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标题: [讨论贴]谁用过Amaxa公司的Lonza电转染试剂盒？ [打印本页]

作者: 吴才子 时间: 2012-3-18 08:31 标题: [讨论贴]谁用过Amaxa公司的Lonza电转染试剂盒？

有谁用过Amaxa公司的Lonza电转染试剂盒，想讨论一下。

[ 本帖最后由吴才子于 2012-3-18 08:42 编辑 ]

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 08:32

QUOTE:

原帖由 吴才子 于 2012-3-18 08:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有谁用过Amaxa公司的Lonza电转染试剂盒，想讨论一下。

你要讨论什么方面？这个东西，我用得比较多，算是它的第一批客户吧，非常好的东西。

作者: 吴才子 时间: 2012-3-18 08:34 标题: 回复 #2 园丁## 的帖子

你好，谢谢关注。
我用它来转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞，转染前收集1*10^6个细胞，电转之后到6孔板，10小时后用碧云天的蛋白提取试剂盒提蛋白，但是在镜检的时候，发现细胞可能只剩下1/2不到了。。。死亡过半
最后提完蛋白，测了一下浓度，只有20~30ng/ml的浓度，我感觉做WB，这个浓度肯定不行。
怎么解决死亡太多细胞的问题？有没有好的建议？

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 08:34

几个问题：
1，你是用的它推荐的程序和溶液吗？所有操作都严格按照它说的那样做了吗？
2，你用这个成功转过其它细胞没有？我想知道你操作上是否正确。
3，你的细胞状态如何？平时培养，传代是否正常。许多细胞转然后死亡率高，和细胞本身代数过老，状态不佳有很大关系。
4，你观察过24h，48h后细胞存活状况么？电转之后，我建议你至少做一次预试验，观察一下细胞恢复的时间，有些细胞本身贴壁就比较慢，电转之后，受点损伤，需要恢复的时间长点很正常。
5，你的plasmid我假设质量是合格的。
6，以上这些都正确操作，而且48hr后死亡还过半的话，我教你一个小trick，用a23程序，solution v，做一个质粒量的转染梯度，还是那么多细胞，2，4，7，10ug转染，取一个存活，效率综合都比较好的。
如果a23程序你的细胞还大量死亡，可以肯定你的细胞状态不好，和转染无关。因为这个程序作用极弱，正常的MDA-MB-231细胞是比较贱养的细胞，不会受到伤害的。

作者: woshituzhu 时间: 2012-3-18 08:35

1.我肯定是按照试剂说明书上推荐的程序操作的，严格操作。
2.我们这其他实验室也做过，一样的试剂，一样的细胞，比我的效果要好。
3.细胞状态的话，不敢保证非常好，因为我也不知道MDA-MB-231这个细胞在非常好的状态下是什么样子的。但是我感觉，MDA-MB-231这个细胞，为什么总是在显微镜下能看到在细胞上面有许多黑点儿？？是我的细胞有问题，还是这个细胞天生就有黑点儿？
4.我没有观察过24h,48h后细胞的状态。因为我根据试剂盒说明书上推荐，4~8h后就可以检测，但是，我征求了其他人的意见，知道可以等细胞长到48h后再收集，这样细胞数量会多一些，而且，保证转进去的基因正常表达。
5.质粒用天跟的无内毒素质粒大提试剂盒，大约在6个月前提的，一直保存于-20冰箱中，冻容少于5次。

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 08:36

我估计细胞状态是很大的因素，你这细胞可能代数太老或者污染了支原体，这是常常导致转染死亡率高和效率不高的重要因素。
你先用a23程序操作一次，48hr后观察贴壁和转染状况。

作者: 吴才子 时间: 2012-3-18 08:36

可能吧，我也不确定。不过血清都是用四季青的无支原体血清。我也不知道支原体污染是什么样的，但是，不是整个培养瓶都有黑点，只是细胞膜表面有黑色的点，像麻子一样。

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 08:37

同学，四季青的血清。。。。。。我建议你更换血清培养，极有可能是支原体污染导致细胞转染容易死，支原体污染对转染的影响是臭名昭著的，从转染效率，转染效率稳定性，到细胞存活，全面影响的。

作者: jujuba 时间: 2012-3-18 08:37

你好，我也要买该试剂盒，我想问一下你们查找到了该产品的MSDS(MATERIAL SAFETY DATA SHEET )了吗？可以告知我吗、？非常感谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 08:38

要MSDS干吗用？你只要product sheet，知道怎么操作不就可以了？

作者: 吴才子 时间: 2012-3-18 08:38

MSDS(MATERIAL SAFETY DATA SHEET )是什么啊？
我从没关注那个，我只知道这个系列的试剂盒，是不同的细胞对应不同的试剂，对应不同的转染程序。

作者: jujuba 时间: 2012-3-18 08:38

买试剂，要报关啊。
你们知道这个试剂的主要成分是什么吗？
谢谢

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 08:39

QUOTE:

原帖由 jujuba 于 2012-3-18 08:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
买试剂，要报关啊。
你们知道这个试剂的主要成分是什么吗？
谢谢

这个还要报关？都是盐离子溶液。

作者: abc816 时间: 2012-3-18 08:39

国内有代理公司买的，每种细胞都有专门的盒子，不过真的很贵，

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 08:40 标题: 回复 #14 abc816 的帖子

我们自己搞定了一种配方，基本上可以通用70%，我试过几十种，还没有不work的：）

作者: 吴才子 时间: 2012-3-18 08:40 标题: 回复 #15 园丁## 的帖子

你自己配的？那能用么。。。

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 08:41 标题: 回复 #16 吴才子的帖子

我都用了好几年了，转过的细胞都几十种了：）不要把这些看的太神秘，电转buffer就是一些盐溶液

作者: 3648755 时间: 2012-3-18 08:41

MDA-MB-231细胞正常存活率是70-80%,转染效率80%左右

细胞存活率低主要有几个原因：

1.细胞状态,建议转染前细胞融合度80%为宜；

2.质粒纯度，建议使用去除内毒素试剂盒，否则内毒素会造成细胞死亡；

3.细胞数量严格控制在1million/样品，过多或过少都会严重影响实验结果。

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