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标题: [求助]做过Th17流式分析的请看过来 [打印本页]

作者: junjie05 时间: 2012-3-7 15:38 标题: [求助]做过Th17流式分析的请看过来

各位站友，小弟最近在做流式检测Th17细胞的过程中遇到点问题一直未能解决。我用的是PMA、Ionomycin和Brefeldin A体外刺激PBMC检测IL-17的表达，做了正常对照和患者的标本均能检测到IL-17。我同时还标记了表面CCR6分子，想看看是否IL-17阳性的细胞均表达CCR6，但在刺激后流式检测发现无论是正常人还是患者CCR6的表达明显下调到几乎没有了，而文献上其他的疾病如RA的流式图上看并没有CCR6的明显下调。我知道用PMA和Ionomycin刺激后CD4的表达会下调，不知道是否CCR6下调也是因为这个原因？但文献上的流式图却似乎没有下调。不知道哪里的问题，所以请问各位有没有做过CCR6和IL-17同时检测的经验？谢谢了！

作者: 盼盼 时间: 2012-3-7 15:39

我也准备做类似的研究，但就怕PMA、Ionomycin和Brefeldin A体外刺激后检测的表面抗体减少，该怎样设计呢？

作者: gogo 时间: 2012-3-7 15:39

PMA、Ionomycin和Brefeldin A体外刺激后CD4和CCR6等表面抗原并不会下调。
检测时这些表面抗原荧光信号下调很可能是你标记抗体步骤不正确。
标记抗体方法：
1、收集细胞后先标记表面抗原的抗体。
2、固定细胞
3、打孔细胞。
4、标记IL-17的流式抗体。
注意表面抗原的抗体标记必须在固定细胞之前。

作者: rxcc33 时间: 2012-3-7 15:40

PMA、Ionomycin和Brefeldin A体外刺激后CD4和CCR6等表面抗原并不会下调。
检测时这些表面抗原荧光信号下调很可能是你标记抗体步骤不正确。
标记抗体方法：
1、收集细胞后先标记表面抗原的抗体。
2、固定细胞
3、打孔细胞。
4、标记IL-17的流式抗体。
注意表面抗原的抗体标记必须在固定细胞之前。

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前辈你好，我也正有这方面的疑惑。我们实验室也是用PMA，Ionomycin和Brefeldin A体外刺激PBMC后CD4丢失。步骤也是先染表面再固定破膜，最后标记IL-17。所以我们只有通过染CD3和CD8来反圈CD4。我也看到文献上有直接染CD4和IL-17，不知是不是我们在一些小的细节有问题。烦请前辈将具体的protocol附上，不胜感谢！

作者: rxcc33 时间: 2012-3-7 15:41

PMA、Ionomycin和Brefeldin A体外刺激后CD4和CCR6等表面抗原并不会下调。
检测时这些表面抗原荧光信号下调很可能是你标记抗体步骤不正确。
标记抗体方法：
1、收集细胞后先标记表面抗原的抗体。
2、固定细胞
3、打孔细胞。
4、标记IL-17的流式抗体。
注意表面抗原的抗体标记必须在固定细胞之前。

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我又在版内搜到了前辈的其他帖子关于回复Th17的流式检测的。用胞内染色法检测。
一、刺激细胞使其合成IL-17。
二、最后6小时加BFA阻断高尔基体，使合成的IL-17不分泌储存在细胞内。
三、收集细胞，标记表面标记（CD4）。
四、固定细胞。
五、打孔细胞。
六、标记荧光素偶联抗IL-17抗体。
七、流式上样检测。
有几个疑问：
1、我们用的刺激时间是4-5小时，最后2小时加入BFA（许多文献也是这么做的）。不知这里第一步中的刺激时间是多久？
2、固定细胞和打孔的试剂哪个公司的？BD的专门胞内因子检测的试剂么？还是其他的？具体的孵育时间？如果用的是eBioscience的做Treg的破膜固定剂是否有影响？
如果前辈做过这方面的实验，能给一份详细的protocol分享给我们初学者，将不胜感谢！

作者: 2541 时间: 2012-3-7 15:42

1、刺激时间可长可短，但是加BFA的时间2个小时有些短，可能导致细胞内IL-17储存不够而得到假阴性的结果，所以加BFA的时间最好是5至6个小时，时间长了对细胞就有毒性。我看过的文献基本上也是控制在这个时间，不知道你说的文献中只用2个小时是哪些文献，我还没有看到过只用2个小时的。
2、我印象中测Foxp3的固定剂和buffer与一般的胞内染色法所用的试剂不一样，建议你不要使用这个试剂盒的固定剂和打孔剂。你用一般的固定剂和打孔剂（胞内染色用）就可以，这些你可以向公司咨询。

作者: rxcc33 时间: 2012-3-7 15:43

1、刺激时间可长可短，但是加BFA的时间2个小时有些短，可能导致细胞内IL-17储存不够而得到假阴性的结果，所以加BFA的时间最好是5至6个小时，时间长了对细胞就有毒性。我看过的文献基本上也是控制在这个时间，不知道你说的文献中只用2个小时是哪些文献，我还没有看到过只用2个小时的。
2、我印象中测Foxp3的固定剂和buffer与一般的胞内染色法所用的试剂不一样，建议你不要使用这个试剂盒的固定剂和打孔剂。你用一般的固定剂和打孔剂（胞内染色用）就可以，这些你可以向公司咨询。

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感谢回复！两篇文献，1是用BFA两个小时的，2是用三个小时的。
关于胞内因子的固定打孔剂我知道BD公司有配套的，但是不知道其他公司有没有经济一点的。另外还有一个问题：如果用naive T在Th17极化条件下分化后检测Th17。那我是否还需要标记CD4？

作者: c86v 时间: 2012-3-7 15:43

1、有配套的就应该使用配套的，买那些便宜的做不了反而更加浪费财力、人力和物力。
2、naive T极化来的也最好的标记CD4，这个就不要省了，另外，你纯化naive T也不一定纯度能够达到100%。

作者: jkobn 时间: 2012-3-7 15:44

我们准备做naiveCD4T细胞分化成TH17细胞，请问如果我们是通过流式分选naiveCD4T需要买那些荧光抗体啊，很多文献是直接用磁珠分选进行阴性选择分选出来的，请问我们的方法是否可行？

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