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标题: [求助]MTT实验未加DMSO前变黑色原因 [打印本页]

作者: 薄荷侠 时间: 2012-3-18 11:25 标题: [求助]MTT实验未加DMSO前变黑色原因

请问各位大虾，本人近来做MTT实验，用药物干预后，加入MTT试剂（加之前镜下观察发现细胞状态可，无明显污染），继续培养4小时后，准备加DMSO时发现培基颜色变黑，倒置显微镜下发现黑色固定物质沉积，加入DMSO后沉渣大部分溶解，酶标仪比色发现吸光度值特别高，大多1~2以上，不同浓度间部分还是有差异，但与平时吸光度明显不同，请教了几个以前做过的前辈，说是可能被污染了，但加MTT前确实无明显污染，加的时候也是在无菌间操作，MTT也经滤器过滤的，今天换了人家做过的MTT试剂也还是变黑了，请大家帮我分析原因，谢谢！

作者: yueban-1147 时间: 2012-3-18 11:25

应当是污染了，只有污染才会这样吧。污染你可能没看出来吧

作者: HP007 时间: 2012-3-18 11:47

我也有遇到这种情况，但同样的做法同学的药就没问题啊~是药物和MTT起反应了？

作者: 8964357 时间: 2012-3-18 11:48

应该不会是药物的原因。因为连对照的未加药物的几个孔也变黑了，我后来怕是不是血清有影响，还特意在加MTT前把原来的培基换成无血清的培基，结果还是变黑了。但我确实没看到明显污染，细胞生长较快，无明显漂浮物质及颗粒沉积，培基也无浑浊。请问鉴别那种不明显污染有什么好的办法？还有做MTT有什么需要注意防止污染的地方？谢谢！

作者: bananapeople 时间: 2012-3-18 11:48

换新的培养板，重新配制mtt溶液，再做一次试一下。

作者: 黄花菜 时间: 2012-3-18 11:49

根据你的描述，可以排除药物和MTT反应的可能，我感觉还是污染了，根据我的经验，MTT中污染的几种表现如下：
1.加入MTT前细胞状态不好，肉眼看培养液混浊，镜下大量细胞破碎、溶解、视野模糊、悬浮物较多；
2.黑角虫大量繁殖（它的数量和细胞状态相反，细胞状态好时，基本看不到）。
3.加入MTT后很短的时间（1－2MIN）内就变黑，而且是黑的反常，颜色很深。
4.跟以往的实验数据比，OD值过高（1.5以上，当然你的细胞密度太大则另说）；或OD值的增大与药物浓度明显不符。
5.加入DMSO之前，移去上清时，结晶很容易脱落，或大量脱落。
当然你首先要保证好MTT是无菌的，呵呵，仅供参考！

作者: yueban-1147 时间: 2012-3-18 11:49

我也遇见过这样的情况,我实在同步化24小时以后加药,分不同时间点,短时间点比如4小时,没有这样的情况,但12小时或24小时就出现变黑,有时是个别孔,有时是整个扳子,后来我缩短了同步化的时间,时间点也尽量缩短,就避免了这种现象.当时我的感觉是细胞长期处于无血清状态下已经死亡了.

作者: skytree 时间: 2012-3-18 11:50

我认为是你的细胞数太多的缘故!!!有人支持吗??

作者: 薄荷侠 时间: 2012-3-18 11:50

感谢各位回复，我今天又重复了实验，结果还是变黑了，加MTT后约5min就可以在镜下看到黑色的网格状的结晶样物质，而且加药组和对照组都有，但空白组没有，也就是加细胞的都有变化，参照另外未加MTT的板子，可以隐约看到背景有点模糊，是不是种板子时候已经污染了，但好象细胞长得还可以，密度也不大，MTT也过滤过的。请问各位是否隐性污染是不是对细胞生长影响不大？准备在严格无菌操作下再做一次。

作者: hyuu 时间: 2012-3-18 11:51

污染了，我也遇到过

作者: one 时间: 2012-3-18 11:51

我做过不下20次，没有出现过类似情况。但我认为不能用“污染”来解释，因为污染了细胞改变是要有一个过程的，在短短3－4小时内就将细胞“污染”成您描述的那种严重程度，似乎不太可能。我想大概和你的MTT有关，你可以换MTT重新做试一下。

作者: mimili_901 时间: 2012-3-18 11:52

细胞数太多了。
即使MTT不在超静台里加，4h细胞状态也不会有如此大的影响。我们带的学生实验MTT都是在外面加的，也出结果。

作者: c86v 时间: 2012-3-18 11:53

细胞太多了，你可以试试不同细胞浓度的MTT检测，我做过细菌和细胞相互作用，老是发黑，可能是细菌也可以还原四唑蓝，相应降低浓度就好多了

作者: DDD 时间: 2012-3-18 11:53

存在不是细胞数过多原因引起的可能。我最近做MTT也碰到类似的情况。整板中只有一两个孔加MTT后2-3分钟就变黑了。加MTT前显微镜下观察细胞数没有发现个别孔细胞数过多的情况。

作者: vivian4123 时间: 2012-3-18 11:53

一般测出的OD值是多少比较合适的？有人说是要在0.2-0.8范围内是成线性关系，也有人说是在1.5到2多比较好，我也不是很明白，为什么差异会这么大，大家的结果都是什么样子的，哪个好些？

作者: wu11998866 时间: 2012-3-18 11:54

加MTT前确定没有污染，那就是细胞数太多了，测出的A大概要1点几了吧？

作者: gemei0115 时间: 2012-3-18 11:54

我也遇到过这种情况，感觉是污染了。
你培养的细胞没有异常的状况吗？

作者: langlang 时间: 2012-3-18 11:55

1.不会是细胞数太多的缘故
2.如果是细菌污染，加入MTT后只是污染孔颜色很黄很浑浊，不会变黑，加入DMSO后颜色很深。
3.可能是细胞（如黑色素瘤细胞，若状态不好或药物刺激后可变黑）和MTT本身的问题。

作者: TNT 时间: 2012-3-18 11:55

污染的可能性非常大，建议换新板从新作一次
我也碰到过

作者: jkobn 时间: 2012-3-18 11:55

我觉得MTT的重复率太低了，至于变黑我认为应该是污染了。对了，我想问问MTT值一般在什么范围比较可靠啊，和细胞有关吗，我做的是肠道上皮细胞。

作者: shenkunjie 时间: 2012-3-18 11:56

一般测出的OD值是多少比较合适的？有人说是要在0.2-0.8范围内是成线性关系，也有人说是在1.5到2多比较好，我也不是很明白，为什么差异会这么大，大家的结果都是什么样子的，哪个好些？

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产生这种问题的原因在于不同的酶标仪的线性范围不同。

作者: kewanqi2011 时间: 2012-3-18 11:56

各位，有点不明白你们在说什么。加入MTT一定时间后，MTT 在细胞培养体系中被活细胞内线粒体产生的琥珀酸脱氢酶裂解生成Formazan ，是一种紫黑色的结晶。在加入DMSO后Formazan被从细胞内溶解出来，从而通过测吸光度判断活细胞的含量，活细胞比例很大导致看起来很黑，这个现象在正常不过啦，为什么要说是污染了呢？

作者: 薄荷侠 时间: 2012-3-18 11:57

多谢各位的关注，今天又重复了实验，在加药物前先加MTT试一试（加MTT前细胞状态很好，没看到明显污染），结果大概30分钟可以看到培基颜色变黑，在镜下可以见到细胞内的黑色结晶和一些刺猬毛样黑色物质（不知道怎么形容，以一个点为中心成放射状撒开，部分和细胞有连接，吸取上清的时候明显可以带走部分部分这种结晶，贴壁不稳，可惜没带相机）。原来怀疑是MTT的原因，就马上借了实验室其他2个的MTT加进去结果一样，同时换用无血清的培基再加还是变黑。请实验室的几个做细胞的高手看了，也说不清到底是什么东西。现在只有细胞没换了，其他的基本都换了，难道真的重新复苏细胞在做吗？关键到底是什么原因啊。说污染确实细胞生长不受影响，黑胶虫也没怎么看到。唉，近来真的够衰的啦，刚开始做的时候还好好的，现在快一个月了还没做出来，老板催着要结果，快要崩溃了。

作者: xevin 时间: 2012-3-18 11:57

我一直不支持MTT这种方法,觉得它的可信度不高,灵敏度也不高,而且你说的这种情况很普遍,我知道如果污染了加入MTT后一般都会变黑的,但是是否有别的情况也会使其变黑,值得研究.建议楼主换别的方法试试!

作者: wmp1234 时间: 2012-3-18 11:57

我也认为是由于活细胞数量过多所引起，也许药物对细胞的抑制能力差吧。我们做MTT时遇到多污染的现象，只是孔内液体变混浊，变污，而且与其他为污染孔相比较很容易分辨，甚至肉眼即可辨别，而且加DMSO也是在普通条件下加的，所以我想不是污染所致。可以试着增加药物浓度，或者稀释一下细胞数量，在试一下。期待你的下一次结果，祝你好运！

作者: shenkunjie 时间: 2012-3-18 11:58

我刚看见第一贴，反应就是污染了。污染后的细胞孔就是很容易变黑，而且吸上清时容易被吸出。
后来看了大家的讨论贴，感觉你能肯定没污染，那么有可能：
1、细胞内的黑色结晶和一些刺猬毛样黑色物质
这是MTT加入形成的显色的结晶物质，应该没问题。
2、黑色太多，
不知你的MTT浓度用的多少？
3、细胞密度
既然你都重复这么久了。再做一次吧。在同一板子中用不同密度种细胞，试试看，排除细胞密度问题。

作者: orangecake 时间: 2012-3-18 11:58

谈点我的看法：
1)污染问题：我认为你的细胞没有污染，理由是你回帖中讲到你没有在复苏新的细胞，说明你仍然在用同一个细胞做试验并传代。在相同的培养条件下（如同一培养箱），传代细胞是正常的，那么你实验中细胞也可以确定来源是正常的。因此说不是细胞污染问题。
2)黑色颗粒：我以前看过镜下的甲臢，文献讲MTT还原后生成的甲臢为紫色，但我看到的实际上是紫黑色，更偏向于黑色。但我忘记了颗粒的形态，但析出的盐形成结晶是可能的。此外，你要说明一下，在加了溶解液或DMSO后，这个黑色是否溶解。如果溶解，我认为和正常MTT现象一致，因此我认为黑色颗粒是正常的。
3)OD值：由于我们作MTT时并没有吸取上清液，因此我不确定我们的具体实验结果是否能提供参考价值。但我们目前作的结果，肿瘤细胞48小时OD值基本在1.0－1.6。
4)阳性对照：你所提供的信息和讨论均未提到阳性对照，我不知道为什么，阳性对照的作用，一方面是让你进行对比，另一方面就是要证明你整个实验的完整性和正确性，而你现在没有阳性对照（也许我没看到），所以你问题出现后不能找出原因。
5)细胞密度：我认为问题出现在细胞密度上，有黑色颗粒析出，说明甲臢浓度高，量多了，析出了，其原因说明细胞还原酶多了（不考虑活性提高的可能），也就是说细胞量多了。遗憾的是你没有提供阳性对照，因此现在能判断的，只有你的细胞密度问题。

建议：1)设阳性对照2)降低细胞密度

作者: zwsyrt 时间: 2012-3-18 11:59

楼上分析的很精细
也许是我没有看完所有帖子
我感觉细胞染菌可能性较大
（因为楼主说空白组没有变黑）
还有你的MTT溶液是自己配的吧
浓度是不是不合适？
和楼上说的一样
我也建议你做个阳性对比一下看看

作者: summerxx 时间: 2012-3-18 11:59

肯定不是污染，降低MTT的浓度。另外，MTT的货号和你的配方说一下。

作者: 薄荷侠 时间: 2012-3-18 12:00

感谢大家的帮助。今天又重复了实验，结果还是变黑了。
1.大家所提到的“阳性对照组对照组”是否就是指只加细胞和培基不加药物组？每次这个组也变黑了。
2.细胞密度并不大，我种板用的密度是104，每孔100UL。
3.MTT用的是鼎国的，另外还用过碧云天的试剂盒，也用过sigma的，结果都一样，今天还特意现配的鼎国的MTT，加PBS溶解，过滤避光，浓度用的是5mg/ml,每孔加10UL，我还特意试了加5ul、2.5ul结果也一样。
4.每次细胞在96孔板第一天贴壁生长快，加药物干预后呈浓度依赖性可以看到明显的抑制作用（细胞数量不同），同时好象背景有点模糊，细胞间可以看到细颗粒样的东西，但细胞生长状态可。
5.今天加MTT后请实验室一师兄分析了下，他觉得可以看到辐射状分布的可能是菌丝，认为有可能是真菌污染，据他的经验真菌生长慢，不一定很明显影响细胞生长，但MTT是否能与真菌反应？真菌感染后细胞生长传代都不受影响吗？
6.打算重新复苏细胞，把所有东西都换了，看结果怎样。

作者: gogo 时间: 2012-3-18 12:00

我做的MTT最近也是出现这种问题,用的是青蒿提取液,这种提取液颜色是暗黑色的.有没有可能是你做的实验的药物色素沉着的问题造成黑色

作者: 薄荷侠 时间: 2012-3-18 12:01

这是我用数码相机照的几张照片，请大家帮忙分析，由于照相水平一般，图片效果一般。
这是加MTT后约10分钟就可见到的黑色结晶，不知道那些辐射状的物质是什么？
另外这种结晶在细胞密的孔中其密度也增加，但细胞稀的也有，没加药物的阳性对照也有，换了几种MTT都出现，因而肯定不是药物及MTT本身问题，也细胞密度有关但肯定不是细胞太多的原因。

图片附件: 28812413.snap.jpg (2012-3-18 12:01, 43 KB) / 该附件被下载次数 12
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作者: 薄荷侠 时间: 2012-3-18 12:01

这是没加MTT的，看起来细胞生长还可以一样。

图片附件: 81531722.jpg (2012-3-18 12:01, 113.25 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11158

作者: flower-201 时间: 2012-3-18 12:01

你真有探索精神！十分佩服你！看了以上的讨论，我感觉你这次做得应该没问题！照片看不清，但我估计这次不是污染，因为你第二张显示细胞状态还不错，我估计那些毛刺状的物质就是MTT加入后形成的结晶，可能因细胞不同及其他的差别，造成结晶的形态也不同。你看看OD值如果剃度明显，数据可以，就OK了。

作者: lagua123 时间: 2012-3-18 12:02

确实值得佩服。

那些辐射状的物质是结晶，肯定不是污染，可以直接读数看结果。不过还是建议你降低浓度，或仔细看看MTT的成分参数。

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