分析测试百科

标题: [求助]JC-1分析结果求助 [打印本页]

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-3-20 12:42 标题: [求助]JC-1分析结果求助

各位大虾们，小弟来求教。我做了流式，利用JC-1染色分析某种细胞的线粒体膜电位受损情况。结果让我很困惑。跟书上说的完全不一样啊。是不是我参数设置有问题？上流式时比较匆忙，有个老师帮***作。他也没有说清楚到底是什么原理。

图片附件: 95553280.jpeg (2012-3-20 12:42, 44.93 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11197

作者: 66+77 时间: 2012-3-20 12:42

你分析的是什么细胞？
做的什么处理？
标记的是哪些东西？
阴性对照图呢？

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-3-20 12:42

分析的是癌细胞，加了药物刺激。做的是JC-1染色。没有做阴性对照，做了阳性对照。上面那张是正常组图。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-3-20 12:43

这是我按试剂盒说明书里做的阳性对照结果。

图片附件: 10143958.jpeg (2012-3-20 12:43, 40.75 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11198

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-3-20 12:43

这张是我加药最高浓度的结果。

图片附件: 57020921.jpeg (2012-3-20 12:43, 39.04 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11199

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-3-20 12:43

流式那的老师说，看象限里，Q2是正常细胞，Q4里是线粒体膜电位变化的细胞。这样看是对的么？如果我要分析结果。是不是把Q2:Q4的比值给做个柱形变化图就可以了？

作者: 66+77 时间: 2012-3-20 12:44

会不会是组别弄错了？
再做一次试试吧！

作者: 66+77 时间: 2012-3-20 12:44

流式那的老师说，看象限里，Q2是正常细胞，Q4里是线粒体膜电位变化的细胞。这样看是对的么？如果我要分析结果。是不是把Q2:Q4的比值给做个柱形变化图就可以了？

——————————————————————————————————————————

不是这样的，这时不要用比例值，而应该用平均荧光强度。
用FL2的平均荧光强度值/FL1的平均荧光强度值评价线粒体损伤情况，值越高，损伤越利害。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-3-20 12:45

QUOTE:

原帖由 66+77 于 2012-3-20 12:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
流式那的老师说，看象限里，Q2是正常细胞，Q4里是线粒体膜电位变化的细胞。这样看是对的么？如果我要分析结果。是不是把Q2:Q4的比值给做个柱形变化图就可以了？

————————————————————————————— ...

FL2和FL1?我这里有的数据是 PI-A，和FITC-A的MEAN值。
是不是这样算也行的？

作者: 66+77 时间: 2012-3-20 12:45

FL1就是第一荧光通道，就是你的FITC通道。
FL2就是第二荧光通道，应该就是你的PI通道。
平均荧光强度就是通道的Mean值。
看你的图细胞没有明显的阴阳性区分，最好不要用阳性比例作为你的结果，最好用平均荧光强度。
而且JC-1染色一般也是要求结果是FL1和FL2之间平均荧光强度的比值。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-3-20 12:45 标题: 回复 #10 66+77 的帖子

谢谢你的不吝赐教。
我的mean值是分象限的。在象限里相互比较有意义么？

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-3-20 12:46

下面这张是正常组的数据图。

图片附件: 20731145.jpeg (2012-3-20 12:46, 47.96 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11200

作者: hulu呼噜 时间: 2012-3-20 12:46

参见我的一个回帖

cuturl('http://cell.dxy.cn/bbs/topic/17240753')

应将log scale转换为 arithmetic scale，分别得到红、绿荧光的arithmetic mean （AM），然后计算比值Ratio，Ratio=AM红/AM绿。线粒体膜电位受损时，Ratio值降低。

作者: 66+77 时间: 2012-3-20 12:47

不要分象限。分象限比较没有意义，因为象限是根据细胞的阴阳性区分的，你的细胞根本就没有阴阳性之分，象限也就没有意义了。或者说，你划的十字线对于你的这种染色结果来说根本就是错误的。
所以，如果你的图要放到文献中，需要去掉十字线。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-3-20 12:47

参见我的一个回帖

cuturl('http://cell.dxy.cn/bbs/topic/17240753')

应将log scale转换为 arithmetic scale，分别得到红、绿荧光的arithmetic mean （AM），然后计算比值Ratio，Ratio=AM红/AM绿。线粒体膜电位受损时，Ratio值降低。

————————————————————————————————————————

WinMDI 2.9。这个软件，我已经下载安装了，但是全是英文。我还没摸清楚如何使用。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-3-20 12:47

不要分象限。分象限比较没有意义，因为象限是根据细胞的阴阳性区分的，你的细胞根本就没有阴阳性之分，象限也就没有意义了。或者说，你划的十字线对于你的这种染色结果来说根本就是错误的。
所以，如果你的图要放到文献中，需要去掉十字线。

————————————————————————————————

原来如此，这个图误导了我。谢谢！
这图是做流式的老师给我的，关于这个结果，我还是要重复再做的。

作者: hulu呼噜 时间: 2012-3-20 12:48

WinMDI 2.9。这个软件，我已经下载安装了，但是全是英文。我还没摸清楚如何使用。

————————————————————————————————————————————————————————————————

以下是你的结果（density plot）。你的细胞群的位置有点问题，在下图的坐标中，control细胞群的位置宜摆在近象限中点心处，这样受试组的结果会比较好看。

分析方法：
按邮件里所述方法分别计算红、绿色荧光直方图（histogram）的数学均值（AM），以表示细胞群的平均荧光强度。计算Ratio值（Ration=AM红/AM绿），反映线粒体膜电位的平均水平。

图片附件: 20003589.snap.jpg (2012-3-20 12:48, 35.27 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11201

作者: hulu呼噜 时间: 2012-3-20 12:49

.....
用FL2的平均荧光强度值/FL1的平均荧光强度值评价线粒体损伤情况，值越高，损伤越利害。

—————————————————————————————————————————————————————————————————

好像弄反了吧？

FL2采集的是J-aggregates（富集于线粒体）的红色荧光，FL1采集的是JC-1 monomer（胞浆中）的绿色荧光。线粒体损伤时应该是J-aggregates减少而JC-1 monomer增多，应红色荧光减弱而绿色荧光增强，故上述值越低，损伤越利害。

作者: 66+77 时间: 2012-3-20 12:49

不好意思。
的确是我弄反了。
那么楼主的结果是正确的。可以直接分析了。

作者: bohe221 时间: 2012-3-20 12:50

我觉得LZ用象限区分阴性和阳性区域来呈现结果是正确的做法。

参见陈朱波，曹雪涛所著《流式细胞术》（科学出版社）；梁智辉等所著，《流式细胞术基本原理与使用方法》（华中科技大学出版社）

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)