细胞世界

我想请教一下，在小鼠干细胞迁移实验中，一般选择多大孔径的膜，5ul还是8ul？观察的时间一般是几个小时？4hrs还是更长一些？如果加入的是LSK细胞（干祖细胞），上孔的细胞数多少比较合适呢？谢谢。

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请问您说的干细胞是造血干细胞（HSC)还是间充质干细胞(MSC)或者是其它的干细胞？如果是悬浮细胞如HSC一般选用5微米孔径的滤膜，如果是MSC我们一般选用8微米孔径的滤膜。观察的时间还是要和您的实验设计相关，以能最大程度体现各个实验组之间的差异为宜。如果没有文献可以参考，您可以把其它因素（如下腔趋化因子或者血清的浓度，下腔的细胞数量，上腔的细胞数量等）固定，然后拉时间点比如2小时，4小时，6小时，8小时，分别收细胞，选取最为满意的时间点。
至于上腔加入多少细胞如LSK，可以根据文献另外结合自己的实验设计来定。

求助班主：我近期在用traswell做一种细胞对另一种细胞迁移的影响实验，我用的是Corning 8um的膜，可染色方面出了问题。 前期我一直用苏木素染色方法。 具体步骤是：用棉签擦去滤膜上室面的细胞，然后将Transwell insert置入95％乙醇中固定10min，苏木素染色5～10min，l％盐酸酒精脱色数秒，流水冲洗，使细胞核染蓝，取下滤膜，下室面朝上平铺于载玻片上，显微镜下照相并计数迁移到滤膜下室面的SMC，每个样本计数5个高倍视野(400HPF)的细胞数取平均值，测定SMC迁移率。 但染色后发现细胞颜色非常浅（显微镜怎么调都看不清楚），几乎看不见颜色，我用同样的方法染色细胞爬片，发现效果很好。不知问题出在哪地方了？ 附图：。。。
最近我又换了结晶紫的染色方法。首先结晶紫的配制方法：称0.1g 结晶紫先加几毫升酒精溶1下 然后溶解到100ml蒸馏水中，避光备用（不知道是不是我配制的方法不对）。 染色 步骤：细胞用甲醛室温固定30分钟，清水冲洗，膜风干。结晶紫染色10分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。 但我发现染色后整个膜都是紫色的，用水根本洗不掉（洗的太猛又怕把细胞洗掉），上显微镜也观察不到细胞了，整个界面全是紫色的。不知问题出在哪？很是焦急？恳请指导
小弟还想请教一下关于迁移率的计算方法？ 万分感谢

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其实利用transwell观察细胞迁移的实验方法都大同小异，基本上是迁移、擦去上腔面细胞，染色，镜下多视野拍照计数，计算迁移率。其中染色方法很多：苏木素染色、结晶紫染色、Giemsa染色、伊红染色和台盼蓝染色等等。其中各个染色液的配制和染色方法的使用根据各实验室的习惯多有变化，因此，也造成结果的不稳定性。
您提到的问题我也遇到过，因为多个环节可能影响到最终的结果，所以我们实验室现在已经不用以上方法。一般在迁移后，用棉签轻轻擦去滤膜上腔面细胞，甲醇固定15min后，晾干，DAPI染色30min，荧光显微镜下随机挑取5~8个视野，照相，计数，并统计学分析。效果非常的好，照片也比较好看。

如果细胞穿过滤膜进入下腔，则迁移率（%）=（下层细胞数/添加的细胞数）×100%；
如果是对滤膜下腔面的贴壁细胞染色，则可以比较各实验组每视野内的细胞数量。

我想请问，用棉签擦的时候应该注意些什么呢？直接用干的棉签擦吗？如何保证上面的细胞都被擦去了呢？如果用Matrigel胶的话，我觉得边缘的胶很难被擦去，请问怎么处理呢？谢谢！

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呵呵，干湿棉签都可以。用棉签擦的时候要小心，力气太猛会把滤膜弄坏。如果是擦边上，个人的经验一般是自己用棉花卷一个小小的棉签，仔细地擦。另外，正如版主说得那样，一般取视野拍照很少取边缘部位的。

各位前辈:
小弟咨询个问题,我是做血脑屏障模型的,看到有的文献用的transwell直径为1um,有的是0.4um的!还有其他的!请问各位前辈这有什么区别!血脑屏障模型的建立,最好使用哪种的transwell?
请各位给小弟指导!感激感激!

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一般认为，血脑屏障主要由血管内皮细胞、基膜、胶质细胞组成，胶质细胞可以通过终足与内皮细胞相联系。其中，内皮细胞及其间的紧密连接是血脑屏障机能与结构的主要基础。因此，通常先将星形胶质细胞接种于transwell滤膜的反面，待胶质细胞贴牢后，再将内皮细胞接种于微孔膜正面，使胶质细胞可以通过微孔与内皮细胞系形成接触式共培养。
小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，所以从这个角度来说，选择0.4微米和1微米的孔径都可以；如果从充分形成细胞间接触的角度来说，1微米孔径可能更好一些。

如果我要做药物干预肿瘤细胞的迁移作用，应该怎么做呢？

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肿瘤细胞的趋化试验通常是在上腔种上肿瘤细胞，下腔加入特定的趋化因子或者是血清，细胞会向有趋化作用的因子所在的下腔迁移，对掉入下腔的细胞进行计数或者流式分析，或者对迁移到滤膜下腔面的细胞染色、计数、分析，以此观察细胞的迁移能力。
如果是考察药物干预肿瘤细胞的迁移作用，通常的策略是用药物对肿瘤细胞进行预处理，然后收细胞，种到上腔内，进行迁移试验。具体的细节比较多，如药物处理的时间和浓度，既要能改变细胞的迁移能力，又不杀伤细胞或者诱发凋亡；加入到上腔的细胞数量和下腔内趋化因子浓度是否相适应，等等。需要根据您的细胞特性和实验目的来决定。