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标题: [讨论帖]我是这样看细胞接种六孔板的，你呢？ [打印本页]

作者: gogo 时间: 2012-3-18 13:17 标题: [讨论帖]我是这样看细胞接种六孔板的，你呢？

为了方便加处理因素，我们通常在六孔板中接种细胞

但是接种细胞也很有些细节上的讲究

一方面，为了使细胞在加药同步化的时侯处于对数增长期，最好是在前一天晚上接种细胞

并保证细胞培养了12小时左右

另外一方面，接种细胞的数量也很关键，接种的细胞过密，很有可能消除掉了药物的作用，药

效降低，因此对实验结果造成影响，为了避免细胞过密和过稀，即保证前一天晚上接种后第二

天早上细胞的密度达到90%左右，需要我们对自己培养瓶细胞数量与六孔板细胞密度进行摸索，

比如我用50ml培养瓶培养的细胞，90%-100%密度时按上述方法接种两块六孔板，一般能达到所

需要的密度。

当然我在这里也是抛砖引玉，希望和大家在细胞接种上广泛交流经验。谢谢

作者: woshituzhu 时间: 2012-3-18 13:18

我养的 SHG--44 胶质瘤细胞，一般是今晚铺细胞，板或者是瓶子，明天上午给药。

作者: woshituzhu 时间: 2012-3-18 13:18

6孔板买用过，一般用24孔和96孔。

作者: yysr238 时间: 2012-3-18 13:22

怎样确定细胞密度在具体的90%或100%，可以测算出来吗？

作者: is2011 时间: 2012-3-18 13:23

从培养瓶往板子上种细胞有时的确是需要一些经验和技巧的，因为不同的细胞在瓶子里长的数量是不一样的，我种的是平滑肌细胞，铺的很开，个头又大，这样下来一瓶的细胞量就比较少了。我一般是一个25cm2的培养瓶种四个孔，种好之后放两天后再接着处理，其实我觉得在六孔板接种细胞方面还是可以有据可依的。不怕麻烦可依把细胞拿来计数，然后每个孔接种不同数量的细胞，然后观察细胞的生长情况，这样就可以得到自己的细胞比较准确的资料了。
不过在接种板子的时候细胞生长容易出现一个现象，就是中间的长的密，周围的长的疏，出现这个问题以我在园子上看到的帖子和自己的经历来看，主要是把细胞接种到板子上后再加培养基进行稀释的结果，无论你怎么在板子里面混匀效果都不是很好。到目前我找到的最好的办法就是先在瓶子里稀释好以后直接接种到板子上。
我觉得在细胞接种六孔板这个问题上最重要和最难把握是细胞的接种密度和对细胞生长程度的把握，即如何判断细胞长到什么程度拿去实验效果最好，希望有经验的战友多谈谈这方面的经验。最好能有自己的个案，比如说做流式等这些实验的时候对细胞接种是如何把握的。

作者: junjie05 时间: 2012-3-18 13:23

就是中间的长的密，周围的长的疏
这个问题如下解决：垂直方向晃！！前后三下　左右三下，再重复这样，试过多次，效果都非常好！

作者: S6044 时间: 2012-3-18 13:23

要铺匀的关键是静置15分钟后再放入孵箱

作者: c86v 时间: 2012-3-18 13:24

以前铺6孔板和24孔板，经常不匀，通常就是战友们所说的中间多，周围少的情况。经过长时间的摸索，终于基本解决了这个难题，基本操作：用前用1mlPBS或培养液将6孔或24孔板润湿，之后将稀释好的细胞混悬液接种于板上，6孔板每孔2ml即可，24孔最好1ml，0.5的效果不如1ml。因为是预先混好的，接种好后不用摇动，直接放入孵箱即可。
关键是先润湿板，减少板与溶液间的界面张力，使细胞在没来得及沉下时，细胞悬液已经在板中铺匀，尤其是较易贴壁的细胞，如HepG2；再就是预先混合细胞，在小的板孔中很难将相对集中的细胞均匀混悬好，实践证明所以还是预混好点。
加药的话，我一般是铺板24小时或48小时后预处理细胞12小时或24小时，再加药刺激18到24小时，算下来要三四天的周期，以上是实验室的传统，当然也会根据文献，细胞种类不同而改变。

作者: 2541 时间: 2012-3-18 13:24

我这是条很非常十分特别极其宝贵自己摸索绝对有效的经验：针对12孔板和6孔板，沿着孔一周边缘均匀接种，切记：不要接种孔中心区，若种出来中心区还稀的话，则下次可向中心区打两三滴细胞悬液。还有就是，千万不要像有些介绍说的前后啊或者左右啊或者上下啊晃晃板子什么的，一晃就全到中心区了。

这可是我以前做了两年细胞尝试了坛子里多种方法都不理想之后摸索出来的秘制精华

作者: 987789 时间: 2012-3-18 13:25

要铺匀的关键是静置15分钟后再放入孵箱

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很好的建议！试了一下，效果很好啊！

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-3-18 13:25

就是中间的长的密，周围的长的疏
这个问题如下解决：垂直方向晃！！前后三下　左右三下，再重复这样，试过多次，效果都非常好！

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种板以前先向空里加点营养液再种也多均匀的

作者: yhz1973 时间: 2012-3-18 13:25

晃我也试过，一晃全跑中间去了；我在外头放了半个小时再拿进培养箱，一样的不匀。看大家的手感了

作者: vivian4123 时间: 2012-3-18 13:26

请问各位老师，6孔板每孔的细胞数是多少？非常感谢~

作者: skytree 时间: 2012-3-18 13:26 标题: 回复 #13 vivian4123 的帖子

这个要看什么细胞了，根据细胞、生长速度来决定

作者: dotaaa 时间: 2012-3-18 13:27

谢谢各位群友。我也遇到过这种情况。我试下。谢谢各位了。

我现在养成纤维细胞。在消化的时候总是有些成片状的细胞，消化过程后不是成单细胞状态。恳请各位群友多多指教

作者: 铜雀 时间: 2012-3-18 13:27

我总结一下就是：先湿润一下培养板，然后沿着孔一周边缘均匀接种，接种后静置15分钟，放入培养箱。

作者: xevin 时间: 2012-3-18 13:28

我支持十字交叉混匀的方法，我一直用这种方法，一直铺板都比较均匀，不信你们可以试试看

作者: sunnyB 时间: 2012-3-18 13:28

我的经验：

1.种细胞前，先稀释好，不要在孔里稀释。

2.支持十字交叉混匀法，细胞悬液加入培养孔后，左右晃几下，前后晃几下，然后可以在镜下看看匀不匀，不匀再使劲晃……当然不要把培养基晃出来。一定不要转着圈晃，这样一定是中间多，周边少。

作者: 小糖块 时间: 2012-3-18 13:29

十字交叉混匀法，我试试。按照以前学习基础实验的经验，预先润湿培养板应该是不错的方法。

我要种T6细胞，跟前面dabaobei的情况一样，消化下来有片状细胞快，传代后都有，很有影响，镜下看到是细胞块而不是其它诸如蛋白沉积块什么的。养fibroblast的战友多谈谈这方面的经验。

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