现代分析实验

　　一、目的及要求

　　1、了解质粒作为载体在基因工程中的作用

　　2、熟记提取质粒的基本原理，学习提取过程和方法

　　3、为下一步实验提供高纯度的DNA 样品

　　二、原理

　　1、质粒(Plasmid)：独立于染色体以外的双链、闭合、环状DNA，可自我复制。为基因工程中的常用载体(Vector)

　　2、作为载体的质粒需具备以下特点：

　　1) 能自主复制。

　　2) 具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，又称为多克隆位点(multiple cloning sites, MCS)，便于外源基因的插入。

　　3) 具有1 个以上的筛选标记(抗性基因)。

　　4) 分子量相对较小，多拷贝。

　　5) 非结合性质粒。

　　6) 转化效率高。

　　目前已有一系列符合上述要求的质粒作为商品供应。

　　3、大肠杆菌中提取纯化质粒的主要步骤：

　　1) 细菌的培养：LB 培养基+氨苄青霉素O.D600=0.4 对数生长期O.D600=0.6 对数生长后期

　　2)细菌的收集和裂解

　　收集：离心，STE 液洗1-2 次，去除代谢物

　　裂解：SDS 法、碱裂解法、煮沸法

　　碱裂解法：EDTA 破坏细菌的细胞壁和细胞外膜→SDS 裂解细胞膜→NaOH 使核酸、蛋白质变性。

　　3)质粒的分离和纯化

　　加入酸液，质粒DNA、小分子RNA 复性(可溶)，染色体DNA、高分子量RNA、K+/SDS/蛋白质/膜复合物沉淀，离心弃除;酚:氯仿抽提去除蛋白质;RNAse去除残留小分子RNA。

　　三、试剂：

　　略

　　四、操作：

　　1.将0.2ml 含重组质粒pIL 的大肠杆菌接种于2.5ml LB 培养基(含Amp 100ug/ml)中，37℃、150rpm 振荡培养过夜。作用：加Amp 的目的为使含Amp 抗性基因的细菌选择性生长。

　　2.取1.5ml 菌液置于1.5ml EP 管中，15,000rpm 离心30 秒，弃上清，将培养液尽量控干。

　　作用：沉淀细菌。注意：控干时将吸水纸卷成圆柱状，沿管壁轻轻吸取水珠。控干时不要触及细菌沉淀。

　　3.加入1ml STE 溶液，漩涡振荡器上振荡悬菌，15,000rpm 离心5min，弃上清，控干。

　　作用：去除培养基中残留的细菌代谢物。

　　4.加入100ul 溶液Ⅰ，震荡悬菌，室温放置5min。

　　作用：Glucose--增加溶液粘度，保护DNA;Tris-HCl--缓冲液;

　　EDTA--螯合二价阳离子，抑制核酸酶，预处理细菌。

　　注意：在涡振荡器上震荡悬菌。

　　5.加入200ul 溶液Ⅱ，轻轻颠倒混匀5 次，置冰浴5min。

　　作用：SDS--去污剂，使细胞裂解;NaOH--变性剂，使蛋白质、核酸变性。注意：此时溶液呈胶胨状，严格控制混匀次数和变性时间。

　　6.加入150ul 溶液Ⅲ，颠倒混匀，置冰浴10min。

　　作用：酸液，中和NaOH，使质粒DNA、小分子RNA 复性(可溶)，染色体DNA、高分子量RNA、K+/SDS/蛋白质/膜复合物不能复性而沉淀

　　注意：此时溶液出现大量絮状沉淀

　　7.15,000rpm 离心5min，将上清400ul 转移至另一干净EP 管中，弃沉淀。

　　注意：将枪头插入溶液中央吸取，不要将沉淀吸出，用吸水纸擦拭枪头。

　　8.加入240ul 异丙醇(0.6 体积)，混匀，置室温10min。

　　作用：沉淀核酸(DNA、大分子rRNA、mRNA)和蛋白质。

　　9.15,000rpm 离心10min，弃上清，控干。

　　10.50ul TE 溶解沉淀，加入50ul 冰预冷的5M LiCl，混匀，置冰浴10min。

　　作用：使大分子大分子rRNA、mRNA 沉淀，而DNA 不沉淀。

　　11.15,000rpm 离心10min，上清100ul 转移至另一EP 管中。

　　12.加2 倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀，-20℃沉淀10min。

　　13.15,000rpm 离心10min，弃上清。

　　14.待乙醇挥发后，将沉淀溶于20ul TE。将质粒DNA 溶液置于-20℃保存。

　　五、注意事项：

　　1.严格控制碱变性的时间时间，不超过5 分钟。因为，如质粒处于强碱性环境中时间过长，可发生不可逆变性，导致限制性内切酶切割困难。

　　2.在加入溶液III 后，要充分混匀并置冰上。如未见大量白色沉淀，说明实验失败，应立即重做。

　　3.弃上清时，必须控干即除尽管内的液体，在做最后一步时，应尽量将乙醇挥发干净，因为如残留较多乙醇，以后在做酶切鉴定时，乙醇会使限制性内切酶失活。但此步的时间不宜过长，一般在10-15 分钟左右，可用滤纸条小心吸净离心管壁上的乙醇液滴以节省时间。