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标题: [讨论帖]免疫细胞荧光图象重叠：达到激光共聚焦效果 [打印本页]

作者: vvmmoy 时间: 2012-3-18 12:59 标题: [讨论帖]免疫细胞荧光图象重叠：达到激光共聚焦效果

红色Cy3标记

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11161

作者: vvmmoy 时间: 2012-3-18 13:00

兰色Hoechest33258 染核

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11162

作者: vvmmoy 时间: 2012-3-18 13:01

叠加图象

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11163

作者: u234 时间: 2012-3-18 13:02

QUOTE:

原帖由 vvmmoy 于 2012-3-18 12:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

红色Cy3标记

有红色与绿色merge出来的黄色

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 13:02

好象未见类似帖子，我还是请教国外同事才知道这个方法的。
希望此帖子对没有激光共聚焦显微镜的群友有帮助

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 13:03

QUOTE:

原帖由 u234 于 2012-3-18 13:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有红色与绿色merge出来的黄色

什么意思，不明白。

作者: u234 时间: 2012-3-18 13:03 标题: 回复 #6 园丁## 的帖子

我看到照片里有的细胞中见黄色的部分，所以有此一问？
是Cy3标记本身就可以出现这现象吗？

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 13:04

是荧光太强的缘故（二抗浓度加高了），将荧光强度衰减后，就见不到了黄的了

作者: u234 时间: 2012-3-18 13:04

哦。
那若同时另外一个标以绿色的荧光或是(E)GFP的话，很容易出现假的colocolization了

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 13:06

也可能是一抗浓度加高了，总之背景太深

作者: u234 时间: 2012-3-18 13:06

好象未见类似帖子，我还是请教国外同事才知道这个方法的。
希望此帖子对没有激光共聚焦显微镜的战友有帮助

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这个类似，当然Ajust部分没有
记得还见过一个教程，暂时没找到，不过不管怎么说，首先感谢您提供的教程

作者: october7 时间: 2012-3-18 13:07

给出一张衰减到原先荧光1/16的图片（推进一块）

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11164

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 13:08

贴出的衰减到1/16的图就能说明了（此图显色强的地方，在先前图中发橘黄；此图显色弱的地方，在先前图中显正常红色。）
很简单荧光信号太强的缘故。而造成信号太强的缘故是抗体浓度过高或者是拍照时衰减片没有推进去。

作者: u234 时间: 2012-3-18 13:08

先申明一下，不是跟您抬杠

若衰减到1/16，有无可能会掩盖原本具有的反差
因为您给出的照片中细胞的荧光强度不是很均匀，所以想您请教一个问题：
就是，若两组细胞荧光反差很大，这种情况下可能会出现我刚才提到的假阳性的cocolocalization吗？特别是红色+绿色时？

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 13:08 标题: 回复 #14 u234 的帖子

确实存在你讲这个问题，最近我做了很多次免疫细胞化学。拍照时，你选择不同的荧光衰减强度，获得的信息是不同的。
另外可能与数码成像有关。我们知道洗普通照片时，不同照相馆洗出的照片不同。有的偏红，有的偏兰。总之就是对某一种颜色可能出现偏差。
关于红色+绿色没有做过。但是我想没有很多人支持我图片中的黄的地方是红色+绿色的叠加。尽管我没有做过红色+绿色，但是我想不应该是那种橘黄。
正如你所说细胞的荧光强度不是很均匀。但是我们见到的很多文章，往往只给出少量几个细胞的荧光图，因此很容易掩盖整个细胞荧光强度不均匀。

作者: u234 时间: 2012-3-18 13:10

确实存在你讲这个问题，最近我做了很多次免疫细胞化学。拍照时，你选择不同的荧光衰减强度，获得的信息是不同的。
另外可能与数码成像有关。我们知道洗普通照片时，不同照相馆洗出的照片不同。有的偏红，有的偏兰。总之就是对某一种颜色可能出现偏差。
关于红色+绿色没有做过。但是我想没有很多人支持我图片中的黄的地方是红色+绿色的叠加。尽管我没有做过红色+绿色，但是我想不应该是那种橘黄。
正如你所说细胞的荧光强度不是很均匀。但是我们见到的很多文章，往往只给出少量几个细胞的荧光图，因此很容易掩盖整个细胞荧光强度不均匀。

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好像是这样的：
7.5%红+92%黄+0.5%蓝=橘黄

作者: 园丁## 时间: 2012-3-18 13:10 标题: 回复 #16 u234 的帖子

好像是这样的：
7.5%红+92%黄+0.5%蓝=橘黄
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你是这样计算出来的,向你好好学习一下.

作者: u234 时间: 2012-3-18 13:11 标题: 回复 #17 园丁## 的帖子

不是啊，我是从某种颜料的配方中摘录的

所以，我估计，您说的可能更加合理

作者: 白白的 时间: 2012-3-18 13:12

这种做法简直就是掩耳盗铃, 只是让图像让外行看起来像共聚焦图像而已,其反而丢失了灰阶信息, 使图像缺乏层次,共聚焦的图像不仅仅是看起来亮而清晰,其实本质上在于其高对比高解析度, 像上面这种处理方法得出的图像只是相当于把反差增强了,信号和噪音一起增强,并没有使图像的可分辩信息增加.
正规的做法是对普通显微镜的图像进行逆卷积运算,才能得到接近共聚焦效果的图像. 透镜的成像过程就相当于对物体进行卷积运算得到物体的像,因此,理论上对像进行逆卷积运算就可以得到物体的原始信息.
逆卷积运算必须用专业图像处理软件才可以实现,比如ImageProPlus,MatLab,IDL等

作者: u234 时间: 2012-3-18 13:12

感谢楼上的参与讨论，并指出其缺陷，

但，楼主的方法并不是让照片看上去分辨率等方面有所改进，主要是利用来进行图片叠加而已，形成“伪”confocal的效果（只是照片上的），据我所知，国外著名大学的研究机构内也有用此方法的

另外，能否请介绍一下“逆卷积运算”？

作者: 白白的 时间: 2012-3-18 13:13

逆卷积运算是比较专业的数学运算,可惜我也不能全部弄懂,具体用的时候必须借助软件来实现,除了我上面提到的三个软件之外,还有Motic的Mult-Focus软件也可以,只不过前三个都能找到盗版的.
ImageProPlus里面有sharpstack模块,是专门用来进行图像增强的,其中就包括j逆卷积处理;MatLab和IDL需要用里面的decovolution函数,具体可查看相应的帮助;Multi-Focus是一个比较易用的软件,专门用来仿真共聚焦图片

作者: remenb 时间: 2012-3-18 13:13

用显微镜拍摄双荧光染色样品时的正规方法有两种，一种是加上专门的两染料滤光片，直接拍摄两种染料的荧光，这种专用的滤光片很贵，1000美金一个，不能通用，所以很少用。不过其效果会很好的。另一种方法是用通用的滤光片分别拍摄两种染料的荧光，然后用数字合成的方法合成一张图片，用photoshop是可以的，当然这不够"专业"。正规的作法是，用单色CCD配上适当的滤光片，分别拍摄十二位灰度的两种单色荧光图片，用imageproplus给它们加上伪彩色，然后可以合成一张双彩色的图片，还可以进行一些其他的分析处理。这个当然是比不上激光共聚焦的效果的。

作者: remenb 时间: 2012-3-18 13:14

1.如何用PS8.01来合成两张不同色的荧光照片?园子里介绍的那种方法(用拷贝)效果不佳.

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在photoshop中合成照片很简单，就是在大一点的照片上加一个图层 ---- 直接粘帖另一张照片就行，这就形成的有两个图层的PHotoshop格式的图片，然后在图层工具栏里找那个透明度选项，如果是100%透明，就能合成显示两张图了，通过调整透明度，还可以变换两张照片的亮度比例，效果能好看一些。最后合并图层保存。

作者: remenb 时间: 2012-3-18 13:14

2.请问:绿色跟蓝色叠加在一起成什么颜色?

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2.电脑里的纯蓝色与纯绿色相加的颜色是湖蓝色。你也一样可以用图层迭加的方法直接看。

作者: remenb 时间: 2012-3-18 13:15

3.带CCD的荧光显微镜(接电脑,用软件拍照的),在观察荧光时,曝光度,时间,敏感度,像素,各种平衡,如何设置?

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拍摄荧光照片时，最重要的是不能使用自动曝光，要用手动曝光，要注意画面中最亮的亮点不能有光晕，或者有颜色变黄的现象，这些都意味着曝光过度，颜色与强度都会失真的。在不得不使用自动曝光时，要把曝光调整(adjust expose)调到-4，就是降低两档曝光，也就是时间降低至正常的1/4。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=10&id=3740389&sty=1')
如果用的是彩色CCD，还要想法把自动白平衡给关掉。否则颜色失真也会很大，会降低色饱合度 -- 最要命是的关掉白平衡后拍摄的画面似乎与镜下效果不同，颜色似乎更深一些，其实这是人眼的视觉误差。很多人更愿意把白平衡开着，如果是单色荧光样品，也就罢了，但在双染色的样品时，色饱合度高一点是绝对有好处的。
各种数码相机与CCD的操作都有所不同，具体的操作设置还得自己在说明书上找。把握住三条:一是正确曝光，二是处理好白平衡，三是一定要使用有效象素大小拍摄。一般的CCD有效象素也就一百万左右。拍摄成五六百万的格式时很可能还会更模糊。如果电脑硬盘够大，尽量保存TIFF格式图片。BMP太大，jpg格式会有颜色细节的损失，会影响光密度分析的准确性。

关于显微镜的操作可以写上一大堆帖子，只是不知在哪里贴它们比较合适。

作者: vvmmoy 时间: 2012-3-18 13:15

近来由于不能正确使用荧光显微镜,而导致无法拍出理想的结果.(偌大的实验报告竟没有一人能较好的使用它,也没有说明书).白白耗费不少时间.
希望你能继续给我们这些"镜肓"扫肓.说说如何正确用好荧光显微镜!若有电子版的说明书则更好,再谢!
顺再问三个问题:
1.做细胞免疫酶学拍照时(彩色CCD),如何把背景调成白色?再已是彩色的背景,能否再改成白色了吗?
2.以下是一张我刚合成的蓝绿荧光的重叠图像,感觉不理想,请再次指正.
3.截图软件如何才能减少像素丢失?(用hypersnap软件截图,一张图从3M,却变成了50KB?)

作者: kuaizige 时间: 2012-3-18 13:16

这种做法简直就是掩耳盗铃, 只是让图像让外行看起来像共聚焦图像而已,其反而丢失了灰阶信息, 使图像缺乏层次,共聚焦的图像不仅仅是看起来亮而清晰,其实本质上在于其高对比高解析度, 像上面这种处理方法得出的图像只是相当于把反差增强了,信号和噪音一起增强,并没有使图像的可分辩信息增加.
正规的做法是对普通显微镜的图像进行逆卷积运算,才能得到接近共聚焦效果的图像. 透镜的成像过程就相当于对物体进行卷积运算得到物体的像,因此,理论上对像进行逆卷积运算就可以得到物体的原始信息.
逆卷积运算必须用专业图像处理软件才可以实现,比如ImageProPlus,MatLab,IDL等

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还有一个问题：两种颜色的叠加效果有时候共聚焦都很难区分：因为染料浓度不同，染料和被测物的结合效率不同，共聚焦上的激光能量不能保证完全相同——即使是同一种百分比！——所以用一般显微镜拍出来再进行叠加的照片不完全是cocolocalization，很可能是串色。

其次就是清晰度的问题了。
共聚焦的清晰度，一般显微镜很难相比的。

作者: caihong 时间: 2012-3-18 13:16

photoshop is $$$
you can also do this with ImageJ (from cuturl('http://rsb.info.nih.gov/ij/') ), a free software from NIH

1. "open" two/three gray images in ImageJ (or open RGB images, which are represent different channels, and convert to 8-bit by "Image -> Type -> 8bit")
2. use "Process -> Enhance Contrast" to get maximal visual effect
3. use "Image -> Color -> RGB Merge" to get your figure ~~

btw, ImageJ also can do deconvolution, but you need use the scope to get the psm file

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