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标题: [求助]流式细胞仪间接免疫荧光 [打印本页]

作者: cocacola 时间: 2012-3-8 17:30 标题: [求助]流式细胞仪间接免疫荧光

想做细胞免疫荧光，采用间接法用流式细胞仪检测细胞内蛋白，不知道是否要打孔。好像做涂片的免疫荧光不用加打孔素，不知道流式细胞仪的用不用。急，谢谢

作者: redbutterfly 时间: 2012-3-8 17:32

流式检测胞内蛋白需要固定和打孔处理。

作者: 49888 时间: 2012-3-9 11:51

这就要区分你做的细胞是活细胞还是死细胞了，好多东西活细胞是进不去的，必须通透了

做爬片的时候通常细胞已经死了，膜的透过性改变了，好多可以进去了，还是还有一些是需要加通透剂的

流式也是如此，只不过流式一般的实验材料（也就是细胞），状态都比较好，一般都是需要打孔的

作者: u234 时间: 2012-3-9 16:25

流式细胞仪做的就是细胞，但是不知道用多聚甲醛固定后可以放多久。因为实验条件还有所限制。先固定保存，还是标记抗体后再固定呢？有没有哪位仁兄做过相关的课题呢。是测定细胞内的蛋白。

作者: daod 时间: 2012-3-9 16:26

流式检测一般都是要求新鲜标本新鲜检测的，如果实在没有办法，采用固定的方法也可以试一试，但是尽量提早检测，以防得到错误的结果。一般，固定保存一晚问题是不大的，时间长了就不知道会怎么样！
如果检测的是表面抗原分子，则是先标记抗体，然后再固定，检测时用PBS洗涤一次就可以直接上样分析。
如果检测的是胞内蛋白或者分子，则是先固定，可以上机检测时再打孔标记胞内蛋白的抗体上机检测。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-3-9 16:47

间接荧光标记，一定要做好对照~尤其是同型对照。
间接标记的好处是节省费用，敏感度高
但是缺点也很明显：非特异性结合要比直接标记的抗体高出很多~

作者: idea2011 时间: 2012-3-9 16:48

我用的TritonX100的方法，不过好像抗体都没有进去。用的1%的多聚甲醛固定，不知道是不是固定不够还是打孔没有打好。

作者: xueyouzhang 时间: 2012-3-9 16:48

各为高手，请教一下，本人做人外周血单个核细胞的IL-17，也是由于流式仪使用时间的限制，要在刺激，阻断后，第二天，才能检测，我在坛子里看到有前辈建议“对于6小时的protocol，一般采用较多的是在刺激2小时后加入BFA 和Monensin来阻断高尔基体功能，刺激因子的表达，使合成的Intracellular Cytokine能留在细胞内部分必到细胞外，才可以由经Intracellular Cytokine Staining检测到。
阻断后再培养4小时可以把细胞放进4度冰箱留待染色用。 ”

我有一点不明白，（阻断后再培养4小时可以把细胞放进4度冰箱留待染色用），是带着刺激，阻断剂一起就放在冰箱里，不需要离心，清洗等处理后再4度保存吗？在保存的时间里，刺激，阻断剂不会对细胞造成影响吗？

问题比较傻，请大家不吝赐教，谢谢

作者: jrwyyplt 时间: 2012-3-9 16:49

我用的TritonX100的方法，不过好像抗体都没有进去。用的1%的多聚甲醛固定，不知道是不是固定不够还是打孔没有打好。

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1. 2%PFA（PBS配制)固定1小时，冰浴
2. 离心，弃上清，重悬细胞后，PBS（含1%BSA)洗细胞1-2次
3. 0.1%saponin(pbs配制）+1%BSA 15分钟冰浴

4. 离心弃上清，不洗，重悬细胞，染色40分钟，冰浴~

5. 0.1%saponin(pbs配制）+1%BSA 洗细胞3-5次
6. 加1%PFA，上机检测（注意，如果采用的是复合燃料PECY5.5等，必须在1小时以内检测，否则荧光变化很厉害）
7. good luck

作者: lagua123 时间: 2012-3-9 16:52

各为高手，请教一下，本人做人外周血单个核细胞的IL-17，也是由于流式仪使用时间的限制，要在刺激，阻断后，第二天，才能检测，我在坛子里看到有前辈建议“对于6小时的protocol，一般采用较多的是在刺激2小时后加入BFA 和Monensin来阻断高尔基体功能，刺激因子的表达，使合成的Intracellular Cytokine能留在细胞内部分必到细胞外，才可以由经Intracellular Cytokine Staining检测到。
阻断后再培养4小时可以把细胞放进4度冰箱留待染色用。 ”

我有一点不明白，（阻断后再培养4小时可以把细胞放进4度冰箱留待染色用），是带着刺激，阻断剂一起就放在冰箱里，不需要离心，清洗等处理后再4度保存吗？在保存的时间里，刺激，阻断剂不会对细胞造成影响吗？

问题比较傻，请大家不吝赐教，谢谢

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谁说的培养后可以把细胞放进4度冰箱留待染色用的？你想留待多长时间？放在4度冰箱细胞是会死的，是会严重影响你的实验结果的。做实验时要安排好时间，根据流式检测的时间合理安排好刺激的时间，染色所需要的时间，尽量缩短细胞收集到检测时的时间。
另外，细胞放到4度冰箱后细胞的新陈代谢会大幅度下降，刺激剂和阻断剂等基本不会影响细胞。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-9 16:52

有没有人用Triton打孔做的呢，时间和浓度是多少呢？有没有人做过啊，摸索了一段时间了效果似乎不是很好。

作者: 101010 时间: 2012-3-9 16:53

据我所看过的文献，检测胞内细胞因子没有用Triton打孔的，有那摸索的时间，买瓶皂素配了，实验就做出来了。
做实验好比西方人做烹饪，加什么料，加多少，都是严格控制的。这样即使是布什总统也能做出美味的肯德基鸡腿。既然文献都推荐用0.1%的皂素，那你就用，至于为什么，不是你关心的主要问题，您说呢？

作者: 101010 时间: 2012-3-9 17:13

说的培养后可以把细胞放进4度冰箱留待染色用的？你想留待多长时间？放在4度冰箱细胞是会死的，是会严重影响你的实验结果的。做实验时要安排好时间，根据流式检测的时间合理安排好刺激的时间，染色所需要的时间，尽量缩短细胞收集到检测时的时间。
另外，细胞放到4度冰箱后细胞的新陈代谢会大幅度下降，刺激剂和阻断剂等基本不会影响细胞。

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说的很对，人为设置实验干扰因素，其结果可靠性将大大的下降！

作者: Ao7 时间: 2012-3-10 09:03

各为高手，请教一下，本人做人外周血单个核细胞的IL-17，也是由于流式仪使用时间的限制，要在刺激，阻断后，第二天，才能检测，我在坛子里看到有前辈建议“对于6小时的protocol，一般采用较多的是在刺激2小时后加入BFA 和Monensin来阻断高尔基体功能，刺激因子的表达，使合成的Intracellular Cytokine能留在细胞内部分必到细胞外，才可以由经Intracellular Cytokine Staining检测到。
阻断后再培养4小时可以把细胞放进4度冰箱留待染色用。 ”

我有一点不明白，（阻断后再培养4小时可以把细胞放进4度冰箱留待染色用），是带着刺激，阻断剂一起就放在冰箱里，不需要离心，清洗等处理后再4度保存吗？在保存的时间里，刺激，阻断剂不会对细胞造成影响吗？

问题比较傻，请大家不吝赐教，谢谢

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不要放在4度冰箱。可以把胞外染上，然后固定穿膜，染上胞内放四度过夜，次日再检测。如果时间实在来不及至少要染上胞外后固定过夜。

作者: lixi559 时间: 2012-3-10 09:04

4%的多聚甲醛固定，1%的 Trion*100

作者: ritou1985 时间: 2012-3-10 09:05

显然表面抗体
然后用百分之一的多聚甲醛，固定，时间从15分钟到过夜都可以。推荐15分钟，因为过夜会影响phenotype。
然后洗。
用0.1%的saponin打孔，15分钟。
然后洗
染细胞内蛋白。

作者: october7 时间: 2012-3-10 09:16

不知道像abcam提供可以用作Flow Cyt, ICC/IF, WB的抗体是直接法的还是间接法的，怎么看？

作者: ha111 时间: 2012-3-10 09:17

是有打孔试剂

作者: xingyi08 时间: 2012-3-10 09:17

流式检测胞内蛋白需要固定和打孔处理

作者: skytree 时间: 2012-3-10 09:21

小弟刚开始接触流式，拟做小鼠脾脏细胞流式检测表面抗原分子，请教各位大侠，在处理细胞时用冷的PBS洗完两遍后孵育抗体半小时，再用PBS洗了就可以上机了吗？需不需要用多聚甲醛来固定？

作者: join 时间: 2012-3-10 09:22

去年11月我用流式细胞仪做了MSC表面的抗原鉴定，结果很理想，不需要用多聚甲醛来固定了，因抗原位于细胞表面，而不是在胞内

作者: nn255 时间: 2012-3-10 09:23

只要是染胞内就必须固定，通透，增加细胞膜的通透性，否则抗体如何进入细胞内，固定可用4%多聚甲醛，通透可用皂素；当然有的试剂盒会配备

作者: nn255 时间: 2012-3-10 09:36

我比较喜欢的两本流式书籍：
贾永蕊《流式细胞术》这本术讲应用讲得比较清楚，具体到怎么操作。

杜立颍、冯仁青《流式细胞术》这本书讲理论讲得多点，也蛮具体的。

作者: Ao7 时间: 2012-3-10 09:37

小弟刚开始接触流式，拟做小鼠脾脏细胞流式检测表面抗原分子，请教各位大侠，在处理细胞时用冷的PBS洗完两遍后孵育抗体半小时，再用PBS洗了就可以上机了吗？需不需要用多聚甲醛来固定？

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如果你是当天做流式的话不用固定

如果第二天做的话需要固定且标记后的细胞要避光保存偶一般还放在4度冰箱里

作者: ffooll 时间: 2012-3-10 09:39

学习了。

在下也有个问题请教各位高手，我现在正在做流式，是做肝脏组织内的淋巴细胞含量，可是实在不顺利，做了好几例，细胞没有办法圈门，分群不明显，实验室的老师建议先用淋巴细胞分离液，但是具体步骤不知道啊。再摸索还不知道的多长时间。请大家帮忙，有谁做过类似的，给点建议吧，先谢谢了。

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