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标题:[求助]关于脐静脉内皮细胞的原代培养

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我们做的是股动脉内皮细胞原代分离,大体过程相似。说一下自己的意见,仅供参考。
1. 血管长度问题:由于动脉有分支,我们大多时候用1-2cm的动脉分离,分离出的细胞量有个体差异,但够用。你的脐带血管太长,消化不够充分,冲洗也相对困难。建议分成几段消化。
2. 消化过程:我们用胶原酶,37度,15-20分钟,期间抽推3次,保证消化充分。鉴于你血管两端均夹死,可以忽略此过程,但要保证酶消化充分。
3. massage 血管: 由于我们用t型通透管,一段联接针管,先将酶抽回针管,用无菌镊子分三个角度轻轻磨差血管,每个角度磨差完,将酶来回推抽两次,目的是为了让内皮细胞脱落。这个步骤比较关键,力道要适度。
4. 冲洗:用45ml冲洗液经通透口用力冲洗血管。此步骤也比较关键。3和4步骤保证收集到内皮细胞。
接下来就无关紧要了,不外乎离心,培养,换液。
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谢谢两位的支持!
我想问问:那该用什么样的培养基呢?文献上都在用M199,我买的是粉剂,本身就有谷氨酰胺等,我只是加了碳酸氢钠和血清及双抗,对了,碳酸氢钠我用的也是粉剂,过滤的,每一升培养基应该加多少碳酸氢钠才能让PH在7.2-7.4呢?
还有,我正在考虑要买个T型或者是三通管,用注射器真的不方便!
现在想想。里面真的可能混有大量的血细胞,应该是消化之前缺乏冲洗的缘故......
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忘了说一步,将血管一端系在t型通透管上,接着用flushing medium 冲洗一下,去红细胞,然后用少量胶原酶冲一下,再用无菌外科线系住另一端,将胶原酶从t型通透管处注入,充盈血管,然后是消化过程。
脐静脉比股动脉的管腔大很多,一定要找到合适型号的T型通透管,保证能紧接扎在通透管端,不活动,不漏液体,才能保证血管充盈度,和消化质量。
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今天又做了一次原代培养,颗粒无收!胶原酶还是原来的胶原酶;只不过之前找错了血管,找成动脉了,今天看看血管的横切面,不就是最粗的这根是静脉吗?然后像往常一样,注入10ml左右胶原酶。
因为自己做试验比较慢腾腾,所以今天把消化时间缩到10min,基本上前前后后消化了13min左右,(以前消化13min离心后可是米粒大小那么多沉淀啊),然后收集消化液,又冲洗了一遍,收集冲洗液,谁知1000转10min后,离心管里什么都没有!!!
我就纳闷了,问题出在哪里?!
自我反省:1.我的胶原酶出问题了?一直把配好的胶原酶4℃保存
2.消化时间短?(就差几分钟这细胞就一个都没有)
各位师兄师姐,赶紧帮帮忙,年前什么都做不出来的话,过年过的不踏实啊!!!
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我们的胶原酶保存在-20度,做试验时先将胶原酶放室温融化,然后在使用前放入37度水浴箱3-4分钟,然后注入血管腔,消化15-20分钟,加上随后的研磨和冲洗,一般能收到内皮细胞。我已经说了我们原代分离试验所有的要点,若还是不行,我就无能为力了。
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1. 2型胶原酶配置后,分装冻存,用前化开,37度预热;
2. 脐带不能有夹伤,管腔消化前一定要PBS或D-hank’s冲洗干净;
3. 三通管便于充盈和抽吸(手术线一端结扎、一端固定),消化中可轻揉或翻动脐带,促进消化,消化时间一般不超过12min;
4. 培养基可以用高糖DMEM或MCDB131,用进口胎牛血清(hyclone或BIBCO),可以不加细胞因子;
5. 接种后24h内尽量不要去移动培养器皿,利于贴壁。明胶对HUVEC贴壁效果一般,但有助于传代时缩短消化时间。
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......听大家这么一讲,莫非是我的胶原酶不行了?
Oh my......胶原酶出奇的贵!太烧钱了!
听说细胞因子可以明显增强细胞的生长活力,不加的话传代只能3-4代,加了的话7-8代都行
我买不到三通管,郁闷
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刚又做了一次原代培养,已经三天了,换液了,镜下看着细胞挺多的,就是不确定是什么细胞......总觉得背景上有很多黑点点,用酒精棉球擦了又擦,可还是有,莫非是污染?(不会是传说中的黑胶虫吧?)附几张图片,大家帮我看看吧~


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这张也是低倍镜下的,从这张里面估计大家就可以看出细胞旁边那些黑黑的点点,会动哦


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8princess8[使用道具]
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这张是400倍的镜下,正好没看到细胞,但却更清晰的显示了黑点点的模样,在高倍镜下才发现原来这每个黑点点周围都有一层像膜一样的东西,这到底是什么啊?!真的是污染了吗?怎么污染的啊?
为了排除培养基污染的可能性,我专门在镜下看了看用的培养基,亮亮的额,什么都看不到......
大家来帮忙喽!
在镜下各位觉得这是内皮细胞吗?


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