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标题:[讨论帖]Transwell技术答疑

园丁##[使用道具]
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成管是要用到基质胶,可是把内皮加基质胶再和肿瘤细胞长时间共培养,不知道行不行。
如果是考察分泌的因子的作用,可以收肿瘤细胞的培养上清,超滤,加到成管体系中去。
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lixi559[使用道具]
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在做肿瘤细胞迁移实验的时候在transwel小室上室底部铺有鼠尾I型胶原或基质胶,请问,肿瘤细胞能透过I型胶原或者基质胶吗?如果不能的话,肿瘤细胞怎么迁移的?怎么又能观察8um透过膜对侧的细胞呢?如果能的话那又和肿瘤细胞侵蚀实验有什么区别?我的实验还处在设计阶段,很多都不懂 ,请您多多指教,非常感谢!
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园丁##[使用道具]
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回复 #32 lixi559 的帖子

您的问题很好。
细胞迁移试验不用铺基质胶的,如果是肿瘤细胞侵袭试验要铺基质胶模拟细胞外基质,肿瘤细胞分泌一些酶如MMPs,分解基质胶,穿过滤膜。
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版主您好:我用coning公司的transwell小室 3422型做肿瘤侵袭实验,胶买的是BD公司的,自己铺胶,做了三次,发现细胞都不是均匀铺在下室,成团现象,而不铺胶做迁移试验细胞穿过得很均匀。想问一下铺胶有什么技巧,避免这种现象发生。
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lixi559[使用道具]
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冒昧再次打扰版主,还是咨询肿瘤细胞迁移实验的时候要不要包被胶原或基质胶以及细胞能否穿过的问题,后来我查阅了很多文献,很多作者在做迁移实验的时候都有这样一段描述:"聚碳酸酯滤膜用0.01%的I型胶原包被过夜,晾干备用"。
而你说的一搬不用包被胶原或者基质胶,我想请问,是包被好还是不包被好,不包被能说明问题吗?非常感谢!
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版主您好:
已经确定要做肿瘤细胞的侵袭实验,您的这个帖子真是个及时雨,之前也看了很多有关Transwell的帖子,有所收获,但是因为左说纷纭,每个人的protocol并不是一致,所以想请教您几个问题。
第一,是否可以选择coring的transwell货号(3422)做侵袭实验?transwell3422是否要包胶?代理商说不需要,但是看了很多文章还是需要包matrigel的。
第二,BD的matrigel有很多货号,比如356234(Basement Membrane Matrix)和356230(Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced),不知如何选择?
有人说matrigel原胶是50mg/ml,但是就没看到BD说明书上描述胶的浓度,只是告诉5ml。
第二,稀释比列有人说1:2,1:4,1:8,个人感觉总得来说1:4多些。
第三,24孔板的每个transwell小室放多少微升胶,我看有的人说加了再吸出来,个人倾向加30微升,37°培养箱过夜干燥。
刚接触Transwell的侵袭实验,对此很陌生,因为做一次成本比较高,所以比较谨慎,不知您对我的问题有何见解,谢谢!
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请问版主:Transwell板可不可以重复利用?
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园丁##[使用道具]
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冒昧再次打扰版主,还是咨询肿瘤细胞迁移实验的时候要不要包被胶原或基质胶以及细胞能否穿过的问题,后来我查阅了很多文献,很多作者在做迁移实验的时候都有这样一段描述:"聚碳酸酯滤膜用0.01%的I型胶原包被过夜,晾干备用"。其中一篇原文附下。
而你说的一搬不用包被胶原或者基质胶,我想请问,是包被好还是不包被好,不包被能说明问题吗?非常感谢!

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非常感谢您提供的信息,结合您前面的帖子,个人有几点疑问:
您是做细胞迁移试验还是侵袭试验?
用的是transwell还是Boyden小室?
准备铺胶原还是matrigel胶?
用的是肿瘤细胞还是?
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园丁##[使用道具]
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请问版主:Transwell板可不可以重复利用?

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呵呵,某些情况下可以,个人用0.4和5微米的膜,上层放T或者DC,发现用PBS冲冲,超声洗下,酒精泡泡还是可以再用一次的,个人经验不作为推广啊。不过如果是做贴壁细胞的迁移,染膜之后就没法重复用了。
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园丁##[使用道具]
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版主您好:我用coning公司的transwell小室 3422型做肿瘤侵袭实验,胶买的是BD公司的,自己铺胶,做了三次,发现细胞都不是均匀铺在下室,成团现象,而不铺胶做迁移试验细胞穿过得很均匀。想问一下铺胶有什么技巧,避免这种现象发生。

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个人手法,见仁见智。铺胶全过程在冰上操作,连续涂胶,涂完后稍微放一放,再放到培养箱。也有人把稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl 直接加到膜上放培养箱。
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