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标题: [求助]用Lipofectamine™ 2000 转染细胞时... [打印本页]

作者: caihong 时间: 2012-3-15 17:23 标题: [求助]用Lipofectamine™ 2000 转染细胞时...

请问大家，用Lipofectamine™ 2000 转染细胞时，除了质粒和Lipofectamine™ 2000 用无血清培养液稀释外，细胞培养液是不是也必须无血清，请做过转染的战友给点建议，加不加有什么差别吗？再有6小时可以换液了吧（10％DMEM），换不换有差别吗，此时可以加双抗了吗。谢谢大家。

作者: ha111 时间: 2012-3-15 17:23

稀释时一定不要加血清和双抗，培养液里可以加血清，加与不加没什么大的区别。至于换液根据复合物对细胞的毒性而定，有的转染后对细胞产生毒刑，所以最好要换液，换液可以从转染后0.5-24小时。如果以后要用抗性（如G418）筛选那么，最好不要加双抗了。

作者: 04906 时间: 2012-3-15 17:24

如果以后要用抗性（如G418）筛选那么，最好不要加双抗了。

这个是什么原因啊！？

作者: one 时间: 2012-3-15 17:24

稀释时一定不要加血清和双抗，培养液里也不加血清，并且转染时用ＰＢＳ清洗细胞两遍，已消除血清对转染的抑制效果，６小时后补加血清，我是这么做的，效果不错．

作者: 101010 时间: 2012-3-15 17:24

请问补加血清时是不是滴几滴就可以,你换液了吗

作者: jujuba 时间: 2012-3-15 17:25

转染的时候不加血清。但是转染过后最好换液，换成完全培养基吧。反正换液跟补加血清相比也麻烦不了多少，而且脂质体对细胞还是有一定的毒性的，换掉它比较好。

作者: junhun 时间: 2012-3-15 17:26

我转染时用OPTI-MEM无血清培养基一般4-5小时后换为完全培养基（血清浓度5%） 48小时后在进行筛选效果不错

作者: toy 时间: 2012-3-15 17:27

同问，为何用G148筛选不要加双抗啊？
难道双抗对细胞状态有影响？

作者: skytree 时间: 2012-3-15 17:27

大家怎么理解这句话：Lipofectamine™ 2000说明书上的：
4）incubate the cells at 37°C in a CO2 incubator for 24-48 hours until they are ready to assay for transgene expression. It is not necessary to remove the complexes or change the medium; however, growth medium may be replaced after 4-6 hours without loss of transfection activity.
是不是可以在24－48小时中换培养液？

作者: vera+ 时间: 2012-3-15 17:27

我也曾就此问题请教过一个公司，他们的技术支持这样告诉我：
在稀释LIPOFECTINE和质粒DNA时，一定要用无血清和无抗生素的培养基，而且培养基的成分越简单越好，因为这个过程只是为了让LIPFECTINE 包裹DNA，血清影响LIPOFECTINE 对DNA包裹。只要包裹好了，有血清应该对转染的过程不是很大。

作者: zsxan1990 时间: 2012-3-15 17:28

大家怎么理解这句话：Lipofectamine™ 2000说明书上的：
4）incubate the cells at 37°C in a CO2 incubator for 24-48 hours until they are ready to assay for transgene expression. It is not necessary to remove the complexes or change the medium; however, growth medium may be replaced after 4-6 hours without loss of transfection activity.
是不是可以在24－48小时中换培养液

转染后6小时或更久（根据细胞状态而定，一般1 /4~1/5细胞形态改变既可），可以更换完全培养基。再24～48h可以更换含筛选抗生素的完全培养基，这个时间也依赖于细胞的状态（部分细胞开始有生长、伸展的迹象时）。此外，加抗生素时建议不要换液，直接加到培养液中既可，因此时细胞较脆弱，尽量减少损伤）

作者: woshituzhu 时间: 2012-3-15 17:29

转染的时候培养液里不加血清，并且转染前用ＰＢＳ或hank's清洗细胞两遍。尽量的去除血清。血清对转染效率有抑制作用。转染过后最好换液，换成完全培养基。而且转染时培养基内不能有抗生素。脂质体对细胞有一定的毒性的，换掉它比较好。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-3-15 17:29

看了上面的讨论作为转染新手的我非常想知道另外一个问题就是根据说明书，转染之前需要更换培养基进行刺激，那么更换的培养基中是否是完全培养基还是物抗无血清的培养基呢？

非常感谢

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