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标题:[讨论帖]“细胞培养心得

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发表于 2012-4-16 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天细胞心得：养细胞是一门艺术！
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2012-4-16 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问有谁分离过脐血单个核细胞吗？我分离过一次，可是镜下观有很多的红细胞，还有其它一些杂质细胞，哪位高手分离过纯的单个核细胞，请指点一下，谢谢了。我的具体步骤如下：采脐血50ml,冰盒内储存，一个小时后分离（因路途的原因），先用羟已基淀粉沉降一个小时（4度），取上血浆于另一离心管中，再用淋巴细胞分离液分离血浆，方法步骤同用淋巴细胞分离液分离外周血，离心后去上清，用PBS洗涤两次，用含10%胎牛血清重悬培养，镜下观见很多的红细胞以及一些杂质细胞，请问用什么方法可以去除这些红细胞啊，我用淋巴细胞分离液分离外周血单个核 时非常好，可是分离脐血效果就很糟糕了。急，请各位多多指教

另外，分离脐血后我用药物干预两天，请问这两天用什么培养好啊,只用含10%胎牛血清的1640可以吗？
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49888[使用道具]
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发表于 2012-4-16 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本科毕业时就养细胞，但是当时整个实验室的细胞状态都不好，大家换衣是污染了一种黑色小胶虫的微生物，为了能顺利完成毕业答辩，只好改做ELISA。于是，从那时开始，细胞培养在自己的心里也就留下了阴影。研究生进实验室之后，分子生物学实验做完后，又开始跟细胞打起了交道，回顾一下细胞培养的历程，有如下收获：
1、细胞就像孩子，一定要像关爱孩子一样关爱细胞。一定要勤快，最好隔一天给细胞换一次培养基，且培养细胞时加的培养基一定要充裕，否则容易饿着它，它就会给你脸色看。冻存细胞的前一天要给细胞换液，这样有利于细胞保持良好的状态。
2、细胞污染的处置：污染了真菌后，如果肉眼见到霉团了，那就扔之吧；如果是只是在显微镜下见到少量的真菌，可以倒掉液体后，加入新的培养基，同时加入一定量的氟康唑，即可拯救细胞。当细胞培养板中发现霉菌污染时，而细胞又非常重要（如制备分泌单抗的细胞株时），这时可以关闭无菌操作台的风机，在有霉团的细胞孔中加入碘酊，作用5-10分钟后，吸出碘酊，这样可以避免其他没被霉菌污染的细胞孔中的细胞。
3、不同的细胞株，即使使用的是同一种培养基，也不要使用同一瓶培养基，还有，操作完一种细胞株后，不要没有经过紫外线照射就操作另外一种细胞株，以防细胞株间的交叉。
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-4-16 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
说一点，所用的血清，培养基及双抗等在用之前可以先分装，这样是避免污染的一个很好的方法
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bongte[使用道具]
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发表于 2012-4-16 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也来说几句，养细胞时间不算太长，算来前前后后也有10来中细胞株，自己分离的原代细胞也有三四种了。癌细胞就不说了，长的都快也好养，有时候感觉随便养养就行，不过随便养养也不是随便说的，每次还是要按步就班的来，要不然里面长出其它活物来可就麻烦了。加点双抗是有必要的至少心里放心一些。增湿盘里可以放点硫酸铜对霉菌有些作用，定期清理很重要，再好的培养箱时间长了不清理也会出问题。孩子对了总有些偏爱，我最喜欢原代的心肌细胞了，在显微镜下动啊动的可有意思了。
个人几点经验：
1.自己的细胞自己养，让别人帮着换个液什么的总会不太放心，前期准备最好也有一个人来完成，自己准备的东西用着放心。
2.准备很关键，没有好的准备工作啥也别说，PH值、盐离子、灰尘、微生物都在等着你呢。
3.要多观察，多思考，有时候全信本本上的也是不行了，多思考，比如细胞诱导，文献上说诱导48小时，但是你的就不一定行，可能48小时全漂漂了，这个48其中换相同液一次文献上还没说呢呵呵。
4.绝对不能偷懒，该换液的时候换液该传代的时候传代。
5.分离细胞的时候千万注意文献上的RPM，呵呵不知道机器型号的RPM基本等于没说，知道型号不同转头也不行，水平离心跟45度角离心差别也大得很，不信你试试。
6。正常生长的细胞，拧紧瓶盖置室温一周细胞不会死数量也基本不会增加，所以你从别处快递来的细胞长途跋涉不是很脆弱的细胞都没问题，呵呵，偶然发现，不适用于所有细胞，当然大冬天的放室温肯定是不行了。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-4-16 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于原代细胞培养的话，大家切记不满让它长的太满，在细胞大面积接触之前传代，大部分细胞在70%左右吧，宁可分早了少分几瓶也不要让他长过了。
原因：
1、原代细胞接触之后，会抑制生长（大多数细胞系也是如此啦）。这个抑制信号会导致你的细胞老化或分化。总之就使得你的细胞状态不行了。许多原代细胞养的注意的话养个20-30代的话细胞的原有特性还是能维持的。
2、原代细胞大多数时候很难保证100%纯的细胞，常见的杂质细胞是成纤维细胞。这个细胞要命的是他接触了还会继续生长。所以如果长的过满了，成纤维细胞会继续生长，导致在你细胞中的比例就迅速增加了。比如本来之后0.5%，长的过满之后下一代细胞中比例可能就是5%了。
以上经验是我一个在某原代细胞公司的朋友（可以说是世界上原代细胞种类最多的一个公司）传授的，希望对大家有帮助。
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2012-4-16 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
新手，刚做了2批新生乳鼠心肌细胞培养，那个惨啊。第一次20个皿污染了16个，现在第2次很多黑疙瘩与细胞们紧密接触，难舍难分，不知道咋办好。。。。。
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发表于 2012-4-16 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没养过孩子养过细胞，养细胞个人认为最需要的是耐心和细心，三天打鱼两天晒网是肯定不行的。
1、耐心。每天都要照看，了解它们。
2、细心。要细心的照顾它们。
细胞其实是和我们一样的有脾气的，如果养的好的话她和你是一起的，你好他就好，如果你心情不好他也就会随之不开心，曾经听人说过一句话，“要不然怎么说是我养的呢”。
细胞需要的是坚持，你要一直和他在一起，他才会好，你要是离他而去，他也就会和你自然分手再也不会理你了。你要为离开他付出双倍甚至更多的代价！所以千万不要离开你自己的细胞！
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发表于 2012-4-16 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DMEM细胞培养基的高糖和低糖对细胞培养影响并不大，我几年前刚开始做细胞培养时也常为此困扰。如果为了保险起见，选高糖的好了。培养基中的谷氨酰胺、丙酮酸钠浓度更重要，一定注意不同货号培养基之间的细小差别，最好选组分全加 入的货号产品，毕竟省得不少另加试剂的开销。HEPES的添加也很关键，尤其对代 谢旺盛的细胞更是如此。选血清时，宁可买Hyclone公司的新生牛血清，也不要用国产胎牛血清，切记。经济情况允许，建议用Hyclone的Define级血清，效果太好了。实际上国产胎牛血清都是新生牛，基本上都是病弱新生牛未哺乳前取的血，甚至不如进口新生牛血清，价格却相差不多。国产血清有的时候太“脏”了，其中的内毒素、支原体等指标都达不到要求，最近研究表明，内毒素是细胞凋亡的诱因之一。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活，灭活后严重影响细胞生长速 度，且细胞贴壁率降低。
Gibico的血清很好，我读硕士时一直用。但是最近两年由于疯牛病的原因（Gibico的血清不都产在美国和澳洲，也有疯牛病发生的国家），进口的少，价格也贵。同一价格的前提下，毕竟Hyclone的Define级质量更好。Sigma的血清也很好， 质量标准比Hyclone的还严格。具体选那种，还得根据您的工作性质而定，毕竟在国内科研经费有限，除非老板有上千万的项目，可以不计实验成本。
关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细 胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后 没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。如果做MTT实验或类似的四唑盐参与线粒体代谢的实验，血清浓度尽可能低一些，一般5%-10%，可以减少血清对结果的干扰，尤其是采用水溶液法（如加10%SDS盐酸 溶解而不用DMSO）时更加重要。如果您做流式细胞分析，需要分析细胞周期，要经过一个“同步化”过程，有的学者用血清饥饿法，也就是24小时不加血清，使细胞周期趋于同步化。
我的细胞传代原则：不用EDTA，只用胰酶，先用D-hank's洗掉残留培养基和血清，然后按1ml胰酶/10cm2培养面积加入，镜下观察，待到细胞回缩明显且尚未脱壁时（这个过程不超过1分钟），倒掉大部分胰酶，只保留细胞表面被少量胰酶湿润，37度培养箱中放置5-15分钟，直至细胞可象流沙状下滑，加入含血清培养基终止消化，轻轻吹打使细胞散开，如有团块，可考虑200目筛过滤，可不洗涤离心细胞。此种方法对细胞伤害最小，如果做流式细胞分析，也可用此法，只不过在胰酶中加 入等量EDTA溶液，出来的峰极规整漂亮。某些细胞只用常规培养基不行，还必须补充生长因子或特殊量的氨基酸才能正常生长，要多参考相关文献。

另外，二氧化碳张力和温度也很重要，有些细胞需要较高的二氧化碳浓度或较特殊
的温度。可选用透气盖培养瓶或培养皿培养板培养。
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2012-4-16 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有意义，今天刚得到人生第一株细胞，我这个比较简单，师兄把什么都准备了，只要换液，每天照看一下就行。师兄还是挺把我当回事的，什么注意事项都交代了，还有一些现在用不到但是养细胞必须的事项都说了。
只是第一天就不太如意，NF-KB本来就娇弱。昨天看的时候细胞还挺好的，那时就应该换个皿分两份了，今天一看，细胞长多了，成片飘了起来。吸掉上面的细胞后只剩一点点细胞，不知道移到新的皿里还能长好不。心里很忐忑啊。
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