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标题: [求助]请教树突状细胞的培养经验 [打印本页]

作者: mickeylin 时间: 2012-3-18 12:02 标题: [求助]请教树突状细胞的培养经验

我是个新手,想请教树突状细胞的培养经验,顺便问问AIM-V与RPMI-1640的区别

作者: zhenxin 时间: 2012-3-18 12:03

我做过原代的脾的树突状细胞分离，请问你是否做原代培养。

作者: mickeylin 时间: 2012-3-18 12:03 标题: 回复 #2 zhenxin 的帖子

RPMI-1640加20%FCS效果不错
最好用磁珠分选前体细胞
这样可以得到比较纯的DC
祝你成功

作者: bananapeople 时间: 2012-3-18 12:04

你好,我也要做原代的脾的树突状细胞分离,但我有很多细节问题不清楚,这方面的资料又不多,把我急死了你能把分离的步骤给我说一下吗?

作者: fqswdzd 时间: 2012-3-18 12:04

我正在做提取DC细胞，经历很多曲折，我发现从骨髓中培养较简单。先提取出骨髓细胞，用红细胞裂解液破红后，用完培调整2*10E6/ml加到6孔板中2ml,再加20ng/ml的IL-4、GM-CSF各1ml。隔天半量换液即可。7-9天可得到。

作者: fqswdzd 时间: 2012-3-18 12:05

直接从脾中分离DC较少，纯度不高，需要加细胞因子。

作者: fqswdzd 时间: 2012-3-18 12:05

我已经通过我说的方法得到大量DC，经鉴定有81%的阳性率DEC205标记

作者: qqq111 时间: 2012-3-18 12:05

我的经验：
可取外周血，MACS或贴壁2小时，获得monocytes，加入GM-CSF IL-4 各50NG／ML，第三天倍半换液体，7天后诱导成功，可看我的结果图片。
如图：

图片附件: 45690122.snap.jpg (2012-3-18 12:05, 25.42 KB) / 该附件被下载次数 25
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11159

作者: moonlight45 时间: 2012-3-18 12:06

you can attach the picture by clicking the "New Reply" button.

作者: qqq111 时间: 2012-3-18 12:07 标题: 回复 #9 moonlight45 的帖子

ok.i know.thank you.
另外对于DC细胞，由于没有特异的表型鉴定，因此鉴定的手段主要是从三个方面：
细胞形态细胞表型及其功能。因此在前两种手段确定DC后，最重要的还是功能
方面的表现，所以在脉冲上肽或者整体抗原后，必须照光终止，与反应性的细胞系
作用，混合淋巴细胞反应检测细胞系的增值，从而确定你所得到的细胞一定是DC。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-3-18 12:09

我的培养体系基本上跟上面各位战友的相同，给你发一张俺的DC的靓照，希望对你有帮助

图片附件: 55409619.snap.jpg (2012-3-18 12:09, 56.42 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11160

作者: 66+77 时间: 2012-3-18 12:09

我的培养体系基本上跟上面各位战友的相同，给你发一张俺的DC的靓照，希望对你有帮助

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你的dc是什么来源的？
那小的亮的是不是淋巴细胞？
你拍照时染色了吗？
望回复！

作者: flower-201 时间: 2012-3-18 12:10

你的dc是什么来源的？
那小的亮的是不是淋巴细胞？
你拍照时染色了吗？
望回复！

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我做的DC共有三种来源，骨髓，外周血和动员后的外周血干细胞。这个是外周血的，是一个移植的供者，拍照时没有染色，我用的是OLYMPUS的倒置显微镜和配套的OLYMPUS的照相系统，可以调节亮度等参数，所以看上去象是染了色的。
至于小的细胞，应该主要是未清除彻底的淋巴细胞为主，也有未诱导成DC的单核细胞。
另外，我的DC还是不成熟的DC，FACS结果显示，CD80的阳性率在80%,CD86在20%左右。
仅供你参考。

作者: hold住 时间: 2012-3-18 12:10

请问有研究DC细胞的表面受体的吗？我想了解DC细胞的表面受体或功能蛋白。先谢谢高手们的指点。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:11

这里有篇文章，不知对你有用不？
Prognostic Characteristics of Breast Cancer Among
Postmenopausal Hormone Users in a Screened Population
By Karla Kerlikowske, Diana L. Miglioretti, Rachel Ballard-Barbash, Donald L. Weaver, Diana S.M. Buist, William E. Barlow,
Gary Cutter, Berta M. Geller, Bonnie Yankaskas, Stephen H. Taplin, and Patricia A. Carney
Purpose: We determined the risk of breast cancer and
tumor characteristics among current postmenopausal
hormone therapy users compared with nonusers, by duration
of use.
Methods: From January 1996 to December 2000, data
were collected prospectively on 374,465 postmenopausal
women aged 50 to 79 years who underwent screening
mammography. We calculated the relative risk (RR) of
breast cancer (invasive or ductal carcinoma-in-situ) and
type of breast cancer within 12 months of postmenopausal
therapy use among current hormone users with a uterus
(proxy for estrogen and progestin use) and without a uterus
(proxy for estrogen use), compared with nonusers.
Results: Compared with nonusers, women using estrogen
and progestin for > 5 years were at increased risk of
breast tumors of stage 0 or I (RR, 1.51; 95% CI, 1.37 to
1.66), stage II or higher (RR, 1.46; 95% CI, 1.30 to 1.63),
size < 20 mm (RR, 1.59; 95% CI, 1.43 to 1.76), size greater
than 20 mm (RR, 1.24; 95% CI, 1.09 to 1.42), grade 1 or 2
(RR, 1.60; 95% CI, 1.44 to 1.77), grade 3 or 4 (RR, 1.54; 95%
CI, 1.37 to 1.73), and estrogen receptor-positive (RR, 1.72;
95% CI, 1.55 to 1.90). Estrogen-only users were slightly
more likely to have estrogen receptor-positive breast cancer
compared with nonusers (RR, 1.14; 95% CI, 1.06 to 1.23).
Conclusion: Use of estrogen and progestin postmenopausal
hormone therapy for five years or more increased
the likelihood of developing breast cancer, including both
tumors with favorable prognostic features and tumors with
unfavorable prognostic features.
J Clin Oncol 21:4314-4321. © 2003 by American
Society of Clinical Oncology.
POSTMENOPAUSAL HORMONE therapy (HT) has been
associated with increased risk of breast cancer.1-3 Estrogen
plus progestin regimens may be associated with a greater risk of
breast cancer than estrogen-only regimens4-6; however, results
are not consistent or conclusive across studies.2,4-7 It is also
unclear whether HT results in an increased risk of breast cancer
with a favorable prognosis (low stage and grade), less favorable
prognosis (high stage and grade), or both.
Several observational studies have reported that HT users
have smaller8-13 and lower-grade tumors,10,12,14-17 while others
have not shown any influence of HT on tumor size14,15,18-23 or
grade.9,13,18,21,23 Three studies have reported that HT users are
more likely to have estrogen receptor- (ER-) positive tumors.
4,9,24 Several others have reported no association with HT
use and ER status.8,10 –15,18 –20,23 The inconsistent results across
studies may be because many include a small number of women
who had been receiving HT when diagnosed with breast cancer
(n 29 to n 263).4,8,10 –21,23 In addition, many of the studies
did not adequately account for breast cancer surveillance by
screening mammography,4,8 –12,15,16,18 –20,23 which could result in
earlier detection and fewer advanced cancers in HT users. Lastly,
the studies had no information or very limited information on
tumor characteristics associated with type of HT regimen or

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:11

duration of use, which may influence tumor features.4,5,8-24
The Women’s Health Initiative randomized controlled trial
showed that women taking a continuous estrogen and progestin
regimen for more than 4 years had an increased risk of breast
cancer.3 A greater proportion of women on estrogen and progestin
regimens were diagnosed with regional disease (Surveillance,
Epidemiology and End Results [SEER] program staging
system), compared with those using placebo.25 Determining
whether HT has clinically important influences on breast cancer
stage or aggressiveness and cancer detection rates by mammography
in a large, community-based population may contribute to
a woman’s decision to start HT, or to take HT for long periods.
We evaluated the influence of HT on breast cancer risk by
pooling data from six mammography registries where current
HT use, history of hysterectomy, and time between mammography
examinations is prospectively recorded. We inferred that
From the Department of Epidemiology and Biostatistics, and the General
Internal Medicine Section, Department of Veterans Affairs, University of
California, San Francisco, CA; Center for Health Studies, Group Health
Cooperative; Department of Biostatistics, University of Washington, Seattle,
WA; Applied Research Program, DCCPS, National Cancer Institute, Bethesda,
MD; Department of Pathology, and Health Promotion Research,
University of Vermont, College of Medicine, Burlington, VT; Center for
Research Design and Statistical Methods, University of Nevada School of
Medicine, Applied Research Facility, Reno, NV; Department of Radiology,
University of North Carolina, Chapel Hill, NC; Norris Cotton Cancer
Center/Dartmouth-Hitchcock Medical Center/Department of Community
and Family Medicine, Dartmouth Medical School, Lebanon, NH.
Submitted May 21, 2003; accepted September 8, 2003.
This work was supported by a National Cancer Institute–funded Breast
Cancer Surveillance Consortium cooperative agreement (U01CA63740,
U01CA86076, U01CA86082, U01CA63736, U01CA70013, U01CA69976,
U01CA63731, U01CA70040).
Authors’ disclosures of potential conflicts of interest are found at the end
of this article.
Address reprint requests to Karla Kerlikowske, MD, San Francisco
Veterans Affairs Medical Center, General Internal Medicine Section, 111A1,
4150 Clement St, San Francisco, CA 94121; e-mail: kerliko@itsa.ucsf.edu.
© 2003 by American Society of Clinical Oncology.
0732-183X/03/2123-4314/$20.00
4314 Journal of Clinical Oncology, Vol 21, No 23 (December 1), 2003: pp 4314-4321
DOI: 10.1200/JCO.2003.05.151
history of hysterectomy is a proxy for type of HT use based on
clinical practice guidelines for HT that have been in place for
more than 10 years, and recommend estrogen and progestin for
women with a uterus, and estrogen only for women without a
uterus. We report the relative risk (RR) of breast cancer by tumor
characteristics and cancer detection rates by mammography
among HT users with and without a uterus by duration of use,
compared with non-HT users.

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:12

METHODS
Data Sources
Data were pooled from six mammography registries that participate in the
Breast Cancer Surveillance Consortium26 (cuturl('http://breastscreening.cancer.gov'))
funded by the National Cancer Institute: (1) San Francisco Mammography
Registry, San Francisco, CA; (2) Group Health Cooperative, Seattle, WA; (3)
Colorado Mammography Advocacy Project, Denver, CO; (4) Vermont
Breast Cancer Surveillance System, Burlington, VT; (5) New Hampshire
Mammography Network, Lebanon, NH; and (6) Carolina Mammography
Registry, Chapel Hill, NC. These registries collect information on screening
and diagnostic mammography examinations performed in their defined
catchment area. Each mammography registry links women in their registry to
a state tumor registry or regional SEER program that collects populationbased
cancer data. Some registries additionally link to pathology databases.
Each registry obtains annual approval from their institutional review board to
collect registry information. Linkage procedures are performed following
human subjects protocols to maintain participant confidentiality.
Subjects
Our study included postmenopausal women aged 50 to 79 years who
underwent bilateral mammography examination indicated by the radiologist
as being performed for screening, between January 1996 and December
2000. Women entered the study at the time of their screening examination
and were observed for 1 year, or until the next screening examination, to
determine if breast cancer was diagnosed. A woman may have had more than
one mammography examination during the study period, and thus, may have
entered the study more than once (n 192,511). Breast cancer was not
uniformly detected during the follow-up period; rather, detection was highest
immediately following a screening examination. Therefore, all analyses were
performed per mammography examination rather than per person-year of
follow-up. Screening examinations that occurred after December 2000 were
excluded to ensure at least 12 months for reporting cancers to tumor
registries after screening examinations.
Women 55 years and older were assumed to be postmenopausal. Women
aged 50 to 54 years were considered to be postmenopausal if both ovaries
had been removed, if they reported that their periods had stopped permanently,
or if they were taking HT. Premenopausal women aged 50 to 54 years
having regular menstrual periods with no HT use were excluded (66,132;
6%). We also excluded women who self-reported breast augmentation
(1%) or prior diagnosis of breast cancer (3%), and women for whom time
between mammography examinations (4%), family history of breast cancer
(8%), or current HT use (17%) was missing.
Measurements and Definitions
For each woman, demographic information and a self-reported breast
health history were obtained at the time of each screening examination by
completing a survey. The survey includes questions about menopausal status,
family history of breast cancer in a first-degree relative, current HT use,women with a uterus who were using HT were considered to be using
estrogen plus progestin, whereas women without a uterus using HT were
considered to be using estrogen only.
Time between mammography examinations was determined using dates of
prior mammography examinations recorded in each mammography registry,
or self-reported information collected at the screening examination. We used
self-reported data, rather than dates of prior mammography examinations
recorded in a registry, to calculate time between mammography examinations
for 6.7% of nonusers, 3.5% of HT users without a uterus, and 9.3% of
HT users with a uterus.
Women were considered to have breast cancer if reports from a breast
pathology database, SEER program, or state tumor registry showed any
invasive carcinoma or ductal carcinoma in situ (DCIS) through December
2001. Women with lobular carcinoma-in-situ only were not considered to
have cancer. All breast cancers were classified according to the American
Joint Committee on Cancer staging system.27 Invasive cancers were categorized
by tumor size, grade, and ER status. The few women (n 55) with
grade 4 tumors (undifferentiated or anaplastic) were included with the group
of women with grade 3 tumors (poorly differentiated).
Statistical Analysis
We stratified the data into three groups based on self-reported current HT
use and history of hysterectomy: (1) no HT use with or without a uterus, (2)
HT use and no uterus (proxy for estrogen only), and (3) HT use and uterus
(proxy for estrogen and progestin use). Frequency distributions of various
risk factors were determined for women in these three groups. Rates and RRs
were calculated using Poisson regression, adjusting for age as a continuous
variable, family history of breast cancer, examination year, time between
mammography examinations, and mammography registry. We standardized
the rates by taking a weighted average of the rates estimated from the Poisson
regression model for each covariate configuration, weighting by the proportion
of women in the study with that covariate configuration. Thus, the same
weights were used for nonusers, estrogen and progestin users, and estrogenonly
users, resulting in an adjustment to the same population. Adjusted
distributions were standardized to the study population using logistic
regression for ER status, and polytomous regression for other tumor
characteristics. We also adjusted all analyses for race. Since the results were
similar, and to minimize the number of women excluded from analyses due
to missing values, we did not adjust for race in the final analyses.
history of hysterectomy, and time between mammography examinations.
Women were considered to have a family history of breast cancer if they
reported having at least one first-degree relative (mother, sister, or daughter)
with breast cancer. Women were considered to be “current HT users” if they
reported using prescription HT at a screening examination. Three registries
collect information on duration of use, which was categorized as less than 5
and 5 years of use. Two registries collect detailed self-report information
on type of HT regimen for women who self-reported “current HT use.” Of
women who reported current HT use and no history of hysterectomy, 80.4%
reported taking estrogen and progestin, 17.8% reported estrogen only, and
1.8% reported progestin only. Of those who reported current HT use and
history of hysterectomy, 87.3% reported taking estrogen only, 12.0%
reported estrogen and progestin, and 0.7% reported progestin only. Thus,

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:12

Rates of breast cancer (invasive cancer or DCIS diagnosed within 12
months of a screening examination and HT use) and 95% CIs were calculated
per 1000 examinations for the three groups and by decade of age.
Adjusted rates and distributions were calculated for stage (0, I, II, and III
and IV combined), tumor size (invasive cancer 10 mm, 11 to 20 mm,
and 20 mm), tumor grade (1, 2, and 3 and 4 combined), and ER status
(positive and negative).
We calculated RRs comparing those taking estrogen and progestin and
those on estrogen only, with to non-HT users by duration of treatment. We
also calculated RRs comparing the risk of tumor characteristics in estrogen
and progestin users and estrogen-only users, with that of nonusers. We
compared the risk of each more favorable tumor feature (stage 0 or I, size
20 mm, grade 1 or 2, ER-positive) and each less favorable tumor feature
(stage II or higher, size 20 mm, grade 3 or 4, ER-negative). We
dichotomized tumor size at 20 mm and stage at 0 or I since both
parameters are considered early stage disease. To evaluate the impact of
study parameters on our findings, two sensitivity analyses were performed
using the same Poisson regression models described above: 1) for a subset of
women whose time between screens ranged from 9 to 18 months with a
median of 13 months, and 2) including all breast cancers occurring within 24
months of a screening examination.
4315 BREAST CANCER AND POSTMENOPAUSAL HT
We calculated the true-positive and false-negative rates per 1000 examinations
for the three study groups. Adjusted rates were calculated using the
same method as described above. We used simulation to estimate the 95%
confidence intervals, sampling 100,000 values of the regression coefficients
from their joint multivariate normal distribution and calculating the rates for
each sample. We estimated upper and lower limits by the simulated 2.5 and
97.5 percentiles. A screening examination was considered a false-negative
examination if breast cancer was diagnosed within 12 months of a negative
examination (BI-RADS [American College of Radiology, Philadelphia, PA]
assessment of 1, 2, or 3 when associated with short-interval follow-up only
or routine follow-up). A screening examination was considered a truepositive
examination if breast cancer was diagnosed within 12 months of a
positive examination (BI-RADS assessment of 0, 4, 5, or 3 when associated
with a recommendation for immediate follow-up).
RESULTS
A total of 373,265 postmenopausal women underwent
683,435 screening mammography examinations between January
1996 and December 2000, of whom 3,202 developed
breast cancer (2,619 invasive and 583 DCIS) within 12
months of an examination.
HT users were more likely to be younger, white, have had a
previous breast biopsy or surgery, and shorter time period
between mammography examinations and less likely to have a
family history of breast cancer (Table 1).
Among women who developed breast cancer, the mean age at
diagnosis was significantly younger among women using estrogen
and progestin and estrogen only compared with nonusers (61
and 63 years v 66 years; P .001). Overall risk of cancer was
higher among women using estrogen and progestin compared
with nonusers (RR, 1.39; 95% CI, 1.31 to 1.47). There was no
significant increased risk of breast cancer among women using
estrogen alone compared with nonusers (RR, 1.05; 95% CI, 0.99
to 1.12). The rate of cancer increased with age for all three groups
(P .0001) and was higher for each decade of age among women
using estrogen and progestin compared with women using estrogen
only, and compared with nonusers (Table 2).
Rate and Risk of Cancer by Tumor Characteristics and
HT Use

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:12

The rates of stage 0, I, and II tumor; invasive cancer 20
mm; grade 1, 2, and 3 or 4 disease; and ER-positive disease were
higher among women using estrogen and progestin compared
with women using estrogen only, and compared with nonusers
(Table 3).
Rate and risk of breast cancer was higher among women using
estrogen and progestin for 5 years compared with nonusers
(RR, 1.49; 95% CI, 1.36 to 1.63) (Table 4). Rate and risk of
breast cancer was not increased among women using estrogen
and progestin less than 5 years, or among those using estrogen
Table 1. Study Population Characteristics for 374,465 Postmenopausal Women
Who Underwent 683,435 Screening Mammography Examinations Between
1996 and 2000 by HT Use
Hormone Use (% of patients)*
No HT Estrogen Only Estrogen and Progestin
No. of women 213,660 79,216 81,589
No. of examinations 382,435 151,399 149,601
Age, years
50-59 35 49 55
60-69 34 34 32
70-79 31 17 13
Race or ethnicity†
White 83 90 91
Black 9 6 3
Asian 6 3 4
Native American or Alaskan
Native
1 0 0
Other races 1 1 1
Hispanic 3 2 3
Family history of breast cancer 16 14 12
Previous breast biopsy or surgery† 21 27 23
Time between screens, years
1 6270 70
2 2423 23
3-4 7 4 4
4 8 3 3

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:13

Abbreviation: HT, hormone therapy.
*Estrogen-only group: HT users without a uterus. Estrogen and progestin group: HT
users with a uterus. Column percentage calculated from number of examinations.
†Missing data: 13% for race, 14% for ethnicity (Hispanic), and 3% for previous
breast biopsy or surgery.
Table 2. Rate of Cancer and 95% CI Among 374,465 Postmenopausal Women Who Underwent Screening Mammography From 1996 to 2000 by HT Use
Hormone Use*
No HT Estrogen Only Estrogen and Progestin
Rate 95% CI Rate 95% CI Rate 95% CI
No. of examinations 382,435 151,399 149,601
No. of cancers 1,803 624 775
Cancers per 1,000 examinations† 4.3 4.2 to 4.5 4.5 4.3 to 4.8 6.0 5.7 to 6.3
Cancers per 1,000 examinations by age, years‡
50-59 3.3 3.1 to 3.6 3.4 3.2 to 3.8 4.5 4.2 to 4.9
60-69 4.6 4.4 to 5.0 4.8 4.4 to 5.2 6.4 5.9 to 6.9
70-79 5.8 5.5 to 6.6 6.0 5.5 to 6.6 7.9 7.2 to 8.6
Abbreviation: HT, hormone therapy.
*Estrogen-only group: HT users without a uterus. Estrogen and progestin group: HT users with a uterus.
†Adjusted for age, family history of breast cancer, examination year, time between mammography examinations, and mammography registry using Poisson regression,
and standardized to the total population.
‡Adjusted for family history of breast cancer, examination year, time between mammography examinations, and mammography registry using Poisson regression, and
standardized to the total population.
4316 KERLIKOWSKE ET AL
only compared with nonusers, irrespective of duration of use
(Table 4).
The risk of tumors associated with more favorable prognostic
characteristics was higher among women using estrogen and
progestin for 5 years compared with nonusers: 41% for DCIS,
51% for stage 0 or I, 59% for invasive cancer 20 mm or smaller,
60% for grade 1 or 2 disease, and 72% for ER-positive disease
(Table 5). The risk of tumors associated with less favorable
prognostic characteristics was also higher among women using
estrogen and progestin for 5 years compared with nonusers:
51% for invasive cancer; 46% for stage II, III, or IV; 24% for
invasive cancer larger than 20 mm; and 54% for grade 3 or 4
disease (Table 5). Except for the increased risk of an ER-positive
tumor (Table 5), overall cancer risk was not higher among
women using estrogen only as compared with nonusers. In a
sensitivity analysis on a subset of women whose time between
screens was approximately 1 year, results were similar to those
presented in Tables 4 and 5 (data not shown), with risk of breast
cancer higher among women using estrogen and progestin for
5 years compared with nonusers (RR, 1.51; 95% CI, 1.32 to
1.72). A separate sensitivity analysis that allowed 24 months for
cancer to occur after a screening examination, found similar
results to those reported in Tables 4 and 5 (data not shown); risk
of breast cancer was higher among women using estrogen and
progestin for 5 years compared with nonusers (RR, 1.55; 95%
CI, 1.40 to 1.71).

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:13

Table 3. Rate of Breast Cancer per 1,000 Examinations and Distribution of Cancers by Stage, Size, Grade, and Estrogen Receptor
Status Among Postmenopausal Women With Screening Examinations From 1996 to 2000 by HT Use
Hormone Use*
No HT Estrogen Only Estrogen and Progestin
Rate
% of
Cancers Rate
% of
Cancers Rate
% of
Cancers
Stage†
0 0.79 20.8 0.77 19.4 1.11 20.6
I 1.97 51.5 2.21 54.9 2.90 54.3
II 0.91 23.8 0.85 21.6 1.18 21.7
III or IV 0.15 3.9 0.17 4.1 0.19 3.5
Tumor size†‡
10 mm 1.14 36.8 1.19 34.6 1.61 36.9
11-20 mm 1.24 39.7 1.49 43.6 1.90 43.8
20 mm 0.74 23.5 0.71 21.9 0.84 19.4
Tumor grade†‡
1 0.68 24.8 0.78 25.5 1.25 31.9
2 1.20 43.5 1.31 44.2 1.57 41.1
3 or 4 0.87 31.8 0.88 30.2 1.02 27.1
Estrogen receptor
status†‡
Positive 1.96 83.1 2.32 84.2 2.96 89.3
Negative 0.40 16.9 0.38 15.8 0.36 10.7
Abbreviation: HT, hormone therapy.
*Estrogen only group: HT users without a uterus. Estrogen and progestin group: HT users with a uterus.
†Adjusted for age, family history of breast cancer, examination year, time between mammography examinations, and mammography
registry using Poisson regression for rates and logistic/polytomous regression for percentages, standardized to the entire population. Missing
data for non-HT users, HT users without a uterus, and HT users with a uterus: 12%, 13%, and 10% for stage; 12%, 13%, and 13% for tumor
size; 22%, 22%, 20% for tumor grade; and 33%, 28%, and 31% for estrogen receptor status, respectively.
‡Invasive cancer only.
Table 4. Rate of Cancer and 95% CI Among Postmenopausal Women Who Underwent Screening Mammography From 1996 to 2000 by Duration of HT Use
No HT
Duration of Use*
Estrogen Only Estrogen and Progestin
5 Years 5 Years 5 Years 5 Years
No. of examinations 382,435 14,815 67,911 24,819 47,979
No. of cancers 1,803 51 272 81 298
Cancers per 1,000 exams 4.3 3.7 4.0 3.7 6.5
95% CI† 4.2 to 4.5 3.1 to 4.5 3.7 to 4.3 3.2 to 4.3 6.0 to 7.0
Relative risk Referent 0.86 0.92 0.85 1.49
95% CI† 0.71 to 1.03 0.84 to 1.00 0.73 to 0.98 1.36 to 1.63
Abbreviation: HT, hormone therapy.
*Estrogen only group: HT users without a uterus. Estrogen and progestin group: HT users with a uterus.
†Adjusted for age, family history of breast cancer, examination year, time between mammography examinations, and mammography registry using Poisson regression
and standardized to the total population.
4317 BREAST CANCER AND POSTMENOPAUSAL HT
Rate of False-Negative and True-Positive Results per
1,000 Examinations

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:14

The rate of false-negative examination results increased from
0.77 (95% CI, 0.72 to 0.82) in non-HT users, to 0.83 (95% CI,
0.71 to 0.97) in women using estrogen 5 years, to 1.71 (95%
CI, 1.50 to 1.97) in women using estrogen and progestin 5
years (Fig 1). The rate of false-negative examination results with
stage II or higher disease increased from 0.30 (95% CI, 0.27 to
0.32) in nonusers, to 0.38 (95% CI, 0.33 to 0.46) in women using
estrogen, to 0.74 (95% CI, 0.64 to 0.88) in women using estrogen
and progestin (Fig 1).
The rate of true-positive examination results increased from
3.6 (95% CI, 3.4 to 3.7) in nonusers and 3.3 (95% CI, 3.0 to 3.7)
in women using estrogen 5 years, to 5.0 (95% CI, 4.5 to 5.5)
in women using estrogen and progestin 5 years (Fig 1). The
rate of true-positive examination results with stage II or
higher disease increased from 0.77 (95% CI, 0.72 to 0.82) in
nonusers and 0.75 (95% CI, 0.63 to 0.9) in women using
estrogen, to 1.07 (95% CI, 0.89 to 1.29) in women using
estrogen and progestin (Fig 1).
DISCUSSION
We determined the risk of breast cancer and compared the
tumor characteristics among current HT users with those of
nonusers undergoing screening mammography. The likelihood
of being diagnosed with breast cancer was increased 46% among
current estrogen and progestin users who had used HT for 5
years compared with nonusers, but not among estrogen and
progestin users who had used HT for less than 5 years, or
estrogen only users irrespective of duration of use. This supports
previous evidence demonstrating an increased risk of breast
cancer among postmenopausal women who use estrogen and
progestin hormone therapies for a long duration.3-6,25 The risk of
breast cancer was increased both for tumors with favorable and
unfavorable prognostic characteristics with the excess risk somewhat
greater for early-stage, small, low-grade, ER-positive
tumors than for tumors with a higher stage and grade. Estrogenonly
users were slightly more likely to have ER-positive breast
cancer compared with nonusers, but overall risk of breast cancer
was not increased compared with nonusers.
Current HT use has been reported to increase a woman’s RR
of breast cancer by 2% to 3% per year.2,5-7 Some studies have
reported that estrogen plus progestin regimens may be associated
with a greater risk of breast cancer than estrogen-only regimens,
4-6,28 while other studies report that the increased risk with
estrogen is similar to estrogen plus progestin.2,7 It has been
reported that HT users tend to have more in situ or localized
tumors at detection, possibly because of earlier detection by
mammography.2,29 On the other hand, studies have reported that
the extent of disease among HT users is the same as non-HT
Table 5. Relative Risk of Breast Cancer for a Given Tumor Characteristic (type, stage, size, grade, and estrogen receptor status) Among Postmenopausal Women
Using Hormone Therapy Relative to Nonusers
Tumor Characteristic

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:15

Estrogen and Progestin Users for 5
Years Versus Nonusers*
Estrogen and Progestin Users for 5
Years Versus Nonusers† Estrogen-Only Users Versus Nonusers‡
RR 95% CI RR 95% CI RR 95% CI
More favorable prognosis
DCIS 1.41 1.24 to 1.60 0.77 0.62 to 0.96 0.98 0.89 to 1.07
Stage 0 or I 1.51 1.37 to 1.66 0.99 0.84 to 1.16 1.07 1.00 to 1.15
Tumor size 20 mm§ 1.59 1.43 to 1.76 0.95 0.80 to 1.13 1.11 1.03 to 1.19
Grade 1 or 2§ 1.60 1.44 to 1.77 0.85 0.71 to 1.02 1.07 0.99 to 1.15
Estrogen receptor-positive§ 1.72 1.55 to 1.90 1.03 0.87 to 1.22 1.14 1.06 to 1.23
Less favorable prognosis
Invasive 1.51 1.38 to 1.66 0.86 0.74 to 1.01 1.05 0.98 to 1.12
Stage II, III, or IV 1.46 1.30 to 1.63 0.65 0.52 to 0.80 0.91 0.84 to 1.00
Tumor size 20 mm§ 1.24 1.09 to 1.42 0.82 0.66 to 1.01 0.91 0.83 to 1.00
Grade 3 or 4§ 1.54 1.37 to 1.73 0.50 0.39 to 0.64 0.98 0.90 to 1.07
Estrogen receptor-negative§ 0.89 0.77 to 1.03 0.71 0.58 to 0.87 0.94 0.86 to 1.04
NOTE. Relative risk (RR) and 95% CI are adjusted for age, family history of breast cancer, examination year, time between mammography examinations, and
mammography registry using Poisson regression, standardized to the total population.
Abbreviation: DCIS, ductal carcinoma in situ.
*n 298 cancers (248 invasive, 50 DCIS) among 47,979 screening examinations; estrogen and progestin group hormone therapy users with a uterus.
†n 81 (68 invasive, 13 DCIS) among 24,819 screening examinations; estrogen and progestin group hormone therapy users with a uterus.
‡n 1,803 (1,483 invasive, 320 DCIS) among 382,435 screening examinations; estrogen only group hormone therapy users without a uterus.
§Invasive cancer only.
Fig 1. White bars indicate a false-negative rate; vertical striped bars indicate
a false-negative rate associated with stage II, III, or IV disease; solid bars indicate
a true-positive rate; and vertical striped bars indicate a true-positive rate associated
with stage II, III, or IV disease. HT, hormone therapy.
4318 KERLIKOWSKE ET AL
users30 or possibly greater, with more stage II or higher disease
cases, and high S phase fraction tumors.19,20 Also, it has been
reported among current or recent users of HT that increased
duration of use may increase the risk of disease spread.2 In the
largest study to date with 3,202 breast cancer cases, we have
shown that after taking into account factors that enhance the
chance of detecting a tumor with good prognostic features, such
as older age31 and routine screening, women using estrogen and
progestin for 5 years are at increased risk of early stage tumors
with a more favorable prognosis. Importantly, we also found that
women using estrogen and progestin are at increased risk of
tumors, with a less favorable prognosis consistent with the
Women’s Health Initiative randomized controlled trial results.25
One explanation of why HT users have tumors with more
favorable prognosis is that current or recent use of HT promotes
growth of pre-existing, clinically latent, hormone-dependent
cancers of low malignant potential, that may not otherwise
become clinically apparent. In support of this hypothesis are the
findings reported by Beral et al2 that risk of breast cancer

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:15

decreases as time since last HT use increases, such that past users
who have not had HT in more than 5 years are not at increased
risk of breast cancer, regardless of prior duration of use. In
addition, recent oral contraceptive use has been associated with
increased detection of localized tumors that does not persist 10
years or more after cessation of use.32 Other evidence in support
of current or recent HT use acting as a cancer promoter are the
findings that well-differentiated invasive tumors with favorable
histology (papillary, tubular, mucinous, medullary) have been
reported to be more prevalent among HT users than nonusers,33
and that HT users are diagnosed at a younger age compared with
nonusers.15 Our findings that estrogen and progestin users were
younger at diagnosis and more likely to have ER-positive tumors
of smaller size and lower grade compared with nonusers supports
the hypothesis that HT promotes growth of preexisting
clinically latent cancers.
Why would women taking HT undergoing routine screening
mammography be at increased risk of breast cancer with less
favorable prognostic characteristics? Taking HT for more than a
year has been shown to increase mammographic breast density
in approximately 16% to 20% of women,34,35 with greater
increases in mammographic density associated with estrogen and
progestin than with estrogen alone.34,36,37 Increased mammographic
density among women taking HT has been associated
with decreases in the sensitivity and specificity of mammography38-
40 and increases in the minimal detectable size of tumor.41
Consistent with these reports, we found that women using
estrogen and progestin for 5 years have a higher rate of
false-negative examination results, and that these false-negative
examination results are associated with a higher rate of stage II
or higher disease as compared with nonusers. Thus, the
increase in less favorable tumors among long-term estrogen
and progestin users may be due, in part, to tumors obscured by
mammographically dense breasts, that progress between
screening examinations. The higher rate of true-positive
examination results associated with stage II or higher disease
in long-term estrogen and progestin users as compared with
nonusers, suggests that estrogen and progestin also may act
synergistically to promote tumorigenesis and more rapid
tumor growth than estrogen alone.42,43
Most studies have found no significant differences in the ER
profiles of breast cancer in HT users and nonusers.8, 10-15, 18-20,
23,25 One small study reported current HT users are more likely
to be diagnosed with ER positive tumors.9 Another study
reported that only long-term HT use of 57 months or more is
associated with having an ER-positive tumor,4 while one study
reported that estrogen and progestin use is associated with

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:16

having an ER-positive tumor, but that estrogen therapy is not.24
Given that estrogen causes proliferation of ER-positive breast
cells in vitro and in vivo,44,45 it is not surprising that we found
that women using estrogen and progestin and estrogen only were
more likely to be diagnosed with an ER-positive tumor. We
evaluated a large sample of women recently diagnosed with
breast cancer from 1996 to 2001. During that period, ER status
would have been measured with current, new immunohistochemical
assays that minimize misclassification. Our large sample
size and recent period of evaluation with improved ER
detection methods could account, in part, for our ability to detect
a difference in ER status among HT users and nonusers.
We studied a large number of women with breast cancer with
extensive information on tumor characteristics for these women.
Our ability to control for screening interval (surveillance bias) is
another strength of this study. The accuracy of our data depends
on completeness of cancer reporting to the SEER program, state
tumor registries, and pathology laboratories at the mammography
registries, which has been estimated to be more than 94.3%
complete.46 In addition, the cancer rates reported are within the
range of those reported in the literature, for which follow-up has
been reported to be 99.6%.47,48 Tumor size, stage, grade, and ER
status were missing for between 12% to 33% of tumors, due in
part to a change in coding of tumor size and stage by SEER
programs between July 1998 and 1999, which resulted in some
invasive cancers with an in situ component to be coded with an
unknown size. We are not aware of a tumor-reporting bias to
cancer registries related to HT status or history of hysterectomy.
Our finding of similar proportions of missing tumor characteristic
parameters among the three study groups does not support
a tumor-reporting bias. We inferred that women on HT with a
uterus were taking estrogen and progestin, and that women
without a uterus were taking estrogen only, as consistent with
recommended clinical guidelines49 and detailed information
from a subset of mammography registries in this study. Any
misclassification according to type of regimen would make it
more difficult to find an association between HT use and tumor
characteristics and, thus may have attenuated our findings. In
addition, our finding of enhanced risk of breast cancer among
estrogen and progestin users compared to estrogen only users is
consistent with other reports.4-6 We collected information on HT
use at the time of mammography, lessening the possibility of
recall bias. Information on hormone use was self-reported,
perhaps leading to some misclassification, but this is likely to
have been random and to lead to an underestimation of the
association between HT use and tumor characteristics. We were
4319 BREAST CANCER AND POSTMENOPAUSAL HT
not able to determine if tumor characteristics vary by dose or
specific HT regimens.
Millions of women either consider using or begin HT in the
United States each year. Although most use HT for short-term
symptom management, some women may choose to stay on HT
for longer periods. Postmenopausal women with a uterus who
are considering whether to take or stay on HT should be
informed that: (1) using estrogen and progestin HT for 5
years increases the likelihood of developing breast cancer; (2)
estrogen and progestin and estrogen-only hormone therapies
increase the risk of an ER-positive tumor with a higher risk
associated with combination HT regimens; and (3) cancers
associated with estrogen and progestin hormone therapies
include both tumors with favorable prognostic features and
unfavorable prognostic features.

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:16

AUTHORS’ DISCLOSURES OF POTENTIAL
CONFLICTS OF INTEREST
The authors indicated no potential conflicts of interest.
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4321 BREAST CANCER AND POSTMENOPAUSAL HT

作者: remenb 时间: 2012-3-18 12:17

自肝癌患者外周血中分离并纯化外周血单个核细胞(PBMC)、T淋巴细胞［3］. 主要步骤如下：以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)；聚丙烯Petri培养皿培养选择性地除去巨噬细胞；尼龙毛柱过滤除去B细胞；与L-亮氨酸-L-亮氨酰甲基酯共培养选择性除去其中的巨噬细胞、NK细胞及细胞毒性T细胞，余下细胞则主要为T淋巴细胞. 肝癌TAA获取［1，4］：常规培养并收集HepG2肿瘤细胞；低渗冻融HepG2肿瘤细胞，高速离心(10000rpm)并收集HepG2肿瘤细胞碎片作为TAA. TAA刺激DC，制备TAA特异性的DC［1］：TAA(源于1×106 HepG2肿瘤细胞)与PBMC(1×106，含DC)于GM-CSF(

作者: Ao7 时间: 2012-3-18 12:17

Sigma 公司的 metrizamide可用来分离树突状细胞，依据细胞的不同密度可将树突状细胞直接分离出来。若想获得较大量的细胞则可从骨髓或脾脏单个核细胞经细胞因子诱导而来。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:18

材料与方法
　　1. 病例选择：慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者组（CHB组）7例，男4例，女3例，年龄23～49岁，平均（35±13.6）岁，纳入标准：人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-A*02阳性，丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotrans-ferase，ALT）>80U/L，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg）、抗-HBc均阳性（采用酶联免疫吸附法检测，试剂盒为美国阿克苏公司产品），排除甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C viru，HCV）、丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）感染。急性乙型肝炎痊愈组（AHB组）4例，均为北京地坛医院住院患者，男女各2例，年龄21～44岁，平均（34.5±8.4）岁，纳入标准：HLA-A*02阳性，病程<3月, 发病期ALT>1000U/L，待ALT复常后3月，HBsAg阴转，抗-HBs阳转，HBeAg、抗-HBc均阴性，排除HAV、HCV、HDV、HEV感染。以上诊断均符合2000年病毒性肝炎防治方案[3]。健康志愿者组(HD组)6例，年龄26～36岁，平均（30±5.6）岁，纳入标准：HLA-A*02阳性，ALT<40U/L，乙型肝炎标志物均阴性，无其它免疫系统合并症。
　　2. 主要试剂及来源：重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子购自德国先灵葆雅公司（1.110U/mg），重组人肿瘤坏死因子-α、重组人白细胞介素-4购自英国Peprotech公司，淋巴细胞分离液（1.077g/ml）购自北京鼎国公司。红细胞裂解液购自美国Sigma公司。RPMI 1640购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司。鼠抗人HLA-A*02单克隆抗体（BB7.2细胞株）由北京大学医学部陈慰峰教授惠赠，T2细胞由第四军医大学隋延仿教授惠赠。FITC结合鼠抗人CD8单克隆抗体、PE标记鼠抗人γ干扰素(interferon，IFN-γ）单克隆抗体购自美国B.D.公司。PE标记鼠抗人白细胞介素（interleukin，IL）-2、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)单克隆抗体、细胞内染色相关试剂如抑制细胞因子分泌试剂Golgistop(monensin)、破膜剂、洗液均购自美国Pharmingen公司，CTL特异性杀伤试剂盒购自美国Promega公司，FACS固定液购自美国B.D公司。
　　3. HLA-A*02型别鉴定：研究对象取200μl新鲜抗凝全血，每管100μl加入流式细胞仪检测管中，再加入2ml红细胞裂解液反应12min后离心，弃上清液，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗细胞两次，其中反应管加入鼠抗人HLA-A*02抗体（BB7.2细胞株培养上清液）100μl, 4℃ 30min孵育后，PBS再次洗细胞，每管加入PE标记羊抗鼠Ig 2μl，4℃ 30min孵育后，PBS洗涤，FACS固定液200μl加入每管，4℃保存用于流式细胞仪检测。
　　4. 多肽合成：依据已知的肽序列合成HBV C区HLA-A*0201限制性CTL表位多肽HBcAg 18-27，序列为FLPSDFFPSV。多肽由赛百盛公司合成，经HPLC纯化后，纯度为大于90%，冻干粉末以2g/L浓度溶于二甲亚砜，-20℃保存备用。
　　5. 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 制备：取研究对象新鲜抗凝外周血，用RPMI 1640不完全培养基以1:1比例稀释，并缓慢加入淋巴细胞分离液的液面上，经密度梯度离心后取白膜层细胞，不完全培养基洗细胞两次，调整细胞浓度，1×106/ml加入24孔板，每孔加入2ml AIM-V无血清培养基。
　　6. DC的培养：参照文献[4]。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:18

7. 特异的记忆性T细胞应答：用分离的PBMC（1×106/ml），加入HBcAg 18-27 20μg/ml，阴性对照仅加入同体积的DMSO，阳性对照加植物血凝素2μg/ml，37℃ 5% CO2孵育1h后每孔均加入Golgistop, 每毫升培养液加入0.7μl Golgistop (使其终浓度为0.2μmol/L), 继续培养5h，培养结束，收集细胞。然后进行细胞内细胞因子的染色实验。
　　8. HBV特异的T细胞免疫应答的诱导及检测：(1)HBV特异的CTL的诱导：DC培养至第9日收集后，调节细胞浓度为1×106/ml，加入HBcAg 18-27多肽终浓度为20μg/ml，37℃ 5% CO2孵育，同时设未加多肽对照，孵育6h后收集细胞，用PBS洗脱未结合的多肽，经放射线照射，剂量为30Gy。将培养DC时未贴壁的淋巴细胞复苏，2×106淋巴细胞/孔铺于6孔板，然后将多肽刺激并照射后的DC加入1×105/孔，IL-2 50U/ml，37℃ 5% CO2共同孵育10d，每隔5d加入多肽刺激的DC 1×105/孔，每隔3d半量换液，同时加入IL-2 50U/ml。10d后，诱导结束，部分培养孔中再次加入多肽刺激照射过的DC 1×105/孔，1h后加Golgistop (0.7μl/ml)，培养5h后收集细胞，以备细胞内细胞因子检测IFN-γ、IL-2、TNF-α，收集剩余培养孔中细胞用于LDH释放实验。(2)流式细胞仪检测细胞内细胞因子染色：参照文献[5，6]。(3)靶细胞的制备：培养的T2细胞中加入HBcAg 18-27多肽终浓度为20μg/ml，37℃ 5% CO2孵育，同时设未加多肽对照，孵育4h后收集细胞，用PBS洗脱未结合的多肽，调整细胞浓度2×105细胞/ml。(4)CTL特异性杀伤实验：按LDH释放实验试剂盒说明，效应细胞和靶细胞比例梯度设为30:1、10:1、3:1，混合培养于96孔U底板中（每个条件设3个复孔），同时设对照，37℃ 5% CO2共同孵育5h，培养结束后，96孔板离心250g, 4min, 将50μl上清液转入酶标板中，按说明书操作，酶标仪检测波长490nm的A值（代表LDH酶活性），根据公式计算相应效靶比下效应细胞杀伤靶细胞的能力。杀伤率（%）＝（实验孔A值-效应细胞自发释放A值-靶细胞自发释放A值）/（靶细胞最大释放A值- 靶细胞自发释放A值）×100。
　　9. 统计学方法：采用样本均数t检验。
结果
　　1. 特异记忆性T细胞应答：AHB组患者对HBcAg 18-27 CTL表位多肽产生很强的记忆反应，而CHB组及HD组产生的细胞因子远低于AHB组,见表1。
　　2. DC诱导特异的CTL应答：见表2。
　　3. LDH释放实验检测DC诱导的CTL对靶细胞的杀伤作用：在CHB组患者，经负荷多肽的DC诱导的T细胞对于加肽孵育的靶细胞比例为30:1、10:1、3:1时，其杀伤率分别为（57.0±20.3）%、（49.5±20.2）%、（21.8±12.9）%；经负荷多肽的DC诱导的T细胞对于未加肽孵育的靶细胞杀伤比例为30:1、10:1、3:1时，其杀伤率分别为(30.4±10.0)%、(27.0±12.7)%、（13.7±3.2）%；未负荷多肽的DC诱导的T细胞对于加肽孵育的靶细胞杀伤比例为30:1、10:1、3:1时其杀伤率分别为(28.4±10.0)%、（24.0±10.0）%、(14.5±3.0)%, 经负荷多肽的DC诱导的T细胞对于加肽孵育靶细胞的杀伤均高于对照组。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:19

表1 不同人群T细胞对乙型肝炎核心抗原18-27的记忆应答（%）
组别　例数　　　分泌细胞因子的细胞占CD8+细胞的百分数
　　　　　　　γ干扰素/CD8 　　白细胞介素-2/CD8 　　肿瘤坏死因子-α/CD8
　急性乙型肝炎痊愈组 4 　　4.26±2.49 　　4.80±2.23　　4.57±2.29
　慢性乙型肝炎组　7 　　　0.18±0.14 　　0.13±0.05 　　0.37±0.18
　健康志愿者组　　 6 　　　0.28±0.13 　　0.59±0.27　　 0.68±0.33
　t值，P值* 　　　　　　　2.851，0.019 　2.709，0.024 　3.235，0.010
　t值，P值** 　　　　　　　2.999，0.013 　2.508，0.031 　3.305，0.010
* 为慢性乙型肝炎组与急性乙型肝炎痊愈组比较；** 为健康志原者组与急性乙型肝炎痊愈组比较，差异均有显著性
表2 慢性乙肝患者淋巴细胞对乙型肝炎核心抗原18-27多肽刺激树突状细胞诱导T细胞反应
组别　　例数　　分泌细胞因子的细胞占CD8+细胞的百分数（%）
　　　　　　　 γ干扰素/CD8 　　白细胞介素-2/CD8 　　　肿瘤坏死因子-α/CD8
慢性乙型肝炎组（1） 7 0.18±0.14 　0.13±0.05 　　　　　　0.37±0.18
慢性乙型肝炎组（2） 7 0.59±0.39　 0.74±0.16 　　　　　　1.52±0.38
慢性乙型肝炎组（3） 7 0.28±0.15　 0.46±0.13 　　　　　　0.68±0.15
t值，P值* 　　　　　 2.401，0.033 　2.383，0.035 　　　　2.769，0.017
t值，P值** 　　　　2.259，0.043　 2.191，0.049 　　　　　2.498，0.028
1为多肽刺激外周血单个核细胞组，2为经多肽刺激树突状细胞诱导T细胞组，3为未加多肽刺激树突状细胞与T细胞孵育组。* 为1组与2组比较；** 为3组与2组比较

讨论
　　HBV感染机体后，体内的CTL通过杀伤靶细胞和分泌细胞因子的非细胞毒机制抑制病毒复制，因此抗病毒T细胞免疫反应的强弱，很可能成为决定急性自限性感染或慢性感染的标志。在急性感染最终清除病毒的个体中，其对于HBV的CTL反应是多克隆、多特异性的，而在慢性感染的个体，对于HBV的CTL反应很弱、几乎测不到，机体对HBV形成一种免疫耐受状态而成为慢性迁延不愈。
　　当致病原侵入机体时，体内的免疫系统产生较强的针对此抗原的免疫反应清除致病原，进入免疫反应的后期，多数效应T和B淋巴细胞逐渐凋亡，但是有部分淋巴细胞分化成为长寿命的记忆性细胞，再次遭遇抗原时，可以对抗原产生很强的次级免疫反应，通过杀伤感染的细胞和分泌细胞因子来消除致病原。根据表面标志及功能，分为CD4+和CD8+记忆性 T细胞[8]。实验发现CHB患者和健康志愿者的PBMC对于HBcAg 18-27 CTL表位多肽的刺激生成低水平的细胞因子，而AHB患者PBMC针对HBcAg 18-27 CTL表位多肽的刺激其T细胞可分泌较高水平的细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α，与CHB患者比较差异有显著性。表明AHB患者对HBV有记忆性细胞存在，可以产生记忆性免疫反应，而CHB患者对于HBV仍处于免疫耐受状态。
在免疫系统中T细胞占有极其重要的地位，T细胞不仅有效应功能，而且是机体调节免疫功能的主体，在清除HBV中，辅助性T细胞（helper T cell，Th）和CTL都起着至关重要的作用，T细胞的活化需要两个信号：第一信号来自T细胞受体识别APC表面的主要组织相容性抗原-肽复合物；第二信号是由协同刺激分子相互作用提供的，包括CD28/B7等，这两组信号都有APC参与作用，DC是其中最强的抗原呈递细胞，其表面丰富表达主要组织相容性复合物分子、协同刺激分子B7和黏附分子，分泌IL-12，从而诱导初级免疫反应，活化初始型T细胞[9]。DC广泛的分布于全身各器官，可以从外周摄取抗原，将其处理后呈递给T细胞，诱导免疫反应，因此DC是免疫反应的启动者。HBV转基因小鼠不能对HBsAg产生免疫反应，但是当将DC回输给小鼠时，可以产生正常数量针对HBsAg的CTL，HBV转基因小鼠对HBsAg的耐受是由于T细胞无能或T细胞忽略形成的而不是由于T细胞的缺失[10]。DC给T细胞提供了活化必须的信号，因此产生了特异的CTL。将DC事先以HBV C区CTL表位多肽刺激，再将刺激后的DC与自身淋巴细胞孵育，诱导T细胞活化，实验结果显示诱导后的T细胞均可分泌较高水平的细胞因子，与其记忆性T细胞比较分泌细胞因子的水平有显著提高。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:19

不同T细胞亚群分泌的细胞因子也不同，IL-2、IFN-γ、TNF-α这3种细胞因子是Th1型细胞因子，而且活化的CTL也可以分泌。IL-2是T淋巴细胞主要的自分泌生长因子，同时也可刺激其它T细胞衍生细胞因子如IFN-γ的产生；IFN-γ与TNF-α的作用相似，可以抑制病毒复制，并且可以增加I类主要组织相容性抗原分子的表达，以此促进CTL介导的病毒感染细胞的杀伤[9]，因此在实验中选择了检测上述3种细胞因子。从实验结果显示经免疫表位多肽诱导的CHB患者DC可以在体外诱导特异性效应T细胞活化，并分泌对病毒清除有重要作用的细胞因子。因此理论上，可以将这种经诱导的DC回输至患者体内，可以有望打破机体免疫耐受，清除体内的HBV。
参考文献
　　1Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 1998, 392: 245-252.
　　2Nouri-Shirazi M, Banchereau J, Fay J, et al. Dendritic cell based tumor vaccines. Immunol Lett, 2000, 74: 5-10.
　　3中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防止方案. 中华肝脏病杂志，2000, 8: 324-329.
　　4李若冰，陈红松，费然，等. 慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞功能的研究. 中华医学杂志，2002，82：887-890.
　　5Waldrop SL, Pitcher CJ, Peterson DM, et al. Determination of antigen-specific memory/effector CD4+ T cell frequencies by flow cytometry: evidence for a novel, antigen-specific homeostatic mechanism in HIV-associated immunodeficiency. J Clin Invest, 1997, 99: 1739-1750.
　　6Jung T, Schauer U, Heusser C, et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods, 1993, 159: 197-207.
　　7姚桢. 分子乙型肝炎病毒相关病学. 北京：中国医药科技出版社，1997. 106-116.
　　8Ahmed R, Gray D. Immunological memory and protective immunity: understanding their relation. Science, 1996, 272: 54-60.
　　9Whitmire JK, Ahmed R. Costimulation in antiviral immunity: differential requirememts for CD4(+) and CD8 T (+)cell responses. Curr Opin in Immunol, 2000, 12: 448-455.
10Shimizu Y, Guidotti L G, Fowler P, et al. Dendritic cell immunization breaks cytotoxic T lymphocyte tolerance in hepatitis B virus transgeneic mice. J Immunol, 1998, 161: 4520- 4529.

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:19

AIM-V是无血清培养基它的应用如下：
BIOMANUFACTURING BULLETIN
适应无血清细胞培养
论文：无蛋白培养基中的杂交瘤细胞的生长和抗体产生
论文：用限定化学成分培养基培养CHO细胞生产重组蛋白
GlutaMAX™——最小化有毒性氨的产生
新型高级颗粒化技术培养基础（Advanced Granulation Technology™）
哺乳动物细胞和昆虫细胞
新型的FreeStyle™ 293表达系统
无酚红培养基
重组蛋白酶（rProtease）
高级D-MEM和高级MEM
第三章无血清和无蛋白培养基

一个成功的企业，必定具备高瞻远瞩的战略眼光。在血清产品受到广泛欢迎，稳居市场占有率第一的情况下，GIBCO 即开始研制无血清培养基产品，这是基于对人类和动物保健品安全性的长远考虑。由于占据了市场先机，GIBCO 理所当然地成为无血清培养基生产的领先者。针对各种细胞如CHO细胞、淋巴细胞、杂交瘤细胞、昆虫细胞等的无血清培养基相继问世，并且发展了完全不含蛋白质成分的无蛋白培养基。而被称作Chemical Defined(化学限定的)的无动物来源培养基的问世，则标志着细胞培养基发展的至高境界。这种明确每一种化学成分、无任何动物来源组分的培养基，消除了对培养基生物安全性的任何担忧。

无血清培养基及应用

无血清培养基是设计用来在无血清条件下生长特殊类型的细胞或进行专门应用的培养基。无血清培养基的使用体现了一种重要的工具，它允许细胞培养在一套限定的条件下进行，尽可能免于干扰参数的影响。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:20

使用无血清培养基的优点 ● 增加确定性
● 性能更加一致
● 容易进行纯化和下游加工
● 细胞功能的精确评估
● 增强生长和/或产量
● 生理反应性的较好对照
● 增强细胞内中介物的检测

某些应用可能需要添加生长因子和/或细胞因子。

小结：

无血清培养基——培养基中没有添加血清，但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。

无蛋白培养基——培养基中没有添加蛋白，但是仍然可能包含一些动物或植物来源的成分（例如，提供低分子量肽的各种水解物）

化学限定培养基——培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分。所有的成分均有已知的化学结构。

血液和骨髓细胞
血液和骨髓细胞无血清培养基产品目录号价格应用
淋巴细胞 AIM V® 12055091 查询补充IL-2的细胞毒淋巴细胞的间接体内 (Ex vivo) 激活。
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL细胞）或细胞毒T细胞的生长。
HIV病毒的生产。
12055083 查询
31035025 查询
0870112DK 查询
0870112BK 查询
巨噬细胞，单核细胞 Macrophage-SFM 12065074 查询生长和维持（可能有必要加入GM-CSF）。
证明巨噬细胞的噬菌作用。
使用γ干扰素或脂多糖激活能杀死肿瘤的细胞。
来源于骨髓、外周血和新生儿脐带学的人造血祖细胞（CD34+） Stempro® -34　SFM（补充Stempro® -营养添加物） 10639011 查询生长和维持人造血祖细胞（加入必须因子）。
研究生长因子在细胞分化时协同/独立作用。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:21

杂交瘤细胞
杂交瘤细胞无血清培养基产品目录号价格应用
小鼠，人，大鼠杂交瘤 CD Hybridomas Medium
CD Hybridomas AGT™ 11279023 查询
化学成分限定，无蛋白培养基，用于细胞生长和单克隆抗体生产。

12372025 查询
12372017 查询
小鼠，人，大鼠杂交瘤 Hybridomas SFM 12045084 查询低蛋白(20µg/ml)培养基，用于细胞生长和单克隆抗体生产。
12045076 查询
小鼠，人，大鼠杂交瘤 PFHM-II 12040077 查询无蛋白培养基，用于细胞生长和单克隆抗体生产。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:21

昆虫细胞
昆虫细胞无血清培养基产品目录号价格应用
Drosophila
melanogaster 细胞
(D. Me 1-2, Schneider S2 细胞)
Drosophila-SFM 10797017 查询无蛋白生长和维持培养基，用于贴壁或悬浮培养。
10797025 查询
BTI-TN-5B1-4 昆虫细胞 Express Five® SFM 10486025 查询无蛋白培养基，用于进行贴壁或悬浮培养的，使用杆状病毒表达载体系统（BEVS）细胞的生长和维持。大规模生产BEVS 表达重组蛋白。
Sf9,Sf21,TN368 细胞 Sf-900 SFM 10902096 查询无蛋白培养基，用于进行贴壁或悬浮培养的，使用BEVS细胞的生长和维持。
大规模生产BEVS 表达重组蛋白。

10902088 查询
10902104 查询
10902070 查询

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:21

人胚胎肾（293）细胞
293 细胞无血清培养基产品目录号价格应用
293 细胞（包括293-F,293-H） CD 293 Medium
CD 293 AGT™
11913019 查询化学限定的无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产或腺病毒生产。没有动物来源成分。
12529020 查询
12529012 查询
293细胞，HeLa S3 细胞 293 SFM Ⅱ 11686029 查询低蛋白（＜10µg/ml）培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产或腺病毒的生产。没有人或动物来源成分的。
悬浮培养状态的293-F细胞 Freestyle™ 293 Expression Medium 12338018 查询无血清和无蛋白（＜10µg/ml）培养基，用于悬浮培养的293-F细胞的生长和转染。
12338026 查询

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:22

中华仓鼠卵巢（CHO）细胞
CHO细胞无血清培养基产品目录号价格应用
CHO细胞（包括CHO-S细胞） CD CHO Medium
CD CHO AGT™
10743011 查询化学限定的无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。没有动物来源成分。
10743029 查询
12490017 查询
12490025 查询
CHO细胞（包括CHO-S细胞） CHO-SFM Ⅱ 12052114 查询低蛋白（＜75µg/ml）培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。
12052098 查询
31033020 查询
22052047 查询
CHO细胞 CHO Ⅲ PFM 无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。可获得定制配方培养基。
CHO细胞 CHO Ⅲ A PFM 无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产的。可获得定制配方培养基。
CHO细胞 CHO-A-SFM 低蛋白（＜250µg/ml）培养基，用于贴壁培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。可获得定制配方培养基。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:22

神经细胞
神经细胞无血清培养基产品目录号价格应用
胎儿神经细胞 Neurobasal™ Medium
或无酚红 Neurobasal™ Medium
21103049 查询没有兴奋性氨基酸的基本培养基协同补充成分一起使用，构成完全的无血清培养基，以维持神经细胞的长期生长。
12348017 查询
成人和新生儿神经细胞（1周） Neurobasal™ A Medium
或无酚红Neurobasal™ A Medium
10888022 查询
12349015 查询
原代大鼠胚胎海马神经元;来自stratium, substantia nigra, septum和cortex原代大鼠神经细胞 Neurobasal™ Medium with:
B-27 添加物
17504044 查询生长和维持。
最小化神经胶质细胞的增殖。
B-27 AO 是没有抗氧化剂的B-27 B-27 AO添加物 10889038 查询 B-27 AO用来研究自由基损害和凋亡。
原代神经元的维持(低蛋白，＜125mg/ml）
神经肿瘤细胞系的生长和维持。

原代大鼠胚胎海马神经元，神经来源的肿瘤细胞系（PC12, B104, N1E-115和NS20） N2 添加物 17502048 查询
原代神经胶质细胞和神经胶质细胞，星形胶质细胞，小神经胶质细胞，少突神经胶质细胞来源的肿瘤细胞系（U-251, MGsp, C6BD, RN-22 G5 添加物 17503012 查询生长和维持

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:23

哺乳动物细胞
哺乳动物细胞无血清培养基产品目录号价格应用
原代和第二代人脐静脉，微血管和动脉的内皮细胞原代人，猴和大鼠肝脏细胞 Human
Endothelial-SFM
11111044 查询细胞的生长和维持，以进行细胞与细胞之间的相互作用，损害分析，动脉硬化，信号转导，细胞因子的产生和细胞基质相互作用的研究。
原代人，猴和大鼠肝脏细胞 Heoatozyme-SFM 17705021 查询维持肝脏细胞（细胞色素P450保持＞9天）。
人表皮角化细胞和子宫颈表皮细胞（不支持成纤维细胞和黑色素细胞） Keratinocyte-SFM (with EGF, BPE) 17005042 查询细胞生长和维持，以进行皮肤替代物，基因治疗和体外毒理学的研究。
37010022 查询
人表皮角化细胞和子宫颈表皮细胞（不支持成纤维细胞和黑色素细胞） Defined
Keratinocyte-SFM (without BPE)
10744019 查询进行子宫颈表皮细胞培养的低蛋白（＜25µg/ml）培养基。用于进行有关人乳头瘤病毒的研究。
胚胎干细胞 Keratinocyte-SFM (without BPE)
KnockOut™ D-MEM with KnockOut™ serum replacement
10829018 查询生长和维持用于各种用途的生产转基因动物的未分化的ES细胞。
10828028 查询
COS-7L, VERO, HEP-2和BHJ-21（悬浮培养） VP-SFM, VP-SFM AGT™ 11681020 查询低蛋白（5µg/ml）培养基，用于细胞生长和病毒的生产。
12559027 查询
12559019 查询
MDCK, MDBK, BHK-21 OptiPro™ SFM 12309019 查询低蛋白培养基，用于肾上皮细胞和表达病毒相关细胞的培养。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:23

BIOMANUFACTURING BULLETIN

单克隆抗体生产的关键技术

上游的决定通常会影响下游的生产——可能更好或更坏。当您选择GIBCO产品时，您就获得了我们的资源以支持您未来的工业应用。当您的生产规模放大时，我们将改动我们的技术以适应您的需求。

在细胞培养方面的革新

作为全球最大的细胞培养基生产商，GIBCO研制并发展了各种培养基，并已优化使细胞适应时间减至最低。

CHO培养基和细胞系

中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是最常用于重组蛋白的表达和单克隆抗体生产的细胞系。可在悬浮培养条件下生长到高密度、可对表达和分泌的蛋白进行适当的转录后修饰（包括糖基化）等特性，使得CHO细胞成为许多抗体和用于人类治疗目的的蛋白质生产的首选（图1）。

重组的CHO细胞可成功地以贴壁或悬浮方式大规模生长。对无血清、无蛋白、限定化学成分的培养条件的使用趋势使得贴壁细胞的使用更加困难而悬浮细胞的使用逐步增长。

GIBCO发展了多种用于大规模悬浮培养的无血清培养基：

CD CHO是限定化学成分的无蛋白培养基，不含谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸腺嘧啶。它不含有任何直接的动物来源成分（图2和图3）。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:23

CHO-S-SFM是一种低蛋白（<100ug/ml）培养基。这是GIBCO的第二代CHO细胞无血清培养基，已被中国客户广泛接受。目前国内主要的EPO生产厂家均使用GIBCO的CHO无血清培养基作为生产原料。我们对此深感自豪。

CHO-III-A PFM无蛋白培养基是优化用于中国仓鼠卵巢细胞贴壁培养的无蛋白培养基，它含有植物水解物，但不含任何直接动物来源的成分。这已是GIBCO生产的第三代CHO细胞培养基，表明GIBCO一直在努力改进产品以适应客户的不同需求，并保持了在无血清培养方面的技术领先地位。

其配方中去除了表面活性剂，并增大了钙离子和镁离子浓度以促进细胞贴壁。CHO-III-A不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶，可用于二氢叶酸还原酶扩增体系。对其他用途，须在使用前添加10ml/lHT。注意：一些二氢叶酸还原酶缺失的CHO细胞须额外添加50mg/l的甘氨酸以促进细胞贴附和扩增。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:24

CD杂交瘤培养基

近年来，须添加血清的杂交瘤培养基已逐步被各种无血清配方所取代。但这些无血清配方中仍然含有蛋白质，这在某些用途上仍然是不可接受的。

对更精确的培养基成分的要求和在保证更好或相同培养效果的前提下去除动物来源成分的需要，促使GIBCO发展了限定化学成分的杂交瘤培养基CD HYBRIDOMA MEDIUM。

● 这是第一种优化用于杂交瘤生长和单克隆抗体生产的无蛋白、限定化学成分的培养基
● 不含任何人类和动物来源的成分
● 不含谷氨酰胺，增加稳定性
● 简化下游纯化工作

由于不含动物来源的成分，减低了含有对人类健康不利的风险因子的可能性。适合于重组的骨髓瘤细胞系和传统的杂交瘤细胞的培养。其培养效果超过须添加血清的普通培养基和无血清培养基。设计用于批量培养系统，也可简单地修饰后用于其他系统。生长在传统的须添加血清的培养基中的细胞可容易地适应这种无蛋白培养基（图4）。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:24

适应无血清细胞培养

有两种方法使细胞适应无血清培养基（SFM）: 1. 直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。
2. 连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。

为了使细胞适应无血清培养，关键的是培养细胞： 1. 处于对数生长中期
2. >90% 活细胞率
3. 适应时以较高的起始细胞接种

下面是适应的一般步骤。起始细胞接种、细胞产量和培养周期作为连续优化的起始点。

直接适应

一些类型的细胞可以直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该是 2.5×10到3.5×10 细胞/ml。当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×10到4×10细胞/ml时，细胞完全适应了无血清培养基。每隔3到5天，当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。

连续适应

1. 以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25％SFM 混合培养基中，传代培养。
2. 当细胞密度>5×10 细胞/ml时，以2×10到3×10细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
3. 以2×10到3×10细胞/ml细胞密度，25％有血清培养基和75% SFM中传代培养。
4. 当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml（接种后4到6天），在100％SFM培养基中传代培养。
5. 每隔3到5天，当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
注释：建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:25

细胞培养适应替代血清

许多细胞利用连续适应的方法能够很好的适应，用包含FBS的当前的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1（v∶v）的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培养基。在每一次适应改变血清比例时，传代细胞2到3次。

培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。

论文：无蛋白培养基中的杂交瘤细胞的生长和抗体产生

Stephen Gorfien, etc. 细胞培养研究和发展部，GIBCO

在最近几年中，传统的需要添加血清的杂交瘤培养基已被不同的无血清配方所取代。但一些无血清培养基配方中仍包含蛋白质（如胰岛素、转铁蛋白、白蛋白等）或者蛋白质水解物。从无动物来源成分的培养基的发展趋势来看，这样的无血清培养基在某些具体应用中也难以接受。我们设计限定化学成分（chemical defined）杂交瘤细胞培养基的目的，就是为了发展出一种无蛋白质的化学成分配方，完全没有动物来源成分，并适用于杂交瘤细胞的生长和单克隆抗体的生产。在此报告中，我们在稳定和搅动的悬浮培养中检验了这种培养基，并成功地放大到15升的生物反应器中。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:25

方法：

杂交瘤AE-1(SP2/0-Derived), PIF6(FOX-NY-Derived), 和TY6-25.3培养在CD杂交瘤培养基(Cat.No.11279), 杂交瘤-SFM, 无蛋白杂交瘤培养基(PFHM ll), 或IMDM+10%FBS。静止悬浮培养在75-cm² 162-cm²培养瓶（分别为15ml或35ml到40ml培养体积）中进行。摇动小规模的培养在125-ml或250-ml（分别为35m和75ml培养体积）一次性塑料摇瓶中，以125～135rpm转速在轨道震动平台上进行。总的细胞数用电子颗粒计数器计数，细胞活力用台盼兰染色评估。

使生长在IMDM+10% FBS或杂交瘤-SFM培养基细胞适应在其它的培养基中生长，经过三代后，评估批次培养的生长状况及抗体生产能力。使用前，CD杂交瘤培养基补充8mM L-谷氨酰胺。所有的小规模实验的数据代表了从指定细胞系获得的多次CD杂交瘤培养基的评估结果。

规模放大实验用Bellco 15-L搅拌罐生物反应器系统。已经适应的CD杂交瘤培养基的细胞以1×10活细胞/ml的密度接种，生物反应器的起始对照参数为：37℃，50%空气饱和度的溶解氧，pH 7.2, 和120rpm。用一个75ml摇瓶进行与生物反应器相同接种的对照培养，以排除细胞或培养基作为生物反应器培养时观察到不良性能的原因。

生长曲线实验使用以前适应的细胞，这种细胞可以生长到6天而无需更换培养液。每天采集样品以确定总的活细胞的密度和抗体的滴度。

通过修改的Wakefield etal.描述的ELISA 分析（1）确定抗体滴度，GIBICO BRL TMB-ELISA(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine Base)被用来观测过氧化物酶偶联的抗体。通过A450读数定量MAb。

在一些实验中，用YSI 2700 Select Analyzer测量用过的培养基样品中的葡萄糖、乳酸盐和L-谷氨酰胺的含量。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:26

结果：

所有试验的杂交瘤细胞成功地适应了从添加血清和无血清的培养基到直接在CD杂交瘤培养基中生长。与添加血清的IMDM培养基相比，培养在CD杂交瘤培养基中的杂交瘤AE-1具有相似的活性细胞密度峰值，但是具有较高的IgG 水平峰值（图1）。对于杂交瘤细胞P1F6，在CD杂交瘤培养基中的生长和MAb 的产量比在杂交瘤－SFM中效果好（图2）。

图1 杂交瘤细胞AE-1的生长状况和IgG的产量来自IMDM+10% FBS静止悬浮培养的细胞适应5代，生长在162-cm²的培养瓶中，5天内不更换培养基。Panel A 生长状况 Panel B 单克隆抗体产量。培养基：CD杂交瘤培养基（■）IMDM+10% FBS（□）杂交瘤－SFM()和PFHM Ⅱ(）。

图2 杂交瘤细胞P1F6的生长状况和IgG的产量来自杂交瘤-SFM搅动悬浮培养的细胞适应3代，生长在125ml的摇瓶中（35ml体积），5天内不更换培养基。培养基：CD杂交瘤培养基（■）和杂交瘤－SFM()。

杂交瘤细胞也被成功地培养在CD 杂交瘤培养基生物反应器中(图3)。此外，生物反应器控制溶解氧和PH值的能力导致比摇瓶对照的更好的生长和更高的产量。图3C显示葡萄糖和谷氨酰胺在生物反应器培养时的利用，表明接种4天后两种成分都变得有限。尽管有必要进一步营养消耗的研究，但是葡萄糖和谷氨酰胺的利用曲线表明，批次添加策略可能进一步促进生长和提高抗体产量。

图3 TP6-25.3杂交瘤细胞在生物反应器中培养的生长状况和IgG的产量以前适应了CD杂交瘤培养基的细胞以1×10活细胞/ml接种到生物反应器（●）或者对照摇瓶（）中。检测5天细胞生长（Panel A）和单克隆抗体产量（Panel B）。Panel C 生物反应器培养中检测活细胞的百分比（●）、谷氨酰胺存留量（） )和葡萄糖存留量（■）。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:26

讨论：

细胞易于适应CD 杂交瘤细胞培养基（传代5次以内）并且在多种培养基体系中相对于无血清和无蛋白培养基可得到相似或更好的培养效果。在15L的搅拌罐反应器中成功放大表明这种培养基具有大规模生物生产系统的应用潜力。

已有几种类型的培养基配方可用于杂交瘤细胞培养，包括需添加血清的IMDM，无血清的杂交瘤培养基（包含2种蛋白和一些动物来源的成分），无蛋白质（PFHM II）的培养基（但含有动物来源的成分）和限定化学成分的CD杂交瘤培养基（不含蛋白质或动物来源的成分）。提高细胞培养效果和单克隆抗体的产量，需要更精密的配方以适应不同的要求。限定化学成分的无蛋白培养基简化了单克隆抗体的回收和纯化，同时由于没有动物来源的成分而避免了一些涉及到法规的麻烦。

参考文献

1. Wakefield, E. F. , Shelton, M, J. , and Hosking, c. s. (1982)
Clinica Chimica Acta 123, 303.
2. Mullins, T. D. , Dzimian, J. L. , Fike, R. M. and Weiss, S. A.
(1991) Focus 13, 91.
3. Fike, R. M. Pfohl, J. , Jayme, D. , and Weiss, S. A. (1990)
Focus 12, 79.
4. Dhainaut, F. Bihoreau, J, L. Lirochon, J. , Vicentelli, R. , and
Migont, G. (1999) Cytotechnology 10, 33.
5. Csirke, B. , Godwin, G. , and Gorfien, S. (1999) Focus 21, 33.

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:27

论文：用限定化学成分的培养基培养的CHO细胞生产重组蛋白

STEPHEN F. GORFIEN,JOYCE L. DZIMIAN,MARY LYNN TILKINS,GLENN P. GODWIN AND RICHARD FIKE. Life Technologies, Inc. 3175 Staley Road., Grand Island, NY 14072. U.S.A

1. 摘要
　
中国仓鼠卵巢细胞（CHO）的无血清培养，作为一种获得高水平表达重组蛋白，同时简化产物的回收和下游步骤的方法越来越普遍使用。然而，无血清培养基仍然含有一种或多种动物来源的成分，包括白蛋白、胎球蛋白、各种荷尔蒙以及其它蛋白质。我们已经证实从CHO培养基配方中去除动物来源蛋白是可行的。血浆蛋白成分如白蛋白和胎球蛋白可以用植物来源的水解产物代替，尽管这种培养基（CHO III PFM）是无蛋白的，但是其化学成分还是没有限定。CD CHO培养基配方是限定化学成分的，不含动植物来源的蛋白质或水解产物。与其它培养基相比，CD CHO虽然相对其它培养基细胞峰密度和最高表达水平出现时间的滞后，但在该培养基中有更佳的峰密度和最高表达水平。我们通过加入丁酸钠成功提高了在最高细胞密度时的表达水平，重组细胞系在生长和重组产物的表达方面表现出一种反比关系，限制细胞密度的方法可能会有效地增强表达。

2. 前言
　
对于大规模培养CHO细胞和重组产物表达，因为与使用血清相关的费用、效果和调控的因素越来越成为问题，所以减少或者去除培养基中的血清成分的方法变得越来越常见。因为无血清培养基可能含有各种未限定成分，包括蛋白质、多肽、蛋白水解物，这些配方是血清培养基的一种改进，但可能并没有去除与血清相关的因素。比无血清培养基进一步改进的是无蛋白培养基。这种无蛋白培养基配方中，传统的成分例如白蛋白、胰岛素和铁传递蛋白被其它的成分替代。然而除非特别标明配方是无蛋白、限定化学成分，培养基中可能包含动植物来源的蛋白水解物，其中可能有促进生长和表达的小分子多肽。我们实验室研制的CHO III PFM培养基是普通的未限定化学成分的无蛋白培养基的一个范例，它含有植物中提取的水解物。我们证明细胞在适应这种培养基之后，与在另外一种无血清培养基CHO-S-SFM II相比，生长相同，而表达水平提高。然而CHO III PFM 去掉植物水解物后，它就不再支持重复传代培养中rCHO细胞的生长。因此一种全新的既无蛋白又是限定化学成分的培养基配方面世了。CD CHO培养基不含动植物来源的或者合成的蛋白质、多肽成分。对于想使用无蛋白培养基和/或限定培养体系的用户，我们调节细胞适应不同的培养基以及调节生长和表达方面的经验是具有指导意义的。

3.材料和方法：

3.1培养基，细胞和培养条件

所有使用的培养基配方都不包含核苷酸而且进行了悬浮培养优化。CHO-S-SFM是一种低蛋白（<100µg/mL）无血清培养基。CHO III PFM是一种基本上没有蛋白质的定制配方，不包含动物来源的蛋白。CD CHO培养基是一种限定化学成分的配方，不包含动植物来源的蛋白质、多肽或者水解产物。
　
CHO（DHFR缺陷型）细胞购自ATCC（CRL-9096，Rockville. MD），然后用以下两种质粒转染：含有氨甲喋呤（MTX）抗性基因的pSV2dhfr（37146）（购自ATCC）和表达ßgal的质粒pCMV ßgal （购自Pam Hawley-Nelson，Invitrogen）。转染使用LIPOFECTAMINE™试剂（Invitrogen公司），用1.2µM MTX 进行筛选，培养物维持在含0.3µM MTX的悬浮培养基中，通常每隔3-4天就以3×10活细胞/ml密度进行传代培养，在125ml体积的塑料摇瓶中培养（20-35ml培养体积），置于有轨摇床上，平转速度为125-135rpm，保持空气湿润，CO2密度为8%。对于rCHO细胞在无血清悬浮培养基CD-CHO中的情况我们进行了放大培养评估，采用5 L Celligen™ 生物反应器（New Brunswick Scientific，Edison，NJ），接种密度为1-3×10活细胞/毫升，最终工作体积是3.8 L。每天取样来测定总细胞和活细胞的数量，葡萄糖和氨基酸的利用情况，乳酸和氨气的累积以及重组产物。PH值、溶解氧和温度以及速度保持原有的设定，分别为：7.40，50%的空气饱和度和37.0℃以及90rpm。在每个实验中，在接种后第9天加入浓缩的10x葡萄糖和谷氨酸（终浓度分别为3.0g/L和1.0g/L）添加剂。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:27

3.2重组蛋白定量和表达增强

用一种改进的方法测量（Hall，等〔4〕和Miller〔5〕）细胞裂解物中 rß－半乳糖苷酶。简单的说，从每个样品中收集2.0ml细胞悬浮物，经过两次冻融过程后，100xg离心4分钟，收集上清测定rß－半乳糖苷酶含量。将100ul上清加入到1.0ml，pH值7.0的 Z buffer中(0.06M Na2PO4，0.04M NaH2PO4, 0.01M KCl, 0.01M MgSO4. 7H2O, 0.05M ß-Mercaptoethanal), 然后加入200ul的ONPG（o-nitrophenyl-ß-D-galactoside, 4.0mg/ml溶于dH2O），37℃温育120分钟。加入500ul的终止缓冲液（1M Na2CO3）终止反应，以相应的培养基作为空白对照，在波长为420nm处测定吸收值。

我们研究出一种加入丁酸钠的方法来增强rß－半乳糖苷酶的表达。培养物在接种后0或2天加丁酸钠至浓度为0.1mM或1.0mM温育，或者在接种第4天加入1.0mM丁酸钠分析重组蛋白表达和生长的效果。

4. 结果

rß-Gal CHO细胞很容易适应CD CHO培养基，而且一旦适应以后，比CHO-S-SFM II(图1)和CHO III PFM(数据未列出)能得到更高的总细胞密度。比较CD CHO培养基和CHO-S-SFM培养基中培养物的rß-Gal水平（图1所示），我们发现在CD CHO中细胞生长和rß-Gal的表达水平呈现反比，直到生长达到平台期的时候r b-Gal才能高水平表达。在不同培养时期加入不同浓度的丁酸钠来增强rß-Gal表达（图3所示）。当高浓度丁酸钠存在时（1.0mM），在接种当天加入生长和表达会受到抑制，而在第2天加入则会抑制生长而增强表达。当低浓度的丁酸钠存在的时候（0.1mM），在接种当天和第2天加入都会增强重组蛋白的表达水平。图4所示是将Celligen 生物反应器和摇瓶对照培养进行比较，发现两者生长动力学相似，而反应器中rß-Gal的表达水平更高。接种后第九天补充葡萄糖和谷氨酸，但是没有提高rß-Gal在第9天的表达水平峰

图1：对比CD-CHO培养基和CHO-S-SFM II中生长和rb－Gal表达。CD-CHO中总的细胞密度持续上升（从第三天到第八天，上方图），但在CHO-S-SFM II培养基密度保持不变；rb-Gal表达在两种培养条件下持续升高（上图），但在CD-CHO中表达的产物总量更多。

图2

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:29

5. 讨论

我们现在正在考虑替换工业用培养基中的动物来源的成份。已经证实CHO细胞有可能在完全限定化学成份、不含动植物来源蛋白质、多肽或水解产物的培养基中生长。与无血清培养基（CHO-S-SFM II）和无蛋白、未限定的培养基（CHO III PFM）相比，在CD CHO培养基的批量培养能获得高密度的细胞。在到达细胞密度的峰值后，CD CHO培养基中培养的DHFR扩增的rCHO细胞系出现高表达水平。已经证实丁酸钠是细胞生长的强抑制剂，还能促进蛋白质合成〔6〕。其他人也证实多克隆抗体〔7〕和重组蛋白质〔8、9〕的表达水平在加入丁酸钠之后提高。在我们的研究中，通过加入丁酸钠成功限制了细胞的生长并增强了rCHO细胞的rß-Gal表达水平。然而，浓度和加入时间对蛋白质表达的优化也非常重要。用5L的生物反应器能在CD CHO中大规模培养。我们利用限定化学成份的培养基培养CHO细胞的实验表明您能够有更好的选择，用以替换含血清培养基、无血清或无蛋白但没有限定化学成份的培养基配方。

参考文献

1. Jayme, D. M., Epstein, D. A., Conrad, D. R. (1988)Tetal bovine serum altertives, Nature 334:547-8.
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3. Lambert, K. J. , and Birch, J. R. (1985) Animal Cell Biotechnology, R. E. Spier and J. B. Griffiths, Eds. (Academic Press,London),pp.85-122.
4. Hll, C. V. , Jacob, P. E. , Ringlod, G. M. , Lee, F. (1983) Expression and regulation of Escherichia coli lacZ gene fusions in mammailian cells. J Mol Appl Gen 2(1):101-109
5. Miller, j. (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY.
6. Kruh, J. (1982) Eeffects of sodium butyrate, a new pharmacological agent, on cells in culture. Mol Cell Biochem 42:65-82.
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作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:29

GlutaMAX™——最小化有毒性氨的产生(新技术)

通过使用GlutaMAX™培养基，防止L-谷氨酰胺降解、增加稳定性、最小化有毒性氨的产生。

L-谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分，不幸的是它不稳定，在中性的水溶液中会自发降解。因而，需要频繁地补加L-谷氨酰胺，——伴随破坏无菌状态的可能性——并产生毒性水平的氨。

使用GIBCO™GlutaMAX™培养基，可以避免由于L-谷氨酰胺降解带来的问题。

二肽与众不同

图1 GlutaMAX™二肽在121℃、20分钟高压灭菌后的稳定性

图2 D-MEM 添加GlutaMAX™ -I或L-谷氨酰胺，分装到小瓶中，贮存在37℃。每天取出样品并冻存在-20℃，通过HPLC检测氨的水平。

图3 D-MEM 添加GlutaMAX™ -I或L-谷氨酰胺，分装到小瓶中，贮存在37℃。每天取出样品并冻存在-20℃，通过HPLC检测GlutaMAX™ -I和L-谷氨酰胺的水平。

使用GlutaMAX™培养基，L-谷氨酰胺在贮存和孵育时不会降解。氨的产生最小化。L-谷氨酰胺的释放可以控制。通过鼠杂交瘤细胞生产的单克隆抗体量增加。此外，在使用的时候不需要添加L-谷氨酰胺。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:30

作用原理

GlutaMAX™二肽在细胞内被氨基肽酶分解，从二肽中释放L-谷氨酰胺和L-丙氨酸(GlutaMAX™ -I)。在大部分细胞培养系统，二肽谷氨酰胺可以象L-谷氨酰胺同样有效的被利用。GlutaMAX™ -I二肽是L-谷氨酰胺的直接替代物。无需适应，它既适合于贴壁细胞培养，也适合于悬浮细胞的培养，包括下列情况：

● 需要长期的孵育而不补充营养的培养系统（例如克隆分析）
● 要求最优标准化培养基进行长期的研究（例如毒性检测）
● 对氨敏感的培养系统（例如高密度生物反应器）
● 代谢研究

多种形式可供选择

许多广泛使用培养基的GlutaMAX™二肽替代L-谷氨酰胺形式可以得到。此外，GlutaMAX™二肽可以作为单独的补充物而获得，提供200mM溶液直接替代你当前使用的培养基形式。

1. Brand, K., Feki, W., Hintzentern, J., von Langer, K. Luppa, P., and Schroener, C. (1989) Metabolism 38, 29.
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Minimum Essential Medium (MEM) alpha Medium(1X), liquid (contains ribonucleosides and deoxyribonucleosides) 32571-036 500 ml 查询
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作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:30

新型高级颗粒化技术培养基(Advanced Granulation Technology™)

简化用于单克隆抗体生产和重组蛋白表达的复杂培养基

自从十九世纪六十年代初GIBCO™ 这一品牌建立以来，一直与细胞培养的技术突破相联系，包括彻底变革这一过程的新颖的培养基形式；1963年的干粉培养基（DPM），1992年的液体浓缩培养基（LMCs），和2002年创新的高级颗粒化技术培养基(AGT™)。

高级颗粒化技术培养基是一种全新的、易于使用的、颗粒状的干粉培养基。AGT™形式使许多的复杂配方适用于干粉培养基，提供了完全单一组分的形式，从而易于使用和从研究到生产的按比例放大。

我们开发了AGT™培养基，它把药物生产的fluid bed granulation应用到细胞培养的营养培养基生产上，这一过程适用于完全配方的多种多样的无血清、无蛋白和化学成分限定的营养培养基。

Invitrogen 公司使用fluid bed granulation药物生产技术生产无血清、无蛋白和化学成分限定的GIBCO™培养基，GIBCO™培养基利用一种新颖的干粉颗粒形式，易于水合和迅速的使用。

图1 培养基准备
Prep with Advanced Granulation Technology™ Media Prep with Dry Powder Media

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:30

完全、单一组分形式、pH值自动调节的培养基

与传统的细胞培养形式相比，新颖的AGT™形式具有明显的优点。AGT™培养基是完全的、pH值调节的培养基，如果必要的话，可能仅仅需要补充常规的L-谷氨酰胺。

AGT™完全培养基的基本优点在于，它为使用者提供了一种原材料，这种原材料能够降低涉及原材料计划、加工和检测的费用及时间。由于AGT™培养基是完全的、pH值预先调节和仅仅需要补充常规添加物的培养基，因而培养基的准备时间也被缩短。此外，由于AGT™颗粒溶解迅速，总的培养基准备时间减少。

检测生长和产量的性能

在杂交瘤细胞、CHO、VEROP和HEK293细胞的生长和生物生产的研究中，与成分相同、通过传统的液体和干粉加工程序生产的培养基相比，来源于AGT™加工程序的GIBCO™特殊培养基具有相同的或者更高的性能（见图2）。

图2 AGT™无血清培养基性能类似或优于1x 液体培养基

经放大验证的性能

AGT™培养基不仅适合于研究使用，它们也最适宜工业化规模的应用。在包括PH值、渗透压和均一性（通过HPLC分析氨基酸、维生素和其它组分）的专门研究中，证明了具有可放大性（见图3）。

图3 在全部的AGT™批次规模放大时，pH值和渗透压保持一致

此外，来自正在进行的实时稳定性研究的数据表明,通过AGT™加工的无血清培养基的稳定性至少与传统的生产方式生产的培养基相同。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:31

现在可以获得GIBCO™ AGT™形式的无血清和化学成分限定的培养基作为标准的目录项目，现在可以获得四种AGT™形式的GIBCO™ 特殊无血清培养基：CD（chemically-defined）杂交瘤培养基、CD CHO培养基、VP-SFM和CD 293培养基。其它的GIBCO™ AGT™ 形式的培养基可以按照定制的要求获得。

值得注意的是一些商业渠道获得的有些“化学成分限定的”营养培养基实际上包含有蛋白质。但是，GIBCO™ CD培养基的客户可以确信这些培养基是化学成分确定的：成分有明确的化学结构，没有人类或动物来源的成分，包括蛋白质和水解产物。通过特别的成分限定，GIBCO™ CD培养基能够提供产品性能的一致性。通过使用非动物来源的成分，减少了外源试剂污染的可能性。

CD杂交瘤培养基最适宜于普通的杂交瘤生长和单克隆抗体的生产及流水线纯化和下游的加工。适合于重组蛋白骨髓瘤细胞系和传统的杂交瘤细胞的培养，特别优于无血清和添加有血清的培养基。成分中不包含有酚红，可以最小化潜在的雌激素样效应和纯化的问题。在培养基中添加250x 胆固醇脂浓缩液时，CD杂交瘤培养基允许胆固醇依赖的细胞系如NS0、NS-1和相关的细胞系生长和表达蛋白。尽管这是为批次系统设计的，但是它很容易为其它用途修改。

CD CHO培养基最适宜于悬浮培养的中华仓鼠卵巢细胞的生长，重组蛋白和单克隆抗体的表达。成分中不包含有酚红，可以最小化潜在的雌激素样效应和纯化的问题。成分中不包含有次黄嘌呤和胸(腺嘧啶脱氧核)苷以便于在dhfr-扩增系统中使用。与添加血清、无蛋白和无血清培养基组分相比较，CD CHO培养基证明具有优越的性能。设计是为批次系统设计的，但是它很容易为其它用途修改。

VP-SFM 可作为目录产品而获得。GIBCO™ VP-SFM是一种无血清、超低蛋白培养基，专门为培养VERO细胞而设计。它也适合于COS-7、MDCK、BHK-21和HEp-2细胞系的生长。它特别适合于繁殖病毒和其它细胞培养应用，例如生产重组病毒和单克隆抗体。

VP-SFM中的痕量蛋白来源于重组蛋白。转铁蛋白已经用一种离子螯合物替代，白蛋白用来自植物的二肽或三肽代替。唯一需要的添加物是L-谷氨酰胺，依赖于使用的细胞系统，L-谷氨酰胺的添加浓度应该在2～6mM。很多细胞系例如VERO、BHK和HEP-2不需要适应VP-SFM：但是一些细胞系可能需要连续的适应。

CD 293培养基是经过专门工程改造的用于高密度悬浮培养293细胞的培养基。作为对于与传统293细胞培养相关困难的回应，GIBCO™ CD 293培养基是一种化学成分限定、无蛋白培养基。

CD 293培养基没有任何动物来源成分、不确定的裂解物或水解产物。CD 293培养基具有广泛的应用，包括腺病毒、逆转录病毒和其它病毒的繁殖，重组蛋白的生产和药物筛选的使用。

新型高级颗粒化技术培养基 ● 最优化的干粉颗粒形式的GIBCO™ 无血清培养基
● 完全的、pH预先调节的：只需加入水和谷氨酰胺（如果需要）
● 溶解快速，需要最少的培养基准备时间
● 保证培养基新鲜
● 容易进行从研究到生物生产的放大
● 与液体培养基相比较，降低了冰箱贮存要求
● 贮存期长
● 可以得到定制配方培养基

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:31

产品货号规格价格
CD CHO AGT™ 12490-017 1×1L 查询
12490-025 1×10L 查询
CD Hybridoma AGT™ 12372-025 1×1L 查询
12372-017 1×10L 查询
VP-SFM AGT™ (add L-glutamine if required) 12559-027 1×1L 查询
12559-019 1×10L 查询
CD 293 AGT ™(add L-glutamine if required) 12529-020 1×1L 查询
12529-012 1×10L 查询
Related Products
L-Glutamine 25030-081 100ml 查询
250X Cholesterol Lipid Concentrate 12531-018 100ml 查询
Distilled Water 15230-162 500ml 查询
CHO-S Cells (adapted to CD CHO and CHO SFM media) 11619-012 3ml 查询

哺乳动物细胞和昆虫细胞（新产品信息）

● 预先适应GIBCO™ 无血清培养基（SFM）生长
● 进行基因表达系统性能检测
● 节省适应所需要的时间和费用
● 方便、可靠的供给

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:32

Invitrogen目前提供了9种细胞系，这9种细胞系预先适应了在新一代GIBCO™ 无血清培养基（SFM）中的生长，提供了在小型和大规模的系统中一致、可靠的性能。

5种哺乳动物细胞和4种昆虫细胞系明显地节省了实验的时间和减少了与适应相关的费用。生长率同于或优于其它商业上可获得的细胞。Invitrogen是细胞培养产品，包括优化的特殊培养基，的最主要的提供商。现在细胞加入到我们的产品行列，为研究者订购高质量的培养基和可靠来源的细胞提供了方便和经济上的实惠。

性能检测特征：

● 支原体和无菌状态检测
● 冷冻检测复苏后生长和活力
● 主要细胞库鉴定检验，包括同功酶检验和鉴定核型
● 报告每一批次总的传代次数和SFM适应传代次数
● 每一批发货附上冷冻－复苏，放大和冷冻保存的程序

哺乳动物细胞系

293-F和293-H，SFM Adapted——人类５型腺病毒转化和在293SFM培养基中适应生长的原代人胚胎肾细胞，高水平表达蛋白质，证明使用Lipofectamine™ 试剂和Plus™ 试剂有较高的转染效率。293-F细胞系具有高于一般水平生长率的特点。293-H很容易转换到单层培养以进行粘附应用。

CHO-S,SFM Adapted——中华仓鼠卵巢细胞，生长在CD CHO培养基，证明使用Lipofectamine™ 试剂有较高的转染效率。

CHO-7L，SFM Adapted——来源于CV-1猿猴细胞的非洲绿猴肾细胞，用SV40突变体转化，在VP-SFM培养基中适应生长。可以扩增和过量表达转染的基因，证明使用Lipofectamine™ 试剂和Plus™ 试剂有较高的转染效率。

Primary Human Keratinocytes,Cryopreserved in Defined Keratinocyte-SFM——原代人角质细胞被加工和冻存在GIBCO™ 限定角质细胞－SFM培养基中，因而有效的适应了这种培养基。在从冻存中复苏后，5天内细胞可以达到完全的汇合培养。用16群加倍进行寿命性能检测，大多数批号证明具有20＋加倍。

图1 预先适应CD CHO培养基的CHO细胞。培养第5天
图2 预先适应293SFM培养基的293细胞。培养第3天

图3 预先适应Express Five™ SFM培养基的High FiveTM细胞。培养第3天图4 预先适应Drosophila-SFM培养基中悬浮生长的D.Mel2(or Schneider S2)细胞。培养第2天

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:32

昆虫细胞系

Sf9, SFM Adapted——来源于亲本spodoptera frugiperda 细胞系IPLB-Sf21-AE的分离克隆，适应于悬浮生长在Sf900Ⅱ,SFM培养基，一般通过使用杆状病毒表达系统（BEVS）来进行重组蛋白的表达。

Sf21, SFM Adapted——分离自spodoptera frugiperda卵巢细胞，适应于悬浮生长在Sf900Ⅱ, SFM培养基，一般通过使用杆状病毒表达系统（BEVS）来进行重组蛋白的表达。

D.Mel2(or Schneider S2), SFM Adapted——分离自Drosophila melanogaster晚期胚胎，适应于悬浮生长在Drosophila-SFM培养基，常常通过磷酸钙转染试剂盒用来进行瞬时或稳定表达重组蛋白。

High Five™, SFM Adapted——来源于亲本Trichoplusia ni BTI-TN-5B1细胞系的分离克隆，适应于悬浮生长在Express Five™ SFM培养基——最适于High Five™和其它的Trichoplusia细胞系。High Five™细胞系常常通过使用杆状病毒表达系统（BEVS）用来进行重组蛋白的表达。

定货信息类型细胞系目录号规格价格适应无血清培养基目录号规格价格
Insect D. Mel 2 10831-014 3 ml 查询 Drosophila-SFM 10797-017 500 ml 查询
10797-025 1000 ml 查询
Insect High Five™ Cells B855-02 3×10 cells/ml 查询 Express Five® SFM 10486-025 1000 ml 查询
Insect Sf9 11496-015 3 ml 查询 Sf-900 II SFM 10902-096 500 ml 查询
10902-088 1000 ml 查询
10902-070 10 L 查询
Insect Sf21 11497-013 3 ml 查询 Sf-900 II SFM 10902-096 500 ml 查询
10902-088 1000 ml 查询
10902-070 10 L 查询
Mammalian 293-F 11625-019 3 ml 查询 293 SFM 11686-029 1000 ml 查询
Mammalian 293-H 11631-017 3 ml 查询 293 SFM 11686-029 1000 ml 查询
Mammalian COS-7L 11622-016 3 ml 查询 VP-SFM 11681-020 1000 ml 查询
Mammalian CHO-S 11619-012 3 ml 查询 CD CHO 10743-011 500 ml 查询
10743-029 1000 ml 查询
Mammalian Primary Human Keratinocytes 12332-011 1 ml 查询 Defined Keratinocyte-SFM 10744-019 500 ml 查询

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:33

相关产品产品目录号规格价格
Blasticidin S HC1 R210-01 50 mg 查询
Calcium Phospate Transfection Kit K2780-01 75 reactions 查询
Cellfectin® Reagent 10362-010 1 ml 查询
Geneticin® (G418 Sulfate), liquid 10131-035 20 ml 查询
10131-027 100 ml 查询
Geneticin® (G418 Sulfate), Powder 11811-023 1 g 查询
11811-031 5 g 查询
Hygromycin B 10687-010 20 ml 查询
Lipofectamine™ Reagent 18324-111 0.5 ml 查询
18324-012 1 ml 查询
18324-020 4×1 ml 查询
Lipofectamine™ 2000 11668-027 0.75 ml 查询
11668-019 1.5 ml 查询
Plus™ Reagent 11514-015 0.85 ml 查询
Zeocin™ R250-01 1 g 查询
R250-05 5 g 查询

新型的FreeStyle™ 293表达系统

Invitrogen 公司新型的FreeStyle™ 293表达系统，简单和优化了293细胞中蛋白质的生产。FreeStyle™ 系统允许对悬浮的293细胞进行转染，在要求大量细胞时，不需要运送许多瓶的贴壁细胞。为了优化293细胞的转染和表达，FreeStyle™ 系统提供：

293fectin™ 转染试剂

提供了悬浮293细胞的最高转染效率。

GIBCO™ FreeStyle™ 293 表达培养基

特别设计使悬浮293细胞能够有效的转染和最佳生长的无血清培养基。

FreeStyle™ 293F 细胞

预先适应了FreeStyle™ 293表达培养基，具有优良操作性能的一个293细胞克隆。

优化的悬浮培养生长

进行蛋白生产时，细胞生长和细胞活性是产品产量的关键。FreeStyle™ 293表达培养基提供无血清培养基中有效的悬浮培养转染和优化的悬浮生长。它不仅没有血清，而且成分中明显的减少了竞争性蛋白组分。你将在表达实验中得到较清楚的蛋白样品并且获得可放大和能够重复的结果。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:33

有效转染

其它转染试剂的供应商推荐使用贴壁293细胞——难于规模放大的流程。特别试验的转染悬浮293细胞的293fectin™ 试剂可以提供高水平蛋白表达的悬浮流程（见图1）。293 fectin™ 转染试剂提供你需要的规模放大转染的效率。

图1 使用FreeStyle™ 293表达系统表达蛋白。FreeStyle™ 293细胞生长在FreeStyle™ 293表达培养基中，用293fection™转染试剂进行瞬时转染。转染后47小时后，收获1×10细胞，检测总蛋白和b-半乳糖苷酶活性。转染的细胞和未转染的细胞有相似的总蛋白水平，但是每毫升转染细胞培养物表达124mg b-半乳糖苷酶。

你需要的结果

我们的FreeStyle™ 293表达系统的每一个组分被设计和检验，以提供你需要的293细胞的悬浮转染的结果。FreeStyle™ 293F细胞是经过选择的容易操作和具有高表达能力的293克隆。它适应了GIBCO™ FreeStyle™ 293 表达培养基，可以节省你的时间和努力。各种组分一起提供有效，可放大，可重复的表达。

产品货号规格价格
FreeStyle™ 293 Expression Kit K9000-01 1 L FreeStyle™ 293 Expression Medium
1 vial of FreeStyle™ 293F Cells
1 ml of 293fectin™ Transfection Reagent
100 ml of Opti-MEM® I
20 µg of pCMV-SPORT ß-gal 查询
GIBCO™ FreeStyle™ 293 12338-018 1 L 查询
Expression Medium 12338-026 6×1 L 查询
293 fectin™ Transfection Reagent 12347-019 1 ml 查询
FreeStyle™ 293F Cells R790-07 1×10 frozen cells 查询

无酚红培养基（新产品信息）

● 细胞标记实验的理想的无毒性培养基
● 允许不可能在经典培养基中进行的特殊的应用
● 可获得定制配方

使用GIBCO™ 无酚红培养基可以扩展细胞标记实验的范围，GIBCO™ 无酚红培养基按照与传统配方相同的精确的标准生产，允许你在经典培养基中不可能进行的特殊应用领域中工作。

酚红，用来作为pH指示剂，可能在一些细胞中呈现雌激素样作用，而且可能对于某些类型细胞具有毒性作用。在细胞实验中所有GIBCO™ 无酚红培养基是无毒性的，同时显示没有雌激素样作用活性。

购GIBCO™ 无酚红培养基比以前更加容易，所有的配方组织在下列列表中，按照培养基的类型进行分类，以提供快速，方便的订购。检查下列列表，发现你需要的配方。如果你的配方不在列表内，我们的定制配方服务部门非常高兴讨论你的要求。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:33

定货信息产品描述目录号规格价格
CD CHO Medium (1X), liquid 10743-029 1,000 ml 查询
10743-011 500 ml 查询
CD Hybridoma Medium (1X), liquid 11279-023 1,000 ml 查询
Cell Culture Freezing Medium-Dimethylsulfoxide (dmso), liquid 11101-011 50 ml 查询
Dulbecco's Modified Eagle Media (D-MEM)
D-MEM (1X), liquid
(low glucose, with 1.0 g/L D-glucose, and 110 mg/L sodium pyruvate, without L-glutamine)
11054-020 500 ml 查询
D-MEM (1X), liquid
(high glucose, with 4.5 g/L D-glucose, L-glutamine, and 25 mM HEPES buffer)
21063-029 500 ml 查询
D-MEM (1X), liquid
(high glucose, with 4.5 g/L D-glucose, without L-glutamine)
31053-028 500 ml 查询
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (D-MEM/F-12) 1:1 Mixture
D-MEM/F-12 (1X), liquid, 1:1 (contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer) 11039-047 10×500 ml 查询
11039-021 500 ml 查询
D-MEM/F-12 (1X), liquid, 1:1 (contins L-glutamine) 21041-025 500 ml 查询
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)
D-PBS (1X), liquid (contains calcium and magnesium) 14040-141 100 ml 查询
14040-133 500 ml 查询
14040-182 10×500 ml 查询
14040-117 1,000 ml 查询
14040-216 6×1000 ml 查询
D-PBS (1X), liquid
(contains 1, 000 mg/L D-glucose and 36 mg/L sodium pyruvate, calcium, and magnesium)
14287-080 500 ml 查询
14287-072 1,000 ml 查询
D-PBS (1X), liquid (contains no calcium or magnesium) 14190-144 500 ml 查询
14190-250 10×500 ml 查询
14190-136 1,000 ml 查询
14190-235 6×1000 ml 查询
14190-078 10 L 查询
D-PBS (10X), liquid (contains calcium and magnesium) 14080-055 500 ml 查询
D-PBS (10X), liquid (contains no calcium or magnesium) 14200-075 500 ml 查询
D-PBS, powder (contains magnesium) 21300-025 10×1 L 查询
21300-058 1×10 L 查询
D-PBS, powder (contains no calcium or magnesium)

Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid (contains no calcium or magnesium)

21600-010 10×1 L 查询
21600-069 1×10 L 查询
21600-044 1×50 L 查询
14155-063
500 ml 查询
Hanks's Balanced Salt Solutions (HBSS)
HBSS (1X), liquid (contains calcium and magnesium) 14025-092 500 ml 查询
14025-076 1,000 ml 查询
HBSS (1X), liquid (contains no calcium chloride, magnesium chloride, or magnesium sulfate) 14175-095 500 ml 查询
14175-079 1,000 ml 查询
14175-103 10×500 ml 查询
HBSS (10X), liquid (xontains calcium and magnesium, but no sodium bicarbonate) 14065-056 500 ml 查询
HBSS (10X), liquid (contains no calcium chloride, magnesium chloride, magnesium chloride, magnesium sulfate, or sodium bicarbonate) 14185-052 500 ml 查询
HepatoZYME-SFM
Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) (1X), liquid (contains L-glutamine)
17705-021 500 ml 查询
21056-023 500 ml 查询
Improved MEM Zn++ Option M (Richter's Modification), liquid 10373-017 500 ml 查询
KaryoMAX® COLCEMIDTM Solution, Iiquid (10 mg/ml), In PBS 15212-012 10 ml 查询
Leibovitz's L-15 Medium (1X), liquid (contains L-glutamine) 21083-027 500 ml 查询
Medium 199 (1X), liquid (contains Earle's salts,L-glutamine, and sodium bicarbonate) 11043-023 500 ml 查询
Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Alpha Medium (1X), liquid (contains L-glutamine, ribonucleosides, and deoxyribonucleosides) 41061-029 500 ml 查询

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:34

MEM (1X), liquid (contains Earle's salts, but no L-glutamine) 51200-038 500 ml 查询
Modified Eagle Medium (MEM) (2X), liquid 11935-046 500 ml 查询
Opti-MEM® I Reduced-Serum (1x), liquid 11058-021 500 ml 查询
Phosphate-Buffered Salines (PBS)
PBS pH 7.2 (1X), liquid 20012-027 500 ml 查询
20012-050 10×500 ml 查询
20012-043 1,000 ml 查询
PBS pH 7.2 (10X), liquid 70013-032 500 ml 查询
PBS pH 7.4 (10X), liquid 70011-044 500 ml 查询
RPMI Medium 1640 (1X), liquid (contains L-glutamine) 11835-055 10×500 ml 查询
11835-030 500 ml 查询
Trypsin-EDTA (0.5% Trypsin, 5.3 mM EDA 4·Na) (10X), liquid 15400-054 100 ml 查询
Trypsin 2.5% (10X), liquid 15090-046 100 ml 查询
Versene 1:5, 000 (1X), liquid 15040-066 100 ml 查询

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:34

重组蛋白酶 (rProtease)

● 一种非动物来源的胰蛋白酶替代物
● 降低风险
● 无血清研究和生物生产中理想的细胞分离试剂
● 很容易获得各种获得任何规模的供给
● 简化下游纯化

GIBCO™ rProtease 是Invitrogen 不断增加的无血清培养基和非动物来源试剂行列中的新成员，它们用于药物发现研究和生物生产。这些创新的细胞培养工具最小化了来自动物病原体的潜在风险，并且消除了许多与动物来源物质相关的问题。

微生物生产的胰蛋白酶替代物

牛或猪来源的胰蛋白酶在细胞培养研究和生物生产中广泛的使用，用来从表面分离贴壁细胞。研究者和生产者希望确保哺乳动物细胞培养和生物生产过程没用动物来源物质，现在他们可以用微生物生产的GIBCO™ rProtease代替胰蛋白酶。已经证明这种类似胰蛋白酶（trypsin-like）的酶对许多种不同的细胞系有效（图1）。

细胞系培养基细胞释放要求的平均时间平均活性
VERO VP-SFM 100％ 5 分钟
VERO E-MEM+5%FBS 100％ 8 分钟
VERO OptiPro™ 98％ 7 分钟
PK-15 E-MEM+10%FBS 98％ 27 分钟
PK-15 OptiPro™ 99％ 11 分钟
MDCK OptiPro™ 98％ 28 分钟
MDBK D-DMEM+5%FBS 100％ 15 分钟
A549 D-DMEM+10%FBS 98％ 9 分钟
293F D-DMEM+5%FBS 97％ 2 分钟

GIBCO™ rProtease是一种微生物生产的动物胰蛋白酶的替代物。它是在一个受控制的、完全没用动物和人类成分的发酵过程中生产。这个过程生产出极其纯的试剂（图2）。

图2 HPLC 层析A 图示标准胰蛋白酶的典型结果。注意表明有杂质的多个峰。HPLC 层析B 清楚地显示rProtease的纯度。

很容易得到任何规模的GIBCO™ rProtease源材料的供给，不象其它非动物胰蛋白酶替代物的源材料，例如植物来源酶，依赖于种植周期，并受到转基因作物的环境法规的影响。

GIBCO™ rProtease保持细胞的活性、产量和形态（图3-5）。无论应用在无血清或有血清系统，rProtease都显示了与胰蛋白酶相同的性能和稳定性，而且在许多情况下，它更加容易使用。由于可用新鲜的培养基灭活，因而不需要胰蛋白酶抑制剂。此外，rProtease中没用酚红，这种pH指示剂可能会呈现类雌激素（estrogen-like）特性，因而可能对某些类型细胞产生毒性。

图3 VERO(非洲绿猴肾细胞)以3.5×10细胞/25cm²在补充4mM L-谷氨酰胺的OptiPro™培养基中铺板。D-PBS清洗细胞后，每个T-25培养瓶中加入1ml rProtease或猪胰蛋白酶。在细胞从表面脱离时，1000rpm离心5分钟。进行细胞总数和存活率记数。发现在所有的情况下，细胞存活率大于大于97％。细胞接种进新的培养瓶，并且重复分析6次连续性传代。

图4胰蛋白酶收获。MDCK细胞生长在GIBICO™ OptiPro™ SFM中，收获但是没有离心。细胞再次铺板，24小时后观察形态。用动物胰蛋白酶收获的细胞没有贴壁或延伸。
图5 rProtease收获。MDCK细胞生长在GIBICO™ OptiPro™ SFM中，收获但是没有离心。细胞再次铺板，24小时后观察形态。用rProtease收获的细胞贴壁或延伸良好。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:35

订货信息 Description Formula No. Size Price
rProtease 12563-011 100 ml 查询
Non-animal, recombinant trypsin substitute used lfor the dissociation of attachment-dependent cell lines. 12563-029 500 ml 查询

高级D-MEM和MEM

● 减少FBS的添加50-90％
● 节省时间和花费
● 延长血清批次的寿命
● 减少不同批次导致的差异
● 适合种类广泛的细胞系

GIBICO™高级D-MEM和MEM是在标准的基本配方基础上富集了血清中的正常组分。新培养基使这些组分参与细胞培养，减少50-90％FBS的添加，而不改变细胞生长、促进、形态或功能。高级配方适合多种普通细胞系的生长和维持包括MDBK、HEp-2、A549、MDCK、WI-38、VERO及其它细胞系。

每一种培养基都是在公开的标准基本配方中进一步添加NEAA和丙酮酸钠。添加下列成分可以减少血清：乙醇胺、谷胱甘肽（还原型）、抗坏血酸磷酸、胰岛素、人（holo）转铁蛋白、AlbuMAX® (一种富含脂的牛血清白蛋白)和微量元素盐亚硒酸钠、matavanadate ammonium、硫酸铜和氯化钨（maganous chloride）。血清使用浓度的降低将会随细胞系和使用的基本培养基的不同而有所变化。尽管推荐的血清浓度是1-5％，但是对于每一个细胞系，血清浓度必须要调整，以获得最佳的结果。对于大部分的应用，减少至少50％血清添加物不需要适应步骤。进行转换时，只需要简单的离心细胞，除去上清液，在减少血清的培养基中再次悬浮细胞。通过最小化的适应实现减少血清的添加。

提供1X液体形式的高级D-MEM和MEM，只需要添加L-谷氨酰胺或GlutaMAX™-I添加物。不要求细胞系适应这些培养基。

图1和2 添加4mM L-谷氨酰胺和1％FBS的高级D-MEM与添加4mM L-谷氨酰胺和10％FBS的Dulbecco's Modified Eagle's Medium (D-MEM)比较。高级D-MEM不进行预适应，A549(人肺肿瘤)细胞以2.5×10细胞/25cm²的密度铺板。培养瓶在37℃、5％CO2和95％空气中孵育一个4天的传代周期。在两种条件下，细胞的生长和形态是相似的。

Advanced D-MEM Applications Cell Types Recommehded Seed Density(Viable cells/25cm2) % FBS in Advanced D-MEM
A549 2.5×10 1-2
COS-7 2.0×10 1-2
MDBK 1.0×10 1-2
MRC-5 5.0×10 2
VERO 1.0×10 1-2

图3 添加4mM L-谷氨酰胺和10％FBS的Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (D-MEM)与添加1或2％FBS的高级D-MEM比较（细胞系依赖）。各种细胞系铺板两份，接种密度的变化范围是1.0-5.0×10细胞/25cm2培养瓶（接种密度细胞系依赖）。培养瓶孵育在37℃、5％CO2和95％空气，经过至少传3代，传代周期是3-天：4天，再孵育4天。数据表示连续培养第4天传代培养物的平均值。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:35

出色的研究以出色的细胞培养开始

良好的细胞培养始于GIBICO™的产品和服务。

作为世界最大的细胞培养产品生产商，GIBICO™培养基、血清、试剂和技术支持已经制定全球标准40年了。全世界的科学家信任我们的质量，依靠我们的服务和欢迎我们的创新，现在通过整合Invitrogen的分子生物学工具甚至更加强大。

留心Invitrogen的方法，它们将会节省您的时间和花费，满足您变化的需求和改善您的实验结果。

Advanced MEM Applications Cell Types Recommehded Seed Density(Viable cells/25cm²) % FBS in Advanced MEM
HEp-2 3.0×10 2
MDCK 1.0×10 2
PK-15 2.0×10 1-2
VERO 1.0×10 1-2
WI-38 4.0×10 2

图4 添加4mM L-谷氨酰胺和10％FBS的Minimum Essential Medium (MEM)与添加1或2％FBS的高级MEM比较（细胞系依赖）。培养瓶孵育在37℃、5％CO2和95％空气，经过至少传3代，传代周期是3-天：4天，再孵育4天。数据表示连续培养第4天传代培养物的平均值。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:36

无血清培养基及应用
BIOMANUFACTURING BULLETIN
适应无血清细胞培养
论文：无蛋白培养基中的杂交瘤细胞的生长和抗体产生
论文：用限定化学成分培养基培养CHO细胞生产重组蛋白
GlutaMAX™——最小化有毒性氨的产生
新型高级颗粒化技术培养基础（Advanced Granulation Technology™）
哺乳动物细胞和昆虫细胞
新型的FreeStyle™ 293表达系统
无酚红培养基
重组蛋白酶（rProtease）
高级D-MEM和高级MEM
第三章无血清和无蛋白培养基

一个成功的企业，必定具备高瞻远瞩的战略眼光。在血清产品受到广泛欢迎，稳居市场占有率第一的情况下，GIBCO 即开始研制无血清培养基产品，这是基于对人类和动物保健品安全性的长远考虑。由于占据了市场先机，GIBCO 理所当然地成为无血清培养基生产的领先者。针对各种细胞如CHO细胞、淋巴细胞、杂交瘤细胞、昆虫细胞等的无血清培养基相继问世，并且发展了完全不含蛋白质成分的无蛋白培养基。而被称作Chemical Defined(化学限定的)的无动物来源培养基的问世，则标志着细胞培养基发展的至高境界。这种明确每一种化学成分、无任何动物来源组分的培养基，消除了对培养基生物安全性的任何担忧。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:36

无血清培养基及应用

无血清培养基是设计用来在无血清条件下生长特殊类型的细胞或进行专门应用的培养基。无血清培养基的使用体现了一种重要的工具，它允许细胞培养在一套限定的条件下进行，尽可能免于干扰参数的影响。

使用无血清培养基的优点 ● 增加确定性
● 性能更加一致
● 容易进行纯化和下游加工
● 细胞功能的精确评估
● 增强生长和/或产量
● 生理反应性的较好对照
● 增强细胞内中介物的检测

某些应用可能需要添加生长因子和/或细胞因子。

小结：

无血清培养基——培养基中没有添加血清，但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。

无蛋白培养基——培养基中没有添加蛋白，但是仍然可能包含一些动物或植物来源的成分（例如，提供低分子量肽的各种水解物）

化学限定培养基——培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分。所有的成分均有已知的化学结构。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:37

血液和骨髓细胞
血液和骨髓细胞无血清培养基产品目录号价格应用
淋巴细胞 AIM V® 12055091 查询补充IL-2的细胞毒淋巴细胞的间接体内 (Ex vivo) 激活。
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL细胞）或细胞毒T细胞的生长。
HIV病毒的生产。
12055083 查询
31035025 查询
0870112DK 查询
0870112BK 查询
巨噬细胞，单核细胞 Macrophage-SFM 12065074 查询生长和维持（可能有必要加入GM-CSF）。
证明巨噬细胞的噬菌作用。
使用γ干扰素或脂多糖激活能杀死肿瘤的细胞。
来源于骨髓、外周血和新生儿脐带学的人造血祖细胞（CD34+） Stempro® -34　SFM（补充Stempro® -营养添加物） 10639011 查询生长和维持人造血祖细胞（加入必须因子）。
研究生长因子在细胞分化时协同/独立作用。

杂交瘤细胞
杂交瘤细胞无血清培养基产品目录号价格应用
小鼠，人，大鼠杂交瘤 CD Hybridomas Medium
CD Hybridomas AGT™ 11279023 查询
化学成分限定，无蛋白培养基，用于细胞生长和单克隆抗体生产。

12372025 查询
12372017 查询
小鼠，人，大鼠杂交瘤 Hybridomas SFM 12045084 查询低蛋白(20µg/ml)培养基，用于细胞生长和单克隆抗体生产。
12045076 查询
小鼠，人，大鼠杂交瘤 PFHM-II 12040077 查询无蛋白培养基，用于细胞生长和单克隆抗体生产。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:37

昆虫细胞
昆虫细胞无血清培养基产品目录号价格应用
Drosophila
melanogaster 细胞
(D. Me 1-2, Schneider S2 细胞)
Drosophila-SFM 10797017 查询无蛋白生长和维持培养基，用于贴壁或悬浮培养。
10797025 查询
BTI-TN-5B1-4 昆虫细胞 Express Five® SFM 10486025 查询无蛋白培养基，用于进行贴壁或悬浮培养的，使用杆状病毒表达载体系统（BEVS）细胞的生长和维持。大规模生产BEVS 表达重组蛋白。
Sf9,Sf21,TN368 细胞 Sf-900 SFM 10902096 查询无蛋白培养基，用于进行贴壁或悬浮培养的，使用BEVS细胞的生长和维持。
大规模生产BEVS 表达重组蛋白。

10902088 查询
10902104 查询
10902070 查询

人胚胎肾（293）细胞
293 细胞无血清培养基产品目录号价格应用
293 细胞（包括293-F,293-H） CD 293 Medium
CD 293 AGT™
11913019 查询化学限定的无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产或腺病毒生产。没有动物来源成分。
12529020 查询
12529012 查询
293细胞，HeLa S3 细胞 293 SFM Ⅱ 11686029 查询低蛋白（＜10µg/ml）培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产或腺病毒的生产。没有人或动物来源成分的。
悬浮培养状态的293-F细胞 Freestyle™ 293 Expression Medium 12338018 查询无血清和无蛋白（＜10µg/ml）培养基，用于悬浮培养的293-F细胞的生长和转染。
12338026 查询

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:38

中华仓鼠卵巢（CHO）细胞
CHO细胞无血清培养基产品目录号价格应用
CHO细胞（包括CHO-S细胞） CD CHO Medium
CD CHO AGT™
10743011 查询化学限定的无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。没有动物来源成分。
10743029 查询
12490017 查询
12490025 查询
CHO细胞（包括CHO-S细胞） CHO-SFM Ⅱ 12052114 查询低蛋白（＜75µg/ml）培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。
12052098 查询
31033020 查询
22052047 查询
CHO细胞 CHO Ⅲ PFM 无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。可获得定制配方培养基。
CHO细胞 CHO Ⅲ A PFM 无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产的。可获得定制配方培养基。
CHO细胞 CHO-A-SFM 低蛋白（＜250µg/ml）培养基，用于贴壁培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。可获得定制配方培养基。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:38

神经细胞
神经细胞无血清培养基产品目录号价格应用
胎儿神经细胞 Neurobasal™ Medium
或无酚红 Neurobasal™ Medium
21103049 查询没有兴奋性氨基酸的基本培养基协同补充成分一起使用，构成完全的无血清培养基，以维持神经细胞的长期生长。
12348017 查询
成人和新生儿神经细胞（1周） Neurobasal™ A Medium
或无酚红Neurobasal™ A Medium
10888022 查询
12349015 查询
原代大鼠胚胎海马神经元;来自stratium, substantia nigra, septum和cortex原代大鼠神经细胞 Neurobasal™ Medium with:
B-27 添加物
17504044 查询生长和维持。
最小化神经胶质细胞的增殖。

B-27 AO 是没有抗氧化剂的B-27 B-27 AO添加物 10889038 查询 B-27 AO用来研究自由基损害和凋亡。
原代神经元的维持(低蛋白，＜125mg/ml）
神经肿瘤细胞系的生长和维持。

原代大鼠胚胎海马神经元，神经来源的肿瘤细胞系（PC12, B104, N1E-115和NS20） N2 添加物 17502048 查询
原代神经胶质细胞和神经胶质细胞，星形胶质细胞，小神经胶质细胞，少突神经胶质细胞来源的肿瘤细胞系（U-251, MGsp, C6BD, RN-22 G5 添加物 17503012 查询生长和维持

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:38

哺乳动物细胞
哺乳动物细胞无血清培养基产品目录号价格应用
原代和第二代人脐静脉，微血管和动脉的内皮细胞原代人，猴和大鼠肝脏细胞 Human
Endothelial-SFM
11111044 查询细胞的生长和维持，以进行细胞与细胞之间的相互作用，损害分析，动脉硬化，信号转导，细胞因子的产生和细胞基质相互作用的研究。
原代人，猴和大鼠肝脏细胞 Heoatozyme-SFM 17705021 查询维持肝脏细胞（细胞色素P450保持＞9天）。
人表皮角化细胞和子宫颈表皮细胞（不支持成纤维细胞和黑色素细胞） Keratinocyte-SFM (with EGF, BPE) 17005042 查询细胞生长和维持，以进行皮肤替代物，基因治疗和体外毒理学的研究。
37010022 查询
人表皮角化细胞和子宫颈表皮细胞（不支持成纤维细胞和黑色素细胞） Defined
Keratinocyte-SFM (without BPE)
10744019 查询进行子宫颈表皮细胞培养的低蛋白（＜25µg/ml）培养基。用于进行有关人乳头瘤病毒的研究。
胚胎干细胞 Keratinocyte-SFM (without BPE)
KnockOut™ D-MEM with KnockOut™ serum replacement
10829018 查询生长和维持用于各种用途的生产转基因动物的未分化的ES细胞。
10828028 查询
COS-7L, VERO, HEP-2和BHJ-21（悬浮培养） VP-SFM, VP-SFM AGT™ 11681020 查询低蛋白（5µg/ml）培养基，用于细胞生长和病毒的生产。
12559027 查询
12559019 查询
MDCK, MDBK, BHK-21 OptiPro™ SFM 12309019 查询低蛋白培养基，用于肾上皮细胞和表达病毒相关细胞的培养。

BIOMANUFACTURING BULLETIN

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:39

单克隆抗体生产的关键技术

上游的决定通常会影响下游的生产——可能更好或更坏。当您选择GIBCO产品时，您就获得了我们的资源以支持您未来的工业应用。当您的生产规模放大时，我们将改动我们的技术以适应您的需求。

在细胞培养方面的革新

作为全球最大的细胞培养基生产商，GIBCO研制并发展了各种培养基，并已优化使细胞适应时间减至最低。

CHO培养基和细胞系

中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是最常用于重组蛋白的表达和单克隆抗体生产的细胞系。可在悬浮培养条件下生长到高密度、可对表达和分泌的蛋白进行适当的转录后修饰（包括糖基化）等特性，使得CHO细胞成为许多抗体和用于人类治疗目的的蛋白质生产的首选（图1）。

重组的CHO细胞可成功地以贴壁或悬浮方式大规模生长。对无血清、无蛋白、限定化学成分的培养条件的使用趋势使得贴壁细胞的使用更加困难而悬浮细胞的使用逐步增长。

GIBCO发展了多种用于大规模悬浮培养的无血清培养基：

CD CHO是限定化学成分的无蛋白培养基，不含谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸腺嘧啶。它不含有任何直接的动物来源成分（图2和图3）。

CHO-S-SFM是一种低蛋白（<100ug/ml）培养基。这是GIBCO的第二代CHO细胞无血清培养基，已被中国客户广泛接受。目前国内主要的EPO生产厂家均使用GIBCO的CHO无血清培养基作为生产原料。我们对此深感自豪。

CHO-III-A PFM无蛋白培养基是优化用于中国仓鼠卵巢细胞贴壁培养的无蛋白培养基，它含有植物水解物，但不含任何直接动物来源的成分。这已是GIBCO生产的第三代CHO细胞培养基，表明GIBCO一直在努力改进产品以适应客户的不同需求，并保持了在无血清培养方面的技术领先地位。

其配方中去除了表面活性剂，并增大了钙离子和镁离子浓度以促进细胞贴壁。CHO-III-A不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶，可用于二氢叶酸还原酶扩增体系。对其他用途，须在使用前添加10ml/lHT。注意：一些二氢叶酸还原酶缺失的CHO细胞须额外添加50mg/l的甘氨酸以促进细胞贴附和扩增。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:39

CD杂交瘤培养基

近年来，须添加血清的杂交瘤培养基已逐步被各种无血清配方所取代。但这些无血清配方中仍然含有蛋白质，这在某些用途上仍然是不可接受的。

对更精确的培养基成分的要求和在保证更好或相同培养效果的前提下去除动物来源成分的需要，促使GIBCO发展了限定化学成分的杂交瘤培养基CD HYBRIDOMA MEDIUM。

● 这是第一种优化用于杂交瘤生长和单克隆抗体生产的无蛋白、限定化学成分的培养基
● 不含任何人类和动物来源的成分
● 不含谷氨酰胺，增加稳定性
● 简化下游纯化工作

由于不含动物来源的成分，减低了含有对人类健康不利的风险因子的可能性。适合于重组的骨髓瘤细胞系和传统的杂交瘤细胞的培养。其培养效果超过须添加血清的普通培养基和无血清培养基。设计用于批量培养系统，也可简单地修饰后用于其他系统。生长在传统的须添加血清的培养基中的细胞可容易地适应这种无蛋白培养基（图4）。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:40

适应无血清细胞培养

有两种方法使细胞适应无血清培养基（SFM）: 1. 直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。
2. 连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。

为了使细胞适应无血清培养，关键的是培养细胞： 1. 处于对数生长中期
2. >90% 活细胞率
3. 适应时以较高的起始细胞接种

下面是适应的一般步骤。起始细胞接种、细胞产量和培养周期作为连续优化的起始点。

直接适应

一些类型的细胞可以直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该是 2.5×10到3.5×10 细胞/ml。当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×10到4×10细胞/ml时，细胞完全适应了无血清培养基。每隔3到5天，当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。

连续适应

1. 以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25％SFM 混合培养基中，传代培养。
2. 当细胞密度>5×10 细胞/ml时，以2×10到3×10细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
3. 以2×10到3×10细胞/ml细胞密度，25％有血清培养基和75% SFM中传代培养。
4. 当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml（接种后4到6天），在100％SFM培养基中传代培养。
5. 每隔3到5天，当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
注释：建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:40

细胞培养适应替代血清

许多细胞利用连续适应的方法能够很好的适应，用包含FBS的当前的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1（v∶v）的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培养基。在每一次适应改变血清比例时，传代细胞2到3次。

培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。

论文：无蛋白培养基中的杂交瘤细胞的生长和抗体产生

Stephen Gorfien, etc. 细胞培养研究和发展部，GIBCO

在最近几年中，传统的需要添加血清的杂交瘤培养基已被不同的无血清配方所取代。但一些无血清培养基配方中仍包含蛋白质（如胰岛素、转铁蛋白、白蛋白等）或者蛋白质水解物。从无动物来源成分的培养基的发展趋势来看，这样的无血清培养基在某些具体应用中也难以接受。我们设计限定化学成分（chemical defined）杂交瘤细胞培养基的目的，就是为了发展出一种无蛋白质的化学成分配方，完全没有动物来源成分，并适用于杂交瘤细胞的生长和单克隆抗体的生产。在此报告中，我们在稳定和搅动的悬浮培养中检验了这种培养基，并成功地放大到15升的生物反应器中。

方法：

杂交瘤AE-1(SP2/0-Derived), PIF6(FOX-NY-Derived), 和TY6-25.3培养在CD杂交瘤培养基(Cat.No.11279), 杂交瘤-SFM, 无蛋白杂交瘤培养基(PFHM ll), 或IMDM+10%FBS。静止悬浮培养在75-cm² 162-cm²培养瓶（分别为15ml或35ml到40ml培养体积）中进行。摇动小规模的培养在125-ml或250-ml（分别为35m和75ml培养体积）一次性塑料摇瓶中，以125～135rpm转速在轨道震动平台上进行。总的细胞数用电子颗粒计数器计数，细胞活力用台盼兰染色评估。

使生长在IMDM+10% FBS或杂交瘤-SFM培养基细胞适应在其它的培养基中生长，经过三代后，评估批次培养的生长状况及抗体生产能力。使用前，CD杂交瘤培养基补充8mM L-谷氨酰胺。所有的小规模实验的数据代表了从指定细胞系获得的多次CD杂交瘤培养基的评估结果。

规模放大实验用Bellco 15-L搅拌罐生物反应器系统。已经适应的CD杂交瘤培养基的细胞以1×10活细胞/ml的密度接种，生物反应器的起始对照参数为：37℃，50%空气饱和度的溶解氧，pH 7.2, 和120rpm。用一个75ml摇瓶进行与生物反应器相同接种的对照培养，以排除细胞或培养基作为生物反应器培养时观察到不良性能的原因。

生长曲线实验使用以前适应的细胞，这种细胞可以生长到6天而无需更换培养液。每天采集样品以确定总的活细胞的密度和抗体的滴度。

通过修改的Wakefield etal.描述的ELISA 分析（1）确定抗体滴度，GIBICO BRL TMB-ELISA(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine Base)被用来观测过氧化物酶偶联的抗体。通过A450读数定量MAb。

在一些实验中，用YSI 2700 Select Analyzer测量用过的培养基样品中的葡萄糖、乳酸盐和L-谷氨酰胺的含量。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:40

结果：

所有试验的杂交瘤细胞成功地适应了从添加血清和无血清的培养基到直接在CD杂交瘤培养基中生长。与添加血清的IMDM培养基相比，培养在CD杂交瘤培养基中的杂交瘤AE-1具有相似的活性细胞密度峰值，但是具有较高的IgG 水平峰值（图1）。对于杂交瘤细胞P1F6，在CD杂交瘤培养基中的生长和MAb 的产量比在杂交瘤－SFM中效果好（图2）。

图1 杂交瘤细胞AE-1的生长状况和IgG的产量来自IMDM+10% FBS静止悬浮培养的细胞适应5代，生长在162-cm²的培养瓶中，5天内不更换培养基。Panel A 生长状况 Panel B 单克隆抗体产量。培养基：CD杂交瘤培养基（■）IMDM+10% FBS（□）杂交瘤－SFM()和PFHM Ⅱ(）。

图2 杂交瘤细胞P1F6的生长状况和IgG的产量来自杂交瘤-SFM搅动悬浮培养的细胞适应3代，生长在125ml的摇瓶中（35ml体积），5天内不更换培养基。培养基：CD杂交瘤培养基（■）和杂交瘤－SFM()。

杂交瘤细胞也被成功地培养在CD 杂交瘤培养基生物反应器中(图3)。此外，生物反应器控制溶解氧和PH值的能力导致比摇瓶对照的更好的生长和更高的产量。图3C显示葡萄糖和谷氨酰胺在生物反应器培养时的利用，表明接种4天后两种成分都变得有限。尽管有必要进一步营养消耗的研究，但是葡萄糖和谷氨酰胺的利用曲线表明，批次添加策略可能进一步促进生长和提高抗体产量。

图3 TP6-25.3杂交瘤细胞在生物反应器中培养的生长状况和IgG的产量以前适应了CD杂交瘤培养基的细胞以1×10活细胞/ml接种到生物反应器（●）或者对照摇瓶（）中。检测5天细胞生长（Panel A）和单克隆抗体产量（Panel B）。Panel C 生物反应器培养中检测活细胞的百分比（●）、谷氨酰胺存留量（） )和葡萄糖存留量（■）。

讨论：

细胞易于适应CD 杂交瘤细胞培养基（传代5次以内）并且在多种培养基体系中相对于无血清和无蛋白培养基可得到相似或更好的培养效果。在15L的搅拌罐反应器中成功放大表明这种培养基具有大规模生物生产系统的应用潜力。

已有几种类型的培养基配方可用于杂交瘤细胞培养，包括需添加血清的IMDM，无血清的杂交瘤培养基（包含2种蛋白和一些动物来源的成分），无蛋白质（PFHM II）的培养基（但含有动物来源的成分）和限定化学成分的CD杂交瘤培养基（不含蛋白质或动物来源的成分）。提高细胞培养效果和单克隆抗体的产量，需要更精密的配方以适应不同的要求。限定化学成分的无蛋白培养基简化了单克隆抗体的回收和纯化，同时由于没有动物来源的成分而避免了一些涉及到法规的麻烦。

参考文献

1. Wakefield, E. F. , Shelton, M, J. , and Hosking, c. s. (1982)
Clinica Chimica Acta 123, 303.
2. Mullins, T. D. , Dzimian, J. L. , Fike, R. M. and Weiss, S. A.
(1991) Focus 13, 91.
3. Fike, R. M. Pfohl, J. , Jayme, D. , and Weiss, S. A. (1990)
Focus 12, 79.
4. Dhainaut, F. Bihoreau, J, L. Lirochon, J. , Vicentelli, R. , and
Migont, G. (1999) Cytotechnology 10, 33.
5. Csirke, B. , Godwin, G. , and Gorfien, S. (1999) Focus 21, 33.

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:41

论文：用限定化学成分的培养基培养的CHO细胞生产重组蛋白

STEPHEN F. GORFIEN,JOYCE L. DZIMIAN,MARY LYNN TILKINS,GLENN P. GODWIN AND RICHARD FIKE. Life Technologies, Inc. 3175 Staley Road., Grand Island, NY 14072. U.S.A

1. 摘要
　
中国仓鼠卵巢细胞（CHO）的无血清培养，作为一种获得高水平表达重组蛋白，同时简化产物的回收和下游步骤的方法越来越普遍使用。然而，无血清培养基仍然含有一种或多种动物来源的成分，包括白蛋白、胎球蛋白、各种荷尔蒙以及其它蛋白质。我们已经证实从CHO培养基配方中去除动物来源蛋白是可行的。血浆蛋白成分如白蛋白和胎球蛋白可以用植物来源的水解产物代替，尽管这种培养基（CHO III PFM）是无蛋白的，但是其化学成分还是没有限定。CD CHO培养基配方是限定化学成分的，不含动植物来源的蛋白质或水解产物。与其它培养基相比，CD CHO虽然相对其它培养基细胞峰密度和最高表达水平出现时间的滞后，但在该培养基中有更佳的峰密度和最高表达水平。我们通过加入丁酸钠成功提高了在最高细胞密度时的表达水平，重组细胞系在生长和重组产物的表达方面表现出一种反比关系，限制细胞密度的方法可能会有效地增强表达。

2. 前言
　
对于大规模培养CHO细胞和重组产物表达，因为与使用血清相关的费用、效果和调控的因素越来越成为问题，所以减少或者去除培养基中的血清成分的方法变得越来越常见。因为无血清培养基可能含有各种未限定成分，包括蛋白质、多肽、蛋白水解物，这些配方是血清培养基的一种改进，但可能并没有去除与血清相关的因素。比无血清培养基进一步改进的是无蛋白培养基。这种无蛋白培养基配方中，传统的成分例如白蛋白、胰岛素和铁传递蛋白被其它的成分替代。然而除非特别标明配方是无蛋白、限定化学成分，培养基中可能包含动植物来源的蛋白水解物，其中可能有促进生长和表达的小分子多肽。我们实验室研制的CHO III PFM培养基是普通的未限定化学成分的无蛋白培养基的一个范例，它含有植物中提取的水解物。我们证明细胞在适应这种培养基之后，与在另外一种无血清培养基CHO-S-SFM II相比，生长相同，而表达水平提高。然而CHO III PFM 去掉植物水解物后，它就不再支持重复传代培养中rCHO细胞的生长。因此一种全新的既无蛋白又是限定化学成分的培养基配方面世了。CD CHO培养基不含动植物来源的或者合成的蛋白质、多肽成分。对于想使用无蛋白培养基和/或限定培养体系的用户，我们调节细胞适应不同的培养基以及调节生长和表达方面的经验是具有指导意义的。

3.材料和方法：

3.1培养基，细胞和培养条件

所有使用的培养基配方都不包含核苷酸而且进行了悬浮培养优化。CHO-S-SFM是一种低蛋白（<100µg/mL）无血清培养基。CHO III PFM是一种基本上没有蛋白质的定制配方，不包含动物来源的蛋白。CD CHO培养基是一种限定化学成分的配方，不包含动植物来源的蛋白质、多肽或者水解产物。
　
CHO（DHFR缺陷型）细胞购自ATCC（CRL-9096，Rockville. MD），然后用以下两种质粒转染：含有氨甲喋呤（MTX）抗性基因的pSV2dhfr（37146）（购自ATCC）和表达ßgal的质粒pCMV ßgal （购自Pam Hawley-Nelson，Invitrogen）。转染使用LIPOFECTAMINE™试剂（Invitrogen公司），用1.2µM MTX 进行筛选，培养物维持在含0.3µM MTX的悬浮培养基中，通常每隔3-4天就以3×10活细胞/ml密度进行传代培养，在125ml体积的塑料摇瓶中培养（20-35ml培养体积），置于有轨摇床上，平转速度为125-135rpm，保持空气湿润，CO2密度为8%。对于rCHO细胞在无血清悬浮培养基CD-CHO中的情况我们进行了放大培养评估，采用5 L Celligen™ 生物反应器（New Brunswick Scientific，Edison，NJ），接种密度为1-3×10活细胞/毫升，最终工作体积是3.8 L。每天取样来测定总细胞和活细胞的数量，葡萄糖和氨基酸的利用情况，乳酸和氨气的累积以及重组产物。PH值、溶解氧和温度以及速度保持原有的设定，分别为：7.40，50%的空气饱和度和37.0℃以及90rpm。在每个实验中，在接种后第9天加入浓缩的10x葡萄糖和谷氨酸（终浓度分别为3.0g/L和1.0g/L）添加剂。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:42

3.2重组蛋白定量和表达增强

用一种改进的方法测量（Hall，等〔4〕和Miller〔5〕）细胞裂解物中 rß－半乳糖苷酶。简单的说，从每个样品中收集2.0ml细胞悬浮物，经过两次冻融过程后，100xg离心4分钟，收集上清测定rß－半乳糖苷酶含量。将100ul上清加入到1.0ml，pH值7.0的 Z buffer中(0.06M Na2PO4，0.04M NaH2PO4, 0.01M KCl, 0.01M MgSO4. 7H2O, 0.05M ß-Mercaptoethanal), 然后加入200ul的ONPG（o-nitrophenyl-ß-D-galactoside, 4.0mg/ml溶于dH2O），37℃温育120分钟。加入500ul的终止缓冲液（1M Na2CO3）终止反应，以相应的培养基作为空白对照，在波长为420nm处测定吸收值。

我们研究出一种加入丁酸钠的方法来增强rß－半乳糖苷酶的表达。培养物在接种后0或2天加丁酸钠至浓度为0.1mM或1.0mM温育，或者在接种第4天加入1.0mM丁酸钠分析重组蛋白表达和生长的效果。

4. 结果

rß-Gal CHO细胞很容易适应CD CHO培养基，而且一旦适应以后，比CHO-S-SFM II(图1)和CHO III PFM(数据未列出)能得到更高的总细胞密度。比较CD CHO培养基和CHO-S-SFM培养基中培养物的rß-Gal水平（图1所示），我们发现在CD CHO中细胞生长和rß-Gal的表达水平呈现反比，直到生长达到平台期的时候r b-Gal才能高水平表达。在不同培养时期加入不同浓度的丁酸钠来增强rß-Gal表达（图3所示）。当高浓度丁酸钠存在时（1.0mM），在接种当天加入生长和表达会受到抑制，而在第2天加入则会抑制生长而增强表达。当低浓度的丁酸钠存在的时候（0.1mM），在接种当天和第2天加入都会增强重组蛋白的表达水平。图4所示是将Celligen 生物反应器和摇瓶对照培养进行比较，发现两者生长动力学相似，而反应器中rß-Gal的表达水平更高。接种后第九天补充葡萄糖和谷氨酸，但是没有提高rß-Gal在第9天的表达水平峰

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:42

图1：对比CD-CHO培养基和CHO-S-SFM II中生长和rb－Gal表达。CD-CHO中总的细胞密度持续上升（从第三天到第八天，上方图），但在CHO-S-SFM II培养基密度保持不变；rb-Gal表达在两种培养条件下持续升高（上图），但在CD-CHO中表达的产物总量更多。

图2

HFR扩增的rCHO细胞系在生长和表达之间的反比关系。产生r b-Gal的CHO细胞系只有在生长曲线（上方图）到达平台期之后才高水平表达（上方图）。

图3：丁酸钠的浓度和加入时间对生长和表达的影响。rCHO细胞的生长（上方图）在一定浓度丁酸钠加入后受到抑制。rß-Gal的表达（下方图）水平提高，除了在当天加入1.0mM丁酸钠以外，其它情况都超过了第8天的对照水平。

图4.在5L Celligen生物反应器中的生长和rß-Gal表达。rCHO细胞的生长动力学在5L 的搅拌罐反应器（3.8L工作体积）和250ml（75ml的工作体积）的摇瓶中是相似的（上图）。在生物反应器中rß-Gal表达水平（下图）更高。补充葡萄糖和谷氨酸（如第9天箭头所示）加入太迟，不能在到达第九天的峰值后进一步提高产量。

5. 讨论

我们现在正在考虑替换工业用培养基中的动物来源的成份。已经证实CHO细胞有可能在完全限定化学成份、不含动植物来源蛋白质、多肽或水解产物的培养基中生长。与无血清培养基（CHO-S-SFM II）和无蛋白、未限定的培养基（CHO III PFM）相比，在CD CHO培养基的批量培养能获得高密度的细胞。在到达细胞密度的峰值后，CD CHO培养基中培养的DHFR扩增的rCHO细胞系出现高表达水平。已经证实丁酸钠是细胞生长的强抑制剂，还能促进蛋白质合成〔6〕。其他人也证实多克隆抗体〔7〕和重组蛋白质〔8、9〕的表达水平在加入丁酸钠之后提高。在我们的研究中，通过加入丁酸钠成功限制了细胞的生长并增强了rCHO细胞的rß-Gal表达水平。然而，浓度和加入时间对蛋白质表达的优化也非常重要。用5L的生物反应器能在CD CHO中大规模培养。我们利用限定化学成份的培养基培养CHO细胞的实验表明您能够有更好的选择，用以替换含血清培养基、无血清或无蛋白但没有限定化学成份的培养基配方。

参考文献

1. Jayme, D. M., Epstein, D. A., Conrad, D. R. (1988)Tetal bovine serum altertives, Nature 334:547-8.
2. Rosa, M. D. (1989) serum substitutes: is there a solution:Biopharm 2:16-17.
3. Lambert, K. J. , and Birch, J. R. (1985) Animal Cell Biotechnology, R. E. Spier and J. B. Griffiths, Eds. (Academic Press,London),pp.85-122.
4. Hll, C. V. , Jacob, P. E. , Ringlod, G. M. , Lee, F. (1983) Expression and regulation of Escherichia coli lacZ gene fusions in mammailian cells. J Mol Appl Gen 2(1):101-109
5. Miller, j. (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY.
6. Kruh, J. (1982) Eeffects of sodium butyrate, a new pharmacological agent, on cells in culture. Mol Cell Biochem 42:65-82.
7. Oh, S. K. , Vig, P. , Chua, F. , Teo, W. K. , Yap, M. G. S. (1993) Substantial overproduction of antibodies by applying osmotic pressure and sodium butyrate. Biotechnol Bioeng 42:601-610.
8. Dorner, A. J. , Wasley, L. C. , Kaufman, R. J. (1989) Increased synthesis of sereted proteins induces expression of glucose-regulated proteins in butyrate-treated Chinese hamster ovary
cells. J Biol Chem 264(34):20602-20607
9. Palermo, D. P. , DeGraaf, M. E. , Marotti, K. R. , Rehbery, e., Post, L. E. (1991) Production of analytical quantities of recombinant proteins in Chinese hamster ovary cells using sodium butyrate to elevate gene expression. J Biotechnol 19:35-48.

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:43

GlutaMAX™——最小化有毒性氨的产生(新技术)

通过使用GlutaMAX™培养基，防止L-谷氨酰胺降解、增加稳定性、最小化有毒性氨的产生。

L-谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分，不幸的是它不稳定，在中性的水溶液中会自发降解。因而，需要频繁地补加L-谷氨酰胺，——伴随破坏无菌状态的可能性——并产生毒性水平的氨。

使用GIBCO™GlutaMAX™培养基，可以避免由于L-谷氨酰胺降解带来的问题。

二肽与众不同

图1 GlutaMAX™二肽在121℃、20分钟高压灭菌后的稳定性

图2 D-MEM 添加GlutaMAX™ -I或L-谷氨酰胺，分装到小瓶中，贮存在37℃。每天取出样品并冻存在-20℃，通过HPLC检测氨的水平。

图3 D-MEM 添加GlutaMAX™ -I或L-谷氨酰胺，分装到小瓶中，贮存在37℃。每天取出样品并冻存在-20℃，通过HPLC检测GlutaMAX™ -I和L-谷氨酰胺的水平。

使用GlutaMAX™培养基，L-谷氨酰胺在贮存和孵育时不会降解。氨的产生最小化。L-谷氨酰胺的释放可以控制。通过鼠杂交瘤细胞生产的单克隆抗体量增加。此外，在使用的时候不需要添加L-谷氨酰胺。

作用原理

GlutaMAX™二肽在细胞内被氨基肽酶分解，从二肽中释放L-谷氨酰胺和L-丙氨酸(GlutaMAX™ -I)。在大部分细胞培养系统，二肽谷氨酰胺可以象L-谷氨酰胺同样有效的被利用。GlutaMAX™ -I二肽是L-谷氨酰胺的直接替代物。无需适应，它既适合于贴壁细胞培养，也适合于悬浮细胞的培养，包括下列情况：

● 需要长期的孵育而不补充营养的培养系统（例如克隆分析）
● 要求最优标准化培养基进行长期的研究（例如毒性检测）
● 对氨敏感的培养系统（例如高密度生物反应器）
● 代谢研究

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:43

多种形式可供选择

许多广泛使用培养基的GlutaMAX™二肽替代L-谷氨酰胺形式可以得到。此外，GlutaMAX™二肽可以作为单独的补充物而获得，提供200mM溶液直接替代你当前使用的培养基形式。

1. Brand, K., Feki, W., Hintzentern, J., von Langer, K. Luppa, P., and Schroener, C. (1989) Metabolism 38, 29.

产品货号规格价格
GlutaMAX™ Media
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X),liquid (low glucose, contains sodium pyruvate) 10567-014 500 ml 查询
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose, contains sodium pyruvate) 10569-010 500 ml 查询
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose, contains no sodium pyruvate) 10566-016 500 ml 查询
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose, contains HEPES buffer, but no sodium pyruvate) 10564-011 500 ml 查询
D-MEM/F-12, (1X) liquid, 1:1 10565-018 500 ml 查询
F-12 Nutrient Mixture, (Ham) (1X), liquid 31765-035 500 ml 查询
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1X), liquid 31980-030 500 ml 查询
Minimum Essential Medium (MEM) alpha Medium(1X), liquid (contains no ribonucleosides or deoxyribonucleosides) 32561-037 500 ml 查询
Minimum Essential Medium (MEM) alpha Medium(1X), liquid (contains ribonucleosides and deoxyribonucleosides) 32571-036 500 ml 查询
Minimum Essential Medium (MEM), liquid(contains Earle's Salts) 41090-036 500 ml 查询
Minimum Essential Medium (MEM), liquid(contains Earle's Salts and HEPES buffer) 42360-032 500 ml 查询
Opti-MEM* I Reduced-Serum Medium (1X), liquid 51985-034 500 ml 查询
RPMI Medium 1640 (1X), liquid 61870-036 500 ml 查询
RPMI Medium 1640 (1X), liquid(contains HEPES buffer) 72400-047 500 ml 查询
Reagents
GlutaMAX™ -I Supplement 35050-061 500 ml 查询

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:43

新型高级颗粒化技术培养基(Advanced Granulation Technology™)

简化用于单克隆抗体生产和重组蛋白表达的复杂培养基

自从十九世纪六十年代初GIBCO™ 这一品牌建立以来，一直与细胞培养的技术突破相联系，包括彻底变革这一过程的新颖的培养基形式；1963年的干粉培养基（DPM），1992年的液体浓缩培养基（LMCs），和2002年创新的高级颗粒化技术培养基(AGT™)。

高级颗粒化技术培养基是一种全新的、易于使用的、颗粒状的干粉培养基。AGT™形式使许多的复杂配方适用于干粉培养基，提供了完全单一组分的形式，从而易于使用和从研究到生产的按比例放大。

我们开发了AGT™培养基，它把药物生产的fluid bed granulation应用到细胞培养的营养培养基生产上，这一过程适用于完全配方的多种多样的无血清、无蛋白和化学成分限定的营养培养基。

Invitrogen 公司使用fluid bed granulation药物生产技术生产无血清、无蛋白和化学成分限定的GIBCO™培养基，GIBCO™培养基利用一种新颖的干粉颗粒形式，易于水合和迅速的使用。

图1 培养基准备
Prep with Advanced Granulation Technology™ Media Prep with Dry Powder Media

完全、单一组分形式、pH值自动调节的培养基

与传统的细胞培养形式相比，新颖的AGT™形式具有明显的优点。AGT™培养基是完全的、pH值调节的培养基，如果必要的话，可能仅仅需要补充常规的L-谷氨酰胺。

AGT™完全培养基的基本优点在于，它为使用者提供了一种原材料，这种原材料能够降低涉及原材料计划、加工和检测的费用及时间。由于AGT™培养基是完全的、pH值预先调节和仅仅需要补充常规添加物的培养基，因而培养基的准备时间也被缩短。此外，由于AGT™颗粒溶解迅速，总的培养基准备时间减少。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:44

检测生长和产量的性能

在杂交瘤细胞、CHO、VEROP和HEK293细胞的生长和生物生产的研究中，与成分相同、通过传统的液体和干粉加工程序生产的培养基相比，来源于AGT™加工程序的GIBCO™特殊培养基具有相同的或者更高的性能（见图2）。

图2 AGT™无血清培养基性能类似或优于1x 液体培养基

经放大验证的性能

AGT™培养基不仅适合于研究使用，它们也最适宜工业化规模的应用。在包括PH值、渗透压和均一性（通过HPLC分析氨基酸、维生素和其它组分）的专门研究中，证明了具有可放大性（见图3）。

图3 在全部的AGT™批次规模放大时，pH值和渗透压保持一致

此外，来自正在进行的实时稳定性研究的数据表明,通过AGT™加工的无血清培养基的稳定性至少与传统的生产方式生产的培养基相同。

现在可以获得GIBCO™ AGT™形式的无血清和化学成分限定的培养基作为标准的目录项目，现在可以获得四种AGT™形式的GIBCO™ 特殊无血清培养基：CD（chemically-defined）杂交瘤培养基、CD CHO培养基、VP-SFM和CD 293培养基。其它的GIBCO™ AGT™ 形式的培养基可以按照定制的要求获得。

值得注意的是一些商业渠道获得的有些“化学成分限定的”营养培养基实际上包含有蛋白质。但是，GIBCO™ CD培养基的客户可以确信这些培养基是化学成分确定的：成分有明确的化学结构，没有人类或动物来源的成分，包括蛋白质和水解产物。通过特别的成分限定，GIBCO™ CD培养基能够提供产品性能的一致性。通过使用非动物来源的成分，减少了外源试剂污染的可能性。

CD杂交瘤培养基最适宜于普通的杂交瘤生长和单克隆抗体的生产及流水线纯化和下游的加工。适合于重组蛋白骨髓瘤细胞系和传统的杂交瘤细胞的培养，特别优于无血清和添加有血清的培养基。成分中不包含有酚红，可以最小化潜在的雌激素样效应和纯化的问题。在培养基中添加250x 胆固醇脂浓缩液时，CD杂交瘤培养基允许胆固醇依赖的细胞系如NS0、NS-1和相关的细胞系生长和表达蛋白。尽管这是为批次系统设计的，但是它很容易为其它用途修改。

CD CHO培养基最适宜于悬浮培养的中华仓鼠卵巢细胞的生长，重组蛋白和单克隆抗体的表达。成分中不包含有酚红，可以最小化潜在的雌激素样效应和纯化的问题。成分中不包含有次黄嘌呤和胸(腺嘧啶脱氧核)苷以便于在dhfr-扩增系统中使用。与添加血清、无蛋白和无血清培养基组分相比较，CD CHO培养基证明具有优越的性能。设计是为批次系统设计的，但是它很容易为其它用途修改。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:44

VP-SFM 可作为目录产品而获得。GIBCO™ VP-SFM是一种无血清、超低蛋白培养基，专门为培养VERO细胞而设计。它也适合于COS-7、MDCK、BHK-21和HEp-2细胞系的生长。它特别适合于繁殖病毒和其它细胞培养应用，例如生产重组病毒和单克隆抗体。

VP-SFM中的痕量蛋白来源于重组蛋白。转铁蛋白已经用一种离子螯合物替代，白蛋白用来自植物的二肽或三肽代替。唯一需要的添加物是L-谷氨酰胺，依赖于使用的细胞系统，L-谷氨酰胺的添加浓度应该在2～6mM。很多细胞系例如VERO、BHK和HEP-2不需要适应VP-SFM：但是一些细胞系可能需要连续的适应。

CD 293培养基是经过专门工程改造的用于高密度悬浮培养293细胞的培养基。作为对于与传统293细胞培养相关困难的回应，GIBCO™ CD 293培养基是一种化学成分限定、无蛋白培养基。

CD 293培养基没有任何动物来源成分、不确定的裂解物或水解产物。CD 293培养基具有广泛的应用，包括腺病毒、逆转录病毒和其它病毒的繁殖，重组蛋白的生产和药物筛选的使用。

新型高级颗粒化技术培养基 ● 最优化的干粉颗粒形式的GIBCO™ 无血清培养基
● 完全的、pH预先调节的：只需加入水和谷氨酰胺（如果需要）
● 溶解快速，需要最少的培养基准备时间
● 保证培养基新鲜
● 容易进行从研究到生物生产的放大
● 与液体培养基相比较，降低了冰箱贮存要求
● 贮存期长
● 可以得到定制配方培养基

产品货号规格价格
CD CHO AGT™ 12490-017 1×1L 查询
12490-025 1×10L 查询
CD Hybridoma AGT™ 12372-025 1×1L 查询
12372-017 1×10L 查询
VP-SFM AGT™ (add L-glutamine if required) 12559-027 1×1L 查询
12559-019 1×10L 查询
CD 293 AGT ™(add L-glutamine if required) 12529-020 1×1L 查询
12529-012 1×10L 查询
Related Products
L-Glutamine 25030-081 100ml 查询
250X Cholesterol Lipid Concentrate 12531-018 100ml 查询
Distilled Water 15230-162 500ml 查询
CHO-S Cells (adapted to CD CHO and CHO SFM media) 11619-012 3ml 查询

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:45

哺乳动物细胞和昆虫细胞（新产品信息）

● 预先适应GIBCO™ 无血清培养基（SFM）生长
● 进行基因表达系统性能检测
● 节省适应所需要的时间和费用
● 方便、可靠的供给

Invitrogen目前提供了9种细胞系，这9种细胞系预先适应了在新一代GIBCO™ 无血清培养基（SFM）中的生长，提供了在小型和大规模的系统中一致、可靠的性能。

5种哺乳动物细胞和4种昆虫细胞系明显地节省了实验的时间和减少了与适应相关的费用。生长率同于或优于其它商业上可获得的细胞。Invitrogen是细胞培养产品，包括优化的特殊培养基，的最主要的提供商。现在细胞加入到我们的产品行列，为研究者订购高质量的培养基和可靠来源的细胞提供了方便和经济上的实惠。

性能检测特征：

● 支原体和无菌状态检测
● 冷冻检测复苏后生长和活力
● 主要细胞库鉴定检验，包括同功酶检验和鉴定核型
● 报告每一批次总的传代次数和SFM适应传代次数
● 每一批发货附上冷冻－复苏，放大和冷冻保存的程序

哺乳动物细胞系

293-F和293-H，SFM Adapted——人类５型腺病毒转化和在293SFM培养基中适应生长的原代人胚胎肾细胞，高水平表达蛋白质，证明使用Lipofectamine™ 试剂和Plus™ 试剂有较高的转染效率。293-F细胞系具有高于一般水平生长率的特点。293-H很容易转换到单层培养以进行粘附应用。

CHO-S,SFM Adapted——中华仓鼠卵巢细胞，生长在CD CHO培养基，证明使用Lipofectamine™ 试剂有较高的转染效率。

CHO-7L，SFM Adapted——来源于CV-1猿猴细胞的非洲绿猴肾细胞，用SV40突变体转化，在VP-SFM培养基中适应生长。可以扩增和过量表达转染的基因，证明使用Lipofectamine™ 试剂和Plus™ 试剂有较高的转染效率。

Primary Human Keratinocytes,Cryopreserved in Defined Keratinocyte-SFM——原代人角质细胞被加工和冻存在GIBCO™ 限定角质细胞－SFM培养基中，因而有效的适应了这种培养基。在从冻存中复苏后，5天内细胞可以达到完全的汇合培养。用16群加倍进行寿命性能检测，大多数批号证明具有20＋加倍。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:45

图1 预先适应CD CHO培养基的CHO细胞。培养第5天
图2 预先适应293SFM培养基的293细胞。培养第3天

图3 预先适应Express Five™ SFM培养基的High FiveTM细胞。培养第3天图4 预先适应Drosophila-SFM培养基中悬浮生长的D.Mel2(or Schneider S2)细胞。培养第2天

昆虫细胞系

Sf9, SFM Adapted——来源于亲本spodoptera frugiperda 细胞系IPLB-Sf21-AE的分离克隆，适应于悬浮生长在Sf900Ⅱ,SFM培养基，一般通过使用杆状病毒表达系统（BEVS）来进行重组蛋白的表达。

Sf21, SFM Adapted——分离自spodoptera frugiperda卵巢细胞，适应于悬浮生长在Sf900Ⅱ, SFM培养基，一般通过使用杆状病毒表达系统（BEVS）来进行重组蛋白的表达。

D.Mel2(or Schneider S2), SFM Adapted——分离自Drosophila melanogaster晚期胚胎，适应于悬浮生长在Drosophila-SFM培养基，常常通过磷酸钙转染试剂盒用来进行瞬时或稳定表达重组蛋白。

High Five™, SFM Adapted——来源于亲本Trichoplusia ni BTI-TN-5B1细胞系的分离克隆，适应于悬浮生长在Express Five™ SFM培养基——最适于High Five™和其它的Trichoplusia细胞系。High Five™细胞系常常通过使用杆状病毒表达系统（BEVS）用来进行重组蛋白的表达。

定货信息类型细胞系目录号规格价格适应无血清培养基目录号规格价格
Insect D. Mel 2 10831-014 3 ml 查询 Drosophila-SFM 10797-017 500 ml 查询
10797-025 1000 ml 查询
Insect High Five™ Cells B855-02 3×10 cells/ml 查询 Express Five® SFM 10486-025 1000 ml 查询
Insect Sf9 11496-015 3 ml 查询 Sf-900 II SFM 10902-096 500 ml 查询
10902-088 1000 ml 查询
10902-070 10 L 查询
Insect Sf21 11497-013 3 ml 查询 Sf-900 II SFM 10902-096 500 ml 查询
10902-088 1000 ml 查询
10902-070 10 L 查询
Mammalian 293-F 11625-019 3 ml 查询 293 SFM 11686-029 1000 ml 查询
Mammalian 293-H 11631-017 3 ml 查询 293 SFM 11686-029 1000 ml 查询
Mammalian COS-7L 11622-016 3 ml 查询 VP-SFM 11681-020 1000 ml 查询
Mammalian CHO-S 11619-012 3 ml 查询 CD CHO 10743-011 500 ml 查询
10743-029 1000 ml 查询
Mammalian Primary Human Keratinocytes 12332-011 1 ml 查询 Defined Keratinocyte-SFM 10744-019 500 ml 查询

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:46

相关产品产品目录号规格价格
Blasticidin S HC1 R210-01 50 mg 查询
Calcium Phospate Transfection Kit K2780-01 75 reactions 查询
Cellfectin® Reagent 10362-010 1 ml 查询
Geneticin® (G418 Sulfate), liquid 10131-035 20 ml 查询
10131-027 100 ml 查询
Geneticin® (G418 Sulfate), Powder 11811-023 1 g 查询
11811-031 5 g 查询
Hygromycin B 10687-010 20 ml 查询
Lipofectamine™ Reagent 18324-111 0.5 ml 查询
18324-012 1 ml 查询
18324-020 4×1 ml 查询
Lipofectamine™ 2000 11668-027 0.75 ml 查询
11668-019 1.5 ml 查询
Plus™ Reagent 11514-015 0.85 ml 查询
Zeocin™ R250-01 1 g 查询
R250-05 5 g 查询

新型的FreeStyle™ 293表达系统

Invitrogen 公司新型的FreeStyle™ 293表达系统，简单和优化了293细胞中蛋白质的生产。FreeStyle™ 系统允许对悬浮的293细胞进行转染，在要求大量细胞时，不需要运送许多瓶的贴壁细胞。为了优化293细胞的转染和表达，FreeStyle™ 系统提供：

293fectin™ 转染试剂

提供了悬浮293细胞的最高转染效率。

GIBCO™ FreeStyle™ 293 表达培养基

特别设计使悬浮293细胞能够有效的转染和最佳生长的无血清培养基。

FreeStyle™ 293F 细胞

预先适应了FreeStyle™ 293表达培养基，具有优良操作性能的一个293细胞克隆。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:46

优化的悬浮培养生长

进行蛋白生产时，细胞生长和细胞活性是产品产量的关键。FreeStyle™ 293表达培养基提供无血清培养基中有效的悬浮培养转染和优化的悬浮生长。它不仅没有血清，而且成分中明显的减少了竞争性蛋白组分。你将在表达实验中得到较清楚的蛋白样品并且获得可放大和能够重复的结果。

有效转染

其它转染试剂的供应商推荐使用贴壁293细胞——难于规模放大的流程。特别试验的转染悬浮293细胞的293fectin™ 试剂可以提供高水平蛋白表达的悬浮流程（见图1）。293 fectin™ 转染试剂提供你需要的规模放大转染的效率。

图1 使用FreeStyle™ 293表达系统表达蛋白。FreeStyle™ 293细胞生长在FreeStyle™ 293表达培养基中，用293fection™转染试剂进行瞬时转染。转染后47小时后，收获1×10细胞，检测总蛋白和b-半乳糖苷酶活性。转染的细胞和未转染的细胞有相似的总蛋白水平，但是每毫升转染细胞培养物表达124mg b-半乳糖苷酶。

你需要的结果

我们的FreeStyle™ 293表达系统的每一个组分被设计和检验，以提供你需要的293细胞的悬浮转染的结果。FreeStyle™ 293F细胞是经过选择的容易操作和具有高表达能力的293克隆。它适应了GIBCO™ FreeStyle™ 293 表达培养基，可以节省你的时间和努力。各种组分一起提供有效，可放大，可重复的表达。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:47

产品货号规格价格
FreeStyle™ 293 Expression Kit K9000-01 1 L FreeStyle™ 293 Expression Medium
1 vial of FreeStyle™ 293F Cells
1 ml of 293fectin™ Transfection Reagent
100 ml of Opti-MEM® I
20 µg of pCMV-SPORT ß-gal 查询
GIBCO™ FreeStyle™ 293 12338-018 1 L 查询
Expression Medium 12338-026 6×1 L 查询
293 fectin™ Transfection Reagent 12347-019 1 ml 查询
FreeStyle™ 293F Cells R790-07 1×10 frozen cells 查询

无酚红培养基（新产品信息）

● 细胞标记实验的理想的无毒性培养基
● 允许不可能在经典培养基中进行的特殊的应用
● 可获得定制配方

使用GIBCO™ 无酚红培养基可以扩展细胞标记实验的范围，GIBCO™ 无酚红培养基按照与传统配方相同的精确的标准生产，允许你在经典培养基中不可能进行的特殊应用领域中工作。

酚红，用来作为pH指示剂，可能在一些细胞中呈现雌激素样作用，而且可能对于某些类型细胞具有毒性作用。在细胞实验中所有GIBCO™ 无酚红培养基是无毒性的，同时显示没有雌激素样作用活性。

购GIBCO™ 无酚红培养基比以前更加容易，所有的配方组织在下列列表中，按照培养基的类型进行分类，以提供快速，方便的订购。检查下列列表，发现你需要的配方。如果你的配方不在列表内，我们的定制配方服务部门非常高兴讨论你的要求。

定货信息产品描述目录号规格价格
CD CHO Medium (1X), liquid 10743-029 1,000 ml 查询
10743-011 500 ml 查询
CD Hybridoma Medium (1X), liquid 11279-023 1,000 ml 查询
Cell Culture Freezing Medium-Dimethylsulfoxide (dmso), liquid 11101-011 50 ml 查询
Dulbecco's Modified Eagle Media (D-MEM)
D-MEM (1X), liquid
(low glucose, with 1.0 g/L D-glucose, and 110 mg/L sodium pyruvate, without L-glutamine)
11054-020 500 ml 查询
D-MEM (1X), liquid
(high glucose, with 4.5 g/L D-glucose, L-glutamine, and 25 mM HEPES buffer)
21063-029 500 ml 查询
D-MEM (1X), liquid
(high glucose, with 4.5 g/L D-glucose, without L-glutamine)
31053-028 500 ml 查询
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (D-MEM/F-12) 1:1 Mixture
D-MEM/F-12 (1X), liquid, 1:1 (contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer) 11039-047 10×500 ml 查询
11039-021 500 ml 查询
D-MEM/F-12 (1X), liquid, 1:1 (contins L-glutamine) 21041-025 500 ml 查询
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)
D-PBS (1X), liquid (contains calcium and magnesium) 14040-141 100 ml 查询
14040-133 500 ml 查询
14040-182 10×500 ml 查询

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:48

14040-117 1,000 ml 查询
14040-216 6×1000 ml 查询
D-PBS (1X), liquid
(contains 1, 000 mg/L D-glucose and 36 mg/L sodium pyruvate, calcium, and magnesium)
14287-080 500 ml 查询
14287-072 1,000 ml 查询
D-PBS (1X), liquid (contains no calcium or magnesium) 14190-144 500 ml 查询
14190-250 10×500 ml 查询
14190-136 1,000 ml 查询
14190-235 6×1000 ml 查询
14190-078 10 L 查询
D-PBS (10X), liquid (contains calcium and magnesium) 14080-055 500 ml 查询
D-PBS (10X), liquid (contains no calcium or magnesium) 14200-075 500 ml 查询
D-PBS, powder (contains magnesium) 21300-025 10×1 L 查询
21300-058 1×10 L 查询
D-PBS, powder (contains no calcium or magnesium)

Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid (contains no calcium or magnesium)

21600-010 10×1 L 查询
21600-069 1×10 L 查询
21600-044 1×50 L 查询
14155-063
500 ml 查询
Hanks's Balanced Salt Solutions (HBSS)
HBSS (1X), liquid (contains calcium and magnesium) 14025-092 500 ml 查询
14025-076 1,000 ml 查询
HBSS (1X), liquid (contains no calcium chloride, magnesium chloride, or magnesium sulfate) 14175-095 500 ml 查询
14175-079 1,000 ml 查询
14175-103 10×500 ml 查询
HBSS (10X), liquid (xontains calcium and magnesium, but no sodium bicarbonate) 14065-056 500 ml 查询
HBSS (10X), liquid (contains no calcium chloride, magnesium chloride, magnesium chloride, magnesium sulfate, or sodium bicarbonate) 14185-052 500 ml 查询
HepatoZYME-SFM
Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) (1X), liquid (contains L-glutamine)
17705-021 500 ml 查询
21056-023 500 ml 查询
Improved MEM Zn++ Option M (Richter's Modification), liquid 10373-017 500 ml 查询
KaryoMAX® COLCEMIDTM Solution, Iiquid (10 mg/ml), In PBS 15212-012 10 ml 查询
Leibovitz's L-15 Medium (1X), liquid (contains L-glutamine) 21083-027 500 ml 查询
Medium 199 (1X), liquid (contains Earle's salts,L-glutamine, and sodium bicarbonate) 11043-023 500 ml 查询
Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Alpha Medium (1X), liquid (contains L-glutamine, ribonucleosides, and deoxyribonucleosides) 41061-029 500 ml 查询
MEM (1X), liquid (contains Earle's salts, but no L-glutamine) 51200-038 500 ml 查询
Modified Eagle Medium (MEM) (2X), liquid 11935-046 500 ml 查询
Opti-MEM® I Reduced-Serum (1x), liquid 11058-021 500 ml 查询
Phosphate-Buffered Salines (PBS)
PBS pH 7.2 (1X), liquid 20012-027 500 ml 查询
20012-050 10×500 ml 查询
20012-043 1,000 ml 查询
PBS pH 7.2 (10X), liquid 70013-032 500 ml 查询
PBS pH 7.4 (10X), liquid 70011-044 500 ml 查询
RPMI Medium 1640 (1X), liquid (contains L-glutamine) 11835-055 10×500 ml 查询
11835-030 500 ml 查询
Trypsin-EDTA (0.5% Trypsin, 5.3 mM EDA 4·Na) (10X), liquid 15400-054 100 ml 查询
Trypsin 2.5% (10X), liquid 15090-046 100 ml 查询
Versene 1:5, 000 (1X), liquid 15040-066 100 ml 查询

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:48

重组蛋白酶 (rProtease)

● 一种非动物来源的胰蛋白酶替代物
● 降低风险
● 无血清研究和生物生产中理想的细胞分离试剂
● 很容易获得各种获得任何规模的供给
● 简化下游纯化

GIBCO™ rProtease 是Invitrogen 不断增加的无血清培养基和非动物来源试剂行列中的新成员，它们用于药物发现研究和生物生产。这些创新的细胞培养工具最小化了来自动物病原体的潜在风险，并且消除了许多与动物来源物质相关的问题。

微生物生产的胰蛋白酶替代物

牛或猪来源的胰蛋白酶在细胞培养研究和生物生产中广泛的使用，用来从表面分离贴壁细胞。研究者和生产者希望确保哺乳动物细胞培养和生物生产过程没用动物来源物质，现在他们可以用微生物生产的GIBCO™ rProtease代替胰蛋白酶。已经证明这种类似胰蛋白酶（trypsin-like）的酶对许多种不同的细胞系有效（图1）。

细胞系培养基细胞释放要求的平均时间平均活性
VERO VP-SFM 100％ 5 分钟
VERO E-MEM+5%FBS 100％ 8 分钟
VERO OptiPro™ 98％ 7 分钟
PK-15 E-MEM+10%FBS 98％ 27 分钟
PK-15 OptiPro™ 99％ 11 分钟
MDCK OptiPro™ 98％ 28 分钟
MDBK D-DMEM+5%FBS 100％ 15 分钟
A549 D-DMEM+10%FBS 98％ 9 分钟
293F D-DMEM+5%FBS 97％ 2 分钟

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:48

GIBCO™ rProtease是一种微生物生产的动物胰蛋白酶的替代物。它是在一个受控制的、完全没用动物和人类成分的发酵过程中生产。这个过程生产出极其纯的试剂（图2）。

图2 HPLC 层析A 图示标准胰蛋白酶的典型结果。注意表明有杂质的多个峰。HPLC 层析B 清楚地显示rProtease的纯度。

很容易得到任何规模的GIBCO™ rProtease源材料的供给，不象其它非动物胰蛋白酶替代物的源材料，例如植物来源酶，依赖于种植周期，并受到转基因作物的环境法规的影响。

GIBCO™ rProtease保持细胞的活性、产量和形态（图3-5）。无论应用在无血清或有血清系统，rProtease都显示了与胰蛋白酶相同的性能和稳定性，而且在许多情况下，它更加容易使用。由于可用新鲜的培养基灭活，因而不需要胰蛋白酶抑制剂。此外，rProtease中没用酚红，这种pH指示剂可能会呈现类雌激素（estrogen-like）特性，因而可能对某些类型细胞产生毒性。

图3 VERO(非洲绿猴肾细胞)以3.5×10细胞/25cm²在补充4mM L-谷氨酰胺的OptiPro™培养基中铺板。D-PBS清洗细胞后，每个T-25培养瓶中加入1ml rProtease或猪胰蛋白酶。在细胞从表面脱离时，1000rpm离心5分钟。进行细胞总数和存活率记数。发现在所有的情况下，细胞存活率大于大于97％。细胞接种进新的培养瓶，并且重复分析6次连续性传代。

图4胰蛋白酶收获。MDCK细胞生长在GIBICO™ OptiPro™ SFM中，收获但是没有离心。细胞再次铺板，24小时后观察形态。用动物胰蛋白酶收获的细胞没有贴壁或延伸。
图5 rProtease收获。MDCK细胞生长在GIBICO™ OptiPro™ SFM中，收获但是没有离心。细胞再次铺板，24小时后观察形态。用rProtease收获的细胞贴壁或延伸良好。

订货信息 Description Formula No. Size Price
rProtease 12563-011 100 ml 查询
Non-animal, recombinant trypsin substitute used lfor the dissociation of attachment-dependent cell lines. 12563-029 500 ml 查询

高级D-MEM和MEM

● 减少FBS的添加50-90％
● 节省时间和花费
● 延长血清批次的寿命
● 减少不同批次导致的差异
● 适合种类广泛的细胞系

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:49

GIBICO™高级D-MEM和MEM是在标准的基本配方基础上富集了血清中的正常组分。新培养基使这些组分参与细胞培养，减少50-90％FBS的添加，而不改变细胞生长、促进、形态或功能。高级配方适合多种普通细胞系的生长和维持包括MDBK、HEp-2、A549、MDCK、WI-38、VERO及其它细胞系。

每一种培养基都是在公开的标准基本配方中进一步添加NEAA和丙酮酸钠。添加下列成分可以减少血清：乙醇胺、谷胱甘肽（还原型）、抗坏血酸磷酸、胰岛素、人（holo）转铁蛋白、AlbuMAX® (一种富含脂的牛血清白蛋白)和微量元素盐亚硒酸钠、matavanadate ammonium、硫酸铜和氯化钨（maganous chloride）。血清使用浓度的降低将会随细胞系和使用的基本培养基的不同而有所变化。尽管推荐的血清浓度是1-5％，但是对于每一个细胞系，血清浓度必须要调整，以获得最佳的结果。对于大部分的应用，减少至少50％血清添加物不需要适应步骤。进行转换时，只需要简单的离心细胞，除去上清液，在减少血清的培养基中再次悬浮细胞。通过最小化的适应实现减少血清的添加。

提供1X液体形式的高级D-MEM和MEM，只需要添加L-谷氨酰胺或GlutaMAX™-I添加物。不要求细胞系适应这些培养基。

图1和2 添加4mM L-谷氨酰胺和1％FBS的高级D-MEM与添加4mM L-谷氨酰胺和10％FBS的Dulbecco's Modified Eagle's Medium (D-MEM)比较。高级D-MEM不进行预适应，A549(人肺肿瘤)细胞以2.5×10细胞/25cm²的密度铺板。培养瓶在37℃、5％CO2和95％空气中孵育一个4天的传代周期。在两种条件下，细胞的生长和形态是相似的。

Advanced D-MEM Applications Cell Types Recommehded Seed Density(Viable cells/25cm2) % FBS in Advanced D-MEM
A549 2.5×10 1-2
COS-7 2.0×10 1-2
MDBK 1.0×10 1-2
MRC-5 5.0×10 2
VERO 1.0×10 1-2

图3 添加4mM L-谷氨酰胺和10％FBS的Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (D-MEM)与添加1或2％FBS的高级D-MEM比较（细胞系依赖）。各种细胞系铺板两份，接种密度的变化范围是1.0-5.0×10细胞/25cm2培养瓶（接种密度细胞系依赖）。培养瓶孵育在37℃、5％CO2和95％空气，经过至少传3代，传代周期是3-天：4天，再孵育4天。数据表示连续培养第4天传代培养物的平均值。

出色的研究以出色的细胞培养开始

良好的细胞培养始于GIBICO™的产品和服务。

作为世界最大的细胞培养产品生产商，GIBICO™培养基、血清、试剂和技术支持已经制定全球标准40年了。全世界的科学家信任我们的质量，依靠我们的服务和欢迎我们的创新，现在通过整合Invitrogen的分子生物学工具甚至更加强大。

留心Invitrogen的方法，它们将会节省您的时间和花费，满足您变化的需求和改善您的实验结果。

Advanced MEM Applications Cell Types Recommehded Seed Density(Viable cells/25cm²) % FBS in Advanced MEM
HEp-2 3.0×10 2
MDCK 1.0×10 2
PK-15 2.0×10 1-2
VERO 1.0×10 1-2
WI-38 4.0×10 2

图4 添加4mM L-谷氨酰胺和10％FBS的Minimum Essential Medium (MEM)与添加1或2％FBS的高级MEM比较（细胞系依赖）。培养瓶孵育在37℃、5％CO2和95％空气，经过至少传3代，传代周期是3-天：4天，再孵育4天。数据表示连续培养第4天传代培养物的平均值。

作者: tianmei001 时间: 2012-3-18 12:49

由RPMI 1640 干粉10.4g/L(购自GIBCOL公司)、HEPES 2×10 -2 mol/L、L-谷氨酰胺2×10 -3 mol/L、2-
巯基乙醇0.05mol/L、非必需氨基酸0.1mol/L、丙铜酸钠1mol/L、双抗(青霉素100IU/ml、
链霉素0.1g/L)和10％灭活的胎牛血清(购自GIBCOL 公司)构成

作者: tangxin_80 时间: 2012-3-18 12:50

我从人外周血单核细胞诱导树突状细胞
想请教：
1、经过2个小时贴壁后培养板中扔有很多小的园的细胞，我怀疑是淋巴可是他们应该是悬浮的，但为什么洗不掉呢，我甚至是在吹打都没有洗吸去，还有许多血小板贴壁，有什么好的办法吗，我看到培养板里乱糟糟的就闹心！！
2、2小时贴壁时是用有血清的培养基好，还是用无血清的贴壁好呢
3、我进行过流式测定，是测的CD83，表达没有象预期的升高，一直在20～30％左右，与没加因子的组差别不大，我想可能是细胞中混有很多杂细胞，或者是在做流式测定时设门不对，
有谁知道为什么，请给予我一些帮助吧，我都快愁死了：（

作者: newway 时间: 2012-3-18 12:50

我做过原代的脾的树突状细胞分离，请问你是否做原代培养。

作者: hustwb 时间: 2012-3-18 12:51

我在用小鼠的骨髓细胞培养DC，但结果很不理想，不知为什么？很着急!!!!请大家帮帮忙。以下有几个问题：
1.你们培养DC 是悬浮的还是疏松贴壁的？如果是疏松贴壁的，怎样才能有效的收集DC?随便说一下，我想培养的是不成熟的DC,GM-CSF的剂量较低。
2.一般骨髓细胞在培养前是否非要用各种抗体纯化？

作者: kulee 时间: 2012-3-18 12:51

我做的DC共有三种来源，骨髓，外周血和动员后的外周血干细胞。这个是外周血的，是一个移植的供者，拍照时没有染色，我用的是OLYMPUS的倒置显微镜和配套的OLYMPUS的照相系统，可以调节亮度等参数，所以看上去象是染了色的。

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想问下你的“OLYMPUS的照相系统”的设置，我的跟你的是一样的阿，可惜我拍照拍出来的是只有中间一个圆圈视野，其余部位都是没有暴光，黑黑！
谢谢指教！

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