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标题: [求助]lipofectamine2000的转染率 [打印本页]

作者: gemei0115 时间: 2012-3-15 13:14 标题: [求助]lipofectamine2000的转染率

我第一次用lipofectamine2000，请问一下转染率大概是多少？我了解转染率与质粒与质脂体的比例，细胞融合的百分数，转染时间有关系。但是我筛选的细胞株比较小，如果让细胞汇合到80％，细胞的个数要比说明书上的参考个数多一倍多，我想问转染时加入的质粒的量与细胞的个数有关系吗？如果有，我是不是应该比说明书中的参考量多加一些呢？在转染的五六个小时中，大家说细胞有增殖吗？我怎么感觉经过五个小时的转染后，细胞反而少了呢？谢谢

作者: yueban-1147 时间: 2012-3-15 13:15

一些常用的细胞，用推荐的用量，2k效率还是很高的，像293T,cos等细胞我转GFP做对照一般48h后80%的细胞都有表达，当然如果你的细胞比较少见，为了达到最佳效率，应该做个条件优化

作者: lagua123 时间: 2012-3-15 13:15

如果是这样的话，你还是等到细胞有80%的汇合的时候再转好些。因为我感觉做的时候从来没有像楼上的那种转染的效率，也就是40%～50%，可能楼上的技术高超。一般来说，脂质体对细胞都有毒性，所以细胞不会有太多的精力去长，你的细胞变少我想也有这个原因，一些细胞可能漂了起来。

作者: ending 时间: 2012-3-15 13:16

嗯，80％的话还比较保守，因为我在用293T转GFP融合的片断，几乎所有的细胞都有荧光，但有些细胞就不行，大约50%左右

作者: abc816 时间: 2012-3-15 13:16

发两张转染前后的293对比。不同的细胞转染效率差很多，有些就很低，比如HepG2.
转染前：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11095

作者: abc816 时间: 2012-3-15 13:16

转染后：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11096

作者: HPLC使者 时间: 2012-3-15 13:17

293T细胞啊，我想要，我们实验室没有，各位前辈能不能告诉俺怎么能弄这个细胞！

作者: 911 时间: 2012-3-15 13:17

QUOTE:

原帖由 abc816 于 2012-3-15 13:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

转染后：

挺高的效率了

作者: is2011 时间: 2012-3-15 13:17

我看过相关文章最多转染HELA细胞才百分20，HELA够常见吧？

作者: baidukk 时间: 2012-3-15 13:18

我们做lipo感染293T一般效率都在百分之九十以上。不知道yinhaipeng战友要转什么细胞。你最好根据你的细胞情况，也就是在转染前，一定要把你的靶细胞习性摸清楚。细胞状态一定要好，细胞密度可以做个梯度实验看哪个密度适宜，说明书上写的只能参考。转染时质粒用量和 lipo比例根据说明书上的推荐比例和你手头质粒量适当调整，应该问题不大。转染后换液时要注意动作轻柔。还有不要让细胞在外面放太久。呵呵，做转染的人都喜欢在显微镜下欣赏自己的荧光。祝你好运！

作者: kewanqi2011 时间: 2012-3-15 13:18

我也正在做Lipofectamin2000的转染，不过是做小干扰RNA瞬时转染，可能跟楼主的质粒转染还小有区别！可以交流一下。
楼主心里很清楚啊！脂质体2000的转染效率跟质粒与2000的比例、细胞的状态、密度以及转染的时间有关，但我个人体会是不能盲从别人的经验，尤其是过分地相信国内文献上的操作步骤！最可靠的还是根据说明书，然后结合自己对要转的细胞习性的把握进行预实验，摸索一下条件！找到最佳的配比、最佳的细胞密度、状态、最合适的转染时间。我个人一些教训可以参考一下，希望对楼主有帮助：
1、细胞状态不好时，千万不要做转染，纯粹浪费时间与精力！一般是选择最佳状态的细胞传代种板，24小时待细胞融合达70-80%开始做！要注意事前算好细胞种板的密度，是不是在做转染时正好细胞融合到70-80%。当然这个24小时也是针对绝大多数细胞，比如我自己的细胞分裂周期要33个小时，我一般是第一天晚上种板，第三天早上转染！所以预先掌握自己细胞的习性很关键！
2、操作一定要轻柔，尤其是用枪配制转染液时！脂质体的原理就是要包裹质粒进入胞内，所以轻柔操作就很关键，这步直接关系最后的转染效率。而且最好配制时是把脂质体加到质粒里，原理一样！
3、转染时尽量减少细胞在孵箱外暴露的时间，尽可能把所有的准备工作都准备好才拿细胞！
4、楼主说的加转染液细胞出现死亡是正常的。因为脂质体对细胞是有毒性的，尤其是快过期的脂质体，所以最好用新的。
祝好运！

作者: zhezhe 时间: 2012-3-15 13:19

能否说说对悬浮细胞如HL-60细胞的转染情况,(如细胞浓度、配比等），谢谢！

作者: 缘yuan 时间: 2012-3-15 13:19

我作过的hella细胞或ＥＰＣ细胞用lipofectamine2000可以达到７０％－８０％的荧光率（带ＧＦＰ标记），可以说关键是操作的技巧。国外正在卖一种新的转染试剂，可以达９０％上，其内容是在buffer上动了下脑筋，卖得可贵。一般只要按照protocol上操作，基本可以满足实验要求！其中一定注意好细胞生长密度和状态哦！

作者: summerxx 时间: 2012-3-15 13:19

个人觉得：转然还不是很难得问题～～

关键是转然后筛选稳定克隆的问题才难～～，太费时、费力～～～！还不讨好～～

作者: 中国特色 时间: 2012-3-15 13:20

lipo2000转染一般按说明书用量完全可以，不必多加，转染后4-6 小时换液即可，由于其毒性，细胞死亡是正常的

作者: bananapeople 时间: 2012-3-15 13:20

做转染时注意事项挺多，说明书上也很全。我觉得重要的有这么几点：
1.质粒的纯度。
2.质粒与Lipofectamin2000的比例。质粒浓度的估量挺重要的。

至于细胞密度，我觉得可能以种类不同而不同，最好自己摸索一下。
生长状态上面都说了，非常重要。不要做了再后悔，浪费时间。
转染的五六个小时，细胞数目少是正常的，在更换完全培养基之前，应该感觉细胞的轮廓非常清晰。
转染荧光蛋白时，应该比较容易达到60-70%。但是转自己的质粒时，表达量将非常重要。

作者: 吴才子 时间: 2012-3-15 13:20

个人认为，Lipofectamin2000的效率还是挺高的。我曾为另外一个公司的转染试剂作试用报告，与LF2000相比，毒性是小了，效率上却差了很多。但是LF2000的效率和毒性有的时候也受生产批次的影响，我们实验室因为使用较多，所以试好了哪一个批次的就会买一些备用。我还是推荐质粒与LF2000的比例为1：2，即转染六孔板，我一般常用4微克的质粒和8微升的LF2000。当然，转染效率要看细胞的状态，质粒的纯度，脂质体的毒性，细胞的种类等。转染时，细胞最好处于对数生长期，此时转染效率最高。细胞的种类也很重要，像293A，293T，HeLa等都是转染效率较高的细胞，一般可以达到70%。有一些细胞是很难转的。一般转染6小时就可以了，理论上说不用撤液，但是脂质体毒性还是不小的，应该撤液。若是转染对细胞生长有毒性的蛋白，保持1：2的比例，质粒和脂质体都适当少加。具体某一个细胞系，某一个质粒的操作条件可能还需操作者自己摸索。

作者: xingyi08 时间: 2012-3-15 13:21

我觉得具体的转染效率要看细胞，我们曾经同时转染过一种肿瘤的两个细胞系，结果一个转染效果很好，另外一个基本没转染进去。
再有，我觉得lipofectamine2000的转染效率不如他们公司之前的产品lipofectin好，我们曾经同时用这两种转染试剂转染过同一种细胞，后者的效率明显好于前者，而且毒性要小，但是不知道为什么invitrogen公司用lipofectamine2000替代了lipofectin，后者已经没有的买了。

作者: hold住 时间: 2012-3-15 13:21

我在实验过程中觉得,LF2000的推荐比例比较高,若果我降低比例可以得到更高的效果,不知道各位也遇到这种情况,还是***作有问题.
我的DNA浓度1ug/ul左右,6孔板转染,2ugDNA,5ulLF2000 的时候效果更好一些,我转染的是MCF-7,最好也没有50%.
希望各位指教!
学习学习!

作者: jujuba 时间: 2012-3-15 13:22

各位前辈，大家好！我看楼上有做小干扰RNA瞬时转染的，我也要做这个，我刚刚接触实验，很多问题都不明白，希望各位多多指教，我要转的是HepG2细胞，现在用的是含5%血清的1640培养基，我想问一下，转染时需要注意什么问题呢？还用这种培养基可以吗？我在前一天传代铺板第二天转染可以吗？另外，就是我转染后要做MTT分析时效和量效的关系，我是否可以直接用96孔板做转染就可以了？各位有没有相关的浓度梯度推荐给我啊？真的很迷茫，感激涕零！！！谢谢了！！

作者: DDD 时间: 2012-3-15 13:22

各位前辈，大家好！我看好多用24孔板作转染的，一般做质粒转染也用24孔吗？我直接培养瓶可以吗？另外，我想做完转染先做MTT，是不是可以直接用96孔板转？还是先在培养瓶里转然后再种细胞按照MTT的步骤做啊？前辈们多给我一点建议吧，我实在很迷茫啊，谢谢了！

作者: 831226 时间: 2012-3-15 13:22

我准备这几天作转染。有人说才复苏的细胞要传了三代后才转染比较好，因为传三代过后状态才比较好，请问是这样么？还有别人给我说细胞如果传了很多代了，会影响脂质体转进去的效率，因为在不断传代过程中，细胞膜结构可能改变，这种说法是否正确呢？
希望有经验的大侠指点下，谢谢

作者: guagua 时间: 2012-3-15 13:23

各位前辈，我想问问我要转染的是肝癌细胞株HepG2细胞，细胞密度达多少时转染最好啊？听说这种细胞株很难转，是这样吗？我刚接触实验，希望各位多帮帮忙！！！多谢了!!!

作者: guagua 时间: 2012-3-15 13:23

我想问问各位，转染时加DNA或RNA时几微克是不是还需要换算阿？具体怎么算阿？听说还得用什么仪测,是这样吗？怎么算阿？有哪位好心人帮帮我啊？急需求助阿，谢谢！！！

作者: redbutterfly 时间: 2012-3-15 13:24

我也是在HepG2细胞的转染，听说这个细胞很不好转染，我师姐建议我用含有GFP标记的质粒转染，与目的质粒同时做，可以评价目的质粒的转染效率，然后再进行后面的实验。
1.转染没听说过用培养瓶做的，那样消耗脂质体太多了，脂质体1.5ml的就要3000多块，一个瓶里要加至少3 4ml培养基，你可以按比例算一下大约需要多少脂质体。
2.HepG2细胞长得比较慢，建议传代时密度稍微大一些，10000/孔（96孔板）应该算比较大了。第二天的时候细胞融合能到80%左右。我种板时用的不含双抗的含有胎牛血清的MEM培养基，到转染时把培养液吸去，先加入50ul不含血清不含双抗的MEM，然后加入用不含血清不含双抗的MEM稀释过的混合了质粒和脂质体的液体。6h左右后换液，加入含有10%胎牛血清和双抗的 MEM，继续培养。
3.不明白你的意思，“转染时加DNA或RNA时几微克是不是还需要换算阿？”你的质粒应该是浓度已知的比如**ug/ul，按照说明书的要求每孔加入**ug，那你就可以计算出你要加入的质粒有**ul。测定质粒弄得可以在紫外分光光度计上测定OD260，然后进行换算，应该是OD260*？？*稀释倍数=*ug/ml（？记不清了，RNA的应该是40）。
4.转染可以在96孔板中做，然后再做MTT就可以，转染不应该再培养瓶中做，太浪费了而且不能保证脂质体与质粒充分的作用于细胞。
祝你好运，我最近也在做，HepG2确实不好转，建议你先做一下预实验，然后摸索到好的条件在大批量的做MTT，我的惨痛教训，没做预实验直接进行下边的实验，一下做了40个孔，结果检测质粒根本没转进去，我的下边的试剂全都浪费了，将近80块钱呢。
我也正在摸条件，祝我们同样好运。

作者: plaa 时间: 2012-3-15 13:24

有关转染很头疼的问题：
为什么转然后我的细胞几乎都死了，条件摸的是最佳的转染条件，并且质粒提的纯度在1.8以上，不知道是哪个环节出了问题！

作者: guagua 时间: 2012-3-15 13:25

我想问下各位，我做预实验摸出了最佳的转染比例，但做正式试验时转染后48小时见液体变黄就换液了，今天早上一看细胞全死了，什么原因啊?难道换液对它刺激就死了吗？但是不换液也不行吧？为什么预实验挺好的正式实验就不行了呢？请各位前辈帮帮我吧！多谢了！

作者: loli 时间: 2012-3-15 13:25

关于质粒的纯度: OD260/280 其实没什么,主要看你用什么方法纯化的,电泳后条带是否清晰,去盐了么?去酚了么?去内毒素了么?去RNA了没? 脂质体它是随机的将小分子包在内部,上述的各种杂志会严重影响脂质体:质粒复合物形成,并且有些还会对细胞有致命的毒性.
关于脂质体,invitriogen的各种产品说明上都有明确的比例介绍,一般是与质粒的量相比较而定,每种细胞对脂质体的毒性反应不同,所以对转染的时间,转染试剂的用量，细胞的铺板等,都有所要求.

作者: wsll 时间: 2012-3-15 13:26

1. 我个人觉得转染不是很难，但是质粒的提取比较重要，一定要把一些杂质除去。
2.我个人转染过大概5ug， 10ug的质粒进入Hela，感觉都不错。
3.Lipo2000上面推荐的量个人感觉有点偏高，适当降低也可以做的很好。
4. 我用Hela，H1299做转染，293T转染效率道理上应该高些，但是因为293T处理起来很难，很容易漂起来，我一般不用。

作者: duoduo 时间: 2012-3-15 13:26

我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，以下是个人经验，与大家分享。

1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。

2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。

3.无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍（我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高）。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。

4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的！

5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒，我做的结果都不好。

6.48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高

作者: toy 时间: 2012-3-15 13:26

有没有用lip02000转RAW细胞的？同样的操作跟师姐比我的转染效率就是低

作者: qqq111 时间: 2012-3-15 13:26

蛮好比我做的好很多！

作者: october7 时间: 2012-3-15 13:27

我第一次用lipofectamine2000，请问一下转染率大概是多少？我了解转染率与质粒与质脂体的比例，细胞融合的百分数，转染时间有关系。但是我筛选的细胞株比较小，如果让细胞汇合到80％，细胞的个数要比说明书上的参考个数多一倍多，我想问转染时加入的质粒的量与细胞的个数有关系吗？如果有，我是不是应该比说明书中的参考量多加一些呢？在转染的五六个小时中，大家说细胞有增殖吗？我怎么感觉经过五个小时的转染后，细胞反而少了呢？谢谢

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我转的是平滑肌细胞，转染效率是接近100%，用的是lipofectamine2000，我全是按照说明书上操作的，脂质体的量固定，质粒加多了也没用，脂质体是媒介，但增加脂质体又会对细胞有损失，所以一定要合适的比例，最好摸索一下，一般在无血清培养基转染5-6h，不考虑增殖的影响。

作者: 66+77 时间: 2012-3-15 13:27

个人认为，Lipofectamin2000的效率还是挺高的。我曾为另外一个公司的转染试剂作试用报告，与LF2000相比，毒性是小了，效率上却差了很多。但是LF2000的效率和毒性有的时候也受生产批次的影响，我们实验室因为使用较多，所以试好了哪一个批次的就会买一些备用。我还是推荐质粒与LF2000的比例为1：2，即转染六孔板，我一般常用4微克的质粒和8微升的LF2000。当然，转染效率要看细胞的状态，质粒的纯度，脂质体的毒性，细胞的种类等。转染时，细胞最好处于对数生长期，此时转染效率最高。细胞的种类也很重要，像293A，293T，HeLa等都是转染效率较高的细胞，一般可以达到70%。有一些细胞是很难转的。一般转染6小时就可以了，理论上说不用撤液，但是脂质体毒性还是不小的，应该撤液。若是转染对细胞生长有毒性的蛋白，保持1：2的比例，质粒和脂质体都适当少加。具体某一个细胞系，某一个质粒的操作条件可能还需操作者自己摸索。

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我也是用6孔板做转染的，都说加入脂质体和质粒之后的总共体积是500微升每个孔，那么我想知道如果放在培养箱里5个小时，不会干掉吗？？

作者: glass 时间: 2012-3-15 13:28

转染非得传代后做吗？一直生长的换液后直接转染不行吗？并且，我这样转染的效率也很高啊。请问是不是有什么不好的，望指点

作者: 笑弯了腰 时间: 2012-3-15 13:28

我也是用6孔板做转染的，都说加入脂质体和质粒之后的总共体积是500微升每个孔，那么我想知道如果放在培养箱里5个小时，不会干掉吗？？

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这是所配的转染试剂的体积，你的六孔板里还得加opti-MEM 1.5ml啊。

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