[分享帖]细胞爬片的保存和抗原修复问题总结 - 经验共享

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标题:[分享帖]细胞爬片的保存和抗原修复问题总结

一叶[使用道具]
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发表于 2012-4-26 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

28.  细胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。细胞固定后可室温保存在丙酮中，不使之干燥。

29.  如果是检测膜上的物质,好象不能用酒精,

30. 适当密度后取出固定(丙酮-20固定10～20min)，再进行免疫染色。

31.  一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定15-20分钟，然后放-20度，没有问题。
如果细胞爬片是在24孔板或6孔板里进行，冷丙酮会腐蚀板子，最好4%多聚甲醛。

32.  细胞爬片用纯丙酮固定10分钟，取出干燥后用锡纸包裹，-70度保存。

33.  4%多聚甲醛固定后PBS水洗，自然干燥后用锡纸包裹，-20度冻存不超过1月。

一叶[使用道具]
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发表于 2012-4-26 15:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

34.  如果细胞贴壁困难，可将片子先用纯血清挂一层，凉干后再养细胞。

35.  可以买NUNC公司的专用细胞培养用盖玻片，商品名Thermanox™ Coverslips。高分子材料，耐高温灭菌，经过特殊表面处理，细胞容易贴附。可以用剪刀任意裁剪，使用效果好。
上海生工有现货，不用国外定货。我使用后，觉得效果比玻璃盖玻片效果好很多。

36.  我们通常是把细胞玻片固定好后，用PBS冲洗干净，然后用酒精脱水（80%，90%，100%，100%酒精各一次，每次10分钟左右），然后放在烘箱里烘干，这是就相当于石蜡切片了，可以保存一定的时间。
这个方法我们试过的，保持一段时间后做，效果还是可以的。

一叶[使用道具]
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发表于 2012-4-26 15:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

从上面的总结来看，大家多用多聚甲醛和或者丙酮固定，然后-20度保存至少1月，4度的话2周。
请问
1.如果用丙酮固定的话，因为他是有机溶剂，会和6孔板发生反应，请问大家是如何固定的，是把血盖片取出来粘到盖玻片上固定的吗？
2.关于多聚甲醛固定的爬片是否需要抗原修复的问题，先问一下，因为简单查下论坛，有人说需要固定，因为交联反应；有人说固定的时间短不需要修复。有时间的话我爬片是否需要修复再在论坛内搜索后做个整理总结

fei1226com[使用道具]
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发表于 2012-4-26 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的细胞爬片固定液用得是-20度与冷的丙酮甲醇（1：1混合）混合液，固定5-10min，当然，这一步是把爬片取出来放在玻璃培养皿中固定的（这一步一定要小心！！不能弄混正反面）。之后PBS漂洗三遍，自然晾干，放-20保存，我隔了一个多月取出来做免疫荧光也没问题。胞浆，胞核的着色都不受影响。
以前试过纯丙酮固定，细胞收缩非常厉害，害我的成纤维细胞变得跟小蝌蚪似的，根本没法用。

c86v[使用道具]
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发表于 2012-4-26 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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2012-4-26 15:51

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一叶[使用道具]
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发表于 2012-4-26 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

借形态宝帖求助高手！
我最近爬了不少片子，固定前镜下看细胞情况不错，细胞形态比较完整，铺展的也较开，结果当我每次用PBS洗2遍，75%酒精固定5-10分钟，然后再用PBS洗2遍后晾干并存放于4度冰箱，一周左右进行免疫细胞化学实验。
每张玻片出来的结果：镜下细胞的形态残破不堪，胞膜破碎不完整，甚至部分变形的比较厉害，直接导致组化结果不可信。一直不知何故，请几位形态版版主和各位高手帮忙分析一下，非常感谢！

————————————————————————————————————————————————————————————————

首先需要说明的是我现在还没有开始爬片，只是在查找资料，今天中午刚查到几个帖子，希望对你有用。
1.细胞爬片可以买专门的爬片，几块钱一小包的，爬片用前泡酸，高压消毒（包括镊子和枪头）。把用过的24孔板清洗干净，一孔一片，很方便，又互不干扰。把细胞培养到对数生长期，消化后再滴上去，爬1-2天贴壁后（中间可加适量培养液），可在板子里一直做完。清洗时，将PBS滴在片子上即可，不要剧烈摇晃。需要照相时候，再取出来，细胞面贴在载波片上，最好用50%甘油，中性树脂贴不好，容易毁坏细胞形态。取爬片时候，可以用枪头和镊子，或者用以下战友的方法。

2.是关于固定的问题，印象中是不用丙酮，否侧细胞形态变化很厉害，忘记了，刚才也没有再找着，实在丁香通找的，你自己再找找吧

供参考！等我做了爬片大家一起再讨论！

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发表于 2012-4-26 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我前段时间做过细胞爬片，是用多聚甲醛固定的，当时也在考虑要不要进行抗原修复，最后没修复做了，结果显示时没问题的，可以做出来，所以就每次不修复直接做了，这两天又要开始做了，再试几次看看到底行不行在来这里跟大家交流经验。

一叶[使用道具]
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发表于 2012-4-26 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

昨天晚上整理细胞爬片是否需要抗原修复的资料，最后的结果是
细胞爬片做组化不需要抗原修复，但是需要用tritonx－100通透。如果不放心的话，就像楼上泡泡520530战友那样先不用修复，出不来结果的时候再试一试修复！

整理总结】细胞爬片的抗原修复
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=14469722&sty=1')

一叶[使用道具]
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发表于 2012-4-26 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

为什么讨论抗原修复的问题？

福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。因此，抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本因素。

一叶[使用道具]
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发表于 2012-4-26 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

schwann细胞爬片后,我用过4%的多聚甲醛，很好。是爬片，不是石蜡切片对吧，那就不用抗原修复了。

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