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标题: [求助]流式annexin-v检测早期凋亡的问题！ [打印本页]

作者: star#room 时间: 2012-3-10 10:40 标题: [求助]流式annexin-v检测早期凋亡的问题！

请教各位流式高手，我的课题是检测某种药物对肿瘤细胞的凋亡影响，实验设计中用两种药物浓度（ec50 and 2ec50）处理培养细胞，然后用annexin-v kit检测早期凋亡。附件中图为（1）未处理的细胞未染色上流式；（2）未处理的细胞双染后上流式；（3）ec50药物浓度处理的细胞双染后上机；（4）2ec50浓度的药物处理的细胞双染后上机。请问，为什么出来的流式图呈现直线形式？pi单阳和annexin单阳区域都无明显细胞，而pi(+)annexin(+)双阳区域的细胞呈现斜线上升型，而不是团状？？？
恳请各位赐教！
图1：

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作者: star#room 时间: 2012-3-10 10:40

图2：

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作者: star#room 时间: 2012-3-10 10:46

图3：

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作者: star#room 时间: 2012-3-10 10:48

图4：

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作者: 831226 时间: 2012-3-10 10:48

颜色补偿估计没调好

作者: star#room 时间: 2012-3-10 10:49

QUOTE:

原帖由 831226 于 2012-3-10 10:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
颜色补偿估计没调好

请问，怎么做好颜色补偿了？

作者: 831226 时间: 2012-3-10 10:49

个人做凋亡参考的一篇文章，觉得不错，转贴供参考

制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：
a) 没有染色的细胞;
b) 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞;
c) 仅用PI染色的细胞.
1. 上样未经染色的细胞，在线性FS-SS点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。
注意：细胞在经培养后光散射信号会发生变化。要注意使用侧向散射光设门来识别出这些已改变的细胞。
2.建立LogFL1-LogFL3双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞；保证>98%的细胞处于在X、Y轴Log 1为边界的左下象限中心区域。
3. 检测annexin V-FITC单染的细胞并检查FL1-FL3散点图，保证在左上和右上象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在上端象限则说明有荧光渗漏；此时FL1的荧光被FL3 PMT检测到了。为了纠正这种现象，增加FL1漏到FL3荧光的补偿%（这可能在1-5%之间）。如果这个调节没有有效地去除FL3的阳性信号，此时要降低FL3 PMT的电压。
4. 检测PI单染的细胞并检查FL1-FL3散点图，保证在右上和右下象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏；此时PI的荧光被FL1 PMT检测到了。为了纠正这种现象，增加FL3漏到FL1荧光的补偿%（这可能在15-25%之间）。如果这个调节没有有效地去除FL1的阳性信号，此时要降低FL1 PMT的电压。
5. 如果在以上调节补偿过程中更改了PMT的电压，我们建议重复3、4步骤，确保不引起过度荧光补偿。过度补偿可以从阳性细胞十分贴近从标这一现象观察出来。一个恰当的补偿应该是单阳性细胞荧光强度与落在左下Log 1为边界象限中间阴性细胞的荧光强度一致。
6.因为许多未处理的细胞群体中存在一定数量的annexin V和PI双阳性的细胞，运用annexin V试剂盒来检测凋亡必须从处理过的细胞中扣除这些原本就存在的双阳性细胞。
7.根据未处理细胞或对照细胞经annexin V和PI染色后在流式细胞上分析的结果来设定十字门的位置，FL1和FL3的划定方法如下：
a. 设定FL1标尺位置: 处于左下象限内的大群细胞是annexin V染色阴性的细胞（一般这些细胞会在FL1轴方向上升至2个对数坐标值）。将垂直的FL1标尺设定在紧靠annexin V阴性群体右侧0.1-0.2Log单位的地方。b. 设定FL3标尺位置: 可以通过一定数据的双阳性细胞来区分PI+和PI-的细胞群体。在此条件下可能会识别出两群细胞，一是位于散点图的右下方（ANN+/PI-）还有就是右上方（ANN+/PI+）。水平线可以置于这两群细胞的中间。如果在分析的细胞群体中没有PI+细胞，区分PI+细胞最好是参照双阴性细胞群体，将水平线设在双阴性细胞以上0.1-0.3 Log单位的地方。理想中，以上介绍的设门方法可以适用于任何细胞群体来设定十字门的位置。
8. 经处理过的细胞此时可以用annexin V 和PI染色后在流式细胞仪上分析。那些在在阴性群体门以外的细胞可被识为annexin V或annexin V和PI阳性的细胞。

作者: flower-201 时间: 2012-3-10 10:50

楼主你好，我想问一下你们用的流式是哪个公司的？在直方图里面FITC的信号是不是特别高？我们最近的调亡实验也有你这样的现象出现，怀疑可能是仪器的漏洞。

作者: 911 时间: 2012-3-10 10:54

楼主你好，我想问一下你们用的流式是哪个公司的？在直方图里面FITC的信号是不是特别高？我们最近的调亡实验也有你这样的现象出现，怀疑可能是仪器的漏洞。

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你好，我们用的是BD公司的FACSCalibur(TM) Flow Cytometer，之前有人做过比较漂亮的图，我想主要可能还是上机调试及颜色补偿做的不好，下次会参照laugh的调试方法再进行实验！

另外，请问大家一般的早期凋亡都是诱导多久时出现的了？对于药物剂量及作用时间是否有大虾摸出了一些经验的？我的实验使用了ec50及2ec50剂量的药物作用于cancer cell，作用24～96h，而最后看起来在作用24h的时候就更多的象是晚期凋亡及坏死了：（

是否我需要降低药物浓度，采用有人推荐的1/2～1/3ec50，或者减少作用时间，采用6，12，……的timecourse了？

恳请赐教！

作者: KGZ564 时间: 2012-3-10 10:55

我们用的也是BD的仪器，但我们做的是调亡基因，一般作用时间都不超过24h，所以我觉得你还是应该降低药物的作用时间看看。有事先去忙了，有时间再细说。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-3-10 10:55

请教一下，我最近做的凋亡的流式图，在右上区域有线型的非特异性表达，是正常的吗？如果不是正常的，那是什么原因呢？刚开始做，没有经验，希望高手不吝赐教！

作者: 小鱼鱼 时间: 2012-3-10 10:58

检测问题。

作者: windy+++ 时间: 2012-3-10 11:00

recompenaste it with Flojo or FCS express, Fl2-20%Fl1

作者: 2541 时间: 2012-3-10 11:01

检测问题。

请问是什么检测问题，请详细指教一下？
还有我最近做的为什么pi 表达都是零，不可能没有死亡细胞吧？

作者: utt0989 时间: 2012-3-10 11:01

我是用BECKMAN COULTER公司四色流式做的，PI该在地基通道上，请高手指教

作者: zranqi_1 时间: 2012-3-10 13:13

我用的是BD公司的抗体，在BECKMAN COULTER公司的流式上检测，请问会不会有影响

作者: jujuba 时间: 2012-3-10 13:14

不会，在coulter的仪器上pi应该在第三通道

作者: gemei0115 时间: 2012-3-10 13:16

请教正常组的早期凋亡率特别高，而晚期凋亡却不高的原因？

作者: 00无名指00 时间: 2012-3-10 13:16

如果是才开始筛选药物作用浓度的话不需要用流式来检测，成本高而且麻烦。建议先用MTT从大梯度到小梯度筛选一下，然后确定几个浓度再用FCM检测。而且你这个明显就是补偿没调好。双阴性上机时侯横纵坐标的阳性率都要调到0.02以下的。

作者: toy 时间: 2012-3-10 13:17

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