要是有人有这个方面的经验。还望不吝赐教！！！！！

作者: mickeylin 时间: 2012-3-7 15:18

当然有，还很多，其中我做的比较熟练的并且条件摸的也比较成熟的是：免疫磁珠的分选方法，如果你有机会或条件使用它，很乐意和你讨论、交流。
下面我贴了一张照片，是我用这种技术分选CD4+T细胞的效果图。

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我发现你的图里面有一些磁珠根本就没有和细胞结合，是不是抗体已经失效？
我记得磁珠分选，应该行成象花结一样的结构，你怎么会这个样子呢？？

作者: dongdongqiang 时间: 2012-3-7 15:19

我也有幸做过磁珠(beads)分选，稍微了解一些。

磁珠与细胞结合之后，上磁架，培养液中剩下的就是“阴性”细胞（negtive-selected)。若想得到“阳性”细胞，接下来还要将磁珠与“花结细胞“（rosetted cell分开。

有的磁珠和细胞结合之后，需要使用一种Dtetach（洗脱剂），才能顺利掉下来。也有的磁珠改变抚育温度，就可以。

不知道源兄的磁珠是哪种情况，好像洗脱的效果，差了一点吧。

作者: tieshazhang 时间: 2012-3-7 15:19

楼上两位仁兄，看来也是免疫磁珠分选的高手了。很高兴，以后可以好好交流一番了。
1。象pbmc所说那样，有一些磁珠根本就没有和细胞结合，的确是因抗体已经失效，上图是我第一次利用这种技术分离T细胞，所以一来可以练手，二来避免不必要的浪费，这些磁珠便是从师兄师姐那衣钵来得。一般来说，不同性质、类别、厂家的磁珠与细胞结合的比例会有所不同，象我用的这种CD4-beads与CD4+T细胞大约是3/5：1的结合率，所以结合后，细胞与beads会形成一束束美丽的花结细胞（rosetted cell），然后通过上磁架，分开“阴性”细胞（negtive-selected)和“阳性”细胞，再通过Dtetach或改变花结细胞的抚育温度与时间，便可以将beads和细胞分开了。当然分选细胞还是应该以磁珠的说明书为依据，象我曾经做过，CD3/CD4磁珠的分选，虽然这两种磁珠来源同一厂家，但操作过程和磁珠用量，用法都有很大的区别。
2。wanglily0 也是高手呀，磁珠分选过程描述的简洁明了，我用的是Dynabeads M-450 CD3 ( PanT )/CD4 ( T helper) Dynal A,S,Oslo,Norway, 洗脱效果差，主要是因为磁珠以过期，抗体效价低或缺失，非特异性结合远远大于特异性结合。
3。希望大家继续讨论。

作者: mickeylin 时间: 2012-3-7 15:20

补充一点：分离的时候，难免会带入红细胞和血小板，不要紧，培养几天后，这些讨厌的家伙就会自己消失的。

作者: vivian4123 时间: 2012-3-7 15:20

请教一下：请问有没有人分过骨髓造血干细胞呀？我的实验要用的是活细胞，那就不能用流式了是不是? 磁珠的办法是不是太贵了？

作者: newway 时间: 2012-3-7 15:21

以前打算分离脐带血造血干细胞（CD34+细胞），考虑到经费等原因，没敢用免疫磁珠法分离，而从文献中找到一个相对流式和磁珠分离法较便宜的多的方法：两步贴壁法分离脐带血CD34+细胞。

大致步骤：先分离脐带血单个核细胞，放入培养瓶中过夜培养，去除贴壁细胞，收集悬浮细胞后用培养液调整细胞浓度至适当量，加鼠抗CD34单抗，混匀4度作用1小时，再将此混合液移入预先包被好羊抗鼠IgG(H+L)的培养瓶中，4度作用1小时，到掉悬浮细胞，加入培养液用力吹打下黏附细胞，此即为所需的CD34+细胞。分离后一般要用流式细胞仪来做一下纯度分析。

上面是我的实验步骤，不知对你有无帮助，只作参考。

作者: mickeylin 时间: 2012-3-7 15:21

很好,我觉得,淋巴细胞分离后,最主要的目的还是培养得到的细胞.
我养的细胞都是经抗原刺激的,okt3, okt8,mtb多肽等都用过,
一般的pbmc培养,都用10%FCS+1640 ,不加入rIL-2,一个星期左右就会死亡,若是加入了抗原,在抗原的刺激下,即使不加入rIL-2 也能很好的生长.
记得有一次,我把失效的rIL-2加到了细胞悬液内,结果:不加抗原刺激的细胞全布去见了马克思,而加了抗原的生长完全正常.培养最多的天数超过30天~~

建议:加rIL-2培养细胞时,rIL-2保存在4度不能太久.rIL-2 的浓度越大,能保存的时间越长.最好用的时候,分装成1ml/管,其他的放到-80度保存.

作者: duoduo 时间: 2012-3-7 15:22

我用脐血分离培养淋巴细胞多次，感觉：
（1）不同个体淋巴细胞生长差异较明显
（2）红细胞、血小板并不影响后续工作（我用来种病毒）
（3）经过对比，好象加不加IL-2对淋巴细胞的生长影响不大。这是为什么？

作者: 小糖块 时间: 2012-3-7 15:22

也做过白细胞分离，不过密度和离心条件是自己摸的，主要是用两步法分离的，看起来血小板没有楼上的这么多

下面是细胞染核的结果，染上蓝光的是白细胞，大的黑的没有染上的是红细胞，小的是血小板 10X20的

图片附件: 96625006.snap.jpg (2012-3-7 15:22, 41.17 KB) / 该附件被下载次数 6
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