[求助]融合蛋白细胞定位问题 - 经验共享

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标题:[求助]融合蛋白细胞定位问题

彼岸花opp[使用道具]
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发表于 2012-4-6 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，也不是一定要做深究，就是觉得有差异想了解下。估计也没时间去深究了，没几天就毕业了。

请问版主是用什么方法去验证呢？共聚焦？还是电镜?

qqq111[使用道具]
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发表于 2012-4-6 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

GFP载体吗？似乎空GFP载体是会形成二聚的啊，最好还是用内源性抗体染吧

彼岸花opp[使用道具]
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发表于 2012-4-6 16:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

但这个定位于空GFP载体的二聚体应该没什么关系吧？

one[使用道具]
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发表于 2012-4-6 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

GFP作为一种示踪分子，应该可以和目的蛋白形成融合蛋白，然后定位于目的蛋白所表达的位置。你可以研究一下你的目的蛋白的表达方式。比如，你的2号重组质粒所表达的蛋白可能主要就是聚点状的表达，至于定位在什么位置，也与你的目的蛋白有关~。

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发表于 2012-4-6 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知道质粒1和质粒2有什么关系没有，如果该蛋白或者突变体是未进行过报道的话，还是比较有意思的。质粒1，胞浆分布，大的亮点是由于瞬时转染大量蛋白表达，未能正确折叠和来不及降解而形成的聚集体（aggregate）。质粒2，胞浆分布，但该蛋白很容易形成aggregate，这与质粒1不同，可能是由于该蛋白的特性所觉得。为了了解这些蛋白的特性，还需要进行以下实验。1. 更换不同的细胞进行表达。2. 更换GFP tag换成更小的tag，如myc，flag，HA等进行免疫荧光定位。3.筛选稳定表达克隆或者降低转染的质粒，使得表达量降低，再进行观察，看质粒2是否也存在大量的aggregate。以上是在没有很好的内源性抗体的前提下进行的研究。如果质粒2是质粒1的突变体，质粒2可能更有研究的意义。

8princess8[使用道具]
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发表于 2012-4-6 16:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加各种细胞器的燃料做共聚焦.可惜,最后没一个成的.
毕业论文你说可以说,也可以忽悠但我真的推荐如果在没多少时间的情况下,不要去深究了

彼岸花opp[使用道具]
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发表于 2012-4-6 16:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

质粒1和质粒2没有什么联系的。

此外，质粒2里面的亮点的多少以及亮度好像是与该蛋白的表达有关。

因为我替换过载体上的启动子，本身的启动子效率比较高，蛋白表达越高亮点就越多、越亮；

而我替换了的启动子后，启动效率相对较低，荧光强度比较低、亮点比较小，可能就是如gunzi战友所说与该蛋白的共聚体有关。
未替换启动子的重组质粒2图片附上：